Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và ức chế tế bào ung thư của ricin tinh sạch từ hạt thầu dầu ricinus communis

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Thị Thơ

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG
THƢ CỦA RICIN TINH SẠCH TỪ HẠT THẦU DẦU (Ricinus communis)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Thị Thơ

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG
THƢ CỦA RICIN TINH SẠCH TỪ HẠT THẦU DẦU (Ricinus communis)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
Ts.Nguyễn Đình Thắng

Hà Nội - 2017


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới người thầy
tơi ln u q, Ts. Nguyễn Đình Thắng. Thầy là người đã ln tận tình dìu dắt,
hướng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tơi trong suốt q trình học tập và hoàn
thành luận văn này. Thầy cũng là người thắp lửa, truyền cho tôi cảm hứng và niềm
đam mê khoa học từ những ngày đầu bước chân vào con đường nghiên cứu. Xin
cảm ơn thầy đã tiếp nhận, ln quan tâm, động viên khích lệ và bao dung tới tơi.
Tơi xin chân thành cảm ơn tới Phịng Sinh học nano và ứng dụng, thuộc
Phịng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Enzyme và protein và Phịng thí nghiệm
Cơng nghệ tế bào động vật đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi trong suốt q
trình thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơnTs. Ngô Ngọc Trung, các thầy cơ, các anh chị và
các bạn trong nhóm nghiên cứu Phịng sinh học Nano và ứng dụng, nhóm nghiên
cứu Ung thư thực nghiệm đã luôn bên cạnh ủng hộ và hỗ trợ tơi trong q trình
nghiên cứu.
Tơi xin chân thành cảm ơnđến các thầy cô và cán bộ trong Khoa Sinh học,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt các thầy cô trong Bộ môn Sinh lý thực
vật và hóa sinh và Bộ mơn Sinh học tế bào đã ln tận tình truyền đạt cho tơi những
kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn thành viên trong Tổ chức
SYSDO Việt Nam, các thành viên trong Nhóm phát triển Dự án 88 và các bạn bè
thân hữu đã ln bên cạnh, khích lệ, là niềm động lực để tôi thay đổi và trở thành
một người trẻ tốt đẹp hơn.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, những người thân đã
ln bên tơi, động viên tơi trong những lúc khó khăn nhất và tạo điều kiện thuận lợi
nhất cho tôi để có thể tiếp tục học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Hà Nội, tháng 10 năm 2017

Nguyễn Thị Thơ

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... i
MỤC LỤC ............................................................................................................... ii
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... iv
DANH MỤC HÌNH.........................................................................................v
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT………………..............vii
MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN.................................................................................. 3
1.1.Giới thiệu về ung thƣ ....................................................................................... 3
1.1.1.Ung thư ........................................................................................................... 3
1.1.2.Đặc tính của tế bào ung thư .......................................................................... 4
1.1.3.Ung thư da ...................................................................................................... 4
1.2.Giới thiệu về ricin ............................................................................................. 7
1.2.1.Cấu trúc phân tử ricin ................................................................................... 9
1.2.2.Cơ chế gây độc của Ricin ............................................................................... 11
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 16
2.1.Đối tƣợng và vật liệu nghiên cứu .................................................................... 16
2.2.Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu ...................................................... 16
2.3.Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................................. 17
2.3.1.Phương pháp tách dịch chiết thô từ hạt thầu dầu ........................................ 17
2.3.2.Phương pháp tách chiết protein tổng số ....................................................... 17
2.3.3.Phương pháp tách chiết và tinh sạch Ricin .................................................. 18
2.3.3.1.Phương pháp tinh sạch ricin bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion DEAE –
sepharose .................................................................................................................. 18
2.3.3.2.Phương pháp tinh sạch ricin sử dụng sắc ký lọc gel sephadex G-100. ....... 18

2.3.3.3.Sử dụng phương pháp Bradford để định lượng nồng độ protein. ............... 19
2.3.3.4.Phương pháp thẩm tách miễn dịch .............................................................. 19
2.3.3.5.Phương pháp xác định độ tinh sạch của ricin ............................................. 20
2.3.3.6.Phương pháp khối phổ ................................................................................. 20

