TRÍCH LY HOẠT CHẤT AZADIRACHTIN TỪ CÂY NEEM BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT SOXHLET VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VIBRIO SPP. GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TRÊN TÔM

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
---------------o0o---------------

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC OISP 2017

TRÍCH LY HOẠT CHẤT AZADIRACHTIN TỪ CÂY NEEM
BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT SOXHLET
VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VIBRIO SPP.
GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TRÊN TÔM

GVHD: TS. Huỳnh Ngọc Oanh
SVTH: Nguyễn Trịnh Phương Mai
Chung Ngọc Diệp
Lê Bá Khoa

TP.HỒ CHÍ MINH, THÁNG 06 NĂM 2018


LỜI CẢM ƠN
Trong q trình thực hiện và hồn thành đề tài nghiên cứu khoa học này, nhóm tác giả
rất biết ơn sự giúp đỡ tận tình của Cha, Mẹ và những người thân trong gia đình.
Nhóm tác giả chân thành cảm ơn Cô TS. Huỳnh Ngọc Oanh và Thầy TS. Nguyễn Hữu
Hiếu đã giúp đỡ, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm về cách chọn
lọc tài liệu, thông tin cũng như cách làm việc hiệu quả cho đề tài.
Nhóm tác giả chân thành cảm ơn sự tài trợ kinh phí của Văn phịng Đào tạo Quốc tế
OISP – Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM, giúp đề tài được thực hiện tốt hơn.
Chân thành cảm ơn quý anh chị nghiên cứu viên, các bạn sinh viên tại Phịng Thí nghiệm
trọng điểm ĐHQG-HCM Cơng nghệ Hóa học và Dầu khí (CEPP) đã truyền đạt kinh
nghiệm thực tiễn giúp nhóm tác giả hồn thành các thí nghiệm.

Nhóm tác giả chân thành cảm ơn.
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2018
Trưởng nhóm sinh viên
Nguyễn Trịnh Phương Mai

i


TÓM TẮT
Trong nghiên cứu này, hạt cây neem được chọn làm đối tượng nghiên cứu và tiến hành
trích ly dầu neem bằng phương pháp trích ly Soxhlet. Hiệu quả trích ly được thể hiện qua
hiệu suất thu hồi dầu, phân tích hàm lượng azadirachtin bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu
năng cao. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của dầu trích được bằng phương pháp đục
lỗ thạch trên đĩa mơi trường thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose.
Kết quả nghiên cứu cho thấy dầu neem đạt hiệu suất cao nhất là 23,7% khi được trích
trong dung môi metanol, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/25 (g/mL) với 4 giờ trích và được
cơ quay chân khơng ở 60oC.
Kết quả phân tích hàm lượng azadirachtin trong dầu neem đạt 518 mg/kg và mẫu dầu
này có khả năng kháng khuẩn Vibrio parahaemolyticus.

ii


LỜI CAM ĐOAN
Nhóm tác giả xin cam đoan đề tài nghiên cứu khoa học này là cơng trình độc lập của
nhóm tơi. Các số liệu và thơng tin tham khảo trong q trình thực hiện đều có nguồn gốc
rõ ràng và đã được trích dẫn theo đúng quy định. Các kết quả nghiên cứu và kết luận trong
đề tài đều là do thành viên trong nhóm tự phân tích một cách trung thực, khách quan, không
sao chép dưới bất kỳ hình thức nào. Các kết quả này chưa từng được cơng bố trong bất kì
tài liệu nào khác.

Trưởng nhóm sinh viên
Nguyễn Trịnh Phương Mai

iii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................... i
TÓM TẮT .......................................................................................................................... ii
LỜI CAM ĐOAN.............................................................................................................. iii
MỤC LỤC ......................................................................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG ......................................................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................... viii
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................................. 3
1.1. Giới thiệu về cây neem ............................................................................................. 3
1.1.1. Phân bố và danh pháp ........................................................................................ 3
1.1.3. Đặc điểm sinh thái .............................................................................................. 4
1.2. Hoạt chất sinh học chính trong dầu neem (azadirachtin) ......................................... 6
1.3. Phương pháp chiết xuất............................................................................................. 7
1.3.1. Ngâm chiết ......................................................................................................... 7
1.3.2. Phương pháp trích ly Soxhlet ............................................................................. 7
1.4. Hoạt tính kháng khuẩn của dầu neem ....................................................................... 8
1.4.1.Chất kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản ......................................................... 8
1.4.2. Vi khuẩn Vibrio spp. ........................................................................................ 10
1.5 Tính cấp thiết, mục tiêu, nội dung và phương pháp nghiên cứu ............................. 13
1.5.1. Tính cấp thiết.................................................................................................... 13
1.5.2. Mục tiêu nghiên cứu......................................................................................... 13
1.5.3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 13

