BAO CAO DE TAI ;PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÒNGNẤM MEN CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN CỒN VỚICƠ CHẤT BÃ MÍA Ở CẦN THƠ, HẬU GIANG,BẾN TRE

Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Trường TNCS2013-13

Trường Đại học Cần Thơ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG
(do Nghiên cứu sinh thực hiện)

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DỊNG
NẤM MEN CĨ KHẢ NĂNG LÊN MEN CỒN VỚI
CƠ CHẤT BÃ MÍA Ở CẦN THƠ, HẬU GIANG,
BẾN TRE
Mã số: TNCS2013-13

Chủ nhiệm đề tài: Ths. VÕ VĂN SONG TOÀN

Cần Thơ, 3/2014


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Trường TNCS2013-13

Trường Đại học Cần Thơ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

(do Nghiên cứu sinh thực hiện)

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DỊNG NẤM MEN
CĨ KHẢ NĂNG LÊN MEN CỒN VỚI CƠ CHẤT BÃ
MÍA Ở CẦN THƠ, HẬU GIANG, BẾN TRE
Mã số: TNCS2013-13

Xác nhận của trường Đại học Cần Thơ
(ký, họ tên, đóng dấu)

Cần Thơ, 3/2014

Chủ nhiệm đề tài
(ký, họ tên)


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Trường TNCS2013-13

Trường Đại học Cần Thơ

Danh sách những thành viên tham gia nghiên cứu đề tài và đơn vị phối hợp chính

stt
1

Họ tên thành viên
Ths. Võ Văn Song Toàn

2

Bùi Thị Ngọc Hân

3

PGs. TS. Trần Nhân Dũng

Thơng tin cá nhân
Mã số NCS: 62031004,
khóa: 2010 - 2014, chuyên ngành:
Vi Sinh Vật
MSSV: 3108489
Khóa 36, chuyên ngành Vi Sinh
Vật học
Viện Trưởng; Cán bộ hướng dẫn

Đơn vị
Viện NC & PT
CNSH


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Trường TNCS2013-13

Trường Đại học Cần Thơ

MỤC LỤC
Trang
DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU.......................................
MỤC LỤC..................................................................................................................... i
DANH SÁCH BẢNG..................................................................................................iv
DANH SÁCH HÌNH....................................................................................................v

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT......................................................................................vi
TĨM LƯỢC............................................................................................................... vii
THƠNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU...............................................................viii
INFORMATION ON RESEARCH RESULTS ........................................................ix
PHẦN 1. MỞ ĐẦU.......................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề...............................................................................................................1
1.2. Giới thiệu về bã mía, cellulose, cellulase ...............................................................3
1.2.1. Tổng quan bã mía ................................................................................................3
1.2.2. Tổng quan cellulose ............................................................................................3
1.2.3. Tổng quan cellulase .............................................................................................4
1.3. Sự sinh trưởng của vi khuẩn trong điều kiện nuôi cấy tĩnh ....................................6
1.4. Giới thiệu chung về men rượu.................................................................................8
1.4.1. Giới thiệu chung về nấm men..............................................................................9
1.4.2. Hình dạng và kích thước của nấm men................................................................9
1.4.3. Cấu tạo của nấm men.........................................................................................10
1.4.4. Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men.........................................................11
1.4.5. Vai trò và ứng dụng của nấm men......................................................................12
1.5. Sự lên men ethanlol...............................................................................................13
1.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ethanol của nấm men......................17
1.7 Ethanol sinh học.....................................................................................................19
1.7.1 Tình hình nghiên cứu ethanol sinh học trong nước.............................................19
1.7.2 Tình hình nghiên cứu ethanol sinh học ngoài nước.............................................20
i
Chủ nhiệm đề tài: Ths. Võ Văn Song Tồn

