Nghiên cứu biểu hiện protein p53 tái tổ hợp ở nấm men pichia pastoris x33

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--

TRẦN THỊ THÚY NGA

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP
Ở NẤM MEN Pichia pastoris X33

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--

TRẦN THỊ THÚY NGA

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP
Ở NẤM MEN Pichia pastoris X33

Chuyên ngành Di truyền học
Mã số 60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. ĐINH NHO THÁI

Hà Nội - 2017

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Đinh Nho Thái, thầy đã trực tiếp
giảng dạy, hướng dẫn và giúp đỡ tận tình cho tơi trong suốt q trình học tập và nghiên cứu
để hồn thành luận văn này.
Tơi cũng xin bày tỏ lịng biết ơn tới các thầy, cơ tḥc Khoa Sinh học, Trường Đại học
Khoa học Tự nhiên, đặc biệt là các thầy, cô trong Bộ môn Di truyền học đã truyền đạt cho
tôi những tri thức quý báu trong thời gian tôi học tập và nghiên cứu tại Trường.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Đỗ Thị Tuyên, Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme,
Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ trong
thí nghiệm biến nạp gen vào nấm men. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các học viên cao học và
các em sinh viên trong Bộ môn Di truyền học cùng các cán bộ và các em sinh viên trong
Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzyme và Protein đã nhiệt tình hỗ trợ tơi rất nhiều
trong thời gian làm việc tại phịng thí nghiệm.
Lời cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã nhiệt tình đợng viên, chia
sẻ kinh nghiệm và ủng hợ tơi hồn thành tốt nhất đề tài nghiên cứu này.
Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2017.
Học viên

Trần Thị Thúy Nga


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .................................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................ 3
1.1. Tổng quan về ung thư hiện đại......................................................................................... 3

1.1.1. Ung thư và tình hình ung thư trên thế giới ........................................................ 3
1.1.2. Các con đường cơ bản hình thành ung thư ........................................................ 4
1.1.3. Nghiên cứu điều trị ung thư hiện nay ............................................................... 10
1.2. P53 và các nghiên cứu biểu hiện p53 ứng dụng điều trị ung thư............................... 12

1.2.1. Tổng quát về TP53 và protein tương ứng ........................................................ 12
1.2.2. Trình tự nhận biết đặc hiệu của p53 trên các gen mục tiêu ........................... 15
1.2.3. Những nghiên cứu về biểu hiện protien p53 tái tổ hợp .................................. 17
1.3. Hệ thống nấm men Pichia pastoris biểu hiện protein ngo ại lai................................. 19
1.3.1. Đặc điểm của hệ thống biểu hiện P. pastoris .................................................. 19
1.3.2. Vector pPICZα biểu hiện protein ở P. pastoris............................................... 20
1.3.3. Quá trình chuyển gen vào nấm men P. pastoris ............................................. 21
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................... 23
2.1. Vật liệu và hóa chất ......................................................................................................... 23

2.1.1. Vật liệu ................................................................................................................. 23
2.1.2. Hóa chất................................................................................................................ 23
2.1.3. Các đoạn oligonucleotide................................................................................... 23
2.1.4. Thiết bị dùng trong nghiên cứu ......................................................................... 24
2.1.5. Các môi trường nuôi cấy .................................................................................... 25
2.1.6. Các dung dịch và đệm ........................................................................................ 25
2.2. Phương pháp nghiên c ứu ................................................................................................ 26
2.2.1. Tách chiết vector biểu hiện từ chủng E. coli DH5α ....................................... 26


2.2.2. Xử lý vector biểu hiện bằng enzyme giới hạn................................................. 27
2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose ........................................................................... 28
2.2.4. Tinh sạch DNA gel agarose ............................................................................... 29
2.2.5. Biến nạp DNA vào tế bào nấm men bằng phương pháp xung điện ............. 29
2.2.6. Tách chiết DNA tổng số của nấm men ............................................................ 30

2.2.7. Sàng lọc thể biến nạp bằng kĩ thuật PCR......................................................... 31
2.2.8. Nghiên cứu các điều kiện nhằm biểu hiện p53 tái tổ hợp tốt nhất................ 32
2.2.9. Điện di protein trên gel polyacrylamide (SDS – PAGE) ............................... 33

2.2.10. Phương pháp EMSA......................................................................................... 34
2.2.11. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ................................................. 36
2.2.12. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford ......................................... 36
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................................... 38
3.1. Tạo chủng nấm men P. pastoris X33 mang cấu trúc pPICZαA-TAT-p53-His........ 38
3.1.1. Tách chiết plasmid tái tổ hợp từ chủng E. coli DH5α và xử lý với SacI ..... 38
3.1.2. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào P. pastoris và sàng lọc thể biến nạp ............. 40
3.2. Tối ưu quy trình biểu hiện p53 tái tổ hợp ở nấm men P. pastoris X33 .................... 44
3.2.1. Lựa chọn dòng biểu hiện p53 tái tổ hợp........................................................... 44
3.2.2. Tối ưu môi trường biểu hiện p53 tái tổ hợp..................................................... 46
3.2.3. Tối ưu nồng độ methanol cảm ứng biểu hiện .................................................. 48
3.3. Tinh sạch và định lượng protein p53 tái tổ hợp thu được........................................... 49

3.3.1. Tinh sạch protein p53 tái tổ hợp........................................................................ 49
3.3.2. Định lượng protein p53 bằng phương pháp Bradford .................................... 50
3.4. Xác định protein p53 tái tổ hợp bằng phương pháp EMSA ....................................... 53
KẾT LUẬN .............................................................................................................................. 55
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................................. 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................... 56
PHỤ LỤC ................................................................................................................................. 62


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc gen TP53 và protein tương ứng .............................................................. 12
Hình 1.2. Cấu trúc phân tử protein p53 .................................................................................. 14
Hình 1.3. Vector biểu hiện pPICZα. ....................................................................................... 21

