KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (dược LIỆU và dược cổ TRUYỀN) phân lập, xác định cấu trúc của một số hợp chất saponin từ phân đoạn butanol phần thân rễ sâm lai

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT SAPONIN TỪ PHÂN
ĐOẠN BUTANOL PHẦN THÂN RỄ SÂM LAI CHÂU
(PANAX VIETNAMENSIS VAR. FUSCIDISCUS K.
KOMATSU, S. ZHU & S.Q. CAI)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội - 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT SAPONIN TỪ
PHÂN ĐOẠN BUTANOL PHẦN THÂN RỄ
SÂM LAI CHÂU (PANAX VIETNAMENSIS
VAR. FUSCIDISCUS K. KOMATSU, S. ZHU
& S.Q. CAI)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa

:

Người hướng dẫn

:


LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này là kết quả cho quá trình học tập, rèn luyện của tơi tại Khoa Y
Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và quá trình nghiên cứu, thực hành tại Khoa Hóa
Thực vật – Viện Dược liệu.
Qua đây tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:
TS. Nguyễn Thị Duyên – Khoa Hóa Thực Vật – Viện Dược liệu, PGS.TS.
Dương Thị Ly Hương – Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã trực tiếp
hướng dẫn tơi hồn thành đề tài khóa luận này.
Lãnh đạo, thầy cô công tác tại Khoa Y – Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã
giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi được học tập, nghiên cứu tại khoa suốt 5 năm học qua.
Cán bộ nghiên cứu khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu, lãnh đạo Viện
Dược liệu, đặc biệt PGS.TS. Đỗ Thị Hà đã tạo điều kiện và giúp đỡ tơi trong q
trình tiến hành thực nghiệm.
Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống và trồng cây Sâm Lai
Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus K. Komatsu, S. Zhu & S.Q. Cai)”, mã
số: KHCN-TB.16C/13-18, do ThS. Phạm Quang Tuyến chủ nhiệm đã hỗ trợ kinh
phí để thực hiện nghiên cứu.
Gia đình, bạn bè những người ln ln tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ,
động viên tôi trong suốt thời gian học tập vừa qua.
Dù nhận được nhiều hướng dẫn và giúp đỡ nhưng bài khóa luận này khơng
tránh khỏi những thiết sót. Tơi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của các
thầy cơ để bài khóa luận của tơi được hồn thiện hơn.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 23 tháng 4 năm 2018
Sinh viên

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
BLC

Phân đoạn butanol Sâm Lai Châu

BuOH

Butanol

CC

Sắc ký cột (Column Chromatography)

DCM

Dicloromethan

DCMLC

Phân đoạn DCM Sâm Lai Châu

DL/DM

Dược liệu/Dung môi

EtOH

Ethanol

GLUT4

Protein màng tế bào ở cơ vân, cơ tim, mỡ và mơ khác
(Glucose transporter type 4)

HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)

IR

Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)

LPS

Lipopolysaccharid

M

Khối lượng phân tử (Mass)

m/z

Khối lượng/điện tích

MeOH

Methanol

Mp.

Điểm nóng chảy (Melting Point)

MS

Phổ khối (Mass Spectroscopy)

NF-κB

Yếu tố nhân kappa B (Nuclear Factor- Kappa B)

NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

PCA

Phản ứng phản
Anaphylaxis)

PRT4

Pseudoginsenosid

Rf

Hệ số lưu

SKĐ

Sắc ký đồ

vệ

thụ

động

(Passive

Cutaneous


TLC

Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

TLR4

Receptor của LPS (Tool-Like Receptor)

TLTK

Tài liệu tham khảo

TNF-α

Yếu tố hoại tử khối u (Tumor Necrosis Factor)

Treg

Regulary T cells

TT

Thứ tự

UV-Vis

Phổ tử ngoại (Ultra Violet – Visible)

v/v

Thể tích/ Thể tích

VKH&CNVN

Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam

WLC

Phân đoạn nước Sâm Lai Châu


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Các saponin có cấu trúc dạng protopanaxadiol trong Sâm Việt Nam........5
Bảng 1.2. Các saponin có cấu trúc dạng ocotillol trong Sâm Việt Nam.....................8
Bảng 1.3. Các saponin có cấu trúc dạng oleanolic trong Sâm Việt Nam...................9
Bảng 1.4. Các saponin có cấu trúc dạng panaxatriol trong Sâm Việt Nam................9

Bảng 1.5. Các saponin có cấu trúc dạng dammarenediol trong Sâm Việt Nam.......10
Bảng 3.1. Dữ liệu phổ của hợp chất LC05 và MR2................................................. 26
Bảng 3.2. Dữ liệu phổ hợp chất LC07 và Rb1......................................................... 30


