Sử dụng một số chỉ thị phân tử trong nghiên cứu tiến hóa các loài mang muntiacinae ở việt nam nhằm phục vụ bảo tồn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------

NGUYỄN VĂN THÀNH

SỬ DỤNG MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG
NGHIÊN CỨU TIẾN HĨA CÁC LỒI MANG
(MUNTIACINAE) Ở VIỆT NAM NHẰM
PHỤC VỤ BẢO TỒN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI - 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------

NGUYỄN VĂN THÀNH

SỬ DỤNG MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG
NGHIÊN CỨU TIẾN HĨA CÁC LỒI MANG
(MUNTIACINAE) Ở VIỆT NAM NHẰM
PHỤC VỤ BẢO TỒN

Chuyên ngành

: Di truyền học

Mã số

: 60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Cán bộ hướng dẫn:

TS. Lê Đức Minh
PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Vân

HÀ NỘI - 2015


LỜI CẢM ƠN

Để hồn thành tốt luận văn này, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.
Lê Đức Minh cùng PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Vân, là những người đã trực tiếp
hướng dẫn và nhiệt tình chỉ bảo tơi trong suốt q trình học tập và nghiên cứu.
Thầy cô đã cho tôi rất nhiều kiến thức về chun mơn cũng như bồi đắp niềm
đam mê, tính sáng tạo trong q trình nghiên cứu. Bên cạnh đó, tơi cũng muốn
bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô giáo của Bộ môn Di truyền học,
Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện thuận lợi và
động viên tơi trong q trình học tập tại bộ môn, đã tạo điều kiện thuận lợi về
trang thiết bị và cơ sở vật chất cho tơi trong q trình học tập và thực hiện luận
văn.
Đồng thời tôi cũng gửi lời cám ơn chân thành tới các cán bộ thuộc Trung
tâm Nghiên cứu Tài nguyên và Môi trường, Đại học Quốc gia Hà Nội; cùng các
bạn đồng nghiệp đã giúp tôi thu thập, phân loại các mẫu vật quý giá để sử dụng
trong nghiên cứu này.

Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cám ơn chân thành tới gia đình, người thân,
bạn bè, những người đã ln ở bên cổ vũ và động viên tôi vượt qua mọi khó
khăn trong q trình học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, tháng 06 năm 2015
Học viên

Nguyễn Văn Thành


MỤC LỤC:
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

i

DANH MỤC CÁC HÌNH

ii

DANH MỤC CÁC BẢNG

iii

MỞ ĐẦU

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2

1.1. Tổng quan về nhóm Mang

2

1.1.1 Nhóm Mang trên thế giới

2

1.1.2 Nhóm Mang ở Việt Nam

4

2. Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên các chỉ thị phân tử

8

2.1. Phương pháp phân tử đánh giá đa dạng di truyền loài Mang sử dụng trong
nghiên cứu
8
2.2. Các phương pháp sử dụng để xây dựng cây lồi phát sinh

10

2.3. Phân tích thời gian tiến hóa

13

2.4. Gen chỉ thị sử dụng trong phân tích

13

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Vật liệu nghiên cứu

16
16

1.1. Mẫu vật nghiên cứu

16

1.2. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

16

1.3. Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR

17

1.4. Các thiết bị sử dụng cho nghiên cứu:

23

2. Phương pháp nghiên cứu

23

2.1. Tách chiết ADN tổng số

23

2.2. Phản ứng PCR

24

2.3. Điện di, tinh sạch và giải trình tự gen

26

2.4. Xây dựng cây phát sinh chủng loại và phân tích thời gian tiến hóa

27

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

31

1. Kết quả tách chiết ADN tổng số

31

2. Kết quả khuyếch đại gen bằng phản ứng PCR

32

3. Kết quả giải trình tự

34

4. Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loại

35


4.1. Nhánh A - Nhánh Mang Ấn Độ

36

4.2. Nhánh B

36

5. Kết quả phân tích thời gian tiến hóa
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

42
45

KẾT LUẬN

45

KIẾN NGHỊ

46

TÀI LIỆU THAM KHẢO

47

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

47

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

47


DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Nghĩa tiếng Anh

Nghĩa tiếng Việt

ADN

Deoxyribo nucleic acid

Axit deoxyribonucleic

bp

base pair

Cặp bazơ nitơ

EDTA

Ethylen Diamine Tetraacetic Acid

Axit ethylen diamin tetraaxetic

kb

kilobase(=1000bp)

Kilo bazơ

ML

Maximum Likelyhood

Hợp lý tối đa

MP

Maximum Parsimony

Tiết kiệm tối đa

mtDNA

mitochondrial DNA

Hệ gen ty thể

OD

Optical Density

Mật độ quang học

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp

rcf

relative centrifugal force

Lực ly tâm tương đối

nR

Number of root tree

Số cây có gốc

nU

Number of unroot tree

Số cây không gốc

unweighted pair group with

unweighted pair group with

arithmetic mean

arithmetic mean

UPGMA

i


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.

Mang Ấn Độ (M. vaginalis)

4

Hình 2.

Mang Vũ Quang (M. vuquangensis)

6

Hình 3.

Mang Trường Sơn (M truongsonensis)

7

Hình 4.

Bản đồ địa điểm các khu bảo tồn tiến hành thu mẫu

22

Hình 5.

Ảnh điện di ADN tổng số của một số mẫu xương trên gel
Agarose 1%, Marker 1kb

Hình 6.

Ảnh điện di ADN tổng số của một số mẫu da khô trên gel
Agarose 1%, Marker 1kb

Hình 7.

Ảnh điện di một số sản phẩm nhân phân đoạn gen cyt-b-1
(450bp) trên gel Agarose 1%, marker 100bp

Hình 8.

Ảnh điện di một số sản phẩm nhân phân đoạn gen cyt-b-2
(450bp) trên gel Agarose 1%, marker 100bp

Hình 9.

Ảnh điện di một số sản phẩm nhân phân đoạn gen ND4

(450bp) trên gel Agarose 1%, marker 100bp

Hình 10.

Ảnh điện di một số sản phẩm nhân phân đoạn gen G-fib
(450bp) trên gel Agarose 1%, marker 100bp

Hình 11.