ii


2.3.4.Phương pháp thử khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn ............................ 20
2.3.5.Phương pháp đánh giá khả năng chống tế bào ung thư ............................. 21
2.3.5.1.Phương pháp nuôi cấy tế bào ...................................................................... 21
2.3.5.2.Phương pháp khảo sát độc tính của ricin tinh sạch lên tế bào .................... 21
2.3.5.3.Phương pháp khảo sát tác động của ricin lên khả năng tạo khối u in-vitro 22
2.3.5.4.Phương pháp đánh giá tác động của ricin tới mức độ biểu hiện của một số
protein marker của tế bào ........................................................................................ 23
2.3.5.5.Phương pháp đánh giá tác động của ricin tới quá trình apoptosis của tế bào
.................................................................................................................................. 24
2.3.6.Phân tích kết quả............................................................................................ 24
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 25
3.1.Kiểm tra hoạt tính của hạt thầu dầu .............................................................. 25
3.2.Thu dịch tách chiết và tinh sạch ricin từ hạt thầu dầu ................................. 28
3.2.1.Tách chiết protein tổng số .............................................................................. 28
3.2.2.Tinh sạch ricin từ protein tổng số ................................................................. 30
3.3.Khả năng kháng khuẩn của ricin tinh sạch ................................................... 36
3.4.Khả năng ức chế của ricin tinh sạch lên tế bào in vitro ................................ 37
3.4.1.Độc tính của Ricin lên tế bào ung thư da SKMEL28 và tế bào HaCaT. ..... 38
3.4.2.Khả năng ức chế quá trình tạo khối của ricin lên tế bào SKMEL28 in
vitro……………………...…………………………………………………………39
3.4.3.Tác động của ricin tới mức độ biểu hiện của một số protein marker của tế
bào.................. ...........................................................................................................42

KẾT LUẬN ............................................................................................................. 47
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................ 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 49

iii


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Cấu trúc protein ricin .................................................................................9
Bảng 1.2: Amino axit nội phân tử ricin.....................................................................10
Bảng 1.3: Vùng chức năng trong phân tử ricin .........................................................11
Bảng 3.1: Hiệu suất phân tách protein trong muối (NH4)2SO4 .................................29
Bảng 3.2: Quy trình 4 bước phân tách và tinh sạch ricin từ hạt thầu dầu .................33

iv


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Hình ảnh ung thư da [67]. ...........................................................................5
Hình 1.2: Con đường truyền tín hiệu MAPK trong tế bào động vật [64] ...................6
Hình 1.3: Hình ảnh cây Thầu dầu (Ricinnus communis) [63].....................................7
Hình 1.4: Hình ảnh hạt thầu dầu [63]..........................................................................8
Hình 1.5: Cấu trúc phân tử ricin [52] ..........................................................................9
Hình 1.6: Quá trình nhập bào và các con đường di chuyển của ricin trong tế bào
động vật [55]... ..........................................................................................................12
Hình 1.7: Cơ chế hoạt động của ricin [55] ................................................................13
Hình 1.8: Hai con đường chết theo lập trình của tế bào [58] ....................................14
Hình 3.1: Kiểm tra khả năng kháng khuẩn của dịch chiết hạt thầu dầu lên vi khuẩn
gram âm…….. ...........................................................................................................26

Hình 3.2: Kiểm tra khả năng kháng khuẩn của dịch chiết hạt thầu dầu lên vi khuẩn
gram dương…. ..........................................................................................................27
Hình 3.3: SDS-PAGE kiểm tra protein sau khi tủa với các nồng độ khác nhau của
(NH4)2SO4…… .........................................................................................................30
Hình 3.4: Hàm lượng protein qua các phân đoạn sau khi chạy sắc ký trao đổi ion
DEAE - sepharose .....................................................................................................31
Hình 3.5: Thẩm tách miễn dịch kiểm tra độ tinh sạch của ricin sau khi qua sắc ký
lọc gel Sephadex G100..............................................................................................32
Hình 3.6: Trình tự ricin từ EST gi|255587301 ..........................................................34
Hình

3.7:

Phổ

SFIICIQMISEAAR

khối

phổ
(B),

của

các

đoạn

peptide

HEIPVLPNR

SAPDPSVITLENSWGR

(C)

(A),
và

LSTAIQESNQGAFASPIQLQR (D) ........................................................................35
Hình 3.8: Tác động của ricin lên khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn sau khi
xử lý với ricin trong 24 giờ .......................................................................................36

v


Hình 3.9: Độc tính của ricin lên dịng tế bào HaCaT. ...............................................38
Hình 3.10: Độc tính của ricin lên dịng tế bào SKMEL28........................................39
Hình 3.11: Hình ảnh thể hiện tác động của ricin của lên khả năng tạo khối của tế
bào SKMEL28 ..........................................................................................................40
Hình 3.12: Kiểm tra khả năng tạo khối của tế bào sau khi xử lý với ricin ...............41
Hình 3.13: Biểu hiện và mức độ phosphoryl hóa ERK tại tế bào SKMEL28và
HaCaT tại nồng độ 3µg/ml........................................................................................43
Hình 3.14: Kiểm tra tác động của ricin lên quá trình apoptosis của tế bào SKMEL28
và HaCaT sau 36 giờ .................................................................................................44