Viện NC&PT Cơng nghệ Sinh học


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Trường TNCS2013-13

Trường Đại học Cần Thơ

1.8. Phương tiện và phương pháp nghiên cứu..............................................................23
1.8.1. Địa điểm, thời gian, thiết bị, dụng cụ, hóa chất, nguyên vật liệu........................23
1.8.2. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật......................................................24
1.8.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................25
1.8.3.1. Thí nghiệm 1: Phân lập các dịng nâm men từ men rượu...............................25
1.8.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo hoạt tính exoglucanase của nấm men.............................26
1.8.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo hoạt tính endoglucanase của nấm men...........................26
1.8.3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng lên men một số loại đường .......................27
1.8.3.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng phối hợp lên men của các dòng nấm men đã
tuyển chọn với các dòng vi khuẩn................................................................................27
1.8.4. Phương pháp xử lý số liệu..................................................................................29
PHẦN 2: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU........................................................................30
CHƯƠNG 1. Kết quả phân lập dịng nấm men ...........................................................30
CHƯƠNG 2. Kết quả hoạt tính exoglucanase và endoglucanase của nấm men...........32
CHƯƠNG 3. Kết quả lên men ....................................................................................33
3.1. Kết quả lên men trong ống Durham......................................................................33
3.2. Kết quả phối hợp lên men có sự phối hợp giữa nấm men với vi khuẩn.................37
3.2.1. Thể tích cột khí..................................................................................................37
3.2.2. Đo pH trước và sau lên men...............................................................................38
3.2.3. Hàm lượng đường khử trong dịch lên men sau168 giờ .....................................39
3.2.4. Định tính độ cồn bằng cồn kế.............................................................................40
3.2.5. Chuẩn độ cồn dung dịch sau chưng cất..............................................................42
3.2.6. Kết quả phân tích DM........................................................................................43
3.2.7. Kết quả phân tích CF.........................................................................................44
PHẦN 3. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................46
3.1. Kết luận................................................................................................................. 46
3.2. Kiến nghị..............................................................................................................46
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................47

ii
Chủ nhiệm đề tài: Ths. Võ Văn Song Tồn

Viện NC&PT Cơng nghệ Sinh học


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Trường TNCS2013-13

Trường Đại học Cần Thơ

PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1: PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM
PHỤ LỤC 3: PHỤ LỤC THỐNG KÊ

iii
Chủ nhiệm đề tài: Ths. Võ Văn Song Toàn

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Trường TNCS2013-13

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1: Thành phần hóa học bã mía .............................................................................3
Bảng 2. Thành phần hóa học của nấm men..................................................................10
Bảng 3. Thành phần môi trường Potato Glucose Agar (PGA).....................................24

Bảng 4. Thành phần môi trường Potato Glucose (PG).................................................24
Bảng 5. Thành phần môi trường cải tiến nuôi vi khuẩn dạ cỏ bị.................................24
Bảng 6. Thành phần mơi trường cải tiến ni sinh khối vi khuẩn dạ cỏ bò.................25
Bảng 7. Bảng phân bố NT ...........................................................................................28
Bảng 8. Đặc điểm của các dòng nấm men phân lập.....................................................31
Bảng 9. Chiều cao cột khí CO2 (mm) trong ống Durham.............................................34

iv
Chủ nhiệm đề tài: Ths. Võ Văn Song Toàn

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Trường TNCS2013-13

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1. Cấu trúc cellulose .............................................................................................4
Hình 2. Cơ chế tác động của enzyme cellulase .............................................................5
Hình 3. Đường tăng trưởng của tập đồn vi khuẩn .......................................................6
Hình 4. Tế bào nấm men ...............................................................................................9
Hình 5. Các dạng tế bào nấm men khác nhau quan sát dưới kính hiển vi điện tử........10
Hình 6. Cơ chế lên men glucose của nấm men tạo ethanol và CO2..............................16
Hình 7. Đường kính vịng halo trên cơ chất bã mía của các dịng nấm men................32
Hình 8. Thể tích khí trong bình lên men sau 168 giờ...................................................38
Hình 9. Hàm lượng đường khử trong dịch lên men sau 168 giờ .................................39
Hình 10. Độ cồn được tạo ra sau 168 giờ lên men ......................................................40
Hình 11. Hàm lượng ethanol được tạo ra sau 168 giờ lên men (g/l).............................42

