Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định một số ginsenosid trong thực phẩm chức năng chứa nhân sâm (panax ginseng)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ HẠNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GINSENOSID TRONG THỰC PHẨM
CHỨC NĂNG CHỨA NHÂN SÂM (PANAX GINSENG)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI – 2016


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ HẠNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GINSENOSID TRONG THỰC PHẨM
CHỨC NĂNG CHỨA NHÂN SÂM (PANAX GINSENG)

Chun ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

HD1: TS. NGUYỄN THỊ ÁNH HƢỜNG
HD2: PGS.TS. PHẠM THỊ THANH HÀ

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. NGUYỄN THỊ ÁNH
HƢỜNG, PGS.TS. PHẠM THỊ THANH HÀ và ThS. CAO CƠNG KHÁNH đã tận
tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề
tài và viết luận văn.
Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS LÊ HỒNG HẢO, ban
lãnh đạo Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia và các anh
chị, các bạn công tác tại Viện Kiểm định Vệ sinh An toàn Thực phẩm Quốc gia đã
tạo điều kiện thuận lợi cho tôi đƣợc học tập và nghiên cứu trong mơi trƣờng hiện
đại.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới các thầy cơ giáo giảng dạy tại khoa Hố, đặc
biệt là các thầy cơ trong bộ mơn Hố Phân tích, đã cho tơi những kiến thức q giá
trong q trình học tập và thực hiện đề tài này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè của tập thể lớp cao học Hoá
K24, đặc biệt là những ngƣời bạn trong nhóm Hố phân tích K24 đã giúp đỡ, chia
sẻ những khó khăn trong suốt q trình tơi học tập và thực hiện đề tài này.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã ln động viên, chia
sẻ mọi khó khăn cùng tôi.
Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2016
Học viên

Nguyễn Thị Hạnh

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
Abs

Tiếng Anh
Absorbance

ACN

Tiếng Việt
Độ hấp thụ quang
Acetonitril

Association of Official

Hiệp hội cộng đồng phân tích

AOAC

Analytical Community

chính thức

AS

Asymmetry factor

Hệ số đối xứng pic

GC

Gas Chromatography

Sắc ký khí

High performance liquid
HPLC

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

High performance thin layer
HPTLC

chromatography

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

IR

Infrared

Hồng ngoại

LC-

Liquid chromatography tandem

MS/MS

mass spectrometry

Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantification

Giới hạn định lƣợng

MS

Mass spectrometry

Khối phổ

PDA

Photodiode Array

Mảng diod quang

R(%)

Recovery

Hiệu suất thu hồi

RP-HPLC

Reverse phase-HPLC

Sắc ký lỏng pha đảo

RS

Resolution

Độ phân giải

RSD

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tƣơng đối

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

TLC

Thin layer chromatography

Lớp mỏng hiện năng cao
Thực phẩm chức năng

TPCN
tR

Retention time

Thời gian lƣu

USP

United States Pharmacopeia

Dƣợc điển Hoa Kỳ

UV-VIS

Ultraviolet-Visible

Tử ngoại và khả kiến


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Tác dụng đặc trƣng của từng loại ginsenosid .............................................. 7
Bảng 1.2. Các Saponin có aglycon là protopanaxadiol ......................................................... 9

Bảng 1.3. Các Saponin có aglycon là protopanaxatriol ............................................ 10
Bảng 1.4. Saponin với aglycon là acid oleanolic ................................................................. 11
Bảng 3.1. Chƣơng trình gradient 1, 2 ................................................................................. 26
Bảng 3.2. Chƣơng trình gradient 3, 4 .................................................................................. 27

Bảng 3.3. Danh mục các pha động HPTLC khảo sát ................................................ 29
Bảng 3.4. Kết quả định lƣợng ginsenosid trong mẫu TPCN dạng dung dịch với số lần chiết
bằng n-butanol khác nhau. ................................................................................................... 34

Bảng 3.5. Độ lặp lại thời gian lƣu và diện tích pic của các chất ............................... 37
Bảng 3.6. Độ lặp lại hệ số lƣu giữ Rf .................................................................................. 38
Bảng 3.7. Kết quả đánh giá độ tuyến tính của chất chuẩn Rg1, Rg1 ................................... 41
Bảng 3.8. Độ lệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đƣờng chuẩn Rg1, Rb1 ............... 43
Bảng 3.9. Kết quả đánh giá độ tuyến tính của Rg1, Rb1 trên HPTLC ................................ 43
Bảng 3.10. Độ lệch chuẩn của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đƣờng chuẩn Rg1 ........... 44
Bảng 3.11. Độ lệch chuẩn của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đƣờng chuẩn Rg1 ........... 46
Bảng 3.12 . Độ lặp lại của ginsenosid Rg1, Rb1 trong viên nang cứng .............................. 47

Bảng 3.13. Độ lặp lại của ginsenosid Rg1, Rb1 trong viên nang mềm .................... 48
Bảng 3.14. Độ lặp lại của ginsenosid Rg1, Rb1 trong mẫu nƣớc sâm ..................... 49
Bảng 3.15. Kết quả phân tích độ lặp lại của ginsenosid Rg1, Rb1 mẫu dạng bột .... 50
Bảng 3.16. Kết quả phân tích độ lặp lại của ginsenosid Rg1, Rb1 trong mẫu viên
nang mềm trên HPTLC ............................................................................................. 51
Bảng 3.17. Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 trong viên nang cứng.......................... 52
Bảng 3.18. Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 trong viên nang mềm ......................... 53
Bảng 3.19. Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 trong mẫu dung dịch .......................... 54
Bảng 3.20. Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 trong viên nang cứng trên HPTLC..... 55
Bảng 3.21. Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 trong viên nang mềm trên HPTLC..... 56
Bảng 3.32. Kết quả phân tích ginsenosid Rb1, Rb1 trong các TPCN ...................... 57

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 . Mức di động của các ginsenosid 'Rx' trên tấm sắc ký lớp mỏng .......................... 8

Hình 1.2. Cấu trúc các Saponin có aglycon là protopanaxadiol ................................. 9
Hình 1.3. Cấu trúc Saponin có aglycon là protopanaxatriol ..................................... 10
Hình 1.4. Cấu trúc Saponin với aglycon là acid oleanolic ........................................ 10
Hình 1.5. Cơng thức cấu tạo của ginsenosid Rb1 ..................................................... 11
Hình 1.6. Cơng thức cấu tạo của ginsenosid Rg1 ..................................................... 11
Hình 3.1. Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1, Rb1 với gradient 1 ............................ 27
Hình 3.2. Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1, Rb1 với gradient 2 ............................ 27
Hình 3.3. Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1, Rb1 với gradient 3 ............................. 28
Hình 3.4. Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosde Rg1, Rb1 với gradient 4 ............................ 28
Hình 3.5. Hình ảnh HPTLC với hệ pha động 1 ................................................................... 29