vi


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Chữ

Viết đầy đủ

viết tắt

Nghĩa tiếng việt

2 - ME

2-Mercaptoethanol

2-Mercaptoethanol

BSA

Bovine serum albumin

Albumine huyết thanh bị

CFU

Colony forming unit

Đơn vị hình thành khuẩn lạc

DEAE

Diethylaminoethanol

ERK

Extracellular signal regulated kinase

Kinase điều hịa tín hiệu ngoại bào

FBS

Fetal bovine serum

Huyết thanh thai bò

HPR

Horseradish Peroxidase

Peroxidase cải ngựa

International Association for

Hiệp Hội Nghiên Cứu Mật Mã

Cryptologic Research

Quốc Tế

IACR
IC50

The half maximal inhibitory

Nồng độ gây chết 50%

concentration

LB

Luria-Bertani broth

Mơi trường LB

LD50

Lethal dose

Liều lượng gây chết trung bình

MAPK

Mitogen-activated protein kinase

Protein kinase hoạt hóa phân chia

MIC

Minimum Inhibitory Concentration

Nồng độ ức chế tối thiểu

PAGE

Polyacrylamide gel electrophoresis

Điện di trên gel polyacrylamide

PBS

Phosphate buffered saline

Dung dịch muối đệm phosphat

PI

Propidium iodide

Propidium iodide

RIP

Ribosome inactivating protein

Protein bất hoạt ribosome

RPMI

Roswell Park Memorial Institute

Môi trường RPMI

medium

RTA

Ricin toxic A chain

Ricin chuỗi A

RTB

Ricin toxic B chain

Ricin chuỗi B

SDS

Sodium dodecyl sulfate

TKR

Tyrosine kinase receptor

Thụ thể Tyrosine kinase

UPR

Unfolded protein response

Phản ứng mở protein

WHO

World Health Organization

Tổ chức Y tế Thế giới

vii


MỞ ĐẦU
Ung thư là nguyên nhân gây tử vong thứ 2 trên toàn thế giới với hàng triệu
ca mắc bệnh mới được phát hiện hàng năm. Theo thống kê của WHO, trong suốt 2
thập niên vừa qua số ca bệnh nhân ung thư đã tăng 70% và xu hướng tăng mạnh
trong những năm gần đây. Nguyên nhân gây ung thư có thể do thói quen sống, các
tác nhân độc hại từ mơi trường và di truyền. Hiện nay, ngồi một số bệnh ung thư
có khả năng ngăn ngừa bằng sử dụng vắc xin, việc điều trị ung thư chủ yếu phụ
thuộc vào khả năng phát hiện sớm và điều trị kết hợp các phương pháp như hóa trị,
xạ trị, miễn dịch để tiêu diệt tế bào ung thư. Tại các nước đang phát triển, ung thư là
một căn bệnh đáng lo ngại do cơ sở vật chất không đầy đủ gây khó khăn cho việc
chuẩn đốn sớm dẫn tới tỉ lệ tử vong cao. Bên cạnh đó, việc sử dụng thuốc điều trị
nhập ngoại có giá thành cao cũng là một gánh nặng về kinh tế cho người nhà bệnh
nhân và xã hội.
Ricin là một glycoprotein thuộc họ lectin, được tách chiết từ hạt thầu dầu.
Ricin được cấu tạo từ 2 chuỗi A và B được liên kết với nhau qua các cầu đisunfit.
Khi vào trong cơ thể người, ricin tác động thơng qua cơ chế ức chế q trình tổng
hợp protein trong ribosome.Ricin có độ độc tính rất cao và được xếp vào chất độc
nguy hiểm. Trong những năm gần đây, việc ứng dụng chất độc từ nguồn gốc tự
nhiên trong điều trị hóa trị ung thư rất được chú ý. Một số nghiên cứu định hướng
phát triển sử dụng ricin trong điều trị ung thư trên thế giới khẳng định ricin có tác
dụng ức chế q trình sinh trưởng và phát triển của một số dòng tế bào ung thư.Tại
Việt Nam, ngành công nghiệp sản xuất dầu thầu dầu thải bỏ hàng tấn bã thầu dầu

mỗi năm. Những sản phẩm thừa này yêu cầu phải có một quy trình thải bỏ đặc biệt
do vẫn chứa hàm lượng lớn ricin có độc tính cao và có khả năng nguy hại tới sức
khỏe cộng đồng.
Với mong muốn tận dụng những sản phẩm từ thiên nhiên này bên cạnh tiềm
năng ứng dụng cao về hoạt tính của ricin, chúng tơi quyết định tiến hành đề tài
―Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và ức chế tế bào ung thƣ của ricin tách
chiết và tinh sạch từ hạt thầu dầu (Ricinus communis)‖. Với vai trò là nghiên

1


cứu tiền đề trong sử dụng ricin trong điều trị ung thưhướng đích tại Việt Nam, đề tài
có các nhiệm vụ chính sau:
 Tách chiết và tinh sạch ricin từ hạt thầu dầu.
 Kiểm tra độc tính của ricin trên vi khuẩn và tế bào.
 Bước đầu nghiên cứu tác động của ricin lên các đặc tính của tế bào ung thư,
cụ thể là khả năng tác độngvào quá trình tăng sinh, khả năng tạo khối và chết
theo lập trình của tế bào ung thư da SKMEL28.