1.5.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................. 13
iv


CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM ...................................................................................... 16
2.1. Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ, thiết bị và địa điểm thực hiện.............................. 16
2.1.1. Nguyên liệu ...................................................................................................... 16
2.1.2. Hóa chất ........................................................................................................... 16
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị ........................................................................................... 17
2.1.4. Địa điểm thực hiện ........................................................................................... 19
2.2. Quy trình trích ly..................................................................................................... 19
2.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly ............................................ 19
2.4. Định lượng azadirachtin trong dầu neem................................................................ 20
2.5. Thử nghiệm tính kháng khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan trên
tôm ................................................................................................................................. 21
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................................................... 23
3.1. Điều kiện trích ly .................................................................................................... 23
3.1.1. Ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau đến chất lượng dầu neem......... 23
3.1.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến chất lượng dầu neem ........... 23
3.1.3. Ảnh hưởng của thời gian trích đến chất lượng dầu neem ................................ 24
3.2. Phân tích hàm lượng AZA trong dầu neem bằng HPLC ........................................ 24
3.3. Thử nghiệm tính kháng khuẩn ................................................................................ 25
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN ............................................................................................... 27
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................... 28
PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 30

v


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Bệnh gây ra bởi các vi khuẩn Vibrio trong ngành thủy sản .............................. 11
Bảng 2.1. Danh sách hóa chất và vật liệu .......................................................................... 17
Bảng 2.2. Danh sách dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ......................................................... 17
Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của dung môi ................................................................... 20
Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liêu/dung môi ........................................ 20
Bảng 2.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly ........................................................ 20
Bảng 2.6. Điều kiện pha động ........................................................................................... 20
Bảng 3.1. Kết quả khối lượng dầu neem theo các loại dung môi khác nhau. ................... 23
Bảng 3.4. Kết quả thử nghiệm kháng khuẩn. .................................................................... 25

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây neem 6 tuổi .................................................................................................. 4
Hình 1.2. Các bộ phận của cây neem: (a) Quả và lá, (b) Hoa, (c) Hạt khơ ......................... 5
Hình 1.3. Cấu trúc 2D và 3D của phân tử azadirachtin ...................................................... 6
Hình 1.4. Mơ hình thiết bị tẩm trích có cánh khuấy. .......................................................... 7
Hình 1.5. Nguyên lý hoạt động của thiết bị trích ly Soxhlet ............................................... 8
Hình 1.6. Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. .................................................................. 12
Hình 1.7. So sánh tơm khoẻ và tơm nhiễm bệnh EMS ..................................................... 12
Hình 1.8. Sơ đồ hoạt động của hệ thống phân tích HPLC ............................................... 15
Hình 2.1. Hạt neem sau khi được sấy khơ ......................................................................... 16
Hình 2.2. Hệ thống trích Soxhlet ....................................................................................... 18
Hình 2.3. Thiết bị cơ quay chân khơng Buchi ................................................................... 18
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình trích ly. ..................................................................................... 19
Hình 3.1. Đường chuẩn của azadirachtin .......................................................................... 25
Hình 3.2. Kết quả thử nghiệm tính kháng khuẩn Vibrio parahaemolyticus ..................... 26

vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Tên đầy đủ

AZA

Azadirachtin

DMSO

Dimethyl Sulfoxit

MHA

Mueller – Hinton Agar

HPLC

TCBS

High Performance Liquid
Chromatography

Giải thích

Thạch Mueller - Hinton
Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Thiosulfate -citrate-bile
salts-sucrose