Hình 12. Hàm lượng DM giảm sau 168 giờ lên men...................................................43
Hình 13. Hàm lượng CF giảm sau 168 giờ lên men.....................................................44

v
Chủ nhiệm đề tài: Ths. Võ Văn Song Tồn

Viện NC&PT Cơng nghệ Sinh học


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Trường TNCS2013-13

Trường Đại học Cần Thơ

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
CF

Crude fibre, xơ thô

CMC

Carboxymethyl cellulose

DM

Dry matter, khối lượng vật chất khô

DC

Đối chứng

g

Gram

ml

Mililiter

mm

Milimeter

NM

Nấm men

nm

Nanometer

NT

Nghiệm thức

OD

Optical density

TN

Thí nghiệm

µl

Microliter

vi
Chủ nhiệm đề tài: Ths. Võ Văn Song Tồn

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Trường TNCS2013-13

Trường Đại học Cần Thơ

TÓM LƯỢC
- Đề tài “Phân lập và tuyển chọn nấm men từ men rượu để lên men cồn trên cơ
chất bã mía” được thực hiện nhằm mục đích tuyển chọn các dịng nấm men có khả
năng lên men cồn trên cơ chất bã mía. Kết quả đã phân lập được 18 dòng nấm men từ
các viên men khác nhau ở 3 tỷnh (thành phố) Bến Tre, Cần Thơ, Hậu Giang. Các dịng
nấm men được khảo sát hoạt tính exoglucanase và endoglucanase: có 10 dịng (H5,
H6, H7, H9, H10, H12, H13, H15, H16, H18) có hoạt tính exoglucanase, hoạt tính
endoglucanase chưa thể hiện ở 18 dịng nấm men được phân lập. Kết quả lên men
trong ống Durham của 18 dòng nấm men cho thấy bốn dòng nấm men H6, H9, H10,
H13 có khả năng lên men một số loại đường D-Glucose, D-Mannose và D-Galactose
lần lượt là 30 cm, 30 cm, 30 cm, 30 cm (D-Glucose), 30 cm, 25,67 cm, 17, 33 cm,
17,67 cm (D-Mannose) và 25 cm, 21,33 cm, 28,33 cm, 30 cm (D-Galactose). Bốn
dòng nấm men này được chọn để đánh giá khả năng sử dụng bã mía cho q trình lên
men cồn, thơng qua một số chỉ tiêu như thể tích khí, độ cồn, hàm lượng ethanol,

đường khử, hàm lượng DM và CF giảm đi. Kết quả cho thấy rằng dòng nấm men H13
phối hợp với tổ hợp vi khuẩn BM13, BM21 và BM49 (lần lượt tương đồng với
Achromobacter xylosoxidans BL6, Bacillus subtilis S20 và Bacillus subtilis FS32 ở
mức 91, 94 và 94%) có khả năng lên men trên cơ chất bã mía tốt nhất với lượng khí
CO, sinh ra, nồng độ cồn, hàm lượng ethanol, đường khử, lượng DM và CF giảm lần
lượt là 44 ml, 4,33, 2,23 g/ls, 0,483 g/l, 9,62% và 27,57%.
Từ khóa:, Achromobacter xylosoxidans, Bacillus subtilis, bã mía, ethanol, nấm
men H13

vii
Chủ nhiệm đề tài: Ths. Võ Văn Song Tồn

Viện NC&PT Cơng nghệ Sinh học


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Trường TNCS2013-13

Trường Đại học Cần Thơ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
Đơn vị: VIỆN NC & PT CNSH

THƠNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Thơng tin chung:
- Tên đề tài: Phân lập, tuyển chọn một số dịng nấm men có khả năng lên men
cồn với cơ chất bã mía ở Cần Thơ, Hậu Giang, Bến Tre
- Mã số: TNCS2013-13
- Chủ nhiệm: Ths. VÕ VĂN SONG TOÀN
- Cơ quan: Viện NC & PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ
- Thời gian thực hiện: 8/2013 - 3/2014