2


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về ung thƣ
1.1.1. Ung thư
Ung thư là một trong những căn bệnh đang được quan tâm nhất hiện nay.
Theo thống kê của WHO, ung thư là nguyên nhân gây tử vong thứ 2 trên toàn cầu
và chỉ đứng sau bệnh tim mạch [16,55]. Theo báo cáo của Word Cancer Report
năm 2015, trên toàn thế giới có gần 14 triệu trường hợp mới được chuẩn đoán và
8,2 triệu người bệnh nhân chết liên quan tới ung thư, chiếm gần gần 1/6 tỉ lệ tử

vong trên toàn thế giới. Số lượng bệnh nhân đã tăng 22 triệu trường hợp trong
vòng 20 năm vừa qua và con số này được dự đoán lên tới 21,7 triệu ca mắc bệnh
mới và 13 triệu trường hợp tử vong vào năm 2013[55]. Tại Việt Nam, số người
chết vì ung thư lên tới 94,700 người vào năm 2012 (theo thống kê của IACR) và
con số này có xu hướng gia tăng nhanh trong những năm gần đây. Năm loại ung
thư phổ biến ở Việt Nam là ung thư gan (17,6%), ung thư phổi (17,5%), ung thư
dạ dày (1,4%), ung thư vú (8,9%) và ung thư trực tràng (7%).
Ngoài nguyên nhân di truyền, ung thư có thể do một số nguyên nhân chính
như: do tia cực tím (UV) từ mặt trời hoặc các nguồn tiếp xúc khác, tỉ lệ chất béo
trong cơ thể cao, chế độ ăn uống không hợp lý, lười vận động, sử dụng thuốc lá và
rượu bia. Theo thống kê, thuốc lá là nguyên nhân hàng đầu và là tác nhân trực tiếp
dẫn tới 13 loại ung thư khác nhau. Rượu bia với thành phần chính là ethanol cũng
là tác nhân chính gây ung thư. Theo báo cáo của Hiệp hội Ung thư Hoa Kỳ, người
sử dụng nhiều hơn 50 gam ethanol mỗi ngày có tỉ lệ ung thư gấp 2 đến 3 lần so với
người không sử dụng rượu bia. Nhiều nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng tỉ
lệ trường hợp mắc bệnh ung thư phổi, ung thư dạ dày, ung thư trực tràng và ung
thư vú cao có nguyên nhân xuất phát từ sử dụng rượu bia và thuốc lá quá mức.
Bên cạnh đó, thực phẩm không đảm bảo, chứa dư lượng chất bảo vệ thực vật và
chất bảo quản cao, do chế độ ăn không hợp lý kết hợp béo phì cũng là nguyên
nhân lớn dẫn tới ung thư.

3


1.1.2. Đặc tính của tế bào ung thư
Tế bào ung thư là những tế bào có sự phát triển khơng bình thường, có khả
năng phát triển và sinh trưởng vượt qua chu trình tế bào bình thường. Hiện nay, đã
có hơn 100 loại tế bào ung thư được ghi nhận. Do các kiểu tế bào ung thư phát triển
từ các loại tế bào khác nhau, nên đặc điểm và tính chất của các kiểu ung thư cũng có
nhiều sự khác biệt. Tuy nhiên, các tế bào ung thư đều có khả năng sinh học nổi bật

để tạo nên tổ chức bệnh như: duy trì tín hiệu tăng sinh, trốn khỏi tín hiệu ngừng
tăng trưởng và chu trình chết của tế bào, phân chia không giới hạn, khả năng tạo
khối, di căn và tạo mạch máu khối u. Những đặc tính này xuất hiện do sự không ổn
định của hệ gen và q trình gây viêm. Hệ gen khơng ổn định và quá trình viêm
thúc đẩy hình thành khối u khi có tác động của chất gây ung thư hoặc ảnh hưởng từ
mơi trường.
Sự tăng sinh khơng kiểm sốt, hình thành khối tế bào và xâm lấn sang môi
trường xung quanh là đặc điểm thường nhận thấy của tế bào ung thư. Tuy nhiên, với
một số đặc điểm khác nhau về khả năng di chuyển, mức độ nguy hiểm và tính chất
khối u, ung thư được chia thành hai dạng: u lành tính và u ác tính. Khối u lành tính
(benign tumor) là những u có thế bào tăng sinh khơng kiểm sốt tuy nhiên khơng
lan rộng trong cơ thể và chỉ gây nguy hiểm khi xuất hiện tại những vị trí đặc biệt
như ung thư não. U ác tính (malignant) là những khối u nguy hiểm, có khả năng
xâm lấn mạnh ảnh hưởng tới các mơ bên cạnh và có khả năng di căn trong cơ thể.
1.1.3. Ung thư da
Ung thư da (melanoma) là một dạng ung thư ác tính của tế bào sắc tố da
(melanocytes). Melanoma chiếm tỉ lệ thấp (5%)trong tổng số ca mắc bệnh ung thư
nhưng lại là ung thư nguy hiểm nhất với tỉ lệ bệnh nhân chết lên tới 75%. Tế bào
sắc tố da là dạng tế bào xuất hiện dưới da, có nhiệm vụ tổng hợp sắc tố melanin.
Khi chịu tác động của các yếu tố gây ung thư như tia UV hoặc các yếu tố độc hại từ
môi trường làm ảnh hưởng tới hệ gen và các con đường chuyển hóa trong tế bào, tế
bào sắc tố chuyển dạng khơng bình thường và có nguy cơ trở thành tế bào ung thư
da. Ung thư da melanoma có đặc điểm tăng sinh nhanh và khả năng di căn cao.