Hình 1.4. Tích hợp gen ngoại lai vào vị trí 5’AOX1 ở hệ gen của P. pastoris. ................ 22
Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR chọn lọc thể tái tổ hợp….……………………38
Hình 3.2. Kết quả xử lý plasmid tái tổ hợp với enzyme SacI .............................................. 39
Hình 3.3. Kết quả biến nạp DNA tái tổ hợp vào P. pastoris X33 ....................................... 40
Hình 3.4. Kết quả điện di DNA tổng số của nấm men ......................................................... 41
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi EcoRI-Fw/XhoI-Rv ..................... 42
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi AOX1-Fw/AOX1-Rv .................. 43
Hình 3.7. Kết quả sinh trưởng của các dịng biểu hiện sau 72 giờ ...................................... 44
Hình 3.8. Kết quả điện di protein tổng số từ các dòng biến nạp ......................................... 45
Hình 3.9. Kết quả sinh trưởng của chủng X33-36 trong các mơi trường biểu hiện .......... 46
Hình 3.10. Kết quả điện di protein tổng số từ các môi trường biểu hiện ........................... 47
Hình 3.11. Kết quả sinh trưởng của chủng X33-36 ở các nồng đợ methanol .................... 48
Hình 3.12. Kết quả điện di protein từ dịch nuôi cảm ứng với các nồng đợ methanol ...... 49
Hình 3.13. Kết quả điện di khơng biến tính protein p53 tái tổ hợp..................................... 54
Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch p53 tái tổ hợp từ dịch ngoại bào ............. 50
Hình 3.15. Đường chuẩn Bradford .......................................................................................... 51


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Trình tự của các đoạn oligonucleotide .................................................................. 24
Bảng 2.2. Thành phần các loại môi trường nuôi cấy ............................................................ 25
Bảng 2.3. Thành phần các loại dung dịch và đệm................................................................. 26
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn .......................................................... 28
Bảng 2.5. Thành phần của phản ứng PCR.............................................................................. 31
Bảng 2.6. Thành phần gel polyacrylamide 12% .................................................................... 33
Bảng 2.7. Thành phần gel polyacrylamide cho thí nghiệm EMSA..................................... 35
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng EMSA ................................................................................. 35
Bảng 2.9. Thành phần của phản ứng Bradford ...................................................................... 37
Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ DNA tổng số tách được ....................................................... 41

Bảng 3.2. Kết quả đo OD595 nm dựng đường chuẩn ............................................................. 51
Bảng 3.3. Kết quả Bradford của quá trình tinh sạch ............................................................. 52


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Bp

Base pair

BMMY

Buffered Methanol complex medium

DNA

Deoxy ribonucleotide acid

dNTPs

Deoxy ribonucleotide triphosphates

E. coli

Escherichia coli

EMSA

Electrophoretic Mobility Shift Assay

EtBr

Ethidium bromide

IARC

International Agency for Research on Cancer

Kb

Kilo base

LB

Luria Bertani

MM

Minimal medium

MutS

Methanol utilization slow

Mut+

Methanol utilization plus

NLS

Nuclear Localization Signals

NES

Nuclear Export Signals

NST

Nhiễm sắc thể

PCR

Polymerase Chain Reaction

p53DBD

DNA-binding domain of p53

P. pastoris

Pichia pastoris

REs

Response Elements

TAE

Tris base-Acetic-EDTA

TBE

Tris base-Axit Boric-EDTA

WHO

World Health Organization

YP

Yeast extract-Peptone medium

YPM

Yeast extract-Peptone-Methanol medium

YPDM

Yeast extract-Peptone-Dextrose-Methanol medium


TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ

MỞ ĐẦU

Trải qua vài thập kỉ tới nay, ung thư đã trở thành một dạng bệnh lý phổ biến và là
một trong những nguyên nhân hàng đầu dẫn đến tử vong cao ở người. Theo ước tính
thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) thì mỗi năm trên thế giới có khoảng 9-10
triệu người mới mắc bệnh ung thư với tỉ lệ tử vong lên đến hơn 50%.
Cũng theo WHO, Việt Nam đang xếp ở vị trí 78/172 quốc gia và vùng lãnh thổ
được khảo sát về ung thư với tỉ lệ tử vong lên đến 110/100.000 người. Qua mỗi năm, số

người mới mắc ung thư tại Việt Nam đều có xu hướng ngày mợt gia tăng. Trong khi đó,
do điều kiện đời sống còn thấp, việc phát hiện và điều trị ung thư thường xảy ra muộn
khi khối u đã được hình thành hoặc di căn. Các phương pháp điều trị truyền thống thì
khơng thể loại bỏ hồn tồn tế bào ung thư ra khỏi cơ thể, sức khỏe của bệnh nhân ít
được cải thiện trong khi chi phí điều trị lại cao. Trước tình hình đó, nhiều nhà khoa học
đã và đang hướng đến nghiên cứu các protein đích – loại protein có tác đợng tiêu diệt
đặc hiệu các tế bào ung thư mà không ảnh hưởng đến các tế bào bình thường của cơ thể.
Mợt trong những protein đích đã được lựa chọn để nghiên cứu là protein p53 với những
chức năng quan trọng trong cơ thể người như: kiểm sốt chu trình tế bào, sửa chữa DNA
và kích hoạt chương trình apoptosis. Protein p53 tái tổ hợp cũng đã được nhiều nghiên
cứu chứng minh có hoạt tính sinh học và đáp ứng hiệu quả với các tế bào ung thư trong
điều kiện in vitro. Trong tự nhiên, p53 giữ vai trị như mợt nhân tố phiên mã và có nhiều
biến đổi sau dịch mã phức tạp như q trình phosphoryl hóa, acetyl hóa, ubiquitin hóa.
Vì vậy, hệ thống nấm men Pichia pastoris đã được chúng tôi lựa chọn để biểu hiện
protein p53 tái tổ hợp với nhiều ưu điểm nổi bật như: là sinh vật nhân thực có nhiều q
trình biến đổi sau dịch mã hồn chỉnh, dễ nuôi cấy, rẻ tiền và thuận tiện trong việc tinh
sạch protein dạng tiết với khối lượng lớn.

NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33

1


TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ

Với những lý do như trên, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài: “Nghiên cứu biểu
hiện protein p53 tái tổ hợp ở nấm men Pichia pastoris X33” nhằm sản xuất được
protein p53 tái tổ hợp có hoạt tính sinh học để nghiên cứu sự tác động của p53 ngoại lai
với tế bào ung thư trong điều kiện in vitro và in vivo, đồng thời tạo nguyên liệu cho các
nghiên cứu liệu pháp điều trị ung thư sau này.

Đề tài nghiên cứu này được thực hiện với các nội dung sau:
 Tạo chủng Pichia pastoris X33 chứa cấu trúc TAT-p53-His đã dung hợp vào hệ
gen của chúng.
 Nghiên cứu các điều kiện biểu hiện tốt nhất protein p53 tái tổ hợp ở chủng nấm
men Pichia pastoris X33.
 Tinh sạch và định lượng protein p53 tái tổ hợp từ dịch nuôi nấm men Pichia
pastoris X33.
 Kiểm tra hoạt tính của protein p53 tái tổ hợp bằng phương pháp EMSA.

NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33

2


TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về ung thư hiện đại

1.1.1. Ung thư và tình hình ung thư trên thế giới
Thuật ngữ “ung thư” ngày nay được sử dụng để chỉ mợt nhóm bệnh phát sinh do
sự biến đổi của các gen đặc thù, có thể tạo ra mợt tập hợp các tế bào phân chia mợt cách
khơng kiểm sốt (khối u) phát triển từ một mô hay từ một tế bào bình thường. Khối u ác
tính khi phát triển xâm lấn sẽ tiếp cận với mạch máu, từ đó có thể di chuyển và phát triển
tại các mơ ở xa, gây rối loạn chức năng của các mô khác và dẫn đến tử vong [19, 41].
Những con số thống kê cụ thể chứng minh “Ung thư là một trong những nguyên
nhân chính gây ra tử vong ở người” vào những năm gần đây đã được Cơ quan nghiên
cứu Ung thư Quốc tế (IARC) báo cáo vào năm 2013. Cụ thể, đã có khoảng 14 triệu
trường hợp mới mắc ung thư và 8,2 triệu trường hợp tử vong do ung thư vào năm 2012,

ảnh hưởng đến các quần thể người ở tất cả các nước và các vùng trên thế giới [18, 26].
Tính riêng trong giới tính nam, năm 2012, chẩn đoán mắc ung thư ở nam giới phổ biến
nhất là ung thư phổi (16,7%), ung thư tuyến tiền liệt (15,0%) và ung thư đại tràng
(10,0%). Ung thư ở những vị trí này cũng là nguyên nhân phổ biến nhất gây tử vong cho
nam giới với 23,6% ở ung thư phổi, tiếp theo là ung thư gan (11,2%) và ung thư dạ dày
(10,1%). Đối với phụ nữ, chuẩn đoán mắc ung thư phổ biến nhất là ung thư vú (25,2%),
ung thư đại trực tràng (9,2%), ung thư phổi (8,7%) và ung thư cổ tử cung (7,9%). Ung
thư tại những vị trí này cũng tương tự là nguyên nhân phổ biến nhất gây tử vong ở phụ
nữ với 14,7% ở ung thư vú và 13,8% ở ung thư phổi [26, 27,43].
Đến năm 2015, xếp sau bệnh tim và đột quỵ, ung thư trở thành nguyên nhân gây tử
vong thứ hai trên toàn cầu với 8,8 triệu người chết, phổ biến xảy ra ở ung thư phổi với
1,69 triệu ca tử vong, sau đó đến ung thư gan (788.000 ca tử vong), u ruột kết (774.000 ca

NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33

3


TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ

tử vong), ung thư dạ dày (754.000 ca tử vong) và ung thư vú (571.000 ca tử vong). Ước
tính chung về tỉ lệ tử vong do ung thư trên toàn thế giới thì có khoảng 70% số ca xảy ra ở
các nước có thu nhập thấp và trung bình, khoảng 30% số ca phát sinh từ năm nguy cơ sinh
hoạt và chế độ ăn uống như: chỉ số cơ thể cao, ăn ít trái cây và rau quả, thiếu hoạt động
thể lực, sử dụng thuốc lá và bia rượu. Thuốc lá là một yếu tố gây ung thư phổ biến nhất và
chiếm khoảng 22% số ca tử vong. Nhiễm trùng gây ung thư lên đến 25% các trường hợp
ung thư ở những nước thu nhập thấp và trung bình [20]. Vào năm 2015, chỉ có 35% các
quốc gia thu nhập thấp báo cáo có dịch vụ chuẩn đốn bệnh lý tại thành phố và các khu
trung tâm. Tổng chi phí kinh tế hàng năm dành cho ung thư ước tính khoảng 1,16 nghìn
tỷ USD. Do đó, chỉ có khoảng 20% các quốc gia có thu nhập thấp và trung bình có những

giải pháp cần thiết để thúc đẩy chính sách về ung thư [18, 43].
Việt Nam đang phải đối mặt với nhiều khó khăn về chữa trị bệnh với số lượng
người mắc ung thư ngày một tăng. Theo thống kê của Đại học Y Hà Nội, năm 2005, số
ca tử vong do ung thư là 45.413 người; năm 2006, con số này là 48.306 người, trong đó
phổ biến nhất là ung thư gan, sau đó đến ung thư phổi và ung thư dạ dày [34]. Tuy nhiên,
các phương thức điều trị ung thư hiện nay còn tốn kém, hầu hết dựa vào phương pháp
truyền thống là hóa trị, xạ trị và phẫu thuật. Các phương pháp này gây đau đớn kéo dài
cho người bệnh, và chỉ kéo dài tuổi thọ được trong thời gian ngắn hoặc khả năng tái phát
cao do không thể tiêu diệt triệt để tế bào ung thư. Điều này địi hỏi cần phải có giải pháp
điều trị mới, tăng hiệu quả chữa trị bệnh và giảm thiểu kinh phí.

1.1.2. Các con đường cơ bản hình thành ung thư
1.1.2.1. Cơ sở di truyền học phân tử hình thành ung thư
Gen ung thư là dạng alen đặc biệt của các gen bình thường xuất hiện do đợt biến,
làm tăng nguy cơ ung thư hoặc làm thúc đẩy sự phát sinh ung thư. Các gen ung thư phát
sinh từ tế bào mầm sinh dục sẽ có mặt trong hầu hết các tế bào của cơ thể và truyền lại

NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33

4


TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ

cho thế hệ sau, ngược lại, nếu từ tế bào soma sẽ không được truyền cho thế hệ sau. Gen
ung thư được xuất phát từ hai nhóm gen là gen tiền ung thư và gen ức chế khối u [19].
Gen tiền ung thư có chức năng điều khiển q trình sinh trưởng và biệt hóa trong
tế bào. Các đợt biến chuyển gen tiền ung thư thành gen ung thư (oncogene) gây nên rối
loạn chuyển hóa ở tế bào và tạo ra ung thư. Protein được mã hóa bởi gen ung thư thường
có mức biểu hiện chức năng tăng lên so với protein được mã hóa bởi gen tiền ung thư.