Ảnh điện di sản phẩm PCR lần 1 và lần 2

Hình 12.

Tín hiệu bị nhiễu của các nucleotide đầu trong phản ứng
giải trình tự

Hình 13.

Cây phát sinh chủng loại thu được dựa trên dữ liệu gen
cytochrome b (1140bp) sử dụng phương pháp Bayesian

Hình 14.

31
31
32
32
33
33
33

34

38

Cây phát sinh chủng loại dựa trên dữ liệu kết hợp 3 gen
ty thể và 1 gen nhân (gồm 2431 bp, 218 vị trí có giá trị

41

thơng tin) sử dụng phương pháp Bayesian, MP, ML
Hình 15.

Cây phát sinh chủng loại thể hiện thời gian tiến hóa của
nhóm Mang

ii

44


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.

Danh sách các loài Mang trên thế giới

3

Bảng 2.

Số lượng cây khơng gốc và có gốc với số lượng taxa

10

từ 2 - 10
Bảng 3.

Danh sách và thông tin mồi sử dụng cho nghiên cứu

17

Bảng 4.

Thông tin mã số ngân hàng gen các trình tự cùng tên

18

mẫu, địa điểm thu mẫu
Bảng 5.

Thành phần phản ứng PCR

25

Bảng 6.

Chu trình nhiệt phản ứng PCR

25

Bảng 7.

Khoảng cách di truyền giữa các mẫu Mang

40

Roosevelt dựa trên dữ liệu kết hợp 4 gen Cyt-b, ND4,
16S, G - fibrinogen
Bảng 8.

Khoảng cách di truyền của các mẫu Mang lớn

42

Bảng 9.

Địa điểm thu các mẫu Mang lớn

42

Bảng 10.

Khoảng thời gian tiến hóa của các vị trí trên cây tiến

43

hóa

iii

MỞ ĐẦU
Việt Nam được biết đến là một đất nước đa dạng cao về hệ sinh thái, sơng ngịi,
cũng như hệ thống các loài động thực vật. Các vùng tự nhiên của Việt Nam có
nhiều lồi và nhiều trong số đó khơng tìm thấy ở nơi khác trên thế giới. Các nghiên
cứu nhằm tìm kiếm các lồi mới, đánh giá chi tiết về mức độ đa dạng của hệ thống
động thực vật ở Việt Nam đã và đang được tiếp tục thu hút sự quan tâm của các nhà
nghiên cứu. Tuy nhiên, vẫn cịn rất nhiều lồi ở Việt Nam chưa được nghiên cứu chi
tiết bởi nhiều khó khăn gặp phải trong quá trình nghiên cứu.
Cụ thể, trong 15 năm trở lại đây, năm lồi Mang (Muntiacus) đã được tìm thấy
ở Việt Nam dưới dạng loài mới hoặc được xác nhận là có ở trong nước [7 , 12 , 42].
Mặc dù vậy, vẫn chưa có các nghiên cứu chi tiết, đánh giá phân bố, đa dạng di
truyền cũng như quan hệ tiến hóa giữa các lồi Mang trên lãnh thổ Việt Nam. Điều
này một phần do tính quý hiếm, khó bắt gặp cùng tập tính nhút nhát của các loài
Mang. Ngoài ra, chúng đã được xếp vào hạng mục thiếu dữ liệu, sắp nguy cấp và
nguy cấp trong sách đỏ thế giới. Do đó, việc điều tra sử dụng các phương pháp
truyền thống có thể khơng đánh giá được chính xác mức độ đa dạng trong nhóm
này, vì những mẫu thu được từ điều tra thực địa hầu như không cho phép thực hiện
những nghiên cứu so sánh kỹ lưỡng về mặt hình thái. Trong khi đó, với sự phát
triển của sinh học phân tử trong những năm gần đây, những phương pháp sử dụng
ADN đã dần trở thành những công cụ hữu hiệu để điều tra tổng thể những lồi khó
bắt gặp và có thể giúp làm sáng tỏ những mối quan hệ tiến hóa của những lồi được
nghiên cứu. Trong hoàn cảnh này, việc nhận dạng sử dụng phương pháp thu mẫu
không trực tiếp dựa, và các chỉ thị phân tử ADN đối với các mẫu Mang hứa hẹn có
hiệu quả cao.
Vì vậy, chúng tơi thực hiện đề tài “Sử dụng một số chỉ thị phân tử trong
nghiên cứu tiến hóa các lồi Mang (Muntiacinae) ở Việt Nam nhằm phục vụ
bảo tồn” với mục đích đánh giá cụ thể mức độ đa dạng, cũng như phân bố, cùng
mối quan hệ tiến hóa của các lồi Mang ở Việt Nam.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về nhóm Mang
1.1.1 Nhóm Mang trên thế giới
Mang là một nhóm các lồi thú móng guốc thuộc họ hươu nai Cervidae, phân
họ Muntiacinae, giống Muntiacus; nhóm này hiện nay trên thế giới cho đến nay,
dựa theo dữ liệu thu được của sách đỏ thế giới (The IUCN red list of threatended
species) được xác định có 13 lồi (Bảng 1). Mang có cơ thể nhỏ, sống đơn độc hoặc
theo các nhóm nhỏ, mơi trường sống của chúng thường là các khu rừng xanh nhiệt
đới ở châu Á với độ cao tương đối lớn. Rất nhiều lồi Mang hiện đang bị đe dọa bởi
tình trạng săn bắn bất hợp pháp, cũng như tình trạng mất dần môi trường sống của
chúng [20 , 30].
Hiện nay, một vài loài Mang như Mang đen (Muntiacus crinifrons), Mang
Reeve (Muntiacus reevesi) đang được tập trung nghiên cứu, đánh giá [11 , 31 , 35].
Tuy nhiên, phần lớn các loài Mang khác đều chưa có các nghiên cứu cụ thể. Do đó,
thơng tin về các lồi này cịn rất ít, thậm chí một số lồi Mang đã khơng được phát
hiện cho đến cuối thế kỷ 20, đầu thế kỷ 21 (như Mang Roosevelt ở Việt Nam - Lào,
Mang Ghongshan ở tây nam Trung Quốc, Mang lớn ở vùng biên giới Việt Nam Lào) [30]. Loài Mang Roosevelt (M. rooseveltorum) từ sau khhi được mô tả năm
1932 rất hiếm khi được bắt gặp, cho đến năm 1999 được tái phát trở lại tại hiện tại
Lào, mặc dù vậy các mẫu tìm thấy chỉ là các mẩu xương nhỏ sọ [7]; và từ thời điểm
1999 cho đến nay chưa có cơng bố của nghiên cáo nào cho thấy sự xuất hiện của
loài này. Lồi Mang Putao (M. putaoensis) được mơ tả năm 1999 [6] có vùng phân
bố ở phía Bắc Myanmar có quan hệ rất gần với 2 lồi Mang khác có khu phân bố ở
trong dãy Trường Sơn là Mang Trường Sơn (M. truongsonensis) và Mang
Roosevelt (M. rooseveltorum). Ba loài này có hình thái nhỏ và nhiều đặc điểm khá
giống nhau kể cả về quan hệ di truyền [6 , 23]. Mang vàng Borneo (Muntiacus