4


Người mắc bệnh ung thư da có nguy cơ tử vong cao, trong toàn bộ ca mắc bệnh các
trường hợp sống hơn 5 năm chỉ chiếm 5 đến 15%.

Hình 1.1: Hình ảnh ung thƣ da [67].
Con đường truyền tính hiệu protein kinase hoạt hóa mitogen (MAPK) là con
đường chính truyền thơng tin, các tín hiệu phía bên ngồi màng tế bào vào trong tế
bào thông qua các thụ thể, protein và hàng loạt các phản ứng kinase. Con đường
truyền tín hiệu này giữ vai trị quan trọng trong q trình sống của tế bào như: quá
trình tăng sinh, phát triển, phân hóa tế bào, xâm lấn và apoptosis. Các con đường
MAPK đều bao gồm một mô đun kinase 3 lớp liên tiếp, cụ thể, khi nhận tín hiệu
đầu tiên từ các phối tử trên thụ cảm thể ngoài màng tế bào, một MAPK sẽ được kích
hoạt và tạo động lực kích hoạt hàng loạt MAPKK tới MAPKKK [29]. Nhiều cơng
trình nghiên cứu đã chỉ ra rằngrối loạn con đường tín hiệu ERK nói riêng và MAPK
nói chung và các yếu tố kích hoạt mitogen cũng có vai trị quan trọng trong hình
thành ung thư và xuất hiện tại giai đoạn sớm của ung thư. Các thể đột biến và hư
hỏng dẫn tới biểu hiện protein sai lệch và hình thành các đặc tính đặc trưng như tín
hiệu tăng sinh độc lập, tránh apoptosis, không nhạy cảm với các yếu tố tăng trưởng
và có sự phân chia khơng thời hạn của tế bào ung thư [23,29, 31].

5


Hình 1.2: Con đƣờng truyền tín hiệu MAPK trong tế bào động vật [64]
Con đường truyền tín hiệu RAS-RAF-MEK-ERK được thể hiện trên
Hình1.2.Đối với các dịng tế bào melanoma, các tổn thương liên quan đến ung thư
như các đột biến trên thụ thể tyrosine kinase (TKR), Ras và B-Raf hầu hết đều liên
quan và có vai trị quan trọng trong hình thành ung thư, dẫn tới tăng cường biểu
hiện của ERK trong tế bào làm thúc đẩy quá trình tăng sinh và khả năng xâm lấn
của tế bào [29].
Trong những năm gần đây, số lượng bệnh nhân ung thư trên toàn thế giới
vẫn tiếp tục gia tăng. Cuộc chiến chống ung thư luôn là mối quan tâm thường trực
của cộng đồng, xã hội và các nhà khoa học. Bên cạnh các hướng điều trị ung thư
truyền thống như hóa trị, xạ trị, phẫu thuật, nhiều hướng điều trị mới tiên tiến đã và

đang được tiếp tục phát triển (phương pháp miễn dịch, điều trị hướng đích, gen trị
liệu…). Là một trong những nỗ lực đó, nghiên cứu về ricin và phát triển loại protein
này để hạn chế ung thư hiện đang được thực hiện và rất được quan tâm.