Sự tái sắp xếp phức tạp của hệ gen có thể tạo ra gen ung thư. Điển hình là họ gen MYC
(ví dụ gen tiền ung thư C-MYC) mã hóa cho các yếu tố phiên mã ảnh hưởng trực tiếp
đến mức độ biểu hiện của gen, qua đó tác đợng đến sự tăng sinh tế bào và liên quan đến
sự phát sinh của khối u. Cấu trúc di truyền của MYC bị sắp xếp lại theo một số cách dẫn
đến mức biểu hiện cao bất thường các protein MYC, làm hoạt hóa các gen tiền ung thư.
Số gen MYC có thể tăng lên do hiện tượng lặp đoạn NST mang gen MYC hoặc do vị trí
của nó được xếp lại gần mợt promoter mạnh dẫn đến tăng lượng sản phẩm protein.
Những đột biến NST kiểu này ở tế bào soma có thể được nhân lên ổn định cùng q trình
chọn lọc dịng tế bào ung thư [19, 28]. Các gen tiền ung thư cũng có thể được hoạt hóa bởi
cơ chế nhân bản gen. Số bản sao của mỗi gen có thể tăng do hiện tượng nhân bản một vùng
DNA (amplicon) của NST, dẫn đến lượng protein trong tế bào do gen đó mã hóa tăng theo.
Ví dụ lặp vùng NST 2p24 của gen N-MYC là một gen tiền ung thư được chuyển thành gen
ung thư gây phát sinh các u nguyên bào thần kinh. Hiện tượng lặp 20-500 bản sao gen
ERBB2 phổ biến trong các trường hợp ung thư vú và ung thư buồng trứng, u tuyến phát sinh
từ dạ dày và tuyến nước bọt [19,41]. Sự hoạt hóa gen tiền ung thư cịn có thể được tạo ra
bởi chuyển đoạn NST theo hai cơ chế, tùy tḥc vào vị trí của điểm đứt gãy NST: chuyển
đoạn có thể đặt hai trình tự exon thuộc hai gen khác nhau dưới sự điều khiển của chung
một promoter dẫn đến sự biểu hiện của một protein dung hợp; hoặc chuyển đoạn NST
đặt một khung đọc mở hồn chỉnh cạnh mợt promoter hoạt đợng mạnh. Ví dụ điển hình
là bệnh ung thư bạch cầu thể tủy trường diễn có dạng chuyển đoạn tương hỗ hình thành
theo hai cách: dung hợp của các gen BCR và C-ABL từ NST số 22 và từ NST số 9 dẫn
NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33

5


TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ

đến sản phẩm của gen dung hợp BCR-ABL có tác đợng gây ung thư. Nhiều sản phẩn gen
dung hợp BCR-ABL với các khung dung hợp khác nhau được tạo ra nhờ trên NST số 9

chỉ có mợt điểm đứt gãy duy nhất, cịn trên NST số 22 có mợt cụm các điểm đứt gãy đặc
thù [19, 22, 41]. Các gen ung thư là các gen trội về khả năng phát sinh khối u bởi chỉ mợt
đợt biến duy nhất có thể chuyển một gen tiền ung thư thành gen ung thư. Đột biến hoạt
hóa các gen này ln tạo ra ưu thế tăng sinh tế bào mặc dù vẫn tồn tại bản sao của các
alen bình thường. Do kiểu hình mà các gen ung thư quy định không bị át chế bởi sự có
mặt của bản sao kiểu dại cịn lại, nên có thể coi các gen ung thư là các gen trợi [28, 47].
Các gen ức chế khối u bình thường điều khiển các quá trình cơ bản nhằm duy trì sự
cân bằng nợi mơ bao gồm: duy trì tính tồn vẹn của vật chất di truyền, các bước của chu
kỳ tế bào, sự biệt hóa tế bào, mối tương tác giữa các tế bào và q trình apoptosis. Các đợt
biến làm bất hoạt gen ức chế khối u, biến gen đó trở thành mợt gen ung thư, gây ra mất
cân bằng nợi mơ, từ đó dẫn đến sự phát sinh các khối u [19]. Sự bất hoạt một gen ức chế
khối u trải qua hai bước tách biệt nhau: đột biến thứ nhất làm bất hoạt một alen xảy ra ở tế
bào dòng sinh dục hoặc ở tế bào soma; đợt biến thứ hai làm bất hoạt hồn tồn gen ức chế
khối u luôn xảy ra ở tế bào soma và gây nên mất alen bình thường cịn lại, từ đó phát triển
thành khối u. Hiện tượng mất tính dị hợp tử (Loss of Heterozygosity, LOH) phản ánh sự
mất đi của bản sao alen kiểu dại duy nhất còn lại của mợt gen ức chế khối u và có thể xuất
hiện theo các cơ chế khác nhau: mất tồn bợ NST; tái tổ hợp trong nguyên phân hoặc các
đột biến cục bộ. Kết quả là mất các gen ức chế khối u diễn ra nhanh hơn ở các tế bào ung
thư so với ở các tế bào tiền khối u [19, 28]. Theo cơ chế di truyền, các gen ức chế khối u
(dạng đột biến) thường là lặn trong khi các gen gây khối u là trội. Một gen trội như gen
gây khối u thường biểu hiện ngay kiểu hình trong khi hiệu quả kiểu hình của các gen ức
chế khối u đột biến thường bị hạn chế bởi hoạt đợng của alen bình thường và chỉ được
biểu hiện khi alen bình thường cịn lại bị mất đi. Nhìn chung, nếu như các gen ức chế
khối u là lặn thì đột biến của một gen ức chế khối u lại là tính trạng trợi. Như vậy, dù

NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33

6

TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ

một sự kiện di truyền hiếm xảy ra, song trong một quần thể tế bào lớn thì khả năng chúng
xuất hiện vẫn là cao [19].
Một số gen ức chế khối u bị biến đổi đã được phát hiện là nguyên nhân gây ra các
loại ung thư phổ biến cho tới nay. Ví dụ như APC là một gen ức chế khối u nằm trên
NST số 5 có liên quan đến sự phát triển của bệnh ung thư ruột già. Ở cả hai trường hợp
ung thư đơn phát và di truyền, LOH đều dẫn đến làm mất hoàn toàn các alen APC kiểu
dại. Phần lớn các đột biến làm bất hoạt gen APC dẫn đến sự hình thành các protein APC
bị rút ngắn. Mợt gen khác được tìm thấy bị mất trong nhiều trường hợp ung thư đơn phát
ở người nằm trên NST 9p được gọi là CDKN2A. Các protein CDKN2A được mã hóa bởi
các dạng biến dị mất khả năng liên kết và ức chế enzymee Cdk4, vì vậy enzyme này thúc
đẩy sự tăng sinh của tế bào, gây ra ung thư [19, 22, 28]. Gen ức chế khối u TP53 đã được
công nhận là một gen kháng ung thư quan trọng đối với hầu hết các bệnh ung thư ở
người. Các đợt biến ở TP53 được tìm thấy trong nhiều loại ung thư với các tần số khác
nhau (5-90%), xuất hiện ở cả ung thư qua dòng sinh dục và ung thư đơn phát [19, 23,
36]. IARC duy trì mợt cơ sở dữ liệu mô tả tất cả các biến thể của gen TP53 đã được báo
cáo trong nhiều tài liệu khoa học [60]. Hơn 30.000 biến thể somatic được biên soạn, kèm
theo chú thích về kiểu hình khối u, đặc điểm bệnh nhân, các tác động cấu trúc và chức
năng của đột biến [27, 60]. Hầu hết các đột biến ở TP53 là những thay thế đơn amino
acid nằm trong miền liên kết DNA, dẫn đến làm gián đoạn cấu trúc ba chiều của miền
gắn kết DNA và làm thay đổi chức năng quan trọng của p53. Một số điểm nóng thường
xảy ra đợt biến như codon 175, 248, 273, 220, và 245 được tìm thấy trong nhiều loại ung
thư, trong khi một số đột biến khác được phát hiện ở những loại ung thư đặc biệt như
codon 249 trong ung thư gan, hoặc codon 280 và 285 trong ung thư bàng quang [23].
TP53 đợt biến có thể được sử dụng như là dấu hiệu chẩn đoán và tiên lượng về ung thư
trong phịng khám. Mợt số loại thuốc hướng tới con đường p53 đang được phát triển [3].
Các đột biến TP53 cũng được coi là dấu hiệu thông tin cho sự phơi nhiễm chất gây ung
thư. Thực tế, các mơ hình đợt biến TP53 cụ thể đã được mơ tả liên quan đến việc tiếp
NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33

