Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa của một số loài thực vật định hướng nghiên cứu nguyên liệu có tiềm năng chống tăng đường huyết trên mô hình động vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM
-----------------------------

DƯƠNG MINH TRÍ

SÀNG LỌC HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA
CỦA MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT ĐỊNH HƯỚNG
NGHIÊN CỨU NGUYÊN LIỆU CĨ TIỀM NĂNG
CHỐNG TĂNG ĐƯỜNG HUYẾT TRÊN MƠ
HÌNH ĐỘNG VẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số ngành: 60420201

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN NGỌC HỒNG
TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 11 năm 2017


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP. HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS. Nguyễn Ngọc Hồng
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Luận văn Thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Công nghệ TP. HCM
ngày 11 tháng 11 năm 2017
Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm:
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn Thạc sĩ)

TT
1
2
3
4
5

Họ và tên
PGS TS. Nguyễn Tiến Thắng
TS. Nguyễn Hồng Dũng
TS. Võ Đình Lệ Tâm
PGS TS. Thái Văn Nam
TS. Nguyễn Thị Hai

Chức danh Hội đồng
Chủ tịch
Phản biện 1
Phản biện 2
Ủy viên
Ủy viên, Thư ký

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận sau khi Luận văn đã được
sửa chữa (nếu có).
Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV

PGS TS. Nguyễn Tiến Thắng


TRƯỜNG ĐH CƠNG NGHỆ TP. HCM

CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

VIỆN ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
TP. HCM, ngày 30 tháng 08 năm 2017

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: DƯƠNG MINH TRÍ

Giới tính: Nam

Ngày, tháng, năm sinh: 27/04/1993

Nơi sinh: Đồng Nai

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

MSHV: 1541880013

I- Tên đề tài:
SÀNG LỌC HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA MỘT SỐ LỒI THỰC
VẬT ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU NGUN LIỆU CĨ TIỀM NĂNG
CHỐNG TĂNG ĐƯỜNG HUYẾT TRÊN MƠ HÌNH ĐỘNG VẬT
II- Nhiệm vụ và nội dung:
Nhiệm vụ: Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa và hướng đến khả năng làm ổn định
đường huyết của một số loài cây mọc phổ biến ở Việt Nam góp phần hỗ trợ điều trị tiểu
đường.
Nội dung: Sàng lọc khả năng chống oxy hóa của một số loài thực vật và nghiên cứu
khả năng ổn định đường huyết của các mẫu có hoạt tính chống oxy hóa tốt trên mơ

hình chuột tăng đường huyết cấp tính và chuột tiểu đường gây ra bởi Streptozocin.
III- Ngày giao nhiệm vụ: 15/02/2017
IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 30/8/2017
V- Cán bộ hướng dẫn: TS. NGUYỄN NGỌC HỒNG
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

TS. Nguyễn Ngọc Hồng

KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH
(Họ tên và chữ ký)


i

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất kỳ
cơng trình nào khác.
Tơi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã
được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Học viên thực hiện Luận văn

Dƣơng Minh Trí


ii

LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại

học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, q thầy cơ giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh
học - Thực phẩm - Môi trường cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến
thức quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua.
Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Ngọc Hồng,
người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong
suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cơ ở
Phịng Thí nghiệm Khoa Cơng nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng các
anh chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hồn
thành tốt đề tài của mình.
Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã ln bên cạnh, động viên
con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng
như trong cuộc sống.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 11 năm 2017

Dƣơng Minh Trí


iii

TĨM TẮT
Mục đích của nghiên cứu này là để đánh giá hoạt tính chống oxy h a và tiềm năng
chống tăng đường huyết của cao chiết ethanol từ 20 loài thực vật ở Việt Nam Hoạt
tính chống oxy h a được phân tích qua phương pháp qu t gốc tự do
diphenyl- -picryl-hydrazyl và FRAP ( erric Reducing
quả cho thấy

PPH

-

ntioxidant Power

Kết

mẫu cao chiết ethanol từ lá chôm chôm Nephelium lappaceum) và

lá ổi (Psidium guajava c hoạt tính chống oxy h a cao nhất với giá trị I
phương pháp

PPH lần lượt là

lần so với đối chứng ascor ic acid I

50

trong

g ml và 4,14 µg/ml, cao hơn 2,51 lần và
50

52

= 2,73 g ml Trong phương pháp R P

giá trị chống oxy h a của cao chiết lá chôm chôm là
chiết lá ổi là 5794  42 μmol e2+ L giá trị này ằng 0

μmol e2+/L và cao
lần và 0 51 lần so với

ascorbic acid (11390 ± 98 μmol Fe2+ L Hàm lượng polyphenol tổng c trong lá
chôm chôm và lá ổi lần lượt là

3  8,45 mg GAE/g và 150,47  6,49 mg

G E g khô Hàm lượng flavonoid tổng số của hai loại cao chiết lá chôm chôm và lá
ổi lần lượt là

 0,81 mg RE/g và 97,45  1,03 mg RE/g khô Sự ảnh hưởng

của cao chiết với liều thử 00-200mg.kg-1 ở mơ hình chuột tăng đường huyết cấp
tính cho thấy chuột uống cao chiết ethanol từ lá chôm chôm và lá ổi ở nồng độ
150mg.kg-1 thể trọng c nồng độ glucose trong máu giảm đáng kể so với nh m
chứng tăng đường huyết và tương đương với nh m chứng trắng. ao chiết ethanol
từ

mẫu cây này được tiếp tục thử nghiệm trên mơ hình chuột tiểu đường type

gây ra ởi streptozocin STZ và kết quả cho thấy vào ngày thứ

của q trình

theo dõi cao chiết ethanol từ lá chơm chơm c hoạt tính tốt hơn cao chiết từ lá ổi và
tương đương với nh m được sử dụng thuốc trị tiểu đường glibenclamide (10mg.kg-1
thể trọng . Những kết quả thu được trong nghiên cứu này chứng minh lá chôm
chôm và lá ổi là nguồn của chất chống oxy h a tự nhiên c tiềm năng làm ổn định
đường huyết ở liều dùng phù hợp.