6


1.2. Giới thiệu về ricin
Thầu dầu (Ricinus communis) là một loài trong họ Euphorbiacea, xuất hiện
nhiều tại khu vực nhiệt đới nóng ẩm như Châu Phi, Trung Á, Ấn Độ, Trung Quốc
và các nước Đông Nam Á. Từ thời cổ đại, thầu dầu được trồng rộng rãi với nhiều
ứng dụng khác nhau. Người Hy Lạp niên đại 2000 năm trướcCông Nguyên đã bắt
đầu dùng dầu thầu dầu ép từhạt với mục đích thắp sáng và làm đẹp. Tại Ấn Độ, hạt
thầu dầu được sử dụng với một lượng nhỏ để làm thuốc nhuận tràng, hay sử dụng
để diệt nấm và băng bó. Hiện nay, thầu dầu được canh tác và sử dụng nhiều tại khu
vực như Ấn Độ và Trung Quốc[19]. Nghành công nghiệp sản xuất dầu Thầu dầu
thải bỏ hàng triệu tấn bã hạt thầu dầu mỗi năm, với hàm lượng ricin độc hại cao và
có nguy cơ gây hại tới môi trường và sức khỏe cộng đồng. Tuy nhiên, sản phẩm thải
bỏ này có hàm lượng chất dinh dưỡng cao như Vitamin A, Vitamin C, Vitamin B6,
Sterol, Tannin….[20] và có thể ứng dụng trong nghành trồng trọt và chăn ni như
làm phân bón hữu cơ hay thức ăn gia súc sau khi đã xử lý độc.

Hình 1.3: Hình ảnh cây Thầu dầu (Ricinnus communis) [63]

7


Ricin là một protein lectin được tổng hợp trong cây thầu dầu và tập trung chủ yếu
tại hạt với tỉ lệ lên tới 1-5% theo khối lượng [60]. Ricin là một chất gây độc tự
nhiên màu trắngvà tác động tới tế bào thơng qua con đường tổng hợp protein.

Hình 1.4: Hình ảnh hạt thầu dầu [63]
Ricin có độc tính rất cao thông qua đường tiêm, miệng hoặc đường hô hấp;
tiếp xúc với lượng nhỏ ricin thông qua mắt hoặc vùng da bị tổn thương cũng gây
nguy hại nghiêm trọng. Sau 2 đến 5 ngày nuốt phải, người bệnh xuất hiện tổn
thương dạ dày, cơ, hệ thần kinh trung ương, thận, lá lách và gan tùy theo liều lượng
mắc phải. Ricin được xếp vào loại chất độc đặc biệt nguy hiểm theo phân loại độc
tính của Hoa Kỳ. Từ những năm 1800, nghiên cứu về độc tính của ricin đã được
tiến hành trên động vật và gần đây nhất, nhóm nghiên cứu Benson và cộng sự đã
xác định được liều gây chết 50% (LD50) khi tiêm trên chuột của ricin trong vịng 7
tiếng là 0,24µg/kg và 0,58µg/kg đối với chuột bạch [19]. LD50 đối với liều uống trên
chuột là 30mg/kg và ước tính LD50 trên người có giá trị từ 1 – 20mg/kg cơ thể [54].
Vì có độc tính mạnh, trong chiến tranh thế giới lần thứ hairicin đã được Hoa Kỳ và
Liên bang Xô Viết sử dụng như một loại vũ khí sinh học, và gần đây nhất, vào năm
2013 ricin được sử dụng với mục đích khủng bố tại Hoa Kỳ. Do vậy, hiện nay, ricin

8


đã bị nghiêm cấm mua bán, sử dụng thương mại và chỉ được sử dụng trong mục
đích khoa học.
1.2.1. Cấu trúc phân tử ricin

Hình 1.5: Cấu trúc phân tử ricin [52]
Ricin là loại protein ức chế ribosome tổng hợp protein (RIP) loại 2. Ricin
được tạo thành bởi 2 tiểu phần là chuỗi A (RTA~30kDA) liên kết với chuỗi B
(RTB~32kDA) bởi cầu liên kết đisunfit (Hình 1.5).
Bảng 1.1: Cấu trúc protein ricin [63]
Trình tự
Peptide tín hiệu

Vị trí

Hình ảnh vị trí trong phân tử

Độ dài

1 – 35

35

ChuỗiA

36 – 302

276

Liên kết

303 – 314

12

Chuỗi B

315 – 576

262

Ricin có khối lượng 64kDA và là chuỗi gồm 576 amino axit với các trình tự:

đoạn peptide tín hiệu, chuỗi A, liên kết 2 đoạn peptide và chuỗi B (Bảng 1.1). Cấu

9


trúc và các đặc điểm nội phân tử chuỗi amino axit của ricin được thể hiện trong
Bảng 1.2. Chuỗi A là một chuỗi N-glycosid hydrolase gồm 267 amino axit, chuỗi
có 3 domain với tỉ lệ xoắn alpha và gấp beta chiếm hơn 50% [44]. Chuỗi B là một
đoạn lectin gồm 262 amino axit, có khả năng bám glycolipid và glycoprotein bề mặt
màng tế bào thông qua liên kết β (1-4) galactose nhờ 2 vị trí bám galactose trên cấu
trúc (Bảng 1.3).
Bảng 1.2: Amino axit nội phân tử ricin [63]
Vị trí