2


atherodes) là loài đặc hữu ở Borneo. Trong suốt một thời gian dài, đã có sự nhầm
lẫn giữa lồi Mang vàng Borneo và loài Mang thường [30].
Bảng 1. Danh sách các loài Mang trên thế giới
STT

Tên loài

Phân bố

1

Muntiacus atherodes

Đảo Borneo (Brunei, Indonesia và Malaysia)

2

Muntiacus crinifrons

Trung Quốc

3

Muntiacus feaes

Myanmar, Thái Lan

4

Muntiacus gongshanensis

Trung Quốc, Myanmar

5

Muntiacus montanus

Indonesia

6

Muntiacus muntjak

Bruine, Indonesia, Malaysia, Thái Lan

7

Muntiacus vaginalis

8

Muntiacus puhoatensis

Việt Nam

9

Muntiacus putaoensis

Ấn độ, Myanmar

10

Muntiacus reveesi

Trung Quốc, Đài Loan

11

Muntiacus rooseveltorum

Lào, Việt Nam

12

Muntiacus truongsonensis

Lào, Việt Nam

13

Muntiacus vuquangensis

Lào, Việt Nam

Campuchia, Ấn Độ, Lào, Myanmar, Thái
Lan, Việt Nam, Trung Quốc.

Nhóm Mang hiện được các nhà tiến hóa rất quan tâm bởi sự đa dạng trong số lượng
nhiễm sắc thể giữa các loài Mang. Cụ thể, ở Mang thường, đây là cũng là lồi thú
có số lượng nhiễm sắc thể ít nhất với 2n = 6 ở giống cái và 2n = 7 ở giống đực;
Mang Trung Quốc (M. reevesi) có 2n = 46 ở cả hai giới, M. crinifrons 2n = 8 ở
giống cái và 2n = 9 ở giống đực, M. feae 2n = 13 ở giống cái và 2n = 14 ở giống
đực [44]. Tuy nhiên, cho đến nay, nguyên nhân của hiện tượng này còn chưa được
biết rõ.

3


1.1.2 Nhóm Mang ở Việt Nam
Hiện nay, Việt Nam được thống kê có 5 lồi Mang sinh sống [7 , 12 , 42] bao
gồm: Mang Ấn Độ (M. vaginalis) [42], Mang Pù Hoạt (M. puhoatensis) [10], Mang
Roosevelt (M. rooseveltorum), Mang Trường Sơn (M. truongsonensis) [36], Mang
Vũ Quang hay Mang lớn (Megamuntiacus vuquangensis hay Muntiacus
vuquangensis) [40 , 43]. Sau đây là một số mơ tả về 5 lồi Mang được xác định là
có thể có mặt ở Việt Nam.
1.1.2.1. Mang Ấn Độ (M. vaginalis)

Hình 1. Mang Ấn Độ (M. vaginalis)
Mang Ấn Độ (M. vaginalis) hay Mang thường (common muntjac) là tên gọi
thơng thường của lồi Mang này (Hình 1). Lồi này, con đực có sừng nhỏ dài
khoảng 15cm và chỉ có duy nhất 1 nhánh. Mang Ấn Độ đơi lúc cịn được gọi là
“Mang sủa” bởi tiếng kêu đặc trưng của nó khi có nguy hiểm. Những bằng chứng
cổ sinh vật học cho thấy Mang Ấn Độ đã xuất hiện ít nhất là từ cuối kỷ Pleistocene
cách đây 12.000 năm. Loài này thường bị săn bắn để lấy da và thịt. Mang Ấn Độ là
lồi có số lượng cá thể cũng như vùng phân bố rộng nhất trong số các loài Mang.
Trong một nghiên cứu các mẫu từ Ấn Độ, Lào, Việt Nam, Cambodia, Tibet,

Myanma, Bali và Borneo một số nhà nghiên cứu đã cho thấy lồi này có sự đa dạng
rất cao về mặt di truyền và có rất nhiều phân lồi đã được mơ tả dựa trên vùng phân
bố về địa lý [16].