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Hình vẽ Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv.......................4
Hình 1.2. Hình ảnh của Sâm Lai Châu Panax vietnamensis var. fuscidiscus..........13
Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn Sâm Lai Châu............................................. 20
Hình 3.2. Sắc ký đồ phân đoạn Sâm Lai Châu, Sâm Việt Nam, phát hiện bằng
thuốc thử H2SO4 trong cồn tuyệt đối, hơ nóng........................................ 21
Hình 3.3. Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao Sâm Lai Châu phân đoạn butanol.........23
Hình 3.4. Sắc ký đồ của MR2 và LC05.................................................................. 25
Hình 3.5. Cấu trúc hợp chất LC05 (majonosid R2)................................................ 28
Hình 3.6. Kết quả TLC LC07 với phân đoạn butanol............................................ 29
Hình 3.7. Cơng thức hợp chất LC07 (ginsenosid Rb1)........................................... 32


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ.......................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN.................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv........................2
1.1.1. Vài nét về chi Panax L............................................................................ 2
1.1.2. Vị trí phân loại Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv..........2

1.1.3. Đặc điểm thực vật Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv......3
1.1.4. Phân bố Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv.....................4
1.1.5. Thành phần hóa học Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv....4
1.1.6. Tác dụng sinh học của các hợp chất có trong Sâm Việt Nam Panax
vietnamensis Ha & Grushv.............................................................................. 10
1.2. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu – Sâm Lai Châu....................................... 11
1.2.1. Đặc điểm thực vật................................................................................. 12
1.2.2. Phân bố.................................................................................................. 13
1.2.3. Mối quan hệ di truyền giữa Sâm Lai Châu và Sâm Việt Nam...............13
1.2.4. Thành phần hóa học.............................................................................. 14
1.2.5. Tác dụng sinh học................................................................................. 14
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................15
2.1. Đối tượng.......................................................................................................... 15
2.2. Hoá chất, thiết bị............................................................................................... 15
2.2.1. Hoá chất................................................................................................ 15
2.2.2. Thiết bị.................................................................................................. 15
2.3. Phương pháp chiết xuất phân lập và xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết.......16


2.3.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập...................................................... 16
2.3.2. Phương pháp xác định và nhận dạng cấu trúc....................................... 17
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN............................................................ 20
3.1. Chiết các phân đoạn Sâm Lai Châu và phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn
butanol..................................................................................................................... 20
3.1.1. Kết quả chiết phân đoạn Sâm Lai Châu................................................. 20
3.1.2. Kết quả phân lập các hợp chất tinh khiết............................................... 22
3.1.3. Hằng số phân lập các hợp chất phân lập từ Sâm Lai Châu....................24
3.2. Biện luận cấu trúc các hợp chất phân lập được từ Sâm Lai Châu.....................25
3.2.1. Biện luận cấu trúc LC05....................................................................... 25
3.2.2. Biện luận cấu trúc LC07....................................................................... 28

3.3. Bàn luận............................................................................................................ 32
3.3.1. Về chiết xuất......................................................................................... 32
3.3.2. Về phân lập, tinh chế và nhận dạng cấu trúc các hợp chất.....................32
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................... 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


ĐẶT VẤN ĐỀ

Nền kinh tế - xã hội ngày càng phát triển và hiện đại hơn, kéo theo đó là nhu
cầu chăm sóc sức khỏe cho con người ngày càng tăng. Một trong những sản phẩm
chăm sóc sức khỏe con người đó là dược phẩm. Với sự phát triển của khoa học công
nghệ tiến bộ, các nhà khoa học luôn muốn tối ưu hóa cơng dụng của thuốc và hạn
chế tối đa tác dụng phụ của thuốc đó. Một trong các biện pháp hữu hiệu đang được
áp dụng đó là tạo ra các thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên thân thiện với con người.
“Sâm” là từ rất quen thuộc mà hay được dùng để nói về các lồi dược liệu
quý hiếm thuộc chi Panax L.. Có lẽ khi nghe đến Sâm ai cũng biết đến những công
dụng tuyệt vời của nó như: thuốc bổ, tăng lực, chống suy nhược, hồi phục sức lực bị
suy giảm, kích thích nội tiết sinh dục, tăng sức chịu đựng, giải độc và bảo vệ gan,
điều hoà thần kinh trung ương, điều hoà tim mạch, hạ huyết áp, giảm đường
huyết…[53]. Cũng vì những cơng dụng đáng nể đó, các lồi Sâm ln được chú
trọng tìm kiếm, nghiên cứu và phát triển.
Việt Nam nổi tiếng với loài Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha &
Grushv), đây là một trong những lồi Sâm có hàm lượng saponin rất cao. Năm
2013, Phan Kế Long cùng cộng sự đã phát hiện ra một thứ Sâm mới được đặt tên là
Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus), bậc phân loại dưới loài của
Sâm Việt Nam ở huyện Mường Tè, tỉnh Lai Châu [38]. Mặc dù các nghiên cứu sơ
bộ cho thấy Sâm Lai Châu cũng chứa hàm lượng saponin tương đối cao đem lại
những hiệu quả đáng chú ý, song cho đến nay, cịn khá ít những nghiên cứu chi tiết

về thứ Sâm này.
Vì vậy, để làm sáng tỏ thành phần hóa học cũng như giá trị sử dụng của Sâm
Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus) chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân
lập, xác định cấu trúc của một số hợp chất saponin từ phân đoạn butanol phần
thân rễ Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus K. Komatsu, S.
Zhu & S.Q. Cai)” với 2 mục tiêu cần đạt được:
1. Chiết xuất và phân lập một số hợp chất từ phân đoạn n-butanol.
2. Xác định và nhận dạng cấu trúc của các chất phân lập được trong phân đoạn.