Mơ tả

Hình ảnh vị trí trong phân tử

Độ dài

Glycosyl hóa

45 Glc-asparagine

1

Glycosyl hóa

271 Glc-asparagine

1

Liên kết disulfide

294 ↔ 318 Liên kết nội phân tử (chuỗi
A và chuỗi B)

Liên kết disulfide

334 ↔ 353

Liên kết disulfide

377 ↔ 394

Glycosyl hóa

409 Glc-asparagine

1

Glycosyl hóa

449 Glc-asparagine

1

Liên kết disulfide

465 ↔ 478

Liên kết disulfide

504 ↔ 521

Độc tính của ricin có được là do khả năng bất hoạt hóa ribosome q trình
thủy phân của một base adenine đơn (A4324) trên cấu trúc vòng sarcin-ricin (SRL)
của tiểu đơn vị lớn rRNA 28S. RTA có thể hoạt động đơn lẻ như một chất độc, tuy
nhiên để có thể vào được bên trong tế bào, RTA cần sự có mặt RTB với hai vị trí
đặc hiệu có khả năng liên kết với galactose trên bề mặt tế bào. Nhờ có RTB mà
RTA có thể bất hoạt ribosome, khác với các RIP loại I có khả năng bất hoạt cho
ribosome nhưng không thể gây độc cho tế bào do khơng có vị trí đặc hiệu có khả
năng xâm nhập vào tế bào. Các RTB cũng có hoạt tính lectin nhưng hồn tồn
khơng có khả năng bất hoạt Ribosome 28S như RTA.

10


Bảng 1.3: Vùng chức năng trong phân tử ricin [63]
Vị trí

Chức năng

Hình ảnh vị trí trong phân tử

Độ dài

Vùng 1

43 – 45 Bám Carbohydrat

3

Vùng 2

176 – 181 Bám Carbohydrat

6

Vùng 3

230 – 232 Bám Carbohydrat

3

Vùng 4

336 – 340 Bám Carbohydrat

5

Vùng 5

548 – 551 Bám Carbohydrat

4

Vùng 6

565 – 569 Bám Carbohydrat

5

1.2.2. Cơ chế gây độc của Ricin
Khả năng gây độc của ricin dựa vào cấu trúc dị dimer. Khác với các RIP loại
I khác, ricin có khả năng nhập bào thơng qua khả năng bám galactose hoặc Nacetylgalactosmine trên glycoprotein và glycolipid trên bề màng tế bào động vật.
Với một số tế bào đặc biệt biểu hiện thụ thể bề mặt manose như tế bào bạch cầu và
tế bào biểu mô gan chuột, ricin bám trực tiếp vào chuỗi oligosaccharide của các thụ
thể này[52]. Sau khi bám vào các thụ thể trên bề mặt màng tế bào, ricin đi vào trong
tế bào qua con đường nhập bào. Với mỗi loại thụ thể trên bề mặt tế bào khác nhau,
ricin có thể đi vào tế bào thông qua thụ cảm thể clathrin, không bào hoặc cơ chế
không phụ thuộc vào thụ cảm thể này (Hình 1.6c).

11


Hình 1.6: Quá trình nhập bào và các con đƣờng di chuyển của ricin trong tế
bào động vật [55]
Sau khi nhập bào, ricin được bao gói trong các bóng bào (Hình 1.6d). Những
bóng bào này sẽ di chuyển trong tế bào chất và đi vào những con đường khác nhau.
Cụ thể, phần lớn bóng bào chứa ricin sẽ trở lại màng tế bào và xuất bào (Hình 1.6f),
một số bóng bào chứa ricin sẽ dung hợp với lysosome và tiến hành phân cắt ricin
ngay trong các lysosome này (Hình 1.6g). Chỉ có khoảng 5% bóng bào chứa ricin
được vận chuyển thông qua con đường vận chuyển ngược (degrade transport

12


pathway) vào trong bộ máy Gơn gi (Hình 1.6h) và sau đó tới lưới nội chất (Hình
1.6i)[55]. Tại khoang lưới nội chất, cầu nối liên kết đisunfit giữa RTA với RTB bị

cắt đứt bằng enzyme đisunfit isomerase, sảnphẩm tạo thành là 2 chuỗi RTA và RTB
riêng biệt. Ricin RTA sau đó rời khỏi mạng lưới nội chất và đi vào trong tế bào
chất. Tại đây, một số phân tử RTA có thể tránh khỏi q trình phân hủy thơng qua
ubiquitin bằng cách ngăn chặn các đáp ứng UPR (đáp ứng giúp tế bào hồi phục khỏi
tác nhân stress của lưới nội chất). Ngược lại, RTB không trở về tế bào chất như
RTA mà chỉ tồn tại trong khoang lưới nội chất trước khi bị phân hủy bởi cơ chế
phục thuộc vào CDC48 và khơng bào.