4


1.1.2.2. Mang Pù Hoạt (M. puhoatensis)
Lồi Mang này được mơ tả một cách ngẫu nhiên trong một bài báo phổ thông
[10] dựa trên cơ sở các mẫu gạc và một phần trán được Lê Trọng Trải và Đỗ Tước
thu được từ khu vực Pù Hoạt, Quế Phong, Nghệ An, Việt Nam vào năm 1997 [41].
Tuy vậy, loài Mang này chưa từng được nghiên cứu chi tiết về mặt hình thái cũng
như chưa từng được đưa vào những nghiên cứu xây dựng cây phát sinh chủng loại
để đánh giá tính xác thực về mặt di truyền. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tơi
sẽ tiến hành phân tích di truyền cho loài này dựa trên các mẫu được xác định về mặt
hình thái là của lồi Mang Pù Hoạt.
1.2.3. Mang Roosevelt (M. rooseveltorum)
Lồi Mang Roosevelt được mơ tả vào năm 1932 bởi Osgood [33] và trong
suốt 60 năm tiếp theo không có bất kỳ mẫu vật nào được ghi nhận. Lồi này được
ghi nhận tại 3 địa điểm ở Lào, và các mẫu thu được từ thợ săn đều là các mẫu vật
không nguyên vẹn. Cụ thể, vào tháng 2 năm 1995, hai mẫu xương sọ gần như
nguyên vẹn và 6 phần xương sọ khác đã được tìm thấy tại Lào [7]. Loài này hiện
nay được xếp vào hạng mục thiếu dữ liệu trong danh sách đỏ thế giới (IUCN). Hiện
nay phân loại cho lồi này cịn khá nhiều tranh cãi. Về mặt hình thái, lồi này rất
khó phân biệt với các lồi Mang có quan hệ gần khác như Mang Putao và Mang
Trường Sơn. Nguyên nhân của vấn đề này là bởi sự hạn chế của số lượng mẫu vật
cho đến nay rất ít [42]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, khi thực hiện khảo sát ở hai
khu bảo tồn ở miền Trung Việt Nam là khu bảo tồn thiên nhiên (KBTTN) Xuân
Liên và khu bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt cùng với khu vực vùng biên giới với Lào,
chúng tơi đã tìm thấy một số mẫu có hình thái được cho là của loài này. Khi thực

hiện khảo sát ở hai khu bảo tồn ở miền Trung Việt Nam là khu bảo tồn thiên nhiên
Xuân Liên và khu bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt cùng khu vực biên giới Lào, chúng
tơi đã xác nhận sự có mặt của lồi Mang này. Kết quả nghiên cứu cho thấy việc tái
phát hiện trở lại của loài này, cũng như khẳng định lồi này có khu vực phân bố ở
Việt Nam [28]. Ngồi ra, chúng tơi có các nghiên cứu đánh giá chi tiết đa dạng di

5


truyền của loài Mang này tại khu bảo tồn Xuân Liên, kết quả cho thấy, trong lồi
này có những nhánh tiến hóa riêng biệt. Cụ thể, nghiên cứu chỉ ra, trong quần thể
loài Mang Roosevelt tại khu bảo tồn Xuân Liên cùng KBTTN Pù Hoạt có sự tách
biệt về mặt di truyền thành 3 nhánh, mặc dù các mẫu chỉ thu thập trong khu vực khu
bảo tồn. Sự phân tách này có thể liên quan tới ranh giới phân bố của các quần thể
trong hai khu bảo tồn [4].

Hình 2. Mang Vũ Quang (M. vuquangensis)
1.2.4. Mang Vũ Quang (M. vuquangensis)
Mang Vũ Quang (M. vuquangensis) hay còn được gọi là Mang lớn (Giant
muntjac hay Megamuntiacus vuquangensis) (Hình 2). Vào năm 1994 nhóm nghiên
cứu của Tổ chức Bảo tồn Động vật Hoang dã (Wildlife Conservation Society) đã
tìm thấy một số mẫu sừng có kích thước lớn bất thường của nhóm Mang tại các
ngơi làng thuộc dãy Trường Sơn ở phía Đơng trung tâm Lào, gần với biên giới VN
và họ cũng tìm thấy một con đực có sừng Mang các đặc điểm tương tự bị nhốt ở
một gánh xiếc vào tháng 3 năm 1994. Với kích thước lớn và có nhiều đặc điểm hình
thái khác biệt với các lồi đã mơ tả, các nhà khoa học đã đưa ra giả thuyết về khả
năng đây là một loài mới [17 , 40]. Trong giai đoạn này, các mẫu sừng và hộp sọ có
các đặc điểm tương tự cũng được tìm thấy xung quanh khu bảo tồn Vũ Quang ở
Việt Nam [38], và ở một số khu vực khác cùng địa bàn trên [12]. Vì vậy, lồi Mang
lớn (Megamunticus vuquangensis) đã được mơ tả vào năm 1994. Chúng đã được

chứng minh là một loài mới dựa trên cơ sở về kích thước và sự sai khác của trình tự

6


ADN của các gen ty thể giữa Mang lớn, Mang Ấn Độ, Mang Trung Quốc
(Muntiacus reevesi) [19].

Vncreatures
W. Robichaud

Hình 3. Mang Trường Sơn (M. truongsonensis)
1.2.5. Mang Trường Sơn (M. truongsonensis)
Về mặt hình thái, Mang Trường Sơn (Hình 3) được mơ tả có kích thước cơ
thể nhỏ hơn Mang Ấn Độ. Chúng có màu đen, trọng lượng xấp xỉ 15kg; đi rộng
và ngắn, đen ở đỉnh đồng thời có dải trắng bên dưới. Hộp sọ của Mang Trường Sơn
nhỏ hơn so với Mang thường, gạc chính ngắn [36]. Trình tự ADN của 6 mẫu có đặc
điểm nhận dạng của Mang Trường Sơn cho thấy đây là loài Mang khác với các loài
đã biết. Với phát hiện mới này, đây là lồi móng guốc thứ 3 được xác nhận là loài
mới ở Việt Nam trong vịng 5 năm. Mang Trường Sơn là lồi Mang thứ hai được
tìm thấy và mơ tả ở dãy Trường Sơn là loài mới sau Mang Vũ Quang (M.
vuquangensis). Các mơ tả này dựa trên hình thái xương sọ, trình tự ADN và thơng
qua phỏng vấn người dân [36].
Trong các loài trên, ngoại trừ loài Mang Ấn Độ, bốn lồi Mang cịn lại đều
được tìm thấy trong vịng 15 năm trở lại đây hoặc dưới dạng loài mới hoặc được xác
nhận là có mặt trong nước. Những lồi Mang cho đến nay vẫn được coi là khơng có
ở Việt Nam nhưng phân bố ở gần biên giới , như lồi M. reevesi có thể có mặt ở
nước ta nếu có những điều tra chi tiết hơn ở khu vực phía Bắc. Đồng thời lồi Mang