LB

Lysogeny broth

EMS

Early mortality syndrome

viii

Hoại tử gan tụy cấp


ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây neem, còn gọi là cây Xoan Ấn, có tên khoa học là Azadirachta indica, thuộc họ
dái ngựa (Meliaceae), được trồng hầu hết ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của
thế giới, chủ yếu ở Ấn Độ. Hiện cây được trồng để che bóng mát, phục vụ cho các
chương trình trồng và bảo vệ rừng.
Theo dân gian, cây neem có chứa các chất tác dụng chống viêm, giảm sốt, chống nấm,
chống histamine, sát trùng, ức chế sự tăng trưởng của côn trùng [1]. Các hoạt chất từ
cây neem còn được dùng làm thuốc trừ sâu tự nhiên và hóa chất nơng nghiệp.
Chất kháng sinh là thuốc hoặc hóa chất có thể tiêu diệt các vi khuẩn có hại trong cơ thể
hoặc hạn chế sự phát triển của vi khuẩn. Gần đây, thực trạng lạm dụng chất kháng sinh
trong nuôi trồng thủy sản trở nên phổ biến, dẫn đến phát sinh dịch bệnh nghiêm trọng do
sự kháng thuốc của các loại vi khuẩn gây bệnh ở tôm cá, đặc biệt là vi khuẩn Vibrio spp.
làm thu hẹp nhiều diện tích ni trồng thủy sản.

Nghiêm trọng hơn, con người tiêu thụ các loại thực phẩm này có thể dẫn đến các
phản ứng như: chân tay run rẩy, co giật, thay đổi vi sinh ruột, thay đổi sự tổng hợp vitamin
hoặc thậm chí tử vong nếu tiêu thụ quá nhiều. Bên cạnh đó, điều này cịn có thể dẫn đến
kháng thuốc và gây khó khăn cho người điều trị nhiễm trùng.
Các nghiên cứu trích ly các hợp chất của cây neem trước đó hầu hết khơng đề cập
chun sâu về tính chất kháng khuẩn hoặc chỉ khảo sát tính kháng khuẩn của azadirachtin
đối với nhiều loại chủng vi khuẩn gây bệnh phổ biến như Pseudomonas aeruginosa,
Pseudomonas mirabilis, Staphylococcus aureus [2]. Cho đến nay, chưa có một cơng bố
trong và ngồi nước nào nghiên cứu tính kháng khuẩn của dầu neem và azadirachtin đối
với giống vi khuẩn Vibrio spp., đặc biệt là vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại
tử gan trên tơm.
Vì vậy, đề tài nghiên cứu khoa học này bước đầu thực hiện trích ly hoạt chất
azadirachtin, một hợp chất có tính chất kháng khuẩn cao, từ ngun liệu ban đầu là hạt
neem, đồng thời khảo sát sơ bộ tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
gây bệnh hoại tử gan trên tôm. Với kết quả khảo sát này có thể đóng góp thêm cho việc
1


nghiên cứu ứng dụng tạo ra các sản phẩm như thuốc kháng sinh sinh học phục vụ ngành
nông nghiệp, thuỷ sản, công nghệ sinh học, và một số lĩnh vực khác.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về cây neem
1.1.1. Phân bố và danh pháp
1.1.1.1 Danh pháp khoa học
Cây neem có tên khoa học là Azdirachta indica A. Juss thuộc họ xoan (Meliaceae), do
khả năng chịu hạn, cây neem cịn có tên tiếng Việt là “xoan chịu hạn”.

-

Giới: Plantae – Thực vật;

-

Phân giới: Tracheobionta;

-

Liên nghành: Spermatophyta – Thực vật có hạt;

-

Nghành: Magnoliophyta – Thực vật có hoa;

-

Lớp: Magnoliopsida – Hai lá mầm;

-

Phân lớp: Rosidae;

-

Bộ: Sapindales;

-

Họ: Meliaceae – Họ cây dái ngựa;

-

Chi: Azadirachta A. Juss. – Azadirachta;

-

Loài: Azadirachta indica A. Juss., neem.

1.1.1.2 Phân bố
Năm 1981, neem đã được giáo sư Lâm Công Định nhập và trồng thử nghiệm ở tỉnh Ninh
Thuận. Đến đầu những năm 1990, việc trồng neem đã phát triển mạnh. Hiện tại, cây neem
đã được quy hoạch trồng thành rừng dọc theo vùng đất cát ven biển của tỉnh Ninh Thuận,
Bình Thuận với diện tích trên 1.000 ha.
Cây neem bắt đầu được biết đến ở Ấn Độ nhưng theo thời gian cây neem được đưa nhiều
nơi thích nghi khác như: Gana, vùng Caribean, Ai Cập, Mỹ, Anh, Thái Lan. Tại Ấn Độ,
khu vực trồng neem được gọi là “làng dược” vì neem được coi như là một vị thuốc
dân gian có giá trị và cho đến nay nó vẫn được sử dụng và được trồng rộng rãi ở nhiều nơi
trên thế giới, khu vực trồng phổ biến trên 30 quốc gia mà đa số là các nước Nam Á như
Pakistan, Bangladesh, Iran, và các vùng hoang mạc ở Sri Lanka, Thái Lan, Nam
Malaysia,… Ngồi ra, cây neem cịn được tìm thấy ở Philippines: ở đảo Fiji, đảo Mauritius
3