iv

ABSTRACT
The aim of the present study was to evaluate antioxidant activity and the antihyperglycemic potential of ethanolic extract from 20 plant species in Vietnam.
Antioxidant activity were tested on the 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) free
radical scavenging assay and the ferric reducing/antioxidant power assay (FRAP).
The results revealed that the ethanolic extract of rambutan (Nephelium lappaceum)
leaves and guava (Psidium guajava) leaves have high antioxidant activities which
showed an IC50 values in the DPPH method respectively of 6,85 µg/ml and 4,14
µg/ml were 2,51 and 1,52 fold higher that of ascorbic acid (IC50 = 2,73 µg/ml). In
FRAP method, the antioxidant values were 6428 ±

μmol e2+/L of rambutan

leaves extract and 5794  42 μmol Fe2+/L of 1mg/ml concentration of sample of
guava leaves extract, this values by 0.56 fold and 0.51 fold than ascorbic acid
390

9 μmol e2+/L). Total phenolic content of rambutan and guava leaves

with values were 168,73  8,45 mg GAE/g of dry weight and 150,47  6,49 mg
GAE/g of dry weight. Total flavonoid content of rambutan and guava leaves with
values were 74,45  0,81 mg RE/g of dry weight and 97,45  1,03 mg RE/g of dry
weight. Effect of oral glucose tolerance of ethanol extract of leaves was examined
with dose of 100-200mg.kg-1 based on the body weight, the result showed that the
mice were fed ethanol extract of Nephelium lappaceum and Psidium guajava leaves
with dose of 150mg.kg-1 body weight decreased serum glucose levels significantly
when compared to high glucose control group and was equivalently when compared
with that of normal mice control group. The ethanol extracts from two samples
were tested in type 1 streptozocin induced diabetic mice. The results showed that on
day 21 of the test, ethanol extracts from rambutan leaves has a higher activity than

guava leaves and was comparable to that used in the glibenclamide group (10mg.kg1

body weight). The results obtained in the present study demonstrated that

Nephelium lappaceum leaves and Psidium guajava leaves are potential sources of


v

natural antioxidants, possibly be used for improvement of blood glucose at right
dosage.


vi

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ii
TÓM TẮT ................................................................................................................ iii
ABSTRACT .............................................................................................................. iv
MỤC LỤC ................................................................................................................. vi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................... x
DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................................... xi
DANH MỤC CÁC HÌNH .......................................................................................xii
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
Mục tiêu nghiên cứu.................................................................................................. 2
Nội dung nghiên cứu ................................................................................................. 2
Ý nghĩa khoa học ....................................................................................................... 3
Ý nghĩa thực tiễn ....................................................................................................... 3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN..................................................................................... 4
1.1. Gốc tự do và sự stress oxy hóa .......................................................................... 4
1.1.1. Khái niệm về gốc tự do ................................................................................... 4
1.1.2. Mối liên hệ giữa stress oxy hóa và bệnh tiểu đƣờng .................................... 4
1.2. Hợp chất polyphenol và mối liên hệ với bệnh tiểu đƣờng .............................. 5
1.2.1. Ảnh hƣởng của các chất polyphenol lên sự hấp thụ glucose trong ruột .... 6
1.2.2. Ảnh hƣởng của polyphenol lên chức năng tế bào β tuyến tụy .................... 7
1.2.3. Ảnh hƣởng của các polyphenol lên chức năng gan để duy trì cân bằng
glucose nội mô ............................................................................................................ 8
1.3. Sơ lƣợc về bệnh tiểu đƣờng ............................................................................ 10
1.3.1. Phân loại ......................................................................................................... 10
1.3.2. Các yếu tố nguy cơ dẫn đến bệnh tiểu đƣờng............................................. 12
1.3.3. Xét nghiệm hóa sinh chẩn đoán bệnh tiểu đƣờng ...................................... 15
1.3.4. Chế độ dùng thuốc trong điều trị tiểu đƣờng ............................................. 16


vii

1.3.5. Nghiên cứu điều trị tiểu đƣờng bằng thảo dƣợc trên thế giới .................. 18
1.3.6. Nghiên cứu điều trị tiểu đƣờng từ nguồn thực vật tại Việt Nam.............. 19
1.3.7. Mô hình chuột tiểu đƣờng ............................................................................ 21
1.3.7.1. Mơ hình bệnh lý trên động vật thực nghiệm ........................................... 21
1.3.7.2. Mơ hình tiểu đƣờng type 1 ........................................................................ 22
1.3.8. Tổng quan về một số cây trong nghiên cứu ................................................ 25
1.3.8.1. Cây xoài ....................................................................................................... 25
1.3.8.2. Cây chôm chôm .......................................................................................... 27
1.3.8.3. Cây núc nác ................................................................................................. 29
1.3.8.4. Cây ổi ........................................................................................................... 30
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 33
2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài ........................................................... 33