7

Pù Hoạt được mô tả vào năm 1997 cho đến nay vẫn chưa có bất cứ nghiên cứu nào
ở cấp độ phân tử để đánh giá tính xác thực của lồi này. Hơn nữa, Việt Nam có thể
cịn có những loài ẩn sinh chưa được biết đến. Để hiểu rõ hơn mức độ đa dạng của
nhóm này ở nước ta, xác định những thông tin cơ bản như vùng phân bố và số
lượng chính xác của các lồi thuộc nhóm Mang cần có những nghiên cứu chi tiết
hơn đặc biệt cần có những nghiên cứu sử dụng phương pháp sinh học phân tử để
đánh giá mức độ đa dạng di truyền [2].
2. Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên các chỉ thị phân tử
2.1. Phương pháp phân tử đánh giá đa dạng di truyền loài của Mang được sử
dụng trong nghiên cứu
Trước đây, khi các công cụ sinh học phân tử chưa được áp dụng, mối quan hệ di
truyền giữa các loài được xác định chủ yếu dựa trên việc kết hợp, so sánh các dấu
hiệu hình thái bên ngồi, tập tính, cấu trúc tế bào. Tuy vậy, chỉ sử dụng các dấu hiệu
hình thái cho thấy một số hạn chế, cụ thể như ở các loài rất xa nhau nhưng do hiện
tượng đồng hình nên có hình thái giống nhau, hay ở một số trường hợp, đặc điểm
kiểu hình rất khó quan sát như ở các vi sinh vật [1]. Từ giữa những năm 1990, với
sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, một số phương pháp nghiên cứu mới
trong lĩnh vực phân loại học đã hình thành và được gọi là phương pháp phân loại
học phân tử [1]. Phương pháp này dựa trên các dữ liệu thơng tin về hệ gen (ADN)
trong và ngồi nhân hoặc các sản phẩm của chúng (protein) để giúp xây dựng cây
phát sinh chủng loại. Trong đó, việc sử dụng chỉ thị là trình tự ADN cho hiệu quả và
độ tin cậy cao trong các nghiên cứu [25]. Trong trường hợp này, các dấu hiệu phân
tử (chủ yếu là nucleotide) có thể khắc phục những khó khăn của phương pháp phân
loại dựa trên hình thái [1].
Hiện nay có một số phương pháp cơ bản sử dụng chỉ thị ADN để xác định các
mối quan hệ di truyền như: Microsatellites, RFLP (restriction fragment length
polymorphisms), giải trình tự ADN (DNA sequence). Với phương pháp giải trình tự
(DNA sequence) các vùng gen cần thiết được nhân lên bằng phản ứng PCR để tiến

hành xác định chính xác trình tự các nucleotide trên đoạn gen mong muốn. Dựa vào

8


tốc độ biến đổi của các nucleotide trên các vùng gen, chúng ta có thể xác định mối
quan hệ di truyền giữa các loài. Cụ thể, mức độ thay thế các nucleotide tại mỗi vùng
ADN của hệ gen là khác nhau và phụ thuộc áp lực chọn lọc tự nhiên trên mỗi locut
và chức năng của sản phẩm gen. Tuy vậy, ở các locut có áp lực chọn lọc tương
đương thì tốc độ thay đổi trong các trình tự ADN là ổn định, khi xét trong quãng
thời gian tiến hóa lâu dài. Quan hệ di truyền giữa tất cả các dạng sống đều có thể
được xác định dựa trên việc so sánh các chỉ thị phân tử giữa chúng với nhau. Có
nhiều phương pháp được thiết lập nhằm xác định mối quan hệ di truyền giữa các
loài. Một trong nhưng phương pháp cơ bản nhất là xây dựng sơ đồ hình cây dựa
trên các chỉ thị di truyền để mơ tả mối quan hệ giữa các loài, gọi là cây phát sinh
chủng loại hay cây tiến hóa (Phylogenetic tree). Ngồi việc khắc phục được một số
hạn chế của phân loại học truyền thống, nó cũng có nhiều ưu điểm khác như: kết
quả thí nghiệm thường khách quan, chính xác, khơng phụ thuộc vào chủ quan của
người quan sát như trong phân loại học dựa trên hình thái [25].
Cơ sở phân loại của phương pháp này chủ yếu dựa trên trình tự ADN được xây
dựng từ bốn nucleotide là giống nhau ở mọi sinh vật do đó tiện so sánh, nghiên cứu
ngay cả ở những sinh vật khác xa nhau [25]. Sự sai khác trong các trình tự ADN
được xem là kết quả của q trình tiến hóa phân tử theo thời gian. Do vậy, các nhà
khoa học xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng việc so sánh các trình tự ADN và
phân tích sử dụng các thuật tốn xác suất. Cây phát sinh chủng loại thể hiện đa dạng
di truyền, mối quan hệ và tiến hóa giữa các nhóm sinh vật. Dựa trên loại thuật toán
xác suất được sử dụng để phân tích dữ liệu, người ta chia thành nhiều phương pháp
xây dựng cây phát sinh chủng loại khác nhau. Phân tích phát sinh chủng loại sử
dụng trình tự ADN là một phần quan trọng trong các nghiên cứu như: sinh học phân
tử, sinh học phát triển, di truyền học quần thể, tiến hóa và đa dạng sinh học [25].