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn hiệu quả chiết mẫu sử dụng MeOH ở nồng độ khác nhau .
................................................................................................................................... 31
Hình 3.7. Sắc đồ sử dụng với dung môi chiết MeOH 70% ................................................. 31
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn hiệu quả chiết mẫu sử dụng EtOH ở nồng độ khác nhau ..............
............................................................................................................................................. 32

Hình 3.9. Đồ thị biểu thị hiệu quả chiết mẫu với các dung mơi hữu cơ loại lipid .... 33
Hình 3.10. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu ....................................................................... 37
Hình 3.11. Sắc đồ của mẫu trắng .............................................................................. 39
Hình 3.12. Sắc đồ dung dịch mẫu trắng TPCN có thêm ginsenosid Rg1, Rb1 .
Hình 3.13. Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1,Rb1 ........................................ 39
Hình 3.14 . Phổ hấp thụ UV của ginsenosid Rg1 ..................................................... 40
Hình 3.15. Phổ hấp thụ UV của ginsenosid Rb1 ...................................................... 40
Hình 3.16. Sắc đồ dung dịch thử thêm chuẩn ginsenosid ......................................... 41
Hình 3.17. Đồ thị đƣờng chuẩn Rg1, Rb1 phân tích trên HPLC .............................. 42

Hình 3.18. Sắc đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp 500pm ................................................ 42
Hình 3.19. Đồ thị đƣờng chuẩn Rg1, Rb1 trên HPTLC ........................................... 44


Hình 3.20. Sắc đồ của ginsenosid Rg1 và Rb1 phân tích trên HPTLC ............................... 45

Hình 3.21. Sắc đồ ginsenosid 3,0 ppm pha trong dung dịch mẫu trắng ................... 45
Hình 3.22. Sắc đồ phân tích độ lặp lại lần 5 của viên nang cứng ............................. 47
Hình 3.23. Sắc đồ phân tích độ lặp lại viên nang mềm lần 1 .................................... 48
Hình 3.24 . Sắc đồ phân tích độ lặp lại mẫu nƣớc sâm lần 1 .................................... 49
Hình 3.25. So sánh độ lặp lại của sắc đồ 10 mẫu thực phẩm chức năng chứa nhân
sâm dạng bột ............................................................................................................. 50
Hình 3.26. Sắc đồ phân tích độ lặp lại của ginsenosid Rg1, RB1 trong mẫu viên
nang mềm trên HPTLC. ............................................................................................ 51
Hình 3.27. Sắc đồ phân tích độ thu hồi của ginsenosid trong viên nang cứng lần 1. ...
................................................................................................................................... 52
Hình 3.28. Sắc đồ phân tích độ thu hồi của ginsenosid trong viên nang mềm lần 1 ....
................................................................................................................................... 53
Hình 3.29. Sắc đồ phân tích độ thu hồi của ginsenosid trong dung dịch lần 1 ......... 54
Hình 3.30. Sắc đồ phân tích mẫu nang cứng mã NC3 .............................................. 57
Hình 3.31. Sắc đồ phân tích mẫu nang mềm mã NM4 ............................................. 57


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC, CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN
DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHĨA LUẬN
DANH MỤC HÌNH VẼ TRONG KHÓA LUẬN
CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN ..................................................................................... 5
1.1.

Tổng quan về nhân sâm và hoạt chất trong nhân sâm ................................... 5

1.1.1.

Giới thiệu chung về nhân sâm ....................................................................... 5

1.1.2.

Tác dụng đặc trƣng của nhân sâm ................................................................. 6

1.1.3.

Vài nét về nhóm hoạt chất ginsenosid ........................................................... 7

1.1.4.

Cơng thức cấu tạo và tính chất vật lý của ginsenosid Rg1 và Rb1 ............. 11

1.2.

Tổng quan về các phƣơng pháp phân tích ginsenosid ................................. 12

1.3. Các phƣơng pháp xử lý mẫu .............................................................................. 16
1.4. Tổng quan về kỹ thuật HPTLC .......................................................................... 17
1.4.1. Sắc ký lớp mỏng.............................................................................................. 17
1.4.2. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao ...................................................................... 19
2.1.

Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................... 21

2.2.

Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 21

2.3.

Đối tƣợng nghiên cứu .................................................................................. 21

2.4.

Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 21

2.4.1.

Khảo sát các điều kiện HPLC ..................................................................... 22

2.4.2.

Khảo sát các điều kiện phân tích ginsenosid bằng HPTLC ........................ 22

2.4.3.

Xây dựng quy trình xử lý mẫu..................................................................... 23

2.4.4.

Thẩm định quy trình .................................................................................... 24

2.5.

Phƣơng pháp xử lý số liệu ........................................................................... 24

2.6.

Nguyên vật liệu, thiết bị .............................................................................. 24

2.6.1.

Thiết bị và dụng cụ ...................................................................................... 24

2.6.2.

Hóa chất, thuốc thử ...................................................................................... 25
1


2.6.3.

Dung dịch chuẩn .......................................................................................... 25

CHƢƠNG 3 – THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ .................................................... 26
3.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký để phân tích ginsenosid bằng HPLC ....................... 26
3.2. Thiết lập điều kiện sắc ký để phân tích ginsenosid bằng HPTLC ..................... 29
3.3. Xây dựng quy trình xử lý mẫu ........................................................................... 30
3.4. Thẩm định phƣơng pháp .................................................................................... 37
3.4.1. Tính thích hợp hệ thống .................................................................................. 37
3.4.2. Tính chọn lọc, tính đặc hiệu ............................................................................ 38
3.4.3. Khoảng tuyến tính .......................................................................................... 41
3.4.4. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng ......................................................... 45

3.4.5.

Độ lặp lại của phƣơng pháp ......................................................................... 46

3.4.6.

Độ thu hồi của phƣơng pháp ....................................................................... 51

3.4.7.