2.2. Đối tƣợng nghiên cứu....................................................................................... 33
2.2.1. Nguyên liệu thực vật ..................................................................................... 33
2.2.2. Đối tƣợng động vật ........................................................................................ 36
2.2.3. Dụng cụ, hóa chất, thiết bị dùng cho thí nghiệm........................................ 36
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................................. 37
2.3.1. Phƣơng pháp xử lý mẫu, tách chiết và thu nhận cao chiết ....................... 39
2.3.2. Phƣơng pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa ....................................... 39
2.3.2.1. Mơ hình qt gốc tự do DPPH .................................................................. 39
2.3.2.2. Mơ hình FRAP............................................................................................ 41
2.3.3. Phƣơng pháp định lƣợng polyphenol tổng số và flavonoid tổng số ......... 42
2.3.3.1. Phƣơng pháp định lƣợng polyphenol tổng số .......................................... 43
2.3.3.2. Phƣơng pháp định lƣợng flavonoid tổng số............................................. 43
2.3.4. Phƣơng pháp đánh giá khả năng chống tăng đƣờng huyết ...................... 44
2.3.4.1. Xác định độc tính cấp ................................................................................ 44
2.3.4.2. Khảo sát trên mơ hình in vivo chuột tăng đƣờng huyết cấp tính .......... 45
2.3.4.3. Khảo sát trên mơ hình in vivo chuột gây tiểu đƣờng bởi streptozocin.. 47
2.3.4.4. Phƣơng pháp định lƣợng glucose trong máu .......................................... 50


viii

2.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu ............................................................................ 51
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 52
3.1. Kết quả đánh giá khả năng chống oxy hóa .................................................... 52
3.1.1. Mơ hình qt gốc tự do DPPH ..................................................................... 52
3.1.2. Mơ hình FRAP............................................................................................... 56
3.2. Kết quả định lƣợng polyphenol tổng số và flavonoid tổng số ...................... 60
3.2.1. Kết quả định lƣợng polyphenol tổng số ...................................................... 60
3.2.2. Kết quả định lƣợng flavonoid tổng số ......................................................... 61
3.3. Kết quả đánh giá khả năng chống tăng đƣờng huyết ................................... 63

3.3.1. Xác định độc tính cấp ................................................................................... 63
3.3.2. Kết quả đánh giá khả năng điều hòa đƣờng huyết của các mẫu cao chiết
trên mơ hình chuột tăng đƣờng huyết cấp tính .................................................... 63
3.3.2.1. Khả năng điều hịa đƣờng huyết của nhóm cao chiết từ lá cây
Mangifera indica ...................................................................................................... 64
3.3.2.2. Khả năng điều hịa đƣờng huyết của nhóm cao chiết từ lá cây
Nephelium lappaceum.............................................................................................. 65
3.3.2.3. Khả năng điều hịa đƣờng huyết của nhóm cao chiết từ lá cây Psidium
guajava ...................................................................................................................... 67
3.3.2.4. Khả năng điều hòa đƣờng huyết của nhóm cao chiết từ lá cây Oroxylum
indicum ..................................................................................................................... 69
3.3.2.5. Khả năng điều hịa đƣờng huyết của nhóm 4 mẫu cao chiết từ 4 cây có
hoạt tính chống oxy hóa tốt .................................................................................... 71
3.3.3. Kết quả tạo mơ hình chuột tiểu đƣờng type 1 bằng STZ .......................... 73
3.3.4. Kết quả thử nghiệm khả năng ổn định đƣờng huyết của các mẫu trên mơ
hình chuột tiểu đƣờng type 1.................................................................................. 74
3.3.4.1. Kết quả khả năng ổn định đƣờng huyết của các mẫu trên mô hình
chuột tiểu đƣờng type 1 vào ngày thứ nhất .......................................................... 74
3.3.4.2. Kết quả khả năng ổn định đƣờng huyết của các mẫu trên mơ hình
chuột tiểu đƣờng type 1 vào ngày thứ 7 ................................................................ 75


ix

3.3.4.3. Kết quả khả năng ổn định đƣờng huyết của các mẫu trên mơ hình
chuột tiểu đƣờng type 1 vào ngày thứ 14 .............................................................. 76
3.3.4.4. Kết quả khả năng ổn định đƣờng huyết của các mẫu trên mơ hình
chuột tiểu đƣờng type 1 vào ngày thứ 21 .............................................................. 77
3.3.4.5. Kết quả khả năng ổn định đƣờng huyết của các mẫu trên mơ hình
chuột tiểu đƣờng type 1 vào các thời điểm trong 21 ngày thử nghiệm .............. 78

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 83
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 85
PHỤ LỤC


x

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AGEs: advanced glycation endproducts.
DMSO: Dimethyl sulfoxyde.
DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl.
EGCG: Epigallocatechin gallate.
FRAP: ferric reducing/antioxidant power.
G6PD: glucose-6 phosphate dehydrogenase
G6Pase: glucose-6-phosphatase
GAE: Gallic acid equivalent đương lượng gam acid gallic .
GSH-Px: glutathione peroxidase.
HbA1c: Glycosylated hemoglobin.
IC50: half maximal inhibitory concentration .
LDL: low density lipoprotein.
NF-κB: nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells.
NO: nitric oxide.
RE: Rutin equivalent đương lượng gam rutin .
RNS: Reactive Nitrogen Species.
ROS: Reactive Oxygen Species.
SOD: superoxide dismutase.
STZ: streptozocin hay streptozotocin.
TPTZ: 2,4,6-tripyridyl-s-triazin.
PEPCK: phosphoenolpyruvate carboxykinase.