và trải rộng ra các đảo khác ở nam Thái Bình Dương. Ở Trung Đơng, cây neem được
tìm thấy ở Yemen và Saudi Arabia. Tại Châu Phi, cây neem tồn tại ở Ghana, Nigeria,
Sudan và các nước Đông Phi. Ở Châu Mỹ, cây neem được tìm thấy ở các đảo vùng Caribe
và vùng Trung Mỹ.
1.1.3. Đặc điểm sinh thái

Cây neem chịu hạn phát triển tốt trên đất cát pha thịt nhẹ và cát rời, đất có đá lẫn, khơng
chịu ngập úng, đòi hỏi nhiều ánh sáng, chịu hạn tốt, phát triển trên đất có độ pH cao (≥8,5)
thậm chí đất có tầng cứng 1,5 đến 2 m thích hợp với khí hậu nhiệt đới, khơ nóng có thể lên
đến 50˚C, lượng mưa từ 500-1200 mm, độ ẩm 60% nhưng không chịu rét kéo dài, có thể
trồng ở nhiệt độ cao từ 1000-1500 m so với mặt biển.
Neem là cây thân gỗ, chiều cao có thể lên đến 30 m, tán rộng xoè ra như cây sồi, chu vi
tán lá khoảng 2,5 m và có thể vươn xa đến 10 m. Bộ rễ của cây rất sâu, phát triển mạnh, rễ
cái có thể dài gấp hai lần chiều dài của cây. Vỏ cây có chứa khoảng 3,43 % protein; 0,68
% alkaloid; 4,16% chất khoáng và một số axit amin. Vỏ cũng chứa nhiều hoạt chất như
nimbin, nimbinin, nimbidin, interferon, acid gallic… có tính kháng dịch hại. Hình ảnh cây
neem 6 tuổi được thể hiện trong hình 1.1.

Hình 1.1. Cây neem 6 tuổi [3]
4


Mặc dù là một cây thường xanh nhưng nó có thể rụng hầu hết lá vào những mùa hạn
hán nghiêm trọng. Ở độ cao thấp và mơi trường khơ nóng, cây phát triển chậm. Các cuống
lá rất ngắn với các lá non dài 20-40 cm, thường có màu đỏ nhạt hoặc tím.
Hoa và quả được sinh ra trong các cụm phễu và khi chín, các hạt tiêu dạng elip mịn biến
thành màu vàng lục nhạt với một lớp bột ngọt chứa hạt. Vịng hoa neem khá dày có hình
trịn hoặc bầu dục và có thể có đường kính 15-20 m đối với những cây lâu năm. Các cụm
hoa phân nhánh, chứa từ 150 đến 250 hoa. Một bông hoa riêng lẻ có chiều dài 5-6 mm và
rộng 8-11 mm. Hoa có màu trắng và thơm, mọc lên từ mối nối giữa thân và cuống.
Quả giống trái ơ liu, mịn, có hình dạng từ thn dài, hình bầu dục đến gần trịn, và kích
thước khi chín là 1,4-2,8 x 1.0-1,5 cm. Vỏ mỏng và chuyển sang màu vàng khi chín. Vỏ
quả bao gồm một, ít khi hai hoặc ba, hạt dài (hạt nhân) có lớp vỏ màu nâu [4]. Nhân chỉ
chiếm khoảng một phần hai trọng lượng hạt nhưng là nơi tập trung nhiều hoạt chất sinh
học.
Một năm, cây có hai vụ thu hoạch quả, vào tháng 4-6 và 10-12. Số lượng hạt trong 1 kg

quả từ 2000 đến 2500 hạt. Cây trưởng thành có thể sản xuất khoảng 2 kg hạt/năm[1]. Hình
ảnh về hoa, quả và hạt neem được thể hiện trong hình 1.2.