Kết quả áp dụng phƣơng pháp xác định ginsenosid Rg1, Rb1 trong một số

sản phẩm.................................................................................................................... 55
KẾT LUẬN ............................................................................................................... 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................... 59
PHỤ LỤC .................................................................................................................. 63
Phụ lục 1: Sắc đồ đƣờng chuẩn ................................................................................. 63
Phụ lục 2: Sắc đồ khảo sát độ lặp lại......................................................................... 64
Phụ lục 3: Sắc đồ khảo sát độ thu hồi ....................................................................... 65

2


MỞ ĐẦU

Từ xa xƣa, nhân sâm (tên khoa học là Panax Ginseng) đã đƣợc xem là thảo
dƣợc quý hiếm. Hoạt chất chính tạo nên tác dụng kỳ diệu của nhân sâm là thành
phần ginsenosid. Hợp chất này đƣợc phân thành hai nhóm chính là nhóm Rb1 và
nhóm Rg1. Vài năm gần đây nhiều nhà khoa học hƣớng tới sự quan tâm đặc biệt tới
nhân sâm với rất nhiều nghiên cứu đƣợc công bố. Ở Việt Nam cũng nhƣ trên thế

giới, nhân sâm đƣợc biết đến không chỉ là nguồn dinh dƣỡng q báu mà cịn là
một vị thuốc vơ cùng quan trọng. Theo nghiên cứu khoa học và sách đông y thì
nhân sâm có nhiều tác dụng tốt cho sức khỏe con ngƣời.
Ở Việt Nam hiện nay, nhu cầu sử dụng nhân sâm tăng cao. Nguồn nguyên
liệu này chủ yếu đƣợc nhập từ Trung Quốc, Hàn Quốc… nên rất dễ bị giả mạo, sản
phẩm nhập về chất lƣợng không đáp ứng đƣợc chất lƣợng. Vì vậy việc kiểm sốt
tính đúng và chất lƣợng nguyên liệu đầu vào là rất quan trọng. Tuy nhiên, việc
kiểm nghiệm chất lƣợng nguyên liệu nhân sâm và thực phẩm chức năng chứa nhân
sâm ở nƣớc ta vẫn cịn nhiều hạn chế dẫn tới tình trạng ngƣời dân sử dụng nhầm
dƣợc liệu hoặc mua phải dƣợc liệu đã bị chiết hết hoạt chất, kém chất lƣợng. Điều
này không những gây ảnh hƣởng đến sức khỏe của ngƣời bệnh, quyền lợi ngƣời
tiêu dùng mà còn gây mất lòng tin của mọi ngƣời khi sử dụng thuốc từ dƣợc liệu
nói chung, gây tổn hại cho ngành Y tế và Kinh tế của đất nƣớc.
Thông thƣờng các phƣơng pháp đƣợc sử dụng để phân tích hàm ginsenosid
Rg1 và Rb1 bao gồm: các phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS), điện di mao
quản (CE), sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPTLC),
sắc ký bản mỏng hiệu năng cao (HPTLC)... ở Việt Nam phƣơng pháp đƣợc sử dụng
chủ yếu là phƣơng pháp HPLC . Phƣơng pháp HPLC đƣợc áp dụng tại viện Kiểm
Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thức Phẩm Quốc Gia để định tính và định lƣợng
ginsenosid trong thực phẩm chức năng có chứa nhân sâm. Tuy nhiên chƣa có tiêu
chuẩn về việc định lƣợng ban hành ở Việt Nam. Do vậy việc áp dụng phụ thuộc
vào điều kiện phịng thí nghiệm cụ thể. Ngồi ra, phƣơng pháp HPTLC cho thấy
tiềm năng áp dụng để kiểm tra nhanh chất lƣợng của nhân sâm và các sản phẩm từ
3


sâm. Do vậy chúng tôi lựa chọn đề tài nghiên cứu với hi vọng xây dựng một
phƣơng pháp nhằm so sánh, kiểm chứng phƣơng pháp phân tích. Xuất phát từ
những yêu cầu trên, chúng tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu phƣơng pháp xác
định một số ginsenosid trong thực phẩm chức năng chứa nhân sâm (Panax

Ginseng)”.
Mục tiêu nghiên cứu:
 Xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thời hai ginsenosid (Rg1 và Rb1)
bằng kỹ thuật HPTLC và HPLC.
 Thẩm định phƣơng pháp đã đã xây dựng theo các tiêu chí của thế giới.
 Áp dụng triển khai phân tích một số mẫu thực phẩm chức năng chứa nhân
sâm trên thị trƣờng Hà Nội.

4


CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về nhân sâm và hoạt chất trong nhân sâm
1.1.1. Giới thiệu chung về nhân sâm
Bộ phận thƣờng sử dụng là rễ củ đã đƣợc phơi hay sấy khô của Nhân sâm
(Panax ginseng C.A. Meyer) thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae). Họ Nhân sâm
(Araliaceae Juss.) cịn có tên gọi khác là họ Ngũ gia bì. Hầu nhƣ tất cả các loài
trong họ nhân sâm (Araliaceae) đều đƣợc sử dụng làm thuốc trong Y học cổ truyền
ở nhiều nƣớc Á-Âu; đặc biệt là ở các nƣớc Đông-Bắc Á. Sâm trồng gọi là viên
sâm, sâm mọc hoang gọi là sơn sâm.
Viên sâm: Sâm trồng, phơi hoặc sấy khơ, rễ cái có hình thoi hoặc hình trụ
trịn, dài khoảng 3 - 15 cm, đƣờng kính 1 - 2 cm, mặt ngoài màu vàng hơi xám,
phần trên hoặc toàn bộ rễ có nếp nhăn dọc rõ, có khía vân ngang, thô, không liên
tục, rải rác và nông. phần dƣới có 2 - 3 rễ nhánh và nhiều rễ con nhỏ, dài, thƣờng
có mấu dạng củ nhỏ khơng rõ. Thân rễ (Lô đầu) sát ở đầu rễ, dài 1 - 4 cm, đƣờng
kính 0,3 - 1,5 cm, thƣờng cong và co lại, có rễ phụ (gọi là Đinh) và có vết sẹo thân,
trịn, lõm, thƣa (gọi là Lơ uyển). Chất tƣơng đối cứng, mặt bẻ màu trắng hơi vàng,
có tinh bột rõ, tầng phát sinh vòng tròn, màu vàng hơi nâu, vỏ có ống tiết nhựa,
dạng điểm, màu vàng nâu và những kẽ nứt dạng xuyên tâm. Mùi thơm đặc trƣng, vị
hơi đắng và ngọt.