10


CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1.Tổng quan về Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv.
1.1.1. Vài nét về chi Panax L.
Chi Nhân Sâm (Panax L.) là một chi nhỏ trong họ Ngũ gia bì (Araliaceae).
Tồn bộ chi Sâm (Panax L.) trên thế giới hiện đã biết chắc chắn có 14 lồi và 1
dưới loài (thứ-var.). Sự phân bố của chi Panax L. trên thế giới cho thấy chúng chỉ
xuất hiện ở Bắc bán cầu, kéo dài từ vùng rừng núi giáp bờ biển phía Đơng của Bắc
Mỹ bao gồm Bắc Hoa Kỳ và Tây-Nam Canada (có 2 lồi P. quinquefolius và P.
trifoliatus) [6,32,33]. Vùng Đông Bắc Á (gồm Viễn Đông Nga, Đông Bắc Trung
Quốc, bán đảo Triều Tiên và Nhật Bản) có 2 loài là P. ginseng và P. japonica.
Trung tâm phân bố của chi Panax L. có thể từ vùng Tây-Nam của Trung Quốc lan
tỏa xuống phía Bắc của Việt Nam. Thực chất khu vực này gồm 2 tỉnh biên giới kề
nhau là Vân Nam (Trung Quốc) và Lào Cai (Việt Nam), ở đây đang có tới 7 lồi và
dưới lồi (thứ) mọc hoàn toàn tự nhiên, 2 loài trồng là P. notoginseng (nhập từ Bắc
Mỹ) và P. pseudoginseng (khơng tìm thấy trong hoang dại, nhưng giả thiết có
nguồn gốc từ vùng cận Himalaya hoặc là kết quả của lai tự nhiên giữa 2 lồi gần gũi
nào đó). Đây có thể coi là trung tâm phân bố của chi Sâm (Panax L.) trên thế giới.

Ở Bắc Mỹ hiện có 3 lồi (P. notoginseng, P. quinquefolius và P. trifoliatus). Giới
hạn cuối cùng về phía Nam của chi Panax L. là lồi Sâm Việt Nam (Panax
o
vietnamensis) ở Miền Trung của Việt Nam, tại 14 15’ vĩ độ Bắc [6].
Ở Việt Nam, cho đến thời điểm hiện nay, chi Panax có chắc chắn 5 lồi,
trong đó có 2 lồi nhập trồng là Tam thất (P. notoginseng) và Nhân Sâm (P.
ginseng) [6]. Ba loài mọc tự nhiên và đang cần phải bảo tồn là Sâm vũ diệp (Panax
bipinnatifidus Seem.), Tam thất hoang (P. stipuleanatus Tsai & Feng) và đặc biệt là
Sâm Việt Nam (P. vietnamensis Ha & Grushv) – loài đặc hữu hẹp của miền trung
Việt Nam [6].
Cho đến gần đây, loại Sâm Lai Châu, một cây thuốc mới, ít được biết đến ở
Việt Nam đã được Phan Kế Long cùng cộng sự (2013) xác định gần nhất với thứ
Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus K. Komatsu, S. Zhu & S.Q.
Cai), một thứ mới cho khoa học của loài Sâm Việt (P. vietnamensis Ha & Grushv)
[38].
1.1.2. Vị trí phân loại Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv.
Sâm Việt Nam là một loài mới của chi Panax L., họ Nhân Sâm (Araliaceae),


là loài thứ 20 thuộc chi Panax được phát hiện trên thế giới và là loài thứ 3 của chi
Panax L. được tìm thấy và cơng bố chính thức ở Việt Nam. Đây là loài đặc hữu của
hệ thực vật Việt Nam (Theo Trung tâm Sâm Việt Nam - 1993) [54].
Về phân loại Sâm Việt Nam [53]:
- Giới: Plantae
- Ngành: Magnoliophyta
- Bộ: Apiales
- Họ: Araliaceae
- Chi: Panax
- Loài: Panax vietnamensis Ha & Grushv.
- Tên khác: Sâm Việt Nam, Sâm Ngọc Linh, Sâm Khu Năm, Thuốc Dấu.