7


TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ

xúc với tia cực tím trong ung thư da, khói thuốc lá trong ung thư phổi, chất aflatoxin
trong ung thư gan, hoặc axit aristolochic trong các bệnh ung thư ống mật thượng. TP53
đợt biến có thể là dấu hiệu hữu ích trong các nghiên cứu dịch tễ học phân tử để điều tra
nguyên nhân khối u. Việc phát hiện ra các đột biến TP53 ở hội chứng Li-Fraumeni là
một cột mốc phát triển của lĩnh vực ung thư học: lần đầu tiên nguy cơ mắc ung thư có
thể dự đốn trên cơ sở phân tích di truyền [19]. Trong nhiều trường hợp, TP53 không bị
bất hoạt bởi đột biến mà bị bất hoạt bởi sự hoạt hóa của mợt gen gây khối u đối vận với
nó xuất hiện ở cấp đợ sau dịch mã và được điều hòa bởi mối tương tác protein/protein
như: MDM2, protein gây khối u E6 [24, 28].
1.1.2.2. Con đường phát sinh ung thư
Con đường phát sinh ung thư phần lớn được cho là bắt nguồn từ một tế bào ban đầu
duy nhất. Khi một đột biến soma xuất hiện ở mợt tế bào đơn lẻ, đợt biến đó sẽ được nhân
rộng nếu tế bào đột biến bắt đầu phân chia và hình thành nên các thế hệ gồm nhiều tế bào
con đều chứa alen đột biến. Các gen ung thư tạo ra ưu thế chọn lọc cho phép tế bào mang
gen phát triển lấn át các tế bào xung quanh và phá vỡ sự cân bằng nội mô. Nếu mợt gen
tạo ra mợt kiểu hình làm tăng tốc độ sản sinh của tế bào mới hoặc ngăn cản sự chết đi của
tế bào trưởng thành, thì các tế bào mang gen đó sẽ có số lượng vượt trợi so với các tế bào
khác trong cùng khu vực cư trú của mơ, dẫn đến hình thành khối u. Mặc dù các tế bào ung
thư trao đổi chất kém hiệu quả về mặt năng lượng và gây độc với môi trường, nhưng lại
phụ tḥc vào nguồn cung oxy ít hơn bởi chúng tăng cường hoạt động của con đường
đường phân, nhờ vậy có thể thích nghi được với điều kiện ổ sinh thái tế bào vốn không
phù hợp cho các tế bào bình thường. Khối u phát triển thành ung thư thực tế là sản phẩm
hiếm gặp của quá trình tiến hóa theo dịng của các tế bào gồm 2 bước cơ bản: sự phát sinh
đột biến soma và sự lan rợng của các dịng tế bào tới các ổ sinh thái tế bào. Các đột biến

soma tạo ra các kiểu hình thích nghi hơn cho sự tồn tại và tăng sinh, cịn sự lan rợng của
các tế bào lại cung cấp các mục tiêu đột biến mới. Các tế bào ung thư không đáp ứng đúng

NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33

8


TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ

với các tín hiệu ức chế phân bào, các tín hiệu thể dịch và các tín hiệu trao đổi chất khác
vốn có thể ngăn cản sự phân bào quá mức ở các tế bào bình thường [19, 28, 41].
Xét về cơ chế phân tử, đột biến gen là nguyên nhân hàng đầu dẫn tới sự phát sinh
ung thư trong cơ thể người. Sự tích lũy các gen đợt biến gây ung thư trong cơ thể có thể
diễn ra theo ba con đường: (1) được truyền qua dịng sinh dục, (2) do đợt biến tự phát
trong tế bào soma, và (3) do sự lây nhiễm của virus. Kết quả chung là tạo ra nhiều đợt
biến DNA có thể làm thay đổi cấu trúc và chức năng gen, hình thành dạng biến đổi mới,
hay alen mới. Các đột biến nhỏ ảnh hưởng đến đoạn ngắn trên phân tử DNA như: thay
thế đơn nucleotide làm thay đổi một cặp bazơ duy nhất trên DNA; đột biến lớn làm mất
hoặc thêm những đoạn DNA nhỏ (<20 bp) hoặc lớn (>20 bp). Hậu quả của các đột biến
trong trình tự DNA đều có thể biến gen bình thường thành gen ung thư. Tuy nhiên, mức
độ tác động của đợt biến tới sự phát sinh ung thư cịn phụ thuộc vào bản chất của đột
biến, gen bị đột biến, vùng cấu trúc của gen bị đột biến và bản chất của đợt biến. Ví dụ,
đợt biến xảy ra trong vùng ORF có thể gây ảnh hưởng đến chức năng protein, đợt biến
trong các intron lại ít gây hậu quả nghiêm trọng. Các đột biến xảy ra trong các vùng
promoter, vị trí bắt đầu dịch mã, hay tại bợ ba kết thúc dịch mã đều có thể thay đổi chức
năng gen. Ngồi ra, các dạng đợt biến lớn hơn làm đứt gãy các NST dẫn đến các đột biến
chuyển, mất hay đảo đoạn NST, chủ yếu xảy ra ở các đột biến soma [19, 28].
Sự phơi nhiễm với một số nhân tố môi trường nhất định làm tăng nguy cơ phát
sinh một số dạng ung thư phổ biến như: khói thuốc lá, tia UV, bức xạ ion, Aflatoxin

B1… Các nhân tố mơi trường có thể chuyển trực tiếp các gen bình thường thành các gen
ung thư thơng qua phát sinh đợt biến trên trình tự DNA hoặc thúc đẩy sự tăng sinh của
các tế bào đã tích lũy đợt biến. Phần lớn các tác nhân gây ung thư có thể tạo ra một môi
trường cục bộ nhờ đáp ứng viêm để các đợt biến có xu hướng dễ xảy ra, đồng thời là môi
trường thuận lợi cho các tế bào mang các gen ung thư phát triển mạnh [27, 28].

NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33

9


TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ

1.1.3. Nghiên cứu điều trị ung thư hiện nay
1.1.3.1. Điều trị ung thư bằng các phương pháp truyền thống
Điều trị ung thư tiến hóa và phát triển song song với kiến thức của loài người về
y học. Các phương pháp truyền thống áp dụng chữa trị ung thư từ trước đến nay được sử
dụng phổ biến là: phẫu thuật, hóa trị và xạ trị. Mục đích chính của phẫu thuật là cắt bỏ
các mơ ung thư và có thể cùng với mợt số mô lành xung quanh để đảm bảo rằng tất cả
các tế bào ung thư được loại bỏ ra khỏi cơ thể một cách triệt để, chủ yếu áp dụng đối với
các khối u đặc. Phương pháp xạ trị thì sử dụng những hạt năng lượng cao hoặc các tia
X-quang, tia Gamma, chùm tia điện tử hoặc proton để phá hủy vật chất di truyền trong
các tế bào ung thư dẫn tới làm mất khả năng phát triển và lây lan của chúng. Suốt nhiều
thập kỷ qua, xạ trị được chứng minh giúp điều trị triệt để nhiều loại ung thư, song nó
cũng có hạn chế là gây tổn thương cả những mơ bình thường xung quanh. Phương pháp
hóa trị liên quan đến việc sử dụng các thuốc chống ung thư, và giống như xạ trị, sẽ hủy
diệt các tế bào ung thư bằng cách làm tổn hại DNA của chúng. Hóa trị là mợt dạng điều
trị toàn thân tác đợng đến tồn bợ các tế bào đang phát triển nhanh, do đó gây ra các tác
dụng phụ như bị rụng tóc và tiêu chảy [27, 58].
Đơi khi các biện pháp phẫu thuật, xạ trị và hóa trị có thể được kết hợp để điều trị

tốt hơn một loại ung thư cụ thể. Chẳng hạn như, xạ trị có thể được sử dụng trước để làm
thu nhỏ khối u, từ đó các bác sĩ dễ dàng hơn trong việc phẫu thuật cắt bỏ nó. Tuy nhiên
các phương pháp truyền thống này đều mang lại những tác dụng phụ gây tổn thương và
đau đớn cho người bệnh. Đối với trường hợp di căn thì khó có thể loại bỏ hồn tồn tế bào
ung thư ra khỏi cơ thể. Do đó, phẫu thuật, hóa trị hay xạ trị vẫn cịn những điểm yếu cần
được cải tiến hoặc thay đổi phương pháp [28].

NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33

10


TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ

1.1.3.2. Điều trị ung thư bằng liệu pháp điều trị đích
Liệu pháp điều trị đích là mợt loại đặc biệt của hóa trị sử dụng các loại thuốc hoặc
các chất để ngăn chặn sự phát triển và lây lan của ung thư thơng qua tác đợng vào các
phân tử cụ thể có liên quan. Phương pháp này lợi dụng sự khác biệt nhỏ giữa các tế bào
bình thường và các tế bào ung thư. Hầu hết các liệu pháp hóa trị sử dụng thuốc nhằm
giết chết các tế bào trong cơ thể đang phát triển hoặc phân chia khơng kiểm sốt, bao
gồm các tế bào ung thư và cả các tế bào bình thường khác cũng bị ảnh hưởng. Để khắc
phục hạn chế này, liệu pháp điều trị đích nhằm vào các đặc điểm mà chỉ có ở tế bào ung
thư mà khơng có ở tế bào bình thường, vì vậy sẽ hạn chế tác dụng phụ, điều trị bệnh hiệu
quả hơn, đặc biệt là đối với trường hợp ung thư đã bước vào giai đoạn di căn [27, 35,
58]. Một số các phương pháp điều trị đích đã sử dụng như: miễn dịch trị liệu làm tăng
cường hệ miễn dịch của cơ thể để chống lại khối u; liệu pháp hormone làm thay đổi
lượng hormone trong cơ thể để ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư, áp dụng đối
với các bệnh ung thư liên quan đến hormone như ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt [35].
Sự phát sinh các tế bào ung thư thường là do sai hỏng trong DNA làm cho tế bào
hoạt động mạnh mẽ hơn, điển hình là tạo ra nhiều RNA và protein hơn so với mức bình

thường. Liệu pháp điều trị đích sẽ tác động lên DNA, RNA hoặc protein sai hỏng để làm
giảm bớt hay loại bỏ những tác động tiêu cực gây nên cho tế bào, từ đó dẫn đến ức chế
hay loại bỏ các tế bào ung thư. Tuy nhiên, ung thư phát triển với nhiều dòng tế bào khác
nhau nên thông thường đối với mỗi loại ung thư sẽ có tương ứng mợt phương pháp điều
trị đích phù hợp. Ngồi ra, mợt phương pháp khác là liệu pháp gen nhằm thay thế gen
bệnh bằng một bản sao của gen khỏe mạnh làm cho các tế bào ung thư được kiểm sốt
q trình phân chia như các tế bào bình thường. Đây là mợt lựa chọn điều trị đầy hứa
hẹn nhưng vẫn tiềm tàng nguy hiểm và cần được nghiên cứu nhiều hơn [35, 47].

NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33

11


TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ

1.2. P53 và các nghiên cứu biểu hiện p53 ứng dụng điều trị ung thư
1.2.1. Tổng quát về TP53 và protein tương ứng
1.2.1.1. Cấu trúc gen TP53 và protein tương ứng
Gen mã hóa cho protein p53 là mợt gen ức chế khối u - TP53. Ở người, gen TP53
nằm ở cánh ngắn của NST số 17 (17p13.1), kích thước khoảng 20 kb. Gen bao gồm 11
exon trong đó exon đầu tiên là exon khơng mã hóa, theo sau là mợt intron lớn đầu tiên dài
khoảng 10 kb, vùng mã hóa nằm ở giữa exon thứ 2 cho đến giữa exon thứ 11 (Hình 1.1).