Hồng sâm: Hấp, sấy và phơi khơ rễ viên sâm thu đƣợc Hồng sâm; Hồng sâm
có dạng rễ cái hình thon hoặc hình trụ, dài khoảng 3 - 15 cm, đƣờng kính 1 - 2 cm,
mặt ngồi trong mờ, màu nâu hơi đỏ, đơi khi có một vài vết đốm màu nâu hơi vàng
thẫm, có rãnh dọc, vân nhăn và các vết sẹo rễ con; phần đầu rễ cái có các vịng trịn
gián đoạn, khơng rõ nét, phần đuôi rễ cái mang 2-3 rễ nhánh vặn xoắn, chéo nhau
và nhiều rễ con cong queo, hoặc chỉ mang những vết sẹo thân, trịn, lõm (Lơ uyển);
một số thân rễ mang 1 - 2 rễ phụ, còn nguyên dạng hoặc đã gẫy (gọi là đinh). Chất
cứng và giòn, mặt bẻ gẫy nhẵn, tựa nhƣ sừng. Mùi thơm đặc trƣng, vị ngọt và hơi
đắng.
5


Sơn sâm: Nhân sâm mọc hoang, phơi hay sấy khô. Dƣợc liệu là rễ cái, dài
bằng hoặc ngắn hơn thân rễ, có hình chữ V, hình thoi hoặc hình trụ, dài 2 - 10 cm,
mặt ngoài màu vàng hơi xám, có vân nhăn dọc, đầu trên có các vịng vân ngang,
trũng sâu, dày đặc, thƣờng có 2 rễ nhánh, các rễ con trơng rõ ràng, mảnh dẻ, nhỏ
sắp xếp có thứ tự; có mấu nổi lên rõ gọi là “mấu hạt trân châu”. Thân rễ mảnh dẻ,
nhỏ, dài, bộ phận trên có các vết sẹo thân, dày đặc, các rễ phụ tƣơng đối dày đặc,
trơng tựa nhƣ hình hạt táo.
Nhân sâm mọc hoang và đƣợc trồng ở đông bắc Trung quốc, Triều Tiên, Liên
xô cũ. Việc trồng trọt nhân sâm rất công phu, sau 5-6 năm mới thu hoạch. Đất phải
tốt. Cây ƣa bóng râm. Thu hoạch vào mùa xuân và mùa thu, rễ củ đƣợc rửa sạch,
phơi nắng nhẹ, hoặc sấy nhẹ đến khô. Ngƣời ta cho rằng loại mọc hoang có giá trị
hơn loại trồng. Hiện nay nƣớc ta chƣa trồng đƣợc, còn phải nhập nhân sâm của
nƣớc ngồi.
Hiện nay các nhà khoa học đã tìm ra trong nhân sâm có chứa nhiều thành
phần khác nhau, tuy nhiên ginsenosid, chính là thành phần quyết định tác dụng
của nhân sâm. Đây chính là chất có khả năng tạo ra những ảnh hƣởng tích cực
đối với sức khỏe.
1.1.2. Tác dụng đặc trƣng của nhân sâm

Theo y học cổ truyền nhân sâm có cơng dụng: Đại bổ ngun khí, ích huyết,
kiện tỳ ích phế, sinh tân, an thần ích trí. Chủ trị: Khí hƣ muốn thốt, chân tay lạnh,
mạch vi, tỳ hƣ, kém ăn, phế hƣ ho suyễn; tân dịch thƣơng tổn, miệng khát nƣớc, nội
nhiệt tiêu khát, đái tháo, bệnh lâu ngày gầy yếu, tâm hồi hộp, suy tim kiệt sức, hay
choáng ngất. Thành phần hoạt chất của ginsenosid trong nhân sâm có tác dụng đặc
trƣng khác nhau đƣợc tóm tắt trong bảng 1.1

6


Bảng 1.1. Tác dụng đặc trưng của từng loại ginsenosid
Tác dụng đặc trƣng

Ginsenosid
Ro

Phân giải rƣợu, chống viêm gan và phục hồi hƣ tổn gan.

Rb1

Là Saponin có thể kiểm chế hệ thống thần kinh trung ƣơng
làm dịu cơn đau, bảo vệ tế bào gan.

Rb2

Ngăn ngừa, hạn chế bệnh tiểu đƣờng, phòng chống xơ cứng
gan, đẩy nhanh khả năng hấp thụ của tế bào gan.

Rc

Làm dịu cơn đau, tăng tốc độ tổng hợp protein.
Ức chế sự tăng trƣởng của tế bào ung thƣ, ngăn cản hoặc hạn
chế sự phát triển của ung thƣ vú

Rd

Đẩy nhanh hoạt động của vỏ tuyến thƣợng thận

Re

Bảo vệ gan, làm tăng tốc độ tổng hợp của các tế bào tủy.

Rf

Làm dịu cơn đau trong các tế bào não

Rg1

Khả năng gây hƣng phấn thần kinh trung ƣơng, chống và phục
hồi mỏi mệt, cải thiện trí nhớ, tạo DNA, RNA, kích hoạt
protease.

Rg2

Hạn chế sự gắn kết các tiểu cầu máu, phục hồi trí nhớ, tăng
khả năng lƣu thơng máu lên não, kéo dài thời gian sống của tế
bào.

Rh1

Bảo vệ gan, hạn chế khối u, ngăn chặn gắn kết tiểu cầu máu.

Rh2

Ức chế các tế bào ƣng thƣ, hạn chế khối u phát triển

1.1.3. Vài nét về nhóm hoạt chất ginsenosid
Thành phần chủ yếu trong rễ sâm là saponin triterpen. Khi thuỷ phân các
saponin này thu đƣợc 3 loại sapogenin là: acid oleanolic, 20 (s) protopanaxadiol và
20 (s) protopanaxatriol, hai loại sau có cấu trúc damaran. Các Saponin trong Nhân
sâm gọi là ginsenosid đƣợc phân loại dựa vào cấu trúc của ba sapogenin trên.
Saponin còn gọi là saponosid là một nhóm glycosid gặp rộng rãi trong thực vật, đơi
khi trong động vật (Hải sâm, cá sao). Tuy nhiên Saponin ở Nhân sâm có cấu tạo hố