- Tên nước ngoài: Vietnamese ginseng
1.1.3. Đặc điểm thực vật Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv.
Cây thân thảo sống nhiều năm, cao đến 1 m. Thân rễ mập có đường kính 3,5
cm, khơng có rễ, có củ gần hình cầu, đường kính 5 cm. Đốt trên cùng của thân rễ
tồn tại 1-4 thân. Thân nhẵn cao 40-80 cm, rỗng, có 3 mặt hơi trịn, có những rãnh
nhỏ dọc theo chiều dọc. Lá mọc vịng, thường có 4 (ít khi 3, 5, 6). Lá kép chân vịt
có 5 (ít khi 6, 7) lá chét, lá dài 7-12 cm (ít khi 15 cm). Lá chét trên cùng hình trứng
ngược hoặc hình mũi mác, dài 8-14 cm, rộng 3-5 cm, đầu lá thường nhọn đột ngột,
mũi nhọn kéo 1,5-2 cm, góc lá hình nêm, mép lá có răng cưa nhỏ đều, gân bên 19 (ít
khi 8-11) cập dọc theo gân chính và gân bên ở mặt trên của lá chét có nhiều lơng
cứng dạng gai dài đến 3 mm, mặt dưới ít hơn. Cụm hoa dài 25 cm, gấp 1,5-2 lần
chiều dài của cuống lá, thường mang tán đơn độc ở tận cùng, đơi khi có thêm 1-4
tán phụ hoặc một hoa đơn độc. Tán hoa đường kính 2,5-4 cm, có 50-120 hoa. Hoa
màu vàng lục nhạt, đường kính hoa nở 3-4 mm. Bầu 1 ơ, 1 vịi (chiếm 80%) đơi khi
có 2 ơ, 2 vịi (chiếm 20%). Quả khi chín thường màu đỏ, thường có một chấm đen ở
trên đỉnh quả. Quả 1 hạt hình thân, quả 2 hạt có hình cầu hơi dẹt dài 7-10 mm, rộng
4-6 mm [4].
Sâm Việt Nam mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt độ ban
ngày từ 20°C-25°C, ban đêm 15°C-18°C. Sâm Việt Nam có thể sống rất lâu, thậm
chí trên 100 năm, sinh trưởng khá chậm. Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân
rễ, củ và ngồi ra cũng có thể dùng lá và rễ con. Vào đầu tháng 1 hàng năm, Sâm
xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đơng, thân khí sinh lớn dần lên thành cây Sâm
trưởng thành có 1 tán hoa. Từ tháng 4 đến tháng 6, cây nở hoa và kết quả. Tháng 7
bắt đầu có quả chín và kéo dài đến tháng 9. Cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn


lụi dần, lá rụng, để lại một vết sẹo ở đầu củ Sâm và cây bắt đầu giai đoạn ngủ đơng
hết tháng 12. Chính căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ mỗi mùa đơng đến mà người ta
có thể nhận biết cây Sâm bao nhiêu tuổi, phải ít nhất 3 năm tuổi, tức trên củ có một
sẹo (sau 3 năm đầu Sâm chỉ rụng một lá) mới có thể khai thác, khuyến cáo là trên 5

năm tuổi. Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ của Sâm [53].

Hình 1.1. Hình vẽ Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv [55].
1.1.4. Phân bố Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv.
Cây Sâm được phát hiện ở độ cao từ 1200 m trở lên, đạt mật độ cao nhất ở
khoảng từ 1700-2000 m dưới tán rừng già, và cho tới nay chỉ có hai tỉnh Kon Tum
và Quảng Nam là có Sâm này. Sâm mọc tập trung dưới chân núi Ngọc Linh, một
ngọn núi cao 2578 m với lớp đất vàng đỏ trên đá granit dày trên 50 m, có độ mùn
cao, tơi xốp và rừng nguyên sinh cịn rộng [53].
1.1.5. Thành phần hóa học Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv.
Thành phần chủ yếu trong các lồi thuộc chi Panax L. nói chung hay Sâm
Việt Nam nói riêng là saponin sâm hay cịn gọi là ginsenosid. Loại và tỷ lệ
ginsenosid khác nhau giữa các loài và giữa các bộ phân của loài. Theo nghiên cứu
tổng quan về Sâm Việt Nam – Panax vietnamensis đã công bố gần 50 hợp chất
saponin gồm các dẫn xuất của các dạng protopanaxadiol, ocotillol, oleanolic,
panaxatriol và dammarenediol [20]. Các cấu trúc saponin này có từ 2-6 phân tử
đường, chủ yếu là đường 6 cạnh gồm glucose, xylose và rhamnose.
Ngoài các ginsenosid, trong các bộ phận khác nhau của Sâm Việt Nam cịn
có chứa polyacetylen, polysaccharid, flavonoid, daucosterin, chất nhầy, acid amin,
chất đắng, vitamin, cholin, pectin, dầu béo và tinh dầu [4].