xi

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Tên 0 loài thực vật sử dụng trong nghiên cứu........................................ 33
Bảng 3.1. Hoạt tính qu t gốc tự do PPH của 0 mẫu cây...................................... 53
Bảng 3.2. Khả năng chống oxy h a thông qua mô hình R P của 0 mẫu cây...... 58
Bảng 3.3. Hàm lượng polyphenol tổng số của

cây c hoạt tính chống oxy h a cao

nhất ............................................................................................................................ 61
Bảng 3.4 Hàm lượng polyphenol tổng số của

cây c hoạt tính chống oxy h a cao

tốt nhất ....................................................................................................................... 62
Bảng 3.5. Nồng độ glucose máu và % ức chế sự tăng đường huyết ở các liều dùng
khác nhau của các nh m thử nghiệm ........................................................................ 72
Bảng 3.6. Nồng độ glucose máu của các nhóm chuột thử nghiệm........................... 74
Bảng 3.7. Nồng độ glucose máu mmol L của các nh m tại các thời điểm ........... 79


xii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của streptozocin ............................................................ 23
Hình 1.2. Sơ đồ tác động của Streptozocin .............................................................. 24
Hình 1.3. Cây xồi .................................................................................................... 26
Hình 1.4. Lá và quả chơm chơm............................................................................... 27

Hình 1.5. Lá và quả cây núc nác .............................................................................. 29
Hình 1.6. Lá và quả ổi .............................................................................................. 31
Hình 2.1. Hình ảnh 20 mẫu cây sử dụng trong nghiên cứu ...................................... 36
Hình 2.2. Chuột bạch dùng cho thí nghiệm .............................................................. 36
Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ...................................................................... 38
Hình 2.4. Phản ứng giải thích sự thay dổi màu sắc của DPPH ................................ 39
Hình 2.5. Màu sắc của dung dịch DPPH chứa cao chiết có nồng độ từ cao→thấp . 40
Hình 2.6. Nhóm thử nghiệm gồm 6 con chuột ......................................................... 44
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thử hoạt tính của mẫu trên chuột tăng đường
huyết cấp tính ............................................................................................................ 45
Hình 2.8. Chuột được cho uống dung dịch glucose 2g.kg-1 thể trọng ...................... 47
Hình 2.9. Sơ đồ tạo mơ hình chuột mắc bệnh tiểu đường type 1 ............................. 47
Hình 2.10. Chuột được tiêm STZ vào phúc mạc bụng ............................................. 48
Hình 2.11. Sơ đồ thử nghiệm hoạt tính của mẫu trên chuột tiểu đường type 1 ....... 49
Hình 2.12. Chuột được cho uống cao chiết .............................................................. 50
Hình 2.13. Máy đo nồng độ glucose trong máu ....................................................... 50
Hình 3.1. Hoạt tính loại gốc tự do DPPH ở nồng độ 1mg/ml của dịch chiết ethanol
từ 4 mẫu ..................................................................................................................... 55
Hình 3.2. Hoạt tính loại gốc tự do thông qua giá trị IC50 của dịch chiết ethanol từ 4
mẫu ............................................................................................................................ 56
Hình 3.3. Đường chuẩn Fe2+-TPTZ .......................................................................... 57
Hình 3.4. Khả năng chống oxy hóa in vitro trên mơ hình FRAP của 4 mẫu có hoạt
tính tốt nhất ............................................................................................................... 59
Hình 3.5. Đường chuẩn acid gallic ........................................................................... 60


xiii

Hình 3.6 Đường chuẩn rutin .................................................................................... 62
Hình 3.7. Nồng độ glucose máu của nhóm cao chiết ethanol từ lá xồi so sánh với

các nh m đối chứng .................................................................................................. 64
Hình 3.8. Nồng độ glucose máu của nhóm cao chiết ethanol từ lá chôm chôm so
sánh với nh m đối chứng .......................................................................................... 66
Hình 3.9. Nồng độ glucose máu của nhóm cao chiết ethanol từ lá ổi so sánh với
nh m đối chứng. ........................................................................................................ 68
Hình 3.10. Nồng độ glucose máu của nhóm cao chiết ethanol từ lá núc nác so sánh
với nh m đối chứng .................................................................................................. 70
Hình 3.11. Nồng độ glucose máu của các nhóm chuột thử nghiệm vào ngày thứ
nhất ............................................................................................................................ 75
Hình 3.12. Nồng độ glucose máu của các nhóm chuột thử nghiệm vào ngày thứ 7 ....
................................................................................................................................... 76
Hình 3.13. Nồng độ glucose máu của các nhóm chuột thử nghiệm vào ngày thứ 14 ..
................................................................................................................................... 77
Hình 3.14. Nồng độ glucose máu của các nhóm chuột thử nghiệm vào ngày thứ 21 ..
................................................................................................................................... 78


1

MỞ ĐẦU
ĐẶT VẤN ĐỀ
Gốc tự do được tạo ra trong quá trình trao đổi chất của cơ thể khi ở mức độ
cao dẫn đến sự rối loạn và mất cân bằng của các q trình sinh hóa và là ngun
nhân chính gây ra nhiều loại bệnh tật

ođ

việc tìm ra những hợp chất chống oxy

hóa có khả năng ức chế các gốc tự do hoặc các quá trình gián tiếp sinh ra gốc tự do

là điều cần thiết.
hất chống oxy h a c thể c nguồn gốc từ thiên nhiên hoặc được tổng hợp
h a học Tuy nhiên những hợp chất c nguồn gốc từ thiên nhiên c nhiều lợi thế
hơn so với những hợp chất tổng hợp do hợp chất tổng hợp gây ra những phản ứng
phụ như viêm gan và ung thư Bên cạnh đ

những hợp chất c nguồn gốc từ thiên

nhiên đôi khi tác dụng dược lý tốt hơn Kahkonen et al., 1999).
Vấn đề liên quan đến đường huyết ln được mọi người quan tâm đến vì
lượng đường trong máu dù tăng hay giảm đi so với mức ình thường thì sẽ tác động
không tốt đến sức khỏe. Chứng tăng đường huyết ảnh hưởng trực tiếp đến bệnh tiểu
đường