7


học khác so với giới thực vật khác, để phân biệt sự khác biệt này ngƣời ta gọi là
Ginsenosid là từ ghép của Nhân sâm (ginseng) + glicozit (glycosid).
Hầu hết các ginsenosid có cấu trúc dammarane triterpenoid với bộ khung gồm
bốn vòng steroid cố định. Nhiều gốc đƣờng khác nhau (ví dụ nhƣ glucose,
rhamnose, xylose và arabinose) gắn ở vị trí C-3, C-6 hoặc C-20. Ginsenosid đƣợc
đặt tên là 'Rx', với 'R' là viết tắt của gốc và 'x' mô tả mức di động của chúng trên
các tấm sắc ký lớp mỏng, tính phân cực giảm từ chỉ số "một" đến "h".Ví dụ, Ra là
một hợp chất phân cực ít nhất và Rb phân cực hơn so với Ra... Độ phân cực của các
ginsenosid dẫn đến khả năng phân tách của của các ginsenosid cũng khác nhau
đƣợc minh họa trên hình 1.1

Hình 1.1. Mức di động của các ginsenosid 'Rx' trên tấm sắc ký lớp mỏng

Chất lƣợng và thành phần của ginsenosid trong cây nhân sâm bị ảnh hƣởng
bởi các yếu tố nhƣ: loài, tuổi, bộ phận của cây, phƣơng pháp canh tác, mùa thu
hoạch và phƣơng pháp bảo quản. Tổng hàm lƣợng Saponin trong nhân sâm là tỷ lệ
thuận với độ tuổi của nó, đạt tới mức đỉnh điểm vào khoảng sáu tuổi.
Hợp chất Saponin thƣờng đƣợc cấu tạo từ hai phần:
 Phần đƣờng : glycol, phổ biến là D-glucose, D-galactose, L-arabinose, acid
galactunoic, acid D-glucuronic...
8


 Phần phi đƣờng : aglycol ( còn gọi là Sapogenin), là phần chính quyết định
hoạt tính của hợp chất Saponin.
Phần aglycol của Saponin có trong nhân sâm đƣợc chia thành ba loại:
protopanaxadiol, protopanaxatriol và oleanane. Trong đó, protopanaxadiol và
protopanaxatriol là những Saponin triterpenoid tetracyclic có cấu trúc dammarane,
cịn oleanane là Saponin triterpenoide pentacylic. Những hoạt tính sinh học rất đặc
biệt của nhân sâm là do những Saponin có cấu trúc dammarane mang lại. Cấu trúc
các Saponin có aglycon là protopanaxadiol đƣợc minh họa trong hình 1.2, 1.3, 1.4
và bảng 1.2, 1.3, 1.4
21
R2O
OH

20S
12
19
1
3

10

15

8
7

5

27

17

11 18 13
14

30

A

R1O

29

28

Hình 1.2. Cấu trúc các Saponin có aglycon là protopanaxadiol
Bảng 1.2. Các Saponin có aglycon là protopanaxadiol

R1=R2=H: 20(S)-protopanaxadiol
Tên

Ginsenosid-Rb1

R1
G1c2-G1c

R2
G1c6-G1c

Ginsenosid-Rb2

G1c2-G1c

Glc6-Ara(p)

Ginsenosid-Rb3
Ginsenosid-Rc

G1c2-G1c
G1c2-G1c

Glc6-Xyl
Glc6-Ara(f)

Ginsenosid-Rd
Ginsenosid Rh1

G1c2-G1c
Glc2-Rha

Glc

Glc

glc = glucose; ara(p) = arabinose trong dạng pyranose;
ara(f)= arabinose trong dạng furanose;

9


21
R2O
OH

20S
12
19

15

14
9

1

8

10
3

27

17

11 18 13

5

7

30

B

HO

29

28

OR1

Hình 1.3. Cấu trúc Saponin có aglycon là protopanaxatriol
Bảng 1.3. Các Saponin có aglycon là protopanaxatriol
R1=R2=H: 20(S)-protopanaxatriol
Tên
R1
R2
Ginsenosid-Re
Glc2-Rha
G1c
2

Ginsenosid-Rf
G1c -G1c
H
Ginsenosid Rgl
Ginsenosid-Rh1

Glc
G1c

Glc
H

Ginsenosid-Rg1

G1c2-G1c

Glc6-Xyl

rha = rhamnose;

Hình 1.4. Saponin với aglycon là acid oleanolic

10


Bảng 1.4. Saponin với aglycon là acid oleanolic

Tên

R1

R2

Ginsenosid R0

Glc A2- Glc

G1c

glc = glucose;
1.1.4. Cơng thức cấu tạo và tính chất vật lý của ginsenosid Rg1 và Rb1
a. Công thức cấu tạo của ginsenosid Rb1
Chất này có tên theo IUPAC: (3β,12β)-20-{[6-O-(β-D-glucopyranosyl)-β-Dglucopyranosyl]oxy}-12-hydroxydammar-24-en-3-yl

2-O-β-D-glucopyranosyl-β-

D-glucopyranoside. Cấu tạo chi tiết đƣợc biểu diễn trong hình 1.5

Hình 1.5. Công thức cấu tạo của ginsenosid Rb1
- Công thức phân tử: C54H92O23
- Khối lƣợng phân tử: 1109,295g/mol
- Nhiệt độ nóng cháy 197 ~ 1980C
- Độ tan: Dễ tan trong nƣớc (H2O), MeOH (MeOH), alcohol, pyridine, và
dimethyl sulfoxide (DMSO), không tan trong diethyl ether và benzen.
b. Công thức cấu tạo của ginsenosid Rg1
Chất này có tên theo IUPAC: (3β,6α,12β)-20-(β-D-Glucopyranosyloxy)-3,12dihydroxydammar-24-en-6-yl β-D-glucopyranoside. Cơng thức cấu tạo đƣợc biểu
diễn chi tiết trong hình 1.6