1.1.5.1. Cấu trúc các saponin Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv.
a. Các saponin có cấu trúc dạng protopanaxadiol.
Bảng 1.1. Các saponin có cấu trúc dạng protopanaxadiol trong Sâm Việt Nam [20]

TT

Tên

R1

R2

Kiểu cấu trúc

2 1

-Glc - Glc

6 1

A

2 1

-Glc - Ara(p)

6 1

A

2 1

-Glc - Xyl

6 1

A

2 1

-Glc - Ara(f)

6 1

A

2 1

A

1

Ginsenosid Rb1

-Glc - Glc

2

Ginsenosid Rb2

-Glc - Glc

3

Ginsenosid Rb3

-Glc - Glc

4

Ginsenosid Rc

-Glc - Glc

5

Ginsenosid Rd

-Glc - Glc

-Glc

6

Gypenosid XVII

-Glc

-Glc - Glc

6 1

A

7

Notoginsenosid Fa

-Glc - Glc - Xyl

-Glc - Glc

6 1

A

8

Notoginsenosid R4

-Glc - Glc

6 1

6 1

A

9

Quinquenosid R1

-Glc - Glc -Ac
2 1
hoặc -Glc - Glc

2 1

6

A

10

Yesanchinosid J

-Glc - Glc
6|
Ac

6 1

6 1

11

Ginsenosid Re

12

Ginsenosid 20gluco-Rf

13

Ginsenosid Rg1

14

Ginsenosid
Rh1

15

Ginsenosid Rh5

2 1

2 1

2 1
2 1

-Glc - Glc - Xyl
6

-Glc - Glc -Ac
2 1
hoặc -Glc - Glc

2 1

-Glc - Glc - Xyl

A

-Glc - Rha

6 1

-Glc

B

-Glc - Glc

2 1

-Glc

B

-Glc

-Glc

B

-H

B

-CH3

B

20(S)- -Glc
-Glc

16

TT

Vina-ginsenosid R8 -Glc2-1Glc

Tên

-Glc

R1
2 1

R2

C

R3

Kiểu cấu
trúc

-

D

17

Quinquenosid L2

-Glc - Glc

-Glc

18

Notoginsenosid R1

-H

-Glc - Xyl

-Glc

19

Notoginsenosid R6

-H

-Glc

-Glc 1
αGlc

E

20

Pseudo-ginsenosid
RS1

-H

-Glc

E

21

Vina-ginsenosid R4 -Glc2-1Glc

-Glc - Rha
6|
Ac
-H

-Glc

E

2 1

2 1

E
6

Bảng 1.1. Các saponin có cấu trúc dạng protopanaxadiol trong Sâm Việt Nam (tiếp)

TTTên

R1
-Glc2-1Glc

22 24(S)-Vinaginsenosid R9
24(R)-Vina23 ginsenosidR9 Majorosid F1) -Glc2-1Glc
(=
Vina-ginsenosid R13
-Glc2-1Glc

24

25

TT
26
27
28

Ginsenosid Rh4

-Glc

G

-

R2
-

-Glc

-Glc

F
F

R1

-Glc

Kiểu cấu trúc

-Glc

-Glc

Tên
Ginsenosid20(R)Rh1
Vina-ginsenosid R25
Vina-ginsenosid
R12

R2
-Glc

-Glc

H

Kiểu cấu trúc
K
M

-

N


b. Các saponin có cấu trúc dạng ocotillol
Bảng 1.2. Các saponin có cấu trúc dạng ocotillol trong Sâm Việt Nam [20]

TT

Tên

29

24(S)-Majonosid R1

-Glc - Glc

2 1

-H

30 24(S)-Majonosid R2

-Glc - Xyl

2 1

-H

31 Protopanaxatriol oxid II

-H

-H

32 24(S)-Pseudo-ginsenosid F11

-Glc - Rha
6|
Ac

-H

33

-Glc

-H

24(S)-Pseudo-ginsenosid RT4

R1

2 1

R2

34 Vina-ginsenosid R1

-Glc - Rha

2 1

-H

35 Vina-ginsenosid R2

-Glc - Xyl

2 1

-H

36 Vina-ginsenosid R5

-Glc - Xyl -αGlc

37

-Glc - Xyl

Vina-ginsenosid R6

2 1

2 1

4

-H
-H

6
1

38 Vina-ginsenosid R14

αGlc
2 1
-Glc - Xyl

-OH


c. Các saponin có cấu trúc dạng oleanolic
Bảng 1.3. Các saponin có cấu trúc dạng oleanolic trong Sâm Việt Nam [20]

TT

Tên

R1

R2

R3

R4

R5

39

Ginsenosid Ro (=
Chikusetsusaponin V)

-Glc

-H

-H

-H

-Glc

40

Chikusetsusaponin
IVa

-H

-H

-H

-H

-Glc

41

Hemslosid-Ma3

-Glc

-Ara(p)

-H

-H

-Glc

d. Các saponin có cấu trúc dạng panaxatriol
Bảng 1.4. Các saponin có cấu trúc dạng panaxatriol trong Sâm Việt Nam
[20]

TT

Tên

R1

42

Vina-ginsenosid R10

-Glc

43

Vina-ginsenosid R11

-Glc - Xyl

2 1

R2
-OH
-OH


e. Các saponin có cấu trúc dạng dammarenediol
Bảng 1.5. Các saponin có cấu trúc dạng dammarenediol trong Sâm Việt Nam [20]