Mỗi cây phát sinh chủng loại thường chỉ là một phần của cây tiến hóa xuất phát
từ một tổ tiên chung. Tận cùng của mỗi cây phát sinh chủng loại thường là một hoặc
một số taxon. Điểm nằm giữa phân nhánh (node) đại diện cho tổ tiên chung của các
nhóm lồi riêng biệt trước khi phân li tiến hóa. Chiều dài mỗi nhánh thể hiện mức

9


độ khác biệt giữa các taxon. Các cây tiến hóa có điểm xác định tổ tiên chung gọi là
các cây tiến hóa có gốc (root trees), ngược lại, các cây tiến hóa khơng gốc (unroot
trees) chỉ phản ánh mối quan hệ và sự sai khác giữa các taxon. Số lượng cây tiến
hóa tăng lên cùng với số lượng taxon nghiên cứu (Bảng 2) [1]. Cụ thể, số cây phát
sinh chủng loại có gốc (NR) và khơng gốc (NU) tương ứng là:
NR = (2n-3)!/[2n-2(n-2)!]

với n ≥ 2

(Phương trình 2.1)

NU = (2n-5)!/[2n-3(n-3)!]

với n ≥ 3

(Phương trình 2.2)

Dù vây, việc xây dựng cây tiến hóa nào cũng đều cần đến nhóm ngồi, hay còn
gọi là các taxon đối chứng [1 , 34].
Bảng 2. Số lượng cây khơng gốc và có gốc với số lượng taxon từ 2-10
Số

Số lượng

Số lượng

taxon

cây khơng gốc

cây có gốc

2

1

1

3

1

3

4

3

15

5

15

105

6

105

945

7

945

10395

8

10395

135135

9

135135

2027025

10

2027025

34459425

2.2. Các phương pháp sử dụng để xây dựng cây loài phát sinh
Để xác định được cây loài phát sinh, các dữ liệu ADN thường được phân tích
bằng các thuật tốn xác suất. Hiện nay nhiều dạng thuật toán khác nhau được dùng
trong các phần mềm máy tính là cơ sở của nhiều phương pháp xây dựng cây loài
phát sinh khác nhau như: ma trận khoảng cách (Distance Matrix), neighbour
joining, tiết kiệm tối đa (Maximum Parsimony), hợp lý tối đa (Maximum
Likelihood) và Bayesian. Trong nghiên này, chúng tôi sử dụng đồng thời 3 phương

10


pháp là tiết kiệm tối đa (MP), hợp lý tối đa (ML) và Bayesian nhằm so sánh các kết
quả thu được để tăng độ tin cậy cho kết quả cuối cùng. Ba phương pháp kể trên đều
đã được sử dụng rộng rãi ở các nghiên cứu tiến hóa và đã cho kết quả với độ tin cậy
tốt ở các nghiên cứu trước đây [1 , 25 , 34].
2.2.1. Ma trận khoảng cách (Distance matrix)
Ma trận khoảng cách là nhóm các thuật toán đơn giản nhất, được sử dụng từ
lâu trong các nghiên cứu tiến hóa. Trong số đó, thuật tốn UPGMA (unweighted
pair group with arithmetic mean) phân tích tất cả các dấu hiệu, qua đó xác định
khoảng cách di truyền giữa tất cả các cặp mẫu, rồi gộp nhóm từng cặp mẫu có
khoảng cách di truyền ngắn nhất. Thuật tốn này coi tốc độ tiến hóa của các
nucleotide là như nhau ở mọi nhánh tiến hóa. Tuy nhiên, điều này khơng phải lúc
nào cũng đúng, bởi vì tốc độ tiến hóa tại các vùng gen khác nhau có tốc độ khác
nhau phụ thuộc sản phẩm chúng mã hóa và áp lực chọn lọc đối với vùng gen đó [1].
Do vậy, ưu điểm của thuật tốn này là có tốc độ phân tích nhanh và đơn giản,
UPGMA sẽ phù hợp nhất khi sử dụng với cây tiến hóa có tốc độ tiến hóa ở các

nhánh là như nhau. Thuật tốn này cũng sẽ dùng phù hợp để xử lý một lượng lớn dữ
liệu, cho biết khoảng cách di truyền tương đối giữa các lồi, nhưng khơng phản ánh
được tiến hóa ở mỗi gen [1].
2.2.2. Tiết kiệm tối đa (Maximum Parsimony)
Phương pháp này được đề xuất vào năm 1963 bởi Edwards và Cavalli-Sforza
[15]. Tích phân tiến hóa là phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên
hệ dữ liệu là các trình tự ADN, so sánh các vị trí giữa các nucleotide tương ứng
trong hệ dữ liệu ADN này. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bởi phương pháp này
dựa trên nguyên tắc sinh học “đột biến hiếm khi xảy ra”. Thuật tốn này cho rằng
cây tiến hóa phù hợp nhất là cây có số đột biến thấp nhất trong tất cả các cây có thể
tìm được giữa các taxon được phân tích [1 , 34]. Thuật tốn của tích phân tiến hóa
đầu tiên sẽ xác định tất cả các vị trí có giá trị thơng tin bằng cách so sánh tất cả các
trình tự nucleotide tại mỗi vị trí, rồi từ xác định ra cây cần ít đột biến nhất tại mỗi vị

11


trí. Cây phát sinh nào cần ít đột biến nhất khi xét tại tất cả các vị trí được gọi là cây
tiến hóa phỏng đốn. Đây là cây được cho là gần với cây tiến hóa đúng nhất. Với
phương pháp này, chúng ta có thể dự đốn tổ tiên của mỗi nhánh tiến hóa. Tuy
nhiên, tốc độ biến đổi giữa các nucleotide là khơng như nhau, ví dụ như các đột
biến đồng hốn có tỷ lệ xảy ra cao gấp 3 lần các đột biến dị hốn. Bởi vậy đơi khi
phương pháp tiêt kiệm tối đa có thể khơng phản ánh đúng về thời điểm xảy ra sự
tách ly tiến hóa giữa các lồi vì tốc độ tiến hóa của các nucleotide giữa các nhánh là
khác nhau [1].
2.2.3. Hợp lý tối đa (Maximum Likelihood)
Phương pháp hợp lý tối đa là một phương pháp xác suất thuần túy. Phương
pháp này đánh giá một giả thuyết tiến hóa bằng việc xây dựng tất cả cây tiến hóa có
thể có dựa trên mơ hình tiến hóa và cơ sở dữ liệu đưa vào, rồi từ đó xác định cây có
xác suất xảy ra cao nhất. Phương pháp này thường được xem là phương pháp cung