11

Hình 1.6. Cơng thức cấu tạo của ginsenosid Rg1

- Cơng thức: C42H72O14
- M: 801,013 g/mol.
- Nhiệt độ nóng chảy 194 ~ 1960C
- Độ tan: Dễ tan trong nƣớc (H2O), methanol (MeOH), pyridime. Ít tan
trong ethyl acetat, cloroform. Khơng tan trong diethyl và benzen.
1.2. Tổng quan về các phƣơng pháp phân tích ginsenosid
Ginsenosid là đối tƣợng phân tích có thành phần nền phức tạp. Thơng thƣờng,
trong ginsenosid khơng chỉ có một chất, một hỗn hợp chất có tính chất khác nhau,
mà thƣờng chứa một nhóm các chất có tính chất tƣơng đối giống nhau. Các chất
trong cùng một nhóm chất đều giống nhau về khung cơ bản, khác nhau một vài
nhóm thế hoặc các thành phần khác, tức là khác nhau khơng nhiều về tính chất vật
lý, tính chất hố học. Chính vì vậy, việc sử dụng các phƣơng pháp quang phổ (UVVIS, IR, huỳnh quang,…) để phân tích định lƣợng một thành phần trong dƣợc liệu
gặp nhiều khó khăn và hầu nhƣ là không thể thực hiện đƣợc.
Sắc ký là một trong những phƣơng pháp xác định hàm lƣợng các chất thơng
dụng nhất hiện nay trong phân tích hiện đại. Khác với các phép định lƣợng hoá
học, các phƣơng pháp sắc ký cho phép định lƣợng riêng từng chất cụ thể trong một
hỗn hợp, phù hợp với quá trình phân tích các mẫu dƣợc liệu. Ngƣời ta có thể định
lƣợng một chất hay định lƣợng đồng thời nhiều chất trong một lần định lƣợng nếu
chọn đƣợc điều kiện thích hợp. Các phƣơng pháp sắc ký thƣờng dùng là: sắc ký khí
(GC), sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký điện di mao quản, sắc ký lỏng hiệu năng cao
12


(HPLC), sắc kí bản mỏng hiệu năng cao (HPTLC). Trong đó, sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC) và sắc ký bản mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là phƣơng pháp có nhiều
ứng dụng trong nghiên cứu các hợp chất tự nhiên nói chung và nghiên cứu dƣợc
liệu nói riêng. Ƣu điểm lớn nhất của phƣơng pháp này là có thể phân tích nhiều loại

hợp chất khác nhau, nên khả năng phân tích rộng hơn nhiều so với sắc ký khí
(thƣờng dùng với các đối tƣợng dễ bay hơi). Với pha tĩnh ngày càng đƣợc hoàn
thiện và đổi mới để nâng cao hiệu năng tách, detector ngày càng nhạy, ngày nay có
thể dễ dàng phân tích các chất trong hỗn hợp ở mức ppm tới ppb, thậm chí ppt để
phân tích các chất từ phân cực tới không phân cực, từ các chất bay hơi tới các chất
không bay hơi, từ các chất trung tính tới các chất điện ly,…Trong lĩnh vực dƣợc
liệu, HPLC thƣờng đƣợc sử dụng nhất trong định lƣợng riêng lẻ các chất trong hỗn
hợp phức tạp của dịch chiết dƣợc liệu bằng việc so sánh diện tích pic với chất
chuẩn trong cùng điều kiện phân tích. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao có
nhiều tác giả đã sử dụng phƣơng pháp HPLC để phân tích ginsenosid Rg1 và Rb1
trong dịch sinh học [17][30][34].
Năm 1996, Trong một nghiên cứu William A.Court và cộng sự [17] đã nghiên
cứu xác định đồng thời (Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Ro, Rg1) ginsenosids trong Panax
quinquefolium bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng pha đảo RP-HPLC. Thể tích bơm
mẫu 5 µl, cột Waters Symmetry C18 (150mmì3,9 mm, 5àm), tin ct C18 tng
ng . Tc độ dịng 1,15 ml/phút và bƣớc sóng hấp thụ 203 nm. Pha động là dung
dịch đệm phốt phát (A), dung dịch acetonitrile (dung dịch B) và H2O (dung dịch
C), Chƣơng trình gradient pha động nhƣ sau: 0-15 phút: 81%-79% A, 19% - 21%
B; 15-24,5 phút: 79% - 73,7% A, 21% - 26,3% B; 24,5-29 phút: 73,7% - 73% A,
26,3% - 27% B; 29-43phút: 73% - 66% A, 27% - 34% B; 43-47 phút, 66 -64%A,
34-36%B; 47-54 phút : 54-57 %A, 36-43% B; 54-55 phút: 57-0%A, 43-85%B, 015%C; 55-59 phút 85%B, 15%; 81%A, 19%B. Cách 2: Nhóm tác giả sử dụng vòi
phun tự động 1040A, detecter diode array, cột tách carbohydrate cartridge(250 x
4,6mm) và cột bảo vệ cùng loại. Với cùng bƣớc sóng và thể tích bơm cột nhƣ trên.
Tốc độ dòng 1,5ml/phút. Pha động là dung dịch H2O (A) và acetonitril (B).
13


Chƣơng trình gradient pha động nhƣ sau: 0-28 phút, 9-19%A, 91-81%B; 28-30
phút, 19%A, 81%B; 30-35 phút, 19-22%A, 81-78%B; 35-40 phút, 22-25%A, 7875%B; 40 – 41 phút, 25-9%A, 75-91%B. Độ đúng của Rg1 1,2%, Rb1 là 3,8%.
Năm 2003, trong một nghiên cứu khác Aik-jiang Lau cùng cộng sự [24] đã

phân tích các saponin trong Tam thất thơ và hấp chín sử dụng phƣơng pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao, sử dụng pha đảo với detector diode array định lƣợng đồng thời
(Rg1, Re, R1, Rb1, Rc, Rd). Hệ sử dụng bơm 1100 , van bơm mẫu (20 µl) , cột pha
đảo Waters Symmetry C18 (250x4,6 mm, 5µm). Phân tích pha động chế độ
gradient, nƣớc (A) và acetonitril (B). Dung dịch B từ 20% đến 100% trong thời
gian 80 phút. Tốc độ dòng của pha động 1ml/phút, thể tích bơm mẫu 5µl và duy
trì nhiệt độ cột ở 350C. Detector diode array quét trong khoảng 190nm - 400nm,
bƣớc sóng hấp thụ là 203nm. Độ đúng trong ngày, khác ngày RSD <4%; Hiệu
suất thu hồi 97-102%; Giới hạn phát hiện LOD của Rb1, Rg1 lần lƣợt là
0,011mg/ml; 0,010mg/ml. Giới hạn định lƣợng LOQ của Rb1 và Rg1 lần lƣợt là
0,036mg/ml; 0,033mg/ml.
Năm 2007, Su Na Kim và cùng cộng sự [22] đã nghiên cứu định lƣợng đồng
thời 14 Ginsenosid trong nhân sâm Hàn Quốc bằng phƣơng pháp HPLC - ELSD.
Hệ sử dụng bơm L-62020 (Hitachi), cột tách Zorbax SB-Aq C18 (150-4,6 mm, cỡ
hạt 5µm), bằng dung dịch rửa giải nƣớc (A), dung dịch acetonitril (B) của MeOH
và 200 mM axit phosphoric với diethyl amin 0,1M và sodium 1-heptane sulphonate
12 mM (1:4, v/v). Tốc độ dòng của pha động 1 ml/phút Phân tích pha động chế độ
gradient, dung dịch B từ 21% đến 100% trong thời gian 61 phút. Rửa cột 100%
B với thời gian 10 phút. ELSD đã đƣợc giữ ở nhiệt độ 700C và máy phun khí nitơ
đã đƣợc điều chỉnh để 2,5bar. Detector diode array quét trong khoảng 190nm 203nm, bƣớc sóng hấp thụ là 203nm. Độ đúng trong ngày Rg1 2,62%, Rb1
3,94%, độ đúng khác ngày Rg1 2,19%, Rb1 3,71%; Hiệu suất thu hồi Rg1
100,46%, Rb1 là 104,88%. Giới hạn phát hiện LOD của Rb1, Rg1 lần lƣợt là
0,2µg, 0,15µg. Giới hạn định lƣợng LOQ của Rb1 và Rg1 lần lƣợt là 0,40µg,
0,3µg.
14