ác th i quen trong ăn uống không điều độ, chế độ dinh dưỡng quá nhiều

đồ ngọt đồ béo hoặc uống những loại thức uống có cồn như rượu, bia và ít hoạt
động thể chất cũng ảnh hưởng đến lượng đường trong máu và dần dần sẽ hình thành
bệnh tiểu đường. Với nhu cầu điều trị và dự phòng tiểu đường, hàng loạt các thuốc
tổng hợp đã được các tập đồn các cơng ty dược phẩm nghiên cứu và phát triển.
Tuy nhiên các thuốc có nguồn gốc tổng hợp khơng phải là giải pháp tối ưu đối với
quốc gia đang phát triển như Việt Nam nguyên nhân là giá thành điều trị cao, thuốc
tổng hợp có phản ứng phụ với tác dụng không mong muốn.
Từ trước đến nay, Việt Nam chưa thực sự quan tâm đúng mức đến nền y học
tự cường, mang bản sắc rất riêng của dân tộc ta Đ chính là nền y học bản địa gắn
với sử dụng cây thuốc Nam. Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa
nóng ẩm có một hệ sinh thái phong phú và đa dạng, một tiềm năng lớn về tài
nguyên cây dược liệu n i riêng và tài nguyên dược liệu (thực vật động vật, khoáng

2

vật n i chung Điều này thể hiện ở sự đa dạng về chủng loại cây dược liệu (trong
số hơn

000 lồi thực vật Việt Nam thì có hơn 5.000 lồi cho công dụng làm

thuốc), phân bố rộng khắp cả nước, có nhiều lồi dược liệu được xếp vào lồi q
và hiếm trên thế giới. Với nguồn dược liệu phong phú và đa dạng, thế nhưng hàng
năm Việt Nam vẫn phải tiêu tốn rất nhiều tiền vào việc nhập khẩu nguồn nguyên
liệu từ nước ngoài. Nguy hiểm hơn các nguồn nguyên liệu nhập khẩu cũng chưa
phải là nguồn nguyên liệu sạch, nguyên liệu đảm bảo cho sản xuất thuốc có nguồn
gốc thảo dược. Thuốc có nguồn gốc thảo dược đang được các nước quan tâm và
phát triển với ưu điểm là nguồn dược liệu sẵn có, dễ sử dụng, giá thành rẻ, ít tác
dụng phụ dễ được cộng đồng chấp nhận đặc biệt là các nước kém phát triển và
đang phát triển.
Mục tiêu nghiên cứu
Để đánh giá hiệu quả của các thuốc có nguồn gốc thảo dược thì cần phải có
những nghiên cứu đánh giá tác dụng in vitro và dược lý an đầu Đề tài được thực
hiện nhằm mục đích nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa in vitro và hướng đến
khả năng làm ổn định đường huyết trên mơ hình in vivo trên chuột tăng đường
huyết cấp tính và chuột tiểu đường của một số loài cây mọc phổ biến ở Việt Nam.
Đây là nguồn nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm sẽ góp phần lớn trong việc sản xuất ra
các chế phẩm ngăn ngừa và chữa trị nhiều loại bệnh tật cho con người trong đ c
bệnh tiểu đường.
Nội dung nghiên cứu
- Sàng lọc khả năng chống oxy hóa của một số lồi thực vật thơng qua hai
phương pháp phổ biến là DPPH và FRAP.
- Xác định hàm lượng polyphenol tổng số và flavonoid tổng số của một số cây
có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất.

- Khảo sát khả năng ổn định đường huyết của các cao chiết có hoạt tính chống
oxy hóa cao nhất trên mơ hình in vivo chuột tăng đường huyết cấp tính.


3

- Đánh giá hoạt tính làm ổn định đường huyết của các cao chiết trên mơ hình
chuột bị tiểu đường gây ra bởi streptozocin.
Ý nghĩa khoa học
Sàng lọc hoạt tính chống oxy h a của 0 mẫu cao chiết ethanol của 0 loại
cây từ đ chọn ra một số mẫu cây c hoạt tính tốt nhất định hướng cho việc nghiên
cứu nguyên liệu thực vật c tiềm năng ngăn ngừa và hỗ trợ điều trị ệnh tiểu đường
là một trong các con đường tiếp cận hợp lý
Nghiên cứu hoạt tính làm ổn định đường huyết của lá ổi trên mô hình chuột
ị tiểu đường ởi STZ mà chưa c tài liệu nào trong nước công ố trước đ .
Nghiên cứu hoạt tính chống oxy h a chống tăng dường huyết cấp tính và
làm ổn định đường huyết trên mơ hình chuột ị tiểu đường ởi STZ của cao chiết
ethanol lá chơm chơm mà chưa c tài liệu trong và ngồi nước công ố trước đ
Ý nghĩa thực tiễn
ung cấp thông tin về sự so sánh hoạt tính chống oxy h a và hoạt tính chống
tăng đường huyết của một số lồi cây
Những nghiên cứu về hoạt tính chống oxy h a mạnh và khả năng làm ổn định
đường huyết trên mơ hình chuột ị đái tháo đường là cơ sở cho việc nghiên cứu sâu
hơn và ứng dụng tạo chế phẩm c tác dụng ngăn ngừa và hỗ trợ điều trị ệnh tiểu
đường trên người.