TT
44

Tên
Vina-ginsenosid R3

R1
-Glc

R2
2 1

-Glc - Glc

1.1.5.2. Cấu trúc các polyacetylen
Polyacetylen thường là các hydrocarbon mạch thẳng 17 và 18 carbon với
những nhóm chất liên kết. Đó là đặc điểm của đa số hợp chất có chứa một đầu là
nhóm 3-hydroxyl (hoặc 3-oxo) heptadeca-1-en-4,6-diyn, đầu còn lại của hợp chất là
chuỗi C7H15 [18,21,34].
1.1.6. Tác dụng sinh học của các hợp chất có trong Sâm Việt Nam Panax
vietnamensis Ha & Grushv.
Do có thành phần chính gồm các ginsenosid cho nên các các dụng sinh học
của Sâm hầu hết đều do ginsenosid đem lại.
- Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương
Sâm Việt Nam liều thấp có tác dụng kích thích thần kinh, làm tăng hoạt động
vận động và trí nhớ, nhưng liều cao lại ức chế thần kinh [1].
- Tác dụng chống trầm cảm
Sâm Việt Nam có tác dụng chống trầm cảm ở liều uống một lần 200 mg/kg
hoặc liều 50-100 mg/kg dùng luôn 7 ngày ở chuột nhắt trắng, majonosid R2 tiêm
trong màng bụng có tác dụng chống trầm cảm ở cả 3 liều 3,1; 6,2; 12,5 mg/kg [1].
- Tác dụng tăng sinh lực
Sâm Việt Nam có tác dụng tăng sinh lực trong thí nghiệm chuột bơi, làm
tăng sinh lực chống lại mệt mỏi, giúp phục hồi sức lực [1].

- Tác dụng sinh thích ứng
+ Trong stress vật lý, cho chuột nhắt uống Sâm Việt Nam liều 100 mg/kg có
tác dụng làm tăng khả năng chịu đựng đối với nước nóng (37°C-42°C) và lạnh (5°C) làm kéo dài thời gian sống thêm cả chuột thí nghiệm [1].
+ Trong stress cô lập, chuột nhắt trắng được nuôi riêng từng con trong 4
tuần, thời gian ngủ khi tiêm Natri barbital giảm đi 30%. Sâm Việt Nam liều uống
50-100 mg/kg hoặc hoạt chất majonosid R2 tiêm trong màng bụng liều 3,2; 12,5
mg/kg làm thời gian ngủ trở lại gần bình thường [1].
- Tác dụng chống oxy hóa
Trên thí nghiệm in vitro dùng dịch nổi của mô não, gan và phân đoạn vi thể
gan của chuột nhắt trắng, saponin Sâm Việt Nam ở nồng độ 0,05-0,5 mg/ml có tác
dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành MDA (Malondialdehyd) là sản phẩm của
quá trình oxy hóa lipid màng sinh học [1].
- Tác dụng kích thích miễn dịch
Bột chiết Sâm Việt Nam liều uống 500 mg/kg và majonosid R2 tiêm trong
màng bụng có tác dụng làm tăng chỉ số thực bào trong thí nghiệm in vitro và in vivo
ở chuột nhắt trắng [1].
Dùng liều Escherichia coli gây chết chuột nhắt trắng. Nếu kết hợp dùng sâm
và majonosid R2 với liều trên sẽ làm tăng tỷ lệ số chuột sống sót. Có lẽ do thuốc làm
tăng tác dụng thực bào với E. coli [1].
- Tác dụng phục hồi máu
Trong thí nghiệm làm giảm hồng cầu và bạch cầu ở động vật thí nghiệm,
Sâm Việt Nam có tác dụng làm phục hồi số lượng hồng cầu và bạch cầu đã bị giảm
[1].
- Các tác dụng dược lý khác
Sâm Việt Nam cịn có tác dụng tăng cường nội tiết tố sinh dục, điều hòa hoạt
động của tim, tác dụng chống tăng cholesterol máu, tác dụng bảo vệ gan, có tác
dụng chống viêm và ức chế sự phát triển vi khuẩn Streptococcus gây bệnh viêm
họng ở người [1].
1.2. Tổng quan về đối tƯợng nghiên cứu – Sâm Lai Châu
Năm 2003, Zhu và cộng sự đã mô tả một thứ mới có tên khoa học Panax