(a)

(b)

(c)

Hình 1.2. Các bộ phận của cây neem: (a) Quả và lá, (b) Hoa, (c) Hạt khô [5]
5


1.2. Hoạt chất sinh học chính trong dầu neem (azadirachtin)
Azadirachtin, một hợp chất limonoid tetranortriterpenoid thuộc nhóm lemonoid có chứa
trong dầu hạt cây xoan Ấn Độ (cây neem) với hàm lượng dao động 0,2-0,5% trong lượng
hạt tươi. Azadirachtin có hoạt tính sinh học rất đa dạng, là thành phần chính tác động tính
chống nấm và độc hại đối với cơn trùng. Các hợp chất limonoid và lưu huỳnh có tính chất
chống thấm, sát trùng, chống trầm cảm, hạ sốt và chống giật da được tìm thấy ở những nơi
khác trên cây, ví dụ: lá, hoa, vỏ cây, rễ cây [1]. Với khối lượng phân tử 720,721 gam/mol,
azadirachtin được biết đến với cơng thức phân tử C35H44O16. Độ hịa tan trong nước của
hợp chất này là 0,26 gam/lít và có thể hịa tan nhanh chóng trong etanol, diethyl eter, axeton
và chloroform, nhưng khơng tan trong n-hexane. Azadirachtin bền trong bóng tối ở nhiệt
độ phòng, dễ phân hủy ở nhiệt độ cao, môi trường kiềm và môi trường axit mạnh [6].
Azadirachtin đã và đang được nghiên cứu về phương pháp tách chiết ở nhiều nước trên
thế giới. Cấu trúc 2D và 3D của phân tử azadirachtin được thể hiện trong hình 1.3.

Hình 1.3. Cấu trúc 2D và 3D của phân tử azadirachtin [6]

6

Dầu neem và azadirachtin được nghiên cứu là có khả năng kháng khuẩn. Vì vậy, cần
nghiên cứu về một phương pháp chiết xuất phù hợp để thu được sản phẩm tối ưu.
1.3. Phương pháp chiết xuất
Với sự phong phú và đa dạng của các chủng loại dược liệu tự nhiên ở Việt Nam,
hiện nay có một số nghiên cứu trích chiết các hoạt chất phục vụ cho nghiên cứu và công
nghiệp mỹ phẩm, dược phẩm. Các phương pháp áp dụng để trích ly cũng có nhiều nghiên
cứu khác nhau đề cập đến, mỗi phương pháp đều có ưu – nhược điểm khác nhau.
1.3.1. Ngâm chiết
Đây là phương pháp phổ biến được sử dụng để trích ly các thành phần có hoạt tính sinh
học từ dược liệu. Dược liệu được xay nhuyễn nhằm làm tăng diện tích tiếp xúc giữa mẫu
và dung mơi, và làm ẩm với lượng dung mơi thích hợp trong bình kín có cánh khuấy khoảng
12-48 giờ. Mơ hình thiết bị ngâm chiết có cánh khuấy được thể hiện ở hình 1.4.

Hình 1.4. Mơ hình thiết bị tẩm trích có cánh khuấy. [7]
Phương pháp thích hợp đối với nhiều loại dược liệu, được ứng dụng nhiều đối với trích
ly tinh dầu và các chất hữu cơ dễ bị phân hủy bởi nhiệt, hạn chế được sự thất thoát dung
mơi; nhưng thời gian trích ly dài; hiệu suất thấp.
1.3.2. Phương pháp trích ly Soxhlet
Nguyên lý: dược liệu được bỏ vào túi xiphong đặt trong ống Soxhlet. Bình cầu chứa
dung mơi thích hợp được gắn ở phía dưới ống trích và được đun nóng cho đến khi bay hơi.
7


Dung môi được ngưng tụ trong ống chiết bằng hệ thống sinh hàn. Chu kỳ này lặp lại nhiều
lần đến khi trích kiệt hoạt chất. Dịch trích thu được trong bình cùng với dung mơi. Quy
trình hoạt động của thiết bị trích ly Soxhlet được thể hiện trong hình 1.5.