Hình 1.1. Cấu trúc gen TP53 và protein tương ứng
Chú thích: E1-E11: các vùng exon của gen TP53 và độ dài tương ứng; NLS: tín hiệu định vị nhân;
NES: tín hiệu rời nhân, N-terminal, C-terminal: đầu N và đầu C của protein p53.

Gen TP53 mã hóa cho sản phẩm tương ứng là protein p53 có nhiều chức năng sinh
học quan trọng trong cơ thể người. Tên gọi “p53” được bắt nguồn từ thí nghiệm điện di

protein trên gel SDS-PAGE, người ta nhận thấy xuất hiện băng protein có kích thước
khoảng 53 kDa. Tuy nhiên, dựa vào việc tính tốn trực tiếp từ các gốc amino acid thì khối
lượng thực sự của p53 là khoảng 43,7 kDa. Sự khác nhau này là do số lượng lớn các gốc

NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33

12


TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ

proline gắn trong chuỗi polypeptit, dẫn đến khả năng di chuyển của protein này chậm hơn
trên bản gel polyacrylamide [29, 36, 39]. Protein p53 chứa 393 amino acid [36, 39], bao
gồm các vùng cấu trúc đặc trưng (Hình 1.1): vùng kích hoạt (1-42 amino acid) có chức
năng hoạt hóa q trình phiên mã và tương tác với MDM2; vùng giàu proline có vai trị
điều hịa hoạt đợng của gen TP53 và liên quan đến quá trình pro-apoptosis; vùng liên kết
với DNA tại các trình tự đặc biệt - đây là vị trí chủ yếu cho 90% đột biến xảy ra ở protein
này và gây nên ung thư ở người; vùng oligomer có chức năng tạo cấu trúc bậc 4 của p53;
vùng đầu C-terminal có chức năng điều hịa sự gắn kết giữa protein p53 với DNA đích;
ngồi ra cịn có ba tín hiệu định vị nhân NLS nằm ở C-terminal và tín hiệu rời nhân NES
nằm ở vùng N-terminal [21].
1.2.1.2. Cấu trúc không gian của protein p53
Cấu trúc monomer của protein p53 được cấu tạo bởi hai nếp gấp β nằm song song
với nhau cùng với các yếu tố khác hình thành nên một bề mặt gắn với DNA. Tuy nhiên
trong tế bào, protein p53 tồn tại ở dạng tetramer gồm bốn tiểu đơn vị protein p53 được
liên kết với nhau thông qua vùng oligomer ở đầu C và liên kết với DNA tại vùng gắn
đặc hiệu với DNA (hình 1.2). Tetramer được hình thành từ hai dimer của p53 ghép lại.
Mỗi dimer lại được hình thành từ hai monomer thơng qua liên kết liên phân tử giữa các
tấm β song song. Hai dimer lại liên kết với nhau thông qua tương tác kỵ nước tạo thành
tetramer chặt chẽ và có sự ổn định cao với nhiệt độ. Trung tâm của tetramer là các chuỗi

bên Leu344 từ tất cả các monomer tiếp xúc trực tiếp với nhau. Phần đầu của vùng kích
hoạt trên bốn monomer có thể liên kết được với bốn phân tử MDM2. Bình thường trong
tế bào, cấu trúc tetramer của protein p53 bao gồm bốn monomer liên kết với phân tử
DNA đích và bốn phân tử MDM2 [11, 36, 39].

NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33

13


TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử protein p53 [5]
Chú thích: (A) 2 dimer là 2 mặt phẳng hình chữ nhật đối mặt tạo thành tetramer p53 với 3 trạng thái
tương tác với DNA (màu cam): (i) chỉ 1 dimer (màu xanh hoặc màu đỏ) tương tác với DNA; (ii) các
cạnh ngắn hơn của 2 dimer tương tác dọc theo đường xoắn DNA; (iii) DNA nằm trên các cạnh của
2 dimer. (B và C) các góc chiếu của tetramer p53 tương ứng với mơ hình (ii). Core: vùng lõi gắn đặc
hiệu với DNA. NT, CT: đầu N và đầu C không tương tác với DNA; Ctc: đầu C tương tác với DNA.

NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33

14


TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ

1.2.1.3. Chức năng sinh học của p53
Protein p53 do TP53 mã hóa đã được chứng minh có khả năng ức chế tín hiệu
tăng sinh tế bào, nâng cao hiệu quả của các chất ức chế tăng trưởng, làm cho tế bào bước
vào quá trình tự chết, ngăn chặn sự sao chép liên tục thơng qua lão hóa, thúc đẩy ổn định

gen và kiềm chế sự di căn. Trong tế bào bình thường, protein p53 được duy trì với nồng
đợ thấp nhờ sự phân hủy của proteasome. Chỉ khi tế bào có các tín hiệu stress hay thiệt
hại về DNA thì p53 mới được sản xuất với số lượng nhiều hơn. P53 kiểm sốt chu trình
tế bào tại các điểm kiểm tra bằng cách tương tác với các yếu tố như 14-3-3σ, Cdc25C,
p21, GADD45 nhằm làm ngăn chặn hay cho phép tế bào phân chia. Đồng thời, p53 đóng
vai trị là mợt nhân tố phiên mã thúc đẩy sản xuất các protein có liên quan đến sửa chữa
DNA. Nếu sự sai hỏng DNA khơng thể sửa chữa, p53 sẽ kích hoạt cơ chế tự chết
apoptosis để ngăn chặn việc tăng sinh các tế bào bất thường [23, 33, 39].
1.2.2. Trình tự nhận biết đặc hiệu của p53 trên các gen mục tiêu
Một trong những chức năng quan trọng của p53 là đóng vai trị như mợt nhân tố
phiên mã, điều khiển sự biểu hiện của nhiều gen liên quan bằng cách gắn vào các trình
tự đặc biệt nằm trên các gen mục tiêu như mdm2, Bax, p21,... Sự phá vỡ liên kết giữa
p53 và các trình tự gắn đặc hiệu liên quan đến 50% các loại ung thư đã biết. Điều này
làm nổi bật tầm quan trọng của tương tác giữa p53 với các trình tự DNA cụ thể. Các vị
trí liên kết đồng nhất của p53 được xác định trong ống nghiệm bao gồm hai trình tự
decamer (10 nucleotide), hoặc half-site (mợt nửa cấu trúc), với motif chung là
RRRCWWGYYY (trong đó R = A, G; W = A, T; Y = C, T). Hai trình tự decamer cách
nhau khoảng 0–13 bp. Tuy nhiên, các vị trí nhận biết tự nhiên trong cơ thể người được
xác định có ít cấu trúc DNA chứa khoảng đệm ở giữa hai trình tự decamer này [9, 10].
Mức đợ liên kết với DNA và kích hoạt phiên mã thay đổi đáng kể trong số các gen
được điều hòa bởi p53, do sự thay đổi trong từng yếu tố đáp ứng, sự sắp xếp các nucleotide
bên trong trình tự của chúng, số lần lặp lại và vị trí của trình tự nhận biết đối với vị trí bắt

NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33

15


TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ

đầu. Các cấu trúc tinh thể của phức hợp p53DBD/DNA cho thấy rằng hai nucleotide WW
ở một nửa cấu trúc không được liên kết trực tiếp trong phức hợp với p53DBD. Tuy nhiên,
vị trí này được bảo tồn cao trong các trình tự nhận biết của p53 (p53REs) tự nhiên, với sự
ưu tiên liên kết chặt hơn đối với A-T và A-A, và hiệu quả liên kết hạn chế ở T-A. Hơn nữa,
sự thay đổi trong hai vị trí WW gây ra những thay đổi đáng kể trong hoạt động gắn kết, với
các chuỗi chứa A-T thì hoạt tính liên kết cao hơn đáng kể [9, 45, 53, 54]. Năm 2010, nhóm
nghiên cứu của Itai Beno và cộng sự đã chỉ ra rằng motif CWWG được tìm thấy ở trung tâm
của mỗi trình tự gắn đặc hiệu của p53, là mợt nhân tố chủ chốt trong các tương tác p53/DNA.
Các thí nghiệm EMSA trên gel điện di polyacrylamide cho phép quan sát trực tiếp các phức
hợp oligomer khác nhau được hình thành giữa p53DBD và các vị trí mục tiêu của nó. Nhóm
nghiên cứu đã chứng minh rằng p53DBD liên kết với các trình tự p53REs đặc biệt có chứa
motif CATG với sự hợp tác tương đối thấp ở cả hai dạng cấu trúc dimer và tetramer của
p53. Trong khi đó, p53DBD liên kết với các p53REs có trình tự chứa motif CAAG và CTAG
thì tính bám rất cao. Sự tương tác giữa p53DBD/DNA đã được chứng minh là phụ tḥc
vào trình tự nhận biết và hoạt động thông qua việc kết hợp các p53 tetramer. Chìa khóa cho
sự thay đổi khác nhau trong tương tác p53DBD/DNA là sự xoắn linh hoạt của mơ hình
CWWG trung tâm trong các vị trí liên kết với p53 [30].
Tính gắn đặc hiệu của p53 đối với các trình tự liên kết cũng được nhiều nghiên
cứu chứng minh từ rất sớm trong điều kiện in vitro. Chẳng hạn, gen mdm2 là mợt trong
những mục tiêu kích hoạt phiên mã nhờ p53 [6, 7, 17, 46]. Để xác định mối liên kết giữa
p53 và mdm2, nhóm nghiên cứu của Arie Zauberman và cộng sự (1995) đã khảo sát cấu
trúc và chức năng của vùng tương ứng trên gen mdm2 (hmdm2) ở người. Kết quả cho
thấy, hmdm2 chứa 1 promoter intron (promoter nằm trong intron) phụ thuộc vào p53.
Promoter này được kích hoạt trong cơ thể với sự hiện diện của p53 tự nhiên, dẫn đến
việc sản xuất các mRNA. Promoter hmdm2 intron chứa hai vị trí nhận biết của p53 liên
tiếp. Khi xóa bỏ yếu tố nhận biết thì nhận thấy khơng có sự liên kết giữa p53 và promoter
intron. Do đó, hoạt đợng promoter tối ưu yêu cầu p53 gắn đồng thời với cả hai yếu tố;
NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33

16

TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ

điều này có thể giúp ngăn chặn sự kích hoạt sớm của promoter bởi p53 [6]. Nhóm nghiên
cứu của Jie Li (2015) cũng cho kết quả tương tự về tương tác của p53 và miRNA.
miRNA-138 là chất ức chế khối u tiềm tàng có các chức năng sinh học khác nhau bao
gồm vai trò trong sự phát triển của khối u, sự di căn của tế bào, tổn thương DNA. Sự
biểu hiện miR-138 thường thấp trong ung thư tuyến giáp, ung thư phổi, ung thư cổ tử
cung... Khi phân tích trình tự nucleotide của miR-138, nhóm nghiên cứu nhận thấy có
hai trình tự gắn đặc hiệu của p53 ở hai vị trí khác nhau (3p21.32 và 16q13) gồm hai cấu
trúc decamer nằm tiếp giáp (khơng có khoảng đệm). Khi đợt biến hai trình tự này thì
khơng nhận thấy sự gắn kết giữa p53 và miR-138 trên gel điện di của phương pháp
EMSA [32]. Như vậy, p53 thực hiện nhiều chức năng sinh học thông qua sự liên kết với
mục tiêu tại các trình tự đặc biệt. Đặc điểm này có thể được sử dụng như mợt bằng chứng
xác định hoạt tính sinh học của p53 tái tổ hợp đối với các tế bào ung thư ở người.

1.2.3. Những nghiên cứu về biểu hiện protien p53 tái tổ hợp
Sự thiếu hụt p53 hay p53 mất chức năng trong tế bào ung thư rõ ràng là một trong
những nguyên nhân hàng đầu khiến tế bào ung thư mất kiểm soát về sự tăng tưởng, khơng
sửa chữa được DNA và khơng có q trình apoptosis. Do vậy, xu hướng nghiên cứu bổ
sung p53 vào tế bào ung thư đã được các nhà nghiên cứu tiếp cận từ hai hướng khác nhau.
Phương hướng thứ nhất là áp dụng liệu pháp gen để khơi phục hoạt tính sinh học
cho p53 đã bị sai hỏng. Phương pháp này sử dụng virus để chuyển DNA ngoại lai (chẳng
hạn như chuyển gen p53 dạng dại) vào các tế bào ung thư giúp q trình apoptosis có
thể được diễn ra và ức chế sự tăng sinh quá mức của tế bào. Các virus được sử dụng cho
liệu pháp gen như: retrovirus và adenovirus để nhân lên, gây apoptosis và ức chế sự tăng
sinh của các tế bào ung thư nhưng gần như khơng đáp ứng ở các tế bào bình thường [4,
15]. Phương pháp antisense và siRNA cũng có tác đợng tương tự. Trong một số trường
hợp ung thư do virus HPV gây ra, protein E6 của virus này gắn vào p53 gây bất hoạt. Sự

có mặt của siRNA sẽ làm bất hoạt protein E6 và làm cho p53 hoạt động trở lại [15]. Một

NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33

17