vietnamensis var. fuscidiscus K. Komatsu, S. Zhu & S.Q. Cai, bậc phân loại dưới
loài của Panax vietnamensis. Thứ này được phát hiện tại vùng Jinping, phía nam
tỉnh Vân Nam, Trung Quốc. Gần đây Phan Kế Long và cộng sự (2013) đã phát hiện
thứ Panax vietnamensis var. fuscidiscus nói trên có phân bố ở tỉnh Lai Châu, Việt
Nam và được gọi tên là Sâm Lai Châu [38].
1.2.1. Đặc điểm thực vật
Cây thảo, sống lâu năm. Cây mang hoa cao khoảng 0,5-0,8 m. Thân rễ nạc,
dài 15-20 cm hoặc hơn. Thân mọc thẳng, hình trụ, đường kính 5-8 mm, lõi thân
xốp. Lá kép chân vịt, mọc vòng (3)-4(5-6) lá ở ngọn thân với 5-(6-7) lá chét. Các lá
chét không đều nhau, lá ở giữa to và nhỏ dần sang hai bên. Cuống lá dài 7-12 cm,
có khi lên tới 14 cm, khơng có lá kèm hoặc lá kèm nhỏ. Cuống lá chét dài (0,3)-0,81,4 cm, gốc có lơng hình móc, dài khoảng 2 mm. Lá hình bầu dục, kích thước 8-12
x 2,5-3 cm. Mũi lá nhọn, dài 1,5-2 cm. Gốc lá hình nêm, mép lá khía răng cưa. Lá
có (6)-8-(10) cặp gân, gân chính và các gân bên đều phủ lơng hình móc thưa, dài
khoảng 2 mm. Cụm hoa tán đơn hình cầu, đường kính 2,5-4 cm, mang khoảng 50120 hoa. Cuống tán hoa dài 25-35 cm. Cuống hoa dài 1,5-2 cm. Hoa màu xanh nhạt
hay vàng nhạt, mẫu 5, hiếm khi mẫu 6. Đài hoa hình tam giác, dài khoảng 0,2 mm.
Tràng thuôn, rời nhau, dài khoảng 2 mm. Đế hoa lúc đầu hơi lồi, sau phẳng và sẫm
màu dần. Nhị hoa màu trắng, hơi thị. Chỉ nhị hình sợi mảnh, dài khoảng 2,5 mm.
Bầu 2 ơ, 2 vịi nhụy, phát triển thành quả, 1 ô thường tiêu biến. Quả dẹt, kích thước
7 x 6 mm, màu nâu đỏ đến nâu tím với núm nhụy màu đen khi chín [38].
Sâm Lai Châu ra hoa vào tháng 6-7, quả trưởng thành vào tháng 10-11, quả
chín vào tháng 5-6 năm sau [38].


and

Ph

Hình 1.2. Hình ảnh của Sâm Lai Châu Panax vietnamensis var. fuscidiscus [38].

1.2.2. Phân bố
Sâm Lai Châu xuất hiện trong giới hạn diện tích nhỏ của huyện Mường Tè,
tỉnh Lai Châu. Chúng được tìm thấy trong rừng rậm nguyên sinh mưa mùa nhiệt đới
chưa bị tác động hoặc tác động nhẹ [38].
Sâm Lai Châu phân bố ở độ cao 1900 m, thuộc phần trên của đai núi thấp và
phần dưới của đai núi cao. Nơi đây có độ tàn che ít nhất 70%, bao gồm các loài cây
phổ biến thuộc các họ: Orchidaceae, Rubiaceae, Euphorbiaceae, Moraceae,
Fagaceae, Acanthaceae và Fabaceae. Các loại đá mẹ ở đây là sa thạch rắn biến chất
sâu sắc pha trộn với đá phiến sét [38].
1.2.3. Mối quan hệ di truyền giữa Sâm Lai Châu và Sâm Việt Nam
Theo Phan Kế Long và cộng sự (2014), hai thứ Sâm Lai Châu (P.
vietnamensis var. fuscidiscus) và Sâm Việt Nam (hay Sâm Ngọc Linh, P.
vietnamensis Ha & Grushv. var. vietnamensis) của lồi Sâm Việt (P. vietnamensis
Ha & Grushv) có quan hệ chị em [3]. Cụ thể khi so sánh khoảng cách di truyền giữa
loài Sâm Lai Châu và Sâm Việt Nam (hay Sâm Ngọc Linh) thì khoảng cách di
truyền rất thấp (0,7%) và số vị trí nucleotide sai khác của 2 loài này là 4 nucleotide
[7].


1.2.4. Thành phần hóa học
Các nghiên cứu về thành phần hóa học của Sâm Lai Châu cịn rất hạn chế.
Theo nghiên cứu của Zhu và cộng sự (2004), phần thân rễ Sâm Lai Châu Panax
vietnamensis var. fuscidiscus có chứa các hợp chất ginsenosid Rb1, ginsenosid Rc,
ginsenosid Rd, ginsenosid Re, ginsenosid Rg1, notoginsenosid R2, majonosid R2,
ginsenosid Ro [20,52]. Ngoại trừ notoginsenosid R2, các ginsenosid Rb1, ginsenosid
Rc, ginsenosid Rd, ginsenosid Re, ginsenosid Rg1, ginsenosid Ro cũng là những
thành phần hóa học có chứa trong Sâm Việt Nam (mục 1.1.5).
Bảng 1.6. Cấu trúc hóa học của notoginsenosid R2

Tên

Notoginsenosid R2

R1
-H

R2
2 1

-Glc - Xyl

R3
-H

R4
-H

TLTK
[20,52]

1.2.5. Tác dụng sinh học
Theo tìm hiểu các nghiên cứu, cho đến nay chưa có nghiên cứu nào đánh giá
tác dụng sinh học của Sâm Lai Châu. Tuy nhiên, dựa vào kết quả nghiên cứu thành
phần hóa học của Sâm Lai Châu [52] và các nghiên cứu về mối quan hệ di truyền
giữa Sâm Lai Châu và Sâm Việt Nam [3,7] ta có thể cho những dự đốn rằng Sâm
Lai Châu cũng có các tác dụng sinh học tương tự như Sâm Việt Nam.


CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƯợng
- Dược liệu nghiên cứu là thân rễ của Sâm Lai Châu được cung cấp bởi Chủ
nhiệm đề tài KHCN-TB.16C/13-18, ThS. Phạm Quang Tuyến vào tháng 10/2016.
o

Dược liệu thu về được rửa sạch, thái lát mỏng, sấy khô ở 40-50 C đạt độ ẩm khoảng
5%, xay nhỏ và bảo quản trong túi nylon kín làm ngun liệu nghiên cứu về mặt
hóa học.
2.2. Hố chất, thiết bị
2.2.1. Hố chất
Các dung mơi hóa chất dùng trong phân tích đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt
Nam IV: Cồn 70%, nước cất hai lần, dung môi n-butanol, methanol, aceton,
dicloromethan.
Bột silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck), bột silica gel pha đảo
YMC (30-50 µm, FuJi Silisa Chemical Ltd.).
TM

Chất hấp phụ Sephadex

LH-20 (Amersham Bioscience, Uppsala, Thụy Sỹ).

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien
60G F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck,
0,25 mm).
Dung dịch thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol hơ nóng để phát hiện vết chất.
2.2.2. Thiết bị
- Các dụng cụ cần thiết dùng trong quá trình thực nghiệm: cột sắc ký, bình cầu, bình
nón, ống đong, ống nghiệm…
- Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (BUCHI).
- Tủ sấy Memmert, Binder-FD115.

- Bếp điện, bếp đun cách thủy.
- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR.
- Đèn UV- Vilber lourmat, máy chụp ảnh UV.
- Máy siêu âm Power sonic 405.
- Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC).
- Phổ tử ngoại được ghi trên máy UV-VIS Cary, Khoa phân tích - Viện Dược
liệu.
- [α]D đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter


- Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectrometry,
ESI-MS) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hoá học Các
hợp chất Thiên nhiên, VKH&CNVN.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR của Viện
Hoá học, VKH&CNVN.
2.3. PhƯơng pháp chiết xuất phân lập và xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết
2.3.1. PhƯơng pháp chiết xuất và phân lập
Thân rễ Sâm Lai Châu được chiết xuất bằng phương pháp chiết ngấm kiệt
với dung môi cồn 70%. Tiến hành lọc loại bã dược liệu, gộp dịch lọc, cất thu hồi
dung môi dưới áp suất giảm thu được cao đặc. Cao này được hòa lại với nước và
chiết phân đoạn lần lượt với dung mơi có độ phân cực tăng dần dicloromethan, nbutanol thu được các phân đoạn tương ứng.
Các hợp chất trong thân rễ Sâm Lai Châu được phân lập bằng phương pháp
sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck),
silica gel pha đảo YMC C18 (30-35 mm, FuJisilisa Chemical Ltd.).
Theo dõi, kiểm tra các phân đoạn của sắc ký cột bằng sắc ký lớp mỏng, thực
hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254 (Merck), RP-18 (Merck). Phát
hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc
thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol.
Thu gom, tinh chế các chất phân lập được bằng dung mơi thích hợp. Kiểm tra
độ sạch của các chất phân lập được bằng sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi phù

hợp.
Tiến hành:
+ Lựa chọn hệ dung mơi thích hợp để rửa giải: khảo sát cao tổng bằng sắc ký
lớp mỏng với nhiều hệ dung môi khác nhau, chọn hệ dung mơi có khả năng tách tốt
để làm dung mơi rửa giải.
+ Chuẩn bị cột: cột sắc ký rửa sạch, sấy khơ, lắp thẳng đứng trên giá cố định.
Lót một lớp bơng xuống đáy cột. Cân một lượng thích hợp chất nhồi cột vào cốc có
mỏ, thêm dung mơi thích hợp vào khuấy đều cho hết bọt khí thu được hỗn dịch. Mở
khóa cột, từ từ rót hỗn dịch đã chuẩn bị lên cột, vừa rót vừa gõ nhẹ, đều và đối xứng
quanh thân cột. Sau khi đưa hết pha tĩnh lên cột, tiếp tục cho dung môi chảy liên tục
qua cột đến khi cột hồn tồn ổn định (có thể từ 5-10 giờ). Chú ý không được để cột
bị khô dung môi.