Hình 1.5. Nguyên lý hoạt động của thiết bị trích ly Soxhlet [8]

Trong đề tài này, phương pháp trích Soxhlet được lựa chọn để trích ly dầu vì những ưu
điểm nổi trội như sử dụng lượng dung mơi ít, khi trích thu được dịch trích tối ưu và hệ
thống dễ lắp ráp, dễ sử dụng.
Ngày nay, hiện tượng kháng kháng sinh khá phổ biến trong nuôi trồng thủy sản; dầu
neem được biết đến là có khả năng kháng khuẩn. Vì vậy, cần mở rộng nghiên cứu chất
kháng sinh từ dầu neem.
1.4. Hoạt tính kháng khuẩn của dầu neem
1.4.1.Chất kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản

8


Chất kháng sinh là thuốc hoặc hóa chất có thể tiêu diệt các vi khuẩn có hại trong cơ thể
hoặc hạn chế sự phát triển của vi khuẩn. Gần đây, thực trạng lạm dụng chất kháng sinh
trong nuôi trồng thủy sản trở nên phổ biến.
Trên thế giới:
Nuôi trồng thuỷ sản là một ngành sản xuất ngày càng phát triển, đặc biệt là trong việc
cung cấp nguồn thực phẩm động vật có hàm lượng protein cao, dễ tiêu hóa và có giá trị
sinh học cao. Tuy nhiên, ngành nuôi trồng thủy sản ở nhiều nước hiện nay gặp khó khăn
vì sự phát triển của các bệnh dịch do nguồn cung cấp nước sạch hạn chế. Phân gia súc
không được xử lý và chất thải của con người được sử dụng làm thức ăn cho các ao nuôi
tôm, cá rô phi. Bên cạnh đó việc xử lý nước thải chưa được triệt để làm vi khuẩn phát triển
mạnh. Để giải quyết vấn đề này, các sản phẩm kháng sinh được sử dụng. Loại và số lượng
sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thuỷ sản phụ thuộc vào thực tiễn canh tác, khu vực và
các quy định của quốc gia hoặc khả năng thực thi của chính phủ. Từ ngày 01 tháng 10 năm
2006, đến ngày 31 tháng 5 năm 2007, FDA đã kiểm tra mẫu cá da trơn, cá basa, tôm, cá
lăng và lươn từ Trung Quốc, phát hiện 25% mẫu chứa dư lượng thuốc. Năm 1990, Mỹ có
tỷ lệ sử dụng kháng sinh cao nhất nhưng số lượng này đã giảm do tăng cường sử dụng vắcxin và các hoạt động nông nghiệp mới. Hải sản nhập khẩu vào Hoa Kỳ ngày nay cần được
kiểm soát chặt chẽ qua các quy định của FDA về việc ngăn chặn thực phẩm có chứa dư
lượng kháng sinh.

Ở Việt Nam:
Theo Cục Thú y, năm 2015, một cuộc điều tra tại 5 tỉnh trọng điểm phía Nam (Sóc
Trăng, Bạc Liêu, Bến Tre, Đồng Tháp, An Giang) và tỉnh Bắc Giang cho thấy:
-

75,94 % cơ sở nuôi trồng thuỷ sản sử dụng kháng sinh Pangasius. Các loại này bao
gồm một số loại bị cấm hoặc hạn chế như Enrofloxacin, Amoxiline, Florfenicol,
Doxycycline, Tetracyline.

-

19,86 % các cơ sở nuôi trồng thủy sản sử dụng kháng sinh đối với tơm sử dụng
thuốc của người (ví dụ: Chloramphenicol 250mg).
9


-

Khoảng 30-40 ha diện tích ni trồng thuỷ sản Bắc Giang bị thu hẹp do dịch bệnh
trên tôm.

Phát sinh dịch bệnh nghiêm trọng là do việc lạm dụng thuốc kháng sinh, dẫn đến kháng
thuốc của các loại vi khuẩn gây bệnh trên tơm, phổ biến nhất là nhóm vi khuẩn Vibrio spp..
Trong đó, Vibrio parahaemolyticus là vi khuẩn gây ra bệnh hoại tử gan trên tôm.
1.4.2. Vi khuẩn Vibrio spp.
Vi khuẩn Vibrio spp. là một trong những vi khuẩn nguy hiểm vì chúng khơng những là
tác nhân gây bệnh quan trọng mà cịn có thể gây ngộ độc thực phẩm ở người. Hiện nay,
bệnh truyền nhiễm do nhóm vi khuẩn Vibrio spp. trên thủy sản đặt biệt là trên tôm được
xem là tác nhân gây bệnh đáng được quan tâm, làm ảnh hưởng rất lớn đến sản lượng tôm
nuôi hàng năm. Bên cạnh đó, cơ quan đích của vi khuẩn Vibrio spp. thường là khối gan tụy

của tôm [9].
Những Vibrio spp. như V. harveyi, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V.
anguillarum, V. vulnificus, và V. splendidus thường liên quan đến toom, cá. Bảng 1.1 bên
dưới liệt kê các bệnh gây ra bởi các vi khuẩn Vibrio spp. trong ngành thủy sản.