4

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1.Gốc tự do và sự stress oxy hóa
1.1.1.Khái niệm về gốc tự do
ác “gốc tự do” hay n i chính xác hơn là các chất hoạt động chứa oxy và nitơ
(Reactive Oxygen Species - ROS và Reactive Nitrogen Species - RNS) là các dẫn
xuất dạng khử của oxy và nitơ phân tử

húng được chia thành hai nh m lớn là các

“gốc tự do” và các dẫn xuất không phải gốc tự do
hoặc nguyên tử c một hoặc nhiều điện tử độc thân

ác “gốc tự do” là các phân tử
ác dẫn xuất không phải gốc

tự do như oxy đơn hydroperoxyde nitroperoxyde là tiền chất của các gốc tự do
1.1.2.Mối liên hệ giữa stress oxy hóa và bệnh tiểu đƣờng
ơ thể con người liên tục tiếp xúc với các nguồn sản sinh ra gốc tự do
ROS RNS Để đáp ứng với điều đ

cơ thể có hệ thống chống oxy hóa nội sinh

hoặc được bổ sung chất chống oxy hóa ngoại sinh từ chế độ ăn uống làm trung hòa
các gốc tự do và giữ cân bằng nội môi của cơ thể. Sự mất cân bằng giữa gốc tự do
và chất chống oxy hóa dẫn đến tạo ra một tình trạng gọi là ''stress oxy hóa'' mà một
trong các kết quả của nó là sự phát triển bệnh tiểu đường.
Stress oxy h a đ ng vai trò quan trọng trong sự phát triển của các biến chứng
mạch máu trong bệnh tiểu đường đặc biệt là bệnh tiểu đường type 2 (Pham-Huy,
2008). ROS mức độ cao trong bệnh tiểu đường có thể do sự gia tăng sản xuất các
enzyme catalase, superoxide dismutase (SOD) và glutathione peroxidase (GSHPx) làm cho các mô nhạy cảm với stress oxy hóa dẫn đến sự phát triển của các biến
chứng bệnh tiểu đường (Lipinski, 2001).

Sự biểu hiện quá mức của các gốc tự do gây hại cho các protein tế bào, lipid
màng và nucleic acid và cuối cùng gây ra sự chết của các tế bào Tăng đường huyết
cũng được cho là thúc đẩy quá trình peroxy hóa lipid của LDL (low density
lipoprotein) bằng con đường superoxide. Sự tương tác của glucose với protein dẫn
đến sự hình thành của hợp chất glycate hóa bền vững AGEs (advanced glycation


5

endproducts). Các thụ thể của AGEs (RAGEs), làm bất hoạt enzyme và làm thay
đổi cấu trúc và chức năng của enzyme thúc đẩy sự hình thành gốc tự do, làm ngăn
chặn tác dụng của các chất kháng nitric oxide - gốc tự do

GEs tăng stress oxy

hóa trong tế bào, kích hoạt các yếu tố phiên mã NF-κB, từ đ thúc đẩy tăng điều
chỉnh của NF-κB lên sự kiểm soát các gen đích khác nhau làm tăng cường sản
xuất nitric oxide - chất trung gian gây tổn thương tế bào β đảo tụy. (Maritim et al.,
2003)
1.2. Hợp chất polyphenol và mối liên hệ với bệnh tiểu đƣờng
Thực vật tổng hợp rất nhiều các chất thứ cấp so với động vật vì chúng không
thể lẫn trốn được kẻ thù mà phải dựa vào hệ thống phịng thủ hóa học này Đặc tính
chống oxy hóa hay tạo phức với kim loại; tạo ra các tín hiệu thơng tin giữa phần ở
trên cũng như dưới mặt đất, giữa các cây khác với sinh vật khác; polyphenol còn là
các tác nhân che chắn tia tử ngoại (UV) từ mặt trời. Khả năng chống tia UV giúp
cho thực vật có thể chuyển từ sống dưới nước lên cạn hồn tồn. Các nghiên cứu
cịn cho thấy trao đổi hợp chất polyphenol không chỉ bảo vệ chống lại các yếu tố
sinh học mà cịn tham gia q trình điều hòa ở cấp độ phân tử giúp cây sinh trưởng
và phát triển ình thường. Một số hợp chất polyphenol tham gia tạo màu sắc tự
nhiên của hoa, quả, hấp dẫn côn trùng thụ phấn cho hoa.

Sự đa dạng về cấu trúc của polyphenol kéo dài từ acid của phenol như
hydroxy enzoic và hydroxycinnamic đơn giản đến các đại phân tử polymer lớn như
các proanthocyanidin và ellagitannin. Một nhóm các hợp chất phenol cần thiết là
flavonoid bao gồm các lớp cấu trúc như flavonol flavone flavanol flavanone
anthocyanidin và isoflavone. Lượng khẩu phần ăn của người đối với polyphenol
khoảng 1g/ngày. Tiêu thụ thức ăn từ thực vật giàu polyphenol làm giảm nguy cơ
mắc các bệnh mãn tính như ệnh tiểu đường, bệnh tim mạch và ung thư Các nghiên
cứu in vitro và in vivo về polyphenol cho thấy các polyphenol có hoạt tính chống
viêm, chống oxy hố, chống lại chất gây độc có tính oxy hóa và bảo vệ thần kinh.
Chúng có thể đ ng g p vào việc bảo vệ sức khoẻ con người. Hiện nay, nhiều nghiên