Năm 2009, Ying Shi và cộng sự [30] đã xác định đồng thời chín (Rg1, Re, Rf,
Rb1, Rb3, Rg3, 20(S)-F1, 20(S)-F2, 20(S)-Rh2) ginsenosids trong thực phẩm chức
năng sử dụng hệ thống HPLC, sử dụng cột tách C18 với chiều dài 250mm, 150mm

kết quả cho thấy khi sử dụng cột tách cột Gemini 110A (250 mm × 4,6 mm, kích
thƣớc hạt 5 µm) thời gian phân tích ít nhất 1giờ trong khi cột tách Inertsil ODS2
(150 mm × 4,6 mm, kích thƣớc hạt 5 µm) có thể đạt đƣợc một sự tách biệt cơ bản
trong thời hạn 30phút. Cột bảo vệ (4 mm ì 3,0 mm, kớch thc ht 5 àm). Thể
tích bơm mẫu 5 µl. Pha động là hỗn hợp dung dịch acetonitrile (dung dịch A) và
nƣớc (dung dịch B), tốc độ dịng 1ml/phút. Phân tích pha động chế độ gradient,
dung dịch A từ 21% đến 70% trong thời gian 30 phút. Nhiệt độ cột tách là 100C,
detector diode array quét trong khoảng 190nm - 203nm, bƣớc sóng hấp thụ là
203nm. Độ đúng trong ngày Rg1 0,96%, Rb1 1,4%, độ đúng khác ngày Rg1
2,7%, Rb1 6,9%. Giới hạn phát hiện LOD của Rb1, Rg1 lần lƣợt là 7,0ng; 14ng.
Giới hạn định lƣợng LOQ của Rb1 và Rg1 lần lƣợt là 120mg/kg; 230mg/kg.
Renée J. Vanhaelen-Fastré và cộng sự [32] đã sử dụng phƣơng pháp HPTLC.
Bảng mỏng Silica gel 60 F254 ( 20 mm x 20mm). Pha động sử dụng là hỗ hợp dung
môi:1,2-dicloetan : etanol : MeOH : nƣớc (56,8:19,2:19,2:4,8). Quét ở bƣớc sóng
275mm với tốc độ 5mm/giây. Đƣờng chuẩn tuyến tính với nồng độ ginsenosid Rg1,
Rb1 từ 0,1 - 5µg với Rb1 (r =1), Rg1 (r=0,999). Giới hạn phát hiện 10ng/10mm,
giới hạn định lƣợng LOQ từ 30 – 50ng/10mm.
Nhận xét: Hiện nay, trên thế giới đã có một số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật
HPLC đã đƣợc dùng để phân tích các chất thuộc nhóm Ginsenosid nhƣ: HPLC –
ESI – MS/MS, UPLC,… các kỹ thuật này cho kết quả tốt tuy nhiên các kỹ thuật
này đều hiện đại, đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền và vận hành phức tạp. Ở Việt Nam
hiện nay trang thiết bị cũng nhƣ điều kiện cịn khó khăn nên khó có thể áp dụng
rộng rãi ở các đơn vị kiểm nghiệm và sản xuất. Kỹ thuật HPLC, HPTLC khắc phục
đƣợc những nhƣợc điểm trên vì vậy chúng tơi chọn phƣơng pháp này để phân tích
các thành phần hóa học ginsenosid trong các thực phẩm chức năng chứa nhân sâm.

15


1.3. Các phƣơng pháp xử lý mẫu

Một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả của phƣơng pháp định lƣợng
đó là phƣơng pháp xử lý mẫu.
J.B. Wan cùng cộng sự [33] đã nghiên cứu quá trình xử lý mẫu bột nguyên liệu
khô theo cách: cân 0,5g mẫu bột khô cho vào ống ly tâm 50ml, thêm 30 ml MeOH
lắc đều trong 30 giây trƣớc khi rung siêu âm 2 giờ tại nhiệt độ phòng, để trong bồn
siêu âm. Sau khi ly tâm với tốc độ 2000 vòng/5 phút, dung dịch đƣợc gạn đƣợc định
mức vào bình 50ml, lọc dung dịch qua màng lọc 0,45µm trƣớc khi đƣa vào hệ thống
HPLC.
Ngồi ra nhóm tác giả [11,19,33] sử dụng hệ thống chiết áp suất lỏng Dionex
ASE 200 (Dionex Corp, Sunnyvale, CA, USA) trong điều kiện tối ƣu. Cân 0,5g mẫu
bột đặt vào cột chiết 11ml làm bằng thép không gỉ. Điều kiện tối ƣu: kích thƣớc hạt
0,3 -0,45µm, dung mơi MeOH, nhiệt đơ 1500C, áp suất 6,895 × 103 Mpa, thời gian
là 15 phút và một q trình khép kín. Dung dịch chiết chuyển vào bình định mức
50ml [19,33] hoặc định mức 25ml [15], định mức bằng MeOH. Lọc dung dịch qua
màng lọc 0,45µm[33]; 0,22µm [15,19] trƣớc khi bơm vào hệ thống HPLC.
Trong một nghiên cứu khác Aik-Jiang Lau [24] cùng cộng sự đã nghiên cứu
xử lý 1g mẫu bột, thêm 10ml MeOH 70%, rung siêu âm 230V, trong 20 phút, lọc.
Quá trình chiết đƣợc lặp lại 2 lần. Gạn lấy dung dịch cô quay ở 400C. Phần cặn thu
đƣợc đƣợc hòa tan trong 5ml MeOH 70% và đƣợc lọc qua màng 0,45µm trƣớc khi
mang đi phân tích.
Dirk Steinmann, Markus Ganzera [31] tiến hành xử lý loại dầu viên nang mềm
trƣớc khi phân tích: cân 6g viên nang cho vào bình. Thêm 25 ml dung môi MeOH
40% và 25 ml hexan, lắc trong 30 phút. Chiết lấy phần nƣớc lọc bên dƣới bằng bình
chiết và đƣợc lọc qua màng lọc 0,45µm.
Lie Li cùng cộng sự [26] xử lý 3g bột khô chiết bằng dung dịch 5ml MeOH
80% thêm 1ml dung dịch nội chuẩn 2,5mg/ml, rung siêu âm ở các thời gian khác
nhau 30, 60, 90 và 120 phút. Kết quả cho thấy chiết siêu âm 120 phút tốt nhất và
gần nhƣ khơng có saponin nào cịn thấy lại trong phần thải.
16