10


Bảng 1.1. Bệnh gây ra bởi các vi khuẩn Vibrio trong ngành thủy sản
Vibrio spp. gây bệnh
V. parahaemolyticus

Vật chủ

Bệnh dịch

P. monodon

Bệnh hoại tử gan, tỉ lệ gây chết 80%

(Tôm sú)
Peneause monodon
(Tôm sú)

Gây bệnh phát sáng, tỉ lệ chết cao trên
Litopenaeus vannamei tôm sú
V. harveyi

Gây chết 85% ở giai đoạn ấu trùng

(tôm trắng)
Epinephelus coioides

Viêm dạ dày ruột dẫn đến chết hàng loạt

(Cá mú)
Sulculus diversicolor
(Bào ngư Nhật)
P. monodon
V. alginolyticus

Bệnh đỏ thân

(Tôm sú)
Salmo salar L.
(Cá hồi),

V. anguillarum

Chết hàng loạt

Vibriosis

Oncorhynchus mykiss
(Cá hồi cầu vồng)

V. ordalii

Thuộc giống cá hồi,
cá chình, cá biển

Vibriosis

V. salmonicida

Cá hồi Đại tây dương,
cá hồi vân, cá tuyết
Đại Tây Dương

Vibriosis nước lạnh

Cá hồi Đại tây dương,
cá tuyết

Bệnh lở loét mùa đông

Moritella viscose
(V. viscosus)

Bệnh hoại tử gan do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra đang gây thiệt hại nghiêm
trọng cho ngành nuôi tôm. Hình dạng lồi vi khuẩn này được thể hiện ở hình 1.6.

11


Hình 1.6. Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. [10]
Một số báo cáo cho rằng các con đường lây nhiễm Vibrio parahaemolyticus ở tơm có
thể là thức ăn, vỏ, gan tụy v.v. Vibrio parahaemolyticus chiếm lấy các mô tôm sau khi
thâm nhập qua các tế bào biểu mơ [11]. Hình 1.7 So sánh tơm khỏe và tơm nhiễm bệnh
early mortality syndrome (EMS)

Hình 1.7. So sánh tôm khoẻ và tôm nhiễm bệnh EMS [12]
12


1.5 Tính cấp thiết, mục tiêu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
1.5.1. Tính cấp thiết
Ngành ni trồng thủy hải sản đang ngày càng phát triển, đặc biệt là trong việc cung
cấp nguồn thực phẩm chứa hàm lượng protein cao. Tuy nhiên, ngành sản xuất này đang
gặp khó khăn vì sự phát triển của các bệnh dịch và tác nhân gây bệnh cần quan tâm hiện
nay là bệnh do nhóm vi khuẩn Vibrio spp. gây ra. Dịch bệnh trở nên nghiêm trọng là do sự
kháng thuốc của nhóm vi khuẩn này trên tơm. Đó là mối lo ngại khơng chỉ đối với người
ni gây những khó khăn cho việc trị về sau mà còn ảnh hưởng đến sức khỏe của người
tiêu dùng. Bài nghiên cứu này là cơ sở để đề xuất loại kháng sinh điều trị bệnh hoại tử gan
trên tơm có hiệu quả, hạn chế việc lạm dụng kháng sinh, nhằm mục đích hướng tới “phát
triển bền vững” trong nuôi tôm ở Việt Nam. Xuất phát từ thực trạng trên, nhóm tác giả đã
tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: “Trích ly hoạt chất azadirachtin từ cây neem bằng
phương pháp chiết Soxhlet và thử nghiệm khả năng kháng khuẩn Vibrio spp. gây bệnh hoại
tử gan trên tôm”.
1.5.2. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu của đề tài là trích ly thành công hoạt chất azadirachtin từ hạt cây neem và kết
luận về khả năng kháng khuẩn Vibrio spp. gây bệnh hoại tử gan trên tôm của dầu neem.
1.5.3. Nội dung nghiên cứu
-

Nội dung 1: Trích ly azadirachtin từ hạt cây neem.

-

Nội dung 2: Phân tích dầu neem.

-

Nội dung 3: Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn Vibrio spp. của dầu neem.

1.5.3. Phương pháp nghiên cứu
1.5.3.1. Khảo sát từng yếu tố ảnh hưởng
Tiến hành khảo sát từng yếu tố: dung môi, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi, thời gian.