6

cứu cho thấy các chất polyphenol trong thực phẩm cũng ảnh hưởng đến chuyển hóa
glucose và lipid trong cơ thể. (Kati et al., 2010)
Duy trì trạng thái cân bằng glucose là điều quan trọng nhất đối với sinh lý của
con người, thơng qua sự kiểm sốt hormone nghiêm ngặt. Sự rối loạn kiểm sốt này
có thể dẫn đến hội chứng rối loạn chuyển hóa bao gồm

o phì tăng đường huyết,

giảm dung nạp glucose, cao huyết áp và rối loạn lipid máu (Eckel et al., 2005). Sự
bất thường đặc trưng nhất trong hội chứng rối loạn chuyển hóa là sự đề kháng
insulin, kết quả từ các tương tác giữa các yếu tố di truyền và môi trường, bao gồm
chế độ ăn uống và lối sống ít vận động (McCarthy, 2004 và Uusitupa, 2005). Hội
chứng rối loạn chuyển hóa là yếu tố dẫn đến bệnh đái tháo đường type 2, gây ra bởi
khiếm khuyết trong tác động của insulin và sự bài tiết insulin. Sự rối loạn chuyển
hóa glucose thường liên quan đến sự gia tăng khối lượng chất

o đặc biệt là ở

vùng bụng đến các mô mà ở đ chất béo không được lưu giữ trong trạng thái cân
bằng năng lượng ình thường (Laaksonen et al., 2004).
1.2.1. Ảnh hƣởng của các chất polyphenol lên sự hấp thụ glucose trong ruột
Thực phẩm và đồ uống có nhiều car ohydrate gây tăng đường huyết sau ăn
tăng glucose máu và các rối loạn nội tiết và chuyển hóa khác. Sự hấp thu nhanh
glucose gây áp lực đến cơ chế điều hoà cân bằng glucose làm tăng nguy cơ

o phì,

tiểu đường type 2 và bệnh tim mạch (Ludwig, 2002). α-amylase và α-glucosidase là
những enzyme chủ chốt chịu trách nhiệm cho việc tiêu hóa các carbohydrate trong
khẩu phần ăn chứa glucose.
Một loạt các polyphenol đã được chứng minh là ức chế hoạt động của αamylase và α-glucosidase in vitro. Các polyphenol ức chế các enzyme này bao gồm
flavonoid (anthocyanin, catechin, flavanone, flavonol, flavone và isoflavone), acid
phenolic và tannin (proanthocyanidin và ellagitannin).
Ảnh hưởng của các thực phẩm và đồ uống giàu polyphenol trên đáp ứng
glucose máu sau ăn uống đã được nghiên cứu trong các mơ hình động vật và trong
các nghiên cứu lâm sàng.


7

- Nghiên cứu trên động vật: ác anthocyanin diacyl h a cũng như chiết xuất
anthocyanin từ khoai lang tím làm giảm glucose máu và đáp ứng insulin đối với
việc sử dụng maltose ở chuột nhắt (Matsui et al.

00

ũng c một polyphenol từ

chè, theaflavin 3-O-gallate, có hiệu quả trong việc ngăn chặn sự tăng nồng độ
glucose máu sau bữa ăn giàu maltose Matsui et al., 2007).
- Nghiên cứu lâm sàng: Quả là nguồn giàu chất polyphenol đặc biệt là
anthocyanin, flavonol, proanthocyanidin và acid phenolic. Trong

người khỏe

mạnh, uống sucrose (35 g) với quả mọng (150 g purée làm từ quả việt quất, quả
cam đen nam việt quất và dâu tây cung cấp gần 800 mg polyphenol) tạo ra đáp ứng
đường huyết hàng ngày ổn định khác với nh m đối chứng không uống dịch quả
(Torronen et al., 2007). Hình dạng của đường cong glucose trong huyết tương cho
thấy nồng độ glucose giảm trong giai đoạn đầu và nồng độ hơi cao trong giai đoạn
sau cho thấy phản ứng tích cực do tiêu thụ quả mọng. Quả cũng làm giảm đáng kể
mức tăng glucose đỉnh, giảm tỷ lệ tiêu hoá và hấp thu sucrose từ đường tiêu hóa.
1.2.2. Ảnh hƣởng của polyphenol lên chức năng tế bào β tuyến tụy
Những nghiên cứu gần đây cho thấy nồng độ isoflavonoid đậu nành đã c ảnh
hưởng tích cực đến chức năng tế ào β Choi et al. (2008) sử dụng genistein và
daidzedin để nghiên cứu các yếu tố liên quan đến sự trao đổi chất glucose và insulin
sử dụng một mơ hình chuột bị tiểu đường khơng béo phì và kháng insulin. Cả hai
isoflavonoid (0,2g / kg genistein hoặc daidzein trong 9 tuần đều giữ được sự sản
xuất insulin của tế ào β trong khi chuột ăn chế độ ăn kiêng không c sản xuất
insulin.
Epigallocatechin gallate EG G và rutin đã được kiểm tra về khả năng làm
giảm sự ngộ độc glucose trong các tế ào β tuyến tụy Insuloma (RIN m5F) (Cai và
Lin, 2009). Việc điều trị làm tăng ài tiết insulin phụ thuộc vào glucose và có thể
thúc đẩy việc bài tiết insulin hiệu quả trong thời kỳ ủ bệnh cao khi tiết insulin tiết ra
do ngộ độc glucose (33 mM, 48 giờ), EGCG và rutin làm tăng

TP trong tế bào,

cho thấy sự gia tăng tiết insulin được làm trung hòa bằng cách tăng cường sự tiết
insulin thông thường và glucose, phụ thuộc vào nồng độ ATP.