Hình 1.7: Cơ chế hoạt động của ricin [55]
Trong tế bào chất, hoạt động của RIP gây những tổn hại không thểphục hồi
cho ribosome, chúng ức chế khả năng tổng hợp protein của ribosome bằng cách loại
bỏ một adenin trong chuỗi GAGA của vòng sarcin/ricin(SRL) [52]. Cụ thể, RTA

13


bám vào adenin vị trí 4324 (A4324) và loại bỏ đặc hiệu axit amin này khỏi vùng
trình tự bảo thủ của RNA ribosome 28S trong vịng sarcin/ricin (Hình 1.7).Vịng
sarcin/ricin là một trình tự lặp lại ngắn và có vị trí gần đầu 3’ của rRNA, RTA bám
vào vị trí này để thực hiện quá trình khử purin trên A4324. Sau khi bám vào vòng
sarcin/ricin, chuỗi RTA kẹp A4324 giữa 2 vòng tyrosin của vùng xúc tác và thủy
phân liên kết C-N glycosidic. Kết quả của quá trình thủy phân dẫn đến mất một
adenin tại vị trí 4324 (Hình 1.7B). Sự thay đổi này làm cho ribosome không thể
tương tác với yếu tố kéo dài chuỗi 1 (eEF-1) và yếu tố kéo dài chuỗi 2 (eEF-2), do
vậy ngăn chặn quá trình dịch mã và dẫn tế bào vào con đường chết theo lập trình
[55].

Hình 1.8: Hai con đƣờng chết theo lập trình của tế bào [58]
Theo các báo cáo gần đây, ngồi tác động ảnh hưởng tới q trình tổng hợp
protein của tế bào, ricin cịn có ảnh hưởng thúc đẩy tế bào bước vào apoptosis. Tế

bào động vật bước vào apoptosis theo 2 con đường chính là thơng qua thụ thể chết
(con đường ngoại bào) và con đường ty thể (con đường nội bào). Con đường

14


apoptosis thụ thể bắt đầu bằng thụ thể caspase 8 hoặc caspase 10, trong khi con
đường apoptosis nội bào bắt đầu bằng thụ thể caspase 9. Những caspase này sau đó
sẽ hoạt hóa caspase 3 và caspase 7 và bước vào con đường chết (Hình 1.6). Ricin có
vai trị tham gia vào con đường apoptosis nội bào thông qua tác động tới màng ty
thể dẫn đến giải phóng cytochrome c và cuối cùng hoạt hóa caspase 9 và dẫn tế bào
tới chu trình chết. Điều này được mơ hình hóa như trong Hình 1.8[55].

15


CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Đối tƣợng và vật liệu nghiên cứu
Hạt thầu dầu được cung cấp từ Viện Dược liệu và xác định tại Viện Hóa học

– Mơi trường qn sự, Bộ Tư LệnhHóa học, Bộ Quốc Phịng và Phịng thí nghiệm
Hóa sinh và Sinh lý học thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Trong nghiên cứu này chúng tơi sử dụng 2 dịng tế bào HaCaT và SK-MEL
28. Dòng tế bào HaCaT và dòng tế bào SK-MEL28 được cung cấp từ hãng ATCC
Hoa Kỳ.
Chúng tôi sử dụng 3 chủng vi khuẩn E.coli (ATCC® 25922™),
Staphylococcus aureus (ATCC® 25923™), Bacilus cereus (ATCC® 14579™), được

cung cấp từ hãng ATCC Hoa Kỳ; và chủng vi khuẩnVibrio vulnificus được phân lập
từ tôm mắc bệnh hoại tử gan tụy tại Viện Nuôi trồng thủy sản TW.
2.2.

Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
 Hóa chất:
-

Màng thẩm tích xelophan (ICN Biomedical)

-

Gel Sephadex G-100 (Amersham Biosciences)

-

DEAE Xenlulo (Armesham)

-

Ricin chuẩn (chuỗi A và chuỗi B) (Vectorlabs, Hoa Kỳ)

-

Hóa chất ni cấy tế bào: Mơi trường RPMI, FBS, Kháng sinh
Penicilin, PBS 1x (ATCC).

-

Kháng thể ERK, p-ERK, HPR (ATCC, Hoa Kỳ).

-

Cùng một số hóa chất khác được mua từ những hãng nổi tiếng như
Sigma, ATCC….đạt chuẩn trong nghiên cứu sinh học phân tử.

 Dụng cụ và vật tư tiêu hao
-

Buồng đếm tế bào (Malassez, Pháp)

-

Đĩa nuôi cấy đa giếng (SPL, Hàn Quốc)

-

Đĩa nuôi cấy tế bào 100mm (Corning, Hoa Kỳ)

-

Ống eppendorf 1,5 ml (Corning, Hoa Kỳ)

16