13


-

Loại dung mơi: Thực hiện q trình trích như hình 1.5, cố định thời gian trích 1,5h
sử dụng các dung môi khác nhau như metanol, etanol isopropyl, etyl axetat để tìm
ra loại dung mơi phù hợp cho q trình trích ly.

-

Tỉ lệ ngun liệu/dung mơi: Thực hiện q trình trích như hình 1.5, ở cùng điều kiện
nhiệt độ, dung mơi và thời gian trích là 1,5h. Tiến hành thí nghiệm với tỉ lệ nguyên
liệu/dung môi lần lượt là 1/15, 1/20, 1/25, 1/30, 1/35 để tìm ra tỉ lệ phù hợp cho q
trình trích ly.

-

Thời gian trích: Thực hiện q trình trích như hình 1.5, sử dụng loại dung mơi phù
hợp đã khảo sá. Tiến hành thí nghiệm với thời gian trích lần lượt là 1,5h; 2h, 2,5h;
3h; 3,5h; 4h. để tìm ra thời gian trích ly phù hợp cho q trình trích ly.

-

Hiệu suất của cao trích được tính theo công thức (1.1)
𝐻=

𝑚𝑠ả𝑛 𝑝ℎẩ𝑚 (𝑔)
10g (𝑚ℎạ𝑡 𝑛𝑒𝑒𝑚 𝑏𝑎𝑛 đầ𝑢 )

∗ 100%

(1.1)

1.5.3.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography –
HPLC) là một phương pháp hóa lý, dùng để tách và định lượng các thành phần trong hỗn
hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhưng không trộn lẫn
vào nhau: pha tĩnh và pha động (dung môi rửa giải). Khi dung dịch của hỗn hợp các chất
cần phân tích được đưa vào cột bằng hệ thống bơm để tạo áp suất cao, chúng sẽ được hấp
phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất của pha tĩnh trong cột và chất cần
phân tích. Khi thay đổi thành phần pha động và bơm vào cột sắc kí, do ái lực tương tác
giữa chất cần phân tích với pha động, pha tĩnh khác nhau nên khi pha động di chuyển, các
chất cũng bị đẩy đi dẫn đến sự phân tách [13,14]
Thiết bị HPLC gồm các bình chứa dung mơi, bơm cao áp, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc kí,
đầu dị, bộ phận ghi nhận tín hiệu, và bình thải được mơ tả trong hình 1.8.

14


Bộ phận ghi

nhận dữ liệu

Cột HPLC
Tiêm mẫu

Dung mơi

Đầu dị

Bơm

Bình thải

Hình 1.8. Sơ đồ hoạt động của hệ thống phân tích HPLC. [15]
Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ
nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp để tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ
phân hủy nhiệt.
Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc
trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược
phẩm, môi trường…
Trong nghiên cứu này hệ thống phân tích HPLC được lựa chọn để phân tích hàm
lượng azadirachtin trong dầu neem vì những ưu điểm nổi trội được nêu trên.
1.5.3.3. Phương pháp đục lỗ thạch trên đĩa môi trường thiosulfate-citrate-bile saltssucrose (TCBS)
-

Trải vi khuẩn lên bề mặt thạch TCBS, sau đó đục các lỗ

-

Đục các lỗ thạch cách xa nhau;

-

Nạp chất kháng khuẩn ở các nồng độ khác nhau;

-

Ủ đĩa ở nhiệt độ và thời gian phù hợp. Đọc kết quả bằng cách đo vịng vơ khuẩn
xung quanh lỗ thạch

15


CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM
2.1. Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ, thiết bị và địa điểm thực hiện
2.1.1. Nguyên liệu
Hạt neem khô được thu mua từ Sở nông nghiệp và phát triển nơng thơn Ninh Thuận.

Hình 2.1. Hạt neem sau khi được sấy khơ
Tại phịng thí nghiệm tiến hành các cơng đoạn tiền xử lí và xử lí. Hạt neem được sấy
khơ trong tủ sấy ở nhiệt độ 60°C, sau đó được bóc vỏ và say nhuyễn hoặc nghiền bằng máy
xay mẫu, đảm bảo độ nhuyễn đều, không bị ẩm mốc.
2.1.2. Hóa chất
Các hố chất cần thiết bao gồm dung mơi chiết và chất chuẩn azadirachtin dùng trong
phân tích HPLC.

16