cấp thơng tin chính xác và chi tiết hơn các phương pháp khác [1]. Tuy nhiên, khi dữ
liệu đưa vào lớn thì số cây phát sinh chủng loại thu được sẽ trở nên rất lớn (với số
taxa > 30 thì số cây phát sinh chủng loại thu có thể có > 5x1038 [1]) từ đó khiến khả
năng tính tốn rất chậm. Do vậy, phương pháp này bước đầu sẽ chỉ được áp dụng
với một số lượng dự liệu nhỏ và với các mẫu có đủ số liệu.
2.2.4. Bayesian
Trong phân tích Bayesian, kết quả về phát sinh chủng loại dựa trên xác suất
hậu nghiệm thu được qua cây phát sinh chủng loại.
Bayesian là phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại sử dụng Markov
Chain Monte Carlo (MCMC) có kết hợp của mơ hình tiến hóa và dữ liệu đưa vào,
từ đấy tính tốn ra giá trị xác suất hậu nghiệm (posterior probability - PP) của cây.
Xác suất hậu nghiệm là xác suất có điều kiện mà cây nhận được khi đưa các mơ
hình vào, cơ sở dữ liệu. Phương pháp Bayesian với MCMC đã được được chấp
nhận và sử dụng rộng rãi như là một phương pháp tin cậy trong xây dựng cây phát
sinh chủng loại [22].

12


2.3. Phân tích thời gian tiến hóa
Phân tích xác định thời gian phân tách của các nhóm Mang được thực hiện
dựa trên phần mềm BEAST. Trên thực tế, đây là một gói phần mềm, bao gồm các
chương trình BEAST, BEAUti do đó gọi tắt là BEAUti & BEAST. Gói phần mềm
này sử dụng thuật toán thống kê Bayesian và do đó sẽ cần cung cấp các giá trị tiền
nghiệm kết hợp với các thơng tin có được từ hệ dữ liệu phân tử. Để chạy phân tích,
chúng tơi đưa vào hai hệ dữ liệu. Hệ dữ liệu thứ nhất là dữ liệu ADN chúng tôi thu
được, hệ dữ liệu thứ hai là mốc thời gian phân tách (calibration point ) của loài
Mang và các tham số tiền nghiệm (prior) [5]. Cả hai hệ dữ liệu này được đưa vào
chương trình BEAUti, để từ đó, với phần mềm này chúng tơi lựa chọn các tùy chỉnh
phù hợp cho hai hệ dữ liệu trên, cuối cùng sẽ tạo ra file định dạng mà chương trình

BEAST có thể hiểu và sử dụng để chạy phân tích [14]. Kết quả thu được qua phần
mềm BEAST là cây phát sinh chủng loại đi kèm với mốc thời gian phân tách của
các nhánh nhờ việc mô phỏng mơ hình tốc độ tiến hóa phân tử của các nhánh này
trên cây. Ở mức độ đơn giản nhất, điều này có thể thống nhất một tỷ lệ về thời gian
trên toàn bộ cây phát sinh chủng loại dựa trên các thơng tin hiệu chỉnh (calibration)
đã có [14]. Do vậy, BEAST là phần mềm đầu tiên cho phép suy luận để xây dựng
cây phát sinh chủng loại thể hiện được mơ hình đồng hồ phân tử giữa các lồi [13].
2.4. Gen chỉ thị sử dụng trong phân tích
Hiện nay, rất nhiều các chỉ thị phân tử được xác định với các vai trị khác nhau,
phụ thuộc các mục đích và đối tượng trong các nghiên cứu. Trong đó, hệ gen ty thể,
so với hệ gen nhân, có phương thức sao chép và di truyền khá khác biệt. Bởi vậy,
tốc độ đột biến, thay thế trong hệ gen ty thể cũng có những sai khác nhất định so với
hệ gen nhân. Đồng thời, mỗi loại chỉ thị đều có các ưu điểm và nhược điểm riêng.
Các gen được lựa chọn vào việc xây dựng cây phát sinh chủng loại tùy thuộc vào
mục đích nghiên cứu và thời gian tiến hóa của nhóm lồi cần quan tâm. Thơng
thường, những nghiên cứu tập trung vào nhóm lồi có thời gian tiến hóa ngắn đòi

13


hỏi cần có những gen có tốc độ tiến hóa nhanh và ngược lại những nhóm lồi có
thời gian tiến hóa dài cần có những gen có tốc độ tiến hóa chậm hơn [1 , 8].
Hệ gen ty thể ở nhóm thú và người chứa một phân tử ADN (ký hiệu là mtADN)
có dạng sợi kép, mạch vịng, dài khoảng 15000 bp. Tỷ lệ đột biến đồng nghĩa của hệ
gen ty thể ở người vào khoảng 5,7x10-8 mỗi năm, gấp 10 lần so với đột biến đồng
nghĩa trung bình trong vùng mã hóa của gen nhân [1 , 45]. Tỉ lệ đột biến khác nghĩa
ở các gen mã hóa protein ở hệ gen ty thể rất khác nhau, nhưng trong mọi trường
hợp, tỷ lệ này vẫn cao hơn rất nhiều so với đột biến ở hệ gen nhân. Cơ chế dẫn đến
mtADN có tốc độ đột biến cao như thế có thể do sai sót trong q trình sửa chữa
mtADN. Một lý do khác là áp lực của chọn lọc tự nhiên đối với hệ gen ty thể cao

hơn sao với gen nhân, bởi vì mỗi tế bào chứa hàng chục tỷ ty thể và trung bình mỗi
ty thể chứa 2 bản sao mtADN. Một khác biệt cơ bản nữa của hệ gen ty thể là gen ty
thể nằm ở tế bào chất, di truyền theo dịng mẹ (khơng xảy ra trao đổi chéo do khơng
giảm phân). Do đó, các đột biến xảy ra trên hệ gen ty hầu hết là đột biến thay thế
chứ không phải do tái tổ hợp. Với kích thước nhỏ, cùng với tốc độ đột biến thay thế
cao, hệ gen ty thể là một công cụ hiệu quả cho nghiên cứu tiến hóa, đa dạng di
truyền giữa các loài, và các quần thể [1].
Các vùng gen trong hệ gen ty thể, tùy thuộc vào tốc độ biến đổi khác nhau
được sử dụng với các mục đích nghiên cứu khác nhau. Ví dụ, với gen cytochrome b
(Cyt-b) đã đươc sử dụng trong nhiều nghiên cứu về quan hệ phát sinh chủng loại ở
động vật. Tốc độ biến đổi của gen Cyt-b phù hợp với mục đích so sánh các loài ở
mức độ giống và họ. Kết quả của rất nhiều nghiên cứu phát sinh chủng loại cho
thấy, gen Cyt-b cho các kết quả cây phát sinh chủng loại khá chính xác. Xa hơn nữa,
sử dụng gen Cyt-b có thể hỗ trợ việc xác định giống đối với các loài mới [36]. Dựa
trên các lý do tương tự, các vùng gen khác như Cytochrome c Oxidase subunit I
(COI), NADH dehydrogenase 4 (ND4) được dùng cho di truyền quần thể, quan hệ
phát sinh chủng loại ở mức độ loài và phân loài của lớp thú [24].
Hệ gen nhân có tốc độ, thời gian biến đổi chậm hơn rất nhiều so với hệ gen ty
thể. Do đó, hệ gen nhân phù hợp với việc phân tích, làm rõ các nhánh có thời gian