8

Một nghiên cứu khác cho thấy tác dụng bảo vệ tế ào β của flavonoid được
thực hiện bằng hỗn hợp flavonoid quercetin, luteolin và apigenin trong tế bào RIN
m5F (Kim et al., 2007). Flavonoid có hoạt tính chống viêm trong điều trị
interleukin β IL- β và interferon γ I N-γ và hiệu quả đã được xác minh khi
phân tích di truyền các gen liên quan đến viêm, cho thấy vai trò của flavonoid trong
việc phục hồi khả năng tiết ra insulin bằng cách ngăn ngừa tổn thương tế ào β do
cytokin gây ra.
Việc sử dụng rutin qua đường uống (100 mg / kg, 45 ngày) cho thấy sự sống
sót của tế

ào β ở chuột nhắt do streptozocin (STZ) gây ra (Stanley et al.,

2006). Người ta cho rằng hiệu quả phục hồi tế ào β của rutin là do tăng khả năng
tìm ra các gốc tự do và làm trung gian gia tăng hoạt động của enzyme chống oxy
hoá trong tụy. Tương tự, quercetin, phân tử aglutin của rutin cho thấy có khả năng
phục hồi tế ào β khi sử dụng bổ sung trong chế độ ăn uống (0,5% chế độ ăn uống
trong 14 ngày) ở chuột bị tiểu đường do STZ gây ra (Kobori, 2009). Phân tích biểu
hiện gen cho thấy quercetin khôi phục khả năng tăng sinh tế bào bị ức chế bởi STZ,
và kết quả là nồng độ insulin trong huyết tương càng cao Ngoài ra các dấu hiệu
stress oxy h a cũng được giảm ở tụy, giúp cải thiện sự hủy hoại oxy hóa liên quan
đến bệnh tiểu đường.
1.2.3. Ảnh hƣởng của các polyphenol lên chức năng gan để duy trì cân bằng

glucose nội mơ
Gan đ ng một vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh nồng độ glucose máu
với mơ ngoại vi. Theo ước tính, gan chịu trách nhiệm chiếm một phần a lượng
glucose sau ăn

herrington et al

999 và lưu giữ glucose một cách hiệu quả

thông qua glycogen nhờ con đường chuyển hóa glycogenesis. Ở trường hợp nhịn
ăn gan đ ng vai trị chính duy trì mức độ đường huyết ổn định và sản xuất glucose
theo hai con đường khác nhau bằng cách thủy phân glycogen (glycogenolysis) hoặc
bằng cách tổng hợp glucose từ các chất chuyển h a khác như pyruvate lactate
glycerol và amino acid (gluconeogenesis). Các enzyme chủ yếu chịu trách nhiệm


9

cho việc điều hịa sự hình thành glycogenesis là glucokinase (GK) và synthase
glycogen

(GS), pyruvate

carboxylase,

phosphoenolpyruvate

carboxykinase

(PEPCK) và fructose-1,6-bisphosphatase.

Diosmin là một flavonoid glycoside tự nhiên có rất nhiều trong vỏ quả các loại
quả họ cam quýt. Trong các nghiên cứu trên chuột điều trị thông qua đường uống
của diosmin trong 45 ngày làm giảm đáng kể nồng độ glucose trong máu, giúp tăng
cường hoạt động của các enzyme gan như hexokinase và glucose-6 phosphate
dehydrogenase (G6PD) cùng với việc giảm glucose-6-phosphatase (G6Pase) và
fructose-1,6-bisphosphatase (FDPase) trong mơ hình chuột bị xử lý bởi
streptozotocin (STZ) -nicotinamide. (Ramachandran et al., 2015)
Fisetin là một flavonoid được tìm thấy trong dâu, táo, hồng, nho, hành tây,
dưa chuột. Kết quả của Constantin et al.(2010) cho thấy rằng sự ức chế fisetin vận
chuyển

pyruvate

vào

ty

thể

có

thể

là

nguyên

nhân

gây

ức

chế

gluconeogenesis. isetin cũng áo cáo rằng với liều 0 mg kg cơ thể đối với chuột
bệnh tiểu đường trong 30 ngày cho thấy giảm lượng đường trong máu, giảm nồng
độ HbA1c, tăng insulin huyết tương và giảm mRNA và mức biểu hiện protein của
gen gluconeogenic như phosphoenol pyruvate car oxykinase và G P

trong gan

(Ramachandran et al., 2015)
Collins et al. (2007) nghiên cứu vai trị của EGCG trong q trình tạo glucose
mới ở gan bằng cách cho tế bào gan bị cô lập xử lý với EGCG (< 1pM). EGCG
giảm sản xuất glucose bằng cách ức chế sự biểu hiện của các enzyme trong quá
trình tạo glucose mới (PEPCK và glucose-6-phosphatase) một cách tương tự như
insulin.
Các flavonoid họ cam quýt như hesperidin và naringin 0

g kg được chứng

minh làm giảm nồng độ đường huyết so với chế độ ăn kiêng cho chuột mang gen
db/db (chuột vừa bị béo phì vừa bị đái tháo đường) (Jung et al

00

Tương tự

trong trà xanh và đậu nành hesperidin và naringin cũng làm giảm đáng kể nồng độ

acid béo tự do trong huyết tương nồng độ triglyceride, cholesterol tổng giảm.