2. Mục tiêu: Tuyển chọn nấm men có khả năng lên men cồn với cơ chất bã mía
3. Tính mới và sáng tạo:
- Tuyển chọn được10 dòng nấm men có hoạt tính exoglucanase
- Tổ hợp nấm men H13 và 3 dòng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans BL6,
Bacillus subtilis S20 và Bacillus subtilis FS32 có thể phối hợp để lên men cồn.
4. Kết quả nghiên cứu:
- Phân lập được 18 dòng nấm men trong đó 10 dịng nấm men có hoạt tính
exoglucanase, nhưng chỉ có 4 dịng nấm men (H6, H9, H10, H13) có khả năng lên men
Durham mạnh với 3 loại đường D-Glucose, D-Mannose và D-Galactose.
- Dòng nấm men H13 có khả năng kết hợp tốt nhất với tổ hợp vi khuẩn
Achromobacter xylosoxidans BL6, Bacillus subtilis S20, Bacillus subtilis FS32 để lên
men cồn từ cơ chất bã mía.
5. Sản phẩm:
- Góp phần đào tạo một (01) cử nhân Vi Sinh Vật học khóa 36.
6. Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp
dụng:
- Tiếp tục hồn thiện qui trình lên men cồn từ ngun liệu bã mía đối với tổ hợp
nấm men H13, Achromobacter xylosoxidans BL6, Bacillus subtilis S20, Bacillus
subtilis FS32.
Ngày 31 tháng 3 năm 2014
Xác nhận của Trường Đại học Cần Thơ

Chủ nhiệm đề tài

(ký, họ và tên, đóng dấu)

(ký, họ và tên)

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS
viii

Chủ nhiệm đề tài: Ths. Võ Văn Song Toàn

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Trường TNCS2013-13

Trường Đại học Cần Thơ

1. General information:
Project title: Isolation and selection yeasts for alcohol fermentaion from
sugarcane baggase
Code number: TNCS2013-13
Coordinator: MSc. VÕ VĂN SONG TOÀN
Implementing institution: Biotechnology research and Development Institute,
Can Tho University
Duration: from 8/2013 to 3/2014
2. Objective(s): Selection of yeast for alcohol fermention from sugarcane
baggase
3. Creativeness and innovativeness:
- Ten strains of yeast showed exoglucanase activity.
- Strain of a yeast H13 and three strain of bacteria including of Achromobacter
xylosoxidans BL6, Bacillus subtilis S20 và Bacillus subtilis FS32 showed to be able
mix together for alcohol fermentation.
4. Research results:
- Ten of eighteen strains of yeasts showed exoglucanase activity; However, only four
strains including of H6, H9, H10, H13 were able to fermen alcohol with D-Glucose, DMannose và D-Galactose in Durham bottle.
- Strain of yeast H13 was able to mix with Achromobacter xylosoxidans BL6, Bacillus
subtilis S20 and Bacillus subtilis FS32 for alcohol fermentation.
5. Products:

- Supporting one bachelor in Microbiology of course 36th.
6. Effects, technology transfer means and applicability:
- Improving a process of alcohol fermentation by using sugarcane bagasse as a
substrate.

ix
Chủ nhiệm đề tài: Ths. Võ Văn Song Tồn

Viện NC&PT Cơng nghệ Sinh học


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Trường TNCS2013-13

Trường Đại học Cần Thơ

PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay sức ép từ khủng hoảng dầu mỏ và nhu cầu năng lượng luôn là vấn đề
nan giải của bất cứ quốc gia nào trên thế giới. Mỹ và Brazil đã thành công trong việc
sản xuất ethanol từ nguồn sinh học là bắp và mía. Điều này đã khích lệ các nước khác
đầu tư nghiên cứu vào lĩnh vực nhiên liệu sinh học.
Bên cạnh sản xuất ethanol từ nguồn tinh bột (bắp) và đường (mía), ethanol có thể
được sản xuất từ lignocellulose. Lignocellulose là loại biomass phổ biến nhất trên thế
giới. Vì vậy sản xuất ethanol từ biomass cụ thể là từ nguồn lignocellulose là một giải
pháp thích hợp đặc biệt là với các quốc gia nông nghiệp như Việt Nam.
Nền nông nghiệp Việt Nam hằng năm tạo ra một lượng lớn phế phẩm nơng
nghiệp. Trong đó, bã mía là loại phụ phẩm có chứa đáng kể hàm lượng cellulose và
các loại