14


tiến hóa lâu hơn. Tuy nhiên, hệ gen nhân cũng có các hạn chế nhất định. Với các
mẫu có tuổi mẫu lớn (các mẫu của chúng tơi có tuổi mẫu xấp xỉ 10 năm kể từ khi
mẫu được thu bởi người dân) hay điều kiện bảo quản mẫu không tốt, việc nhân
dịng hệ gen nhân gặp khá nhiều khó khăn bởi số lượng bản sao ít hơn rất nhiều so
với hệ gen ty thể. Ngồi ra, kích thước lớn khiến hệ gen nhân dễ bị biến đổi, phá
hủy [1 , 8].
Từ các ưu và nhược điểm riêng của từng loại chỉ thị, chúng tôi lựa chọn sử dung

cả hệ gen ty thể và hệ gen nhân để có thể có được các kết quả tốt nhất. Cụ thể, trong
nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn 3 gen ty thể là gen Cytochrome b, ND4 (NADH
dehydrogenase subunit 4), gen 16S và 1 gen nhân là gen G-fibrinogen (G-fib).
Ngoài các lý do như đã nêu, chúng tôi lựa chọn các gen trên cịn bởi vì các gen này
đã được sử dụng thành cơng ở các nghiên cứu trên nhóm Mang trước đây. Thậm
chí, cho đến nay, một số lồi Mang chỉ có trình tự duy nhất của 1 gen (Mang
Ghongsang hiện nay chỉ có duy nhất 1 trình tự gen ND4 (AF190678)). Do vậy, khi
lựa chọn các gen kể trên, chúng tôi hi vọng sẽ cho kết quả tốt và có thể kết hợp với
các nghiên cứu trước đây nhằm đưa ra các kết luận phù hợp nhất [7 , 36] [23]. Với
gen Cyt-b chúng tơi quyết định nhân lên tồn bộ chiều dài đoạn gen này là 1140bp
đối với tất cả các mẫu. Gen 16S và G-fib có kích thước khoảng 600bp, gen ND4 có
kích thước khoảng 700bp. Số lượng chi tiết của các gen được chúng tơi tiến hành
giải trình tự và các gen từ GenBank sử dụng cho nghiên cứu được thể hiện ở Bảng
4.

15


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Vật liệu nghiên cứu
1.1. Mẫu vật nghiên cứu
Các mẫu sử dụng trong nghiên cứu được thu bởi các chuyên gia thuộc Trung
tâm Nghiên cứu Tài nguyên và Môi trường, Đại học Quốc gia Hà Nội và Viện Quy
hoạch Lâm Nghiệp. Tổng cộng 78 mẫu gồm 43 mẫu xương và 35 mẫu da khô được
thu thập tại 12 khu bảo tồn trên cả nước (Hình 4), nơi được ghi nhận là có sự xuất
hiện của các lồi Mang. Thơng tin chi tiết về các địa điểm thu mẫu được thể hiện
trong Bảng 4.
1.2. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
 Kít tách chiết DNeasy blood and tissue của Qiagen

 Ethanol của Merk
 PCR Mastermix của Fermentas
 Hotstart Taq Mastermix của Qiagen – Đức
 Kit GeneJET PCR Purification – Thermo
 Agarose của Invitrogen
 Tris-Base của Sigma
 Boric axit của Merk
 EDTA của Merk
 Ethidium bromide của Invitrogen

16


 Marker 100bp, 1kb của Fermentas
 Dye 6X của Fermentas

1.3. Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR
Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR đã được sử dụng và cho kết quả tốt
trong các nghiên cứu về nhóm Mang cũng như các nhóm thú khác trong các nghiên
cứu trước. Ngồi ra, trình tự mồi cho phản ứng nhân phân đoạn gen ND4 được
chúng tôi tự thiết kế trong nghiên cứu này. Các mồi được đặt tại hãng IDT – Mỹ.
Trình tự các cặp mồi này được thể hiện ở dưới đây (Bảng 3).
Bảng 3. Danh sách và thơng tin mồi sử dùng trong nghiên cứu
Phân
Tên
đoạn
mồi
gen
Cyt-b-1

Cyt-b-2

ND4

Kích
thước
phân Trình tự mồi
đoạn
gen
5’-CGAAGCTTGATATGAAAAACCATCGTTG-3’

Irwin et al 1991

5’-AAACTGCAGCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3’

Irwin et al 1991

5’-GCAAGCTTCTACCATGAGGACAAATATC-3’

Irwin et al 1991

5’-GGAATTCATCTCTCCGGTTTACAAGAC-3’

Irwin et al 1991

5’-CTCATRCCYCTGACCTGACTAT-3’

Le et al 2013

5’-GCTATAAATTCGGTAAGTGGATT-3’

Le et al 2013

5’-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3’

Palumbi

BR

5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’

Palumbi

GL1

5’-AGAHAAYTGCTGCATCTTAGATG-3’

Gatesy et al 1997

5’-TTCRTATTTCATAATTTCTTC-3’

Gatesy et al 1997

L14724
H15149
L15162
H15915R
ND4-F
ND4-R

450

750

700

AR
16S

G-fib

Tác giả

600

GR1

590

17

et

al

et

al

1991

1991