Wei Shi cùng cộng sự [29] chiết kết hợp với lị vi sóng. Cân 5g bột sâm cho
vào bình, thêm vào 50ml MeOH 70% ở áp suất 500kPa, thời gian 15 phút. Mẫu
đƣợc để nguội ở nhiệt độ phòng. Gạn dung dịch chuyển vào bình cơ quay 100ml.
Cơ quay chân khơng ở 600C. Phần cịn lại hịa tan trong 30ml nƣớc. Dung dịch đầu
chiết lặp hai lần với 25 ml ether, các lớp nƣớc sau đó đƣợc chiết lặp ba lần với 20
ml nƣớc bão hịa n-butanol. Sau đó, cơ quay chân không cho bay hơi hết n-butanol
và phần cặn đƣợc hòa tan trong 10 ml MeOH. Các dung dịch mẫu đƣợc lọc qua một
màng lọc 0,45 µm trƣớc khi phân tích.
Ngồi ra các tác giả [33] đã xử lý mẫu bằng cách chiết solhet
1.4. Tổng quan về kỹ thuật HPTLC
1.4.1. Sắc ký lớp mỏng
Sắc kí giấy và sắc kí lớp mỏng đã đƣợc xây dựng, phát triển và ứng dụng từ
lâu. Tuy nhiên hiện nay sắc kí giấy ít đƣợc sử dụng. Phổ biến nhất hiện nay là sắc
kí lớp mỏng. Ở nƣớc ta phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng đã đƣợc sử dụng rộng rãi, đã
có nhiều tài liệu, chuyên gia có kinh nghiệm về phƣơng pháp này.
Trong sắc kí mặt phẳng, q trình sắc kí đƣợc tiến hành trên một tờ giấy hay
một lớp bột rải đều và đƣợc giữ trên mặt một tấm kính, chất dẻo hay kim loại, ví dụ
nhơm. Bản thân lớp mỏng có thể là pha tĩnh hoặc chỉ là chất mang để giữ pha tĩnh
trên đó. Pha động là chất lỏng sẽ thấm và chạy trên lớp mỏng do tác dụng của lực
mao dẫn và đôi khi cả trọng lực và điện thế.
a. Nguyên tắc của SKLM
Cũng nhƣ tất cả các phƣơng pháp sắc ký khác, quá trình tách hỗn hợp các chất
bằng SKLM xảy ra khi cho pha động chuyển động qua pha tĩnh. Trong SKLM, pha
tĩnh đƣợc rải thành một lớp mỏng trên một giá đỡ phẳng. Dƣới tác dụng của lực
mao quản, pha động thấm theo lớp mỏng đi qua điểm xuất phát – nơi hỗn hợp chất
cần phân tích đã đƣợc đƣa lên bản mỏng. Trong q trình di chuyển của pha động
qua lớp mỏng chất hấp thụ (pha tĩnh), nhờ các quá trình hấp thụ và giải hấp thụ
đƣợc lặp đi lặp lại và do hệ số phân bố khác nhau mà những chất khác nhau di
chuyển theo hƣớng chuyển động của pha động với các tốc độ khác nhau. Kết quả là

17


mỗi chất trong hỗn hợp phân tích có thể sẽ đƣợc tách riêng ra ở các vị trí khác nhau
trên bản mỏng. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích đƣợc hịa tan trong một
dung mơi thích hợp và đƣợc hút lên bản sắc ký nhờ lực mao dẫn tách dung dịch thí
nghiệm dựa trên độ phân cực của các thành phần trong dung dịch.
Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số lƣu
giữ Rf. Trị số của nó đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất
phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:
Rf
dR: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích.
dM: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động( đo trên
cùng đƣờng đi của vết, tính bằng cm).
Rf: Có giá tr ị dao động từ 0-1.
Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thƣớc 10–30µm đƣợc rải đều và kết dính
thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250 µm trên giá đỡ hình vng. Bản mỏng
có sẵn trên thị trƣờng có kích thƣớc khác nhau thƣờng 5÷20cm, nhiều khi có đƣa
thêm chất huỳnh quang khơng tan vào pha tĩnh để dễ phát hiện chất phân tích. Chất
hấp phụ thƣờng dùng nhất là silicagel.
Pha động dùng cho TLC rất thay đổi, tùy thuộc vào cơ chế sắc ký. Để tăng
cƣờng rửa giải thƣờng dùng 2 dung môi. Nguyên lý chia tách dựa vào hệ số phân
bố giữa 2 pha. Tuy nhiên, lựa chọn tối ƣu hóa sắc ký chủ yếu dựa vào kinh nghiệm.
b .Kỹ thuật TLC


Đƣa chất phân tích lên bản mỏng:
Lƣợng hỗn hợp các chất đƣợc đƣa lên bản mỏng có ý nghĩa rất quan trọng đối

với hiệu quả tách sắc ký, ảnh hƣởng đến giá trị Rf, lƣợng mẫu đƣa lên bản mỏng

khoảng 0,1 - 50µg đƣợc pha trong dung mơi thích hợp. Thể tích dung dịch chấm 1
– 5 µL đối với với sắc ký phân tích và 0,1 – 0,2µL đối với sắc ký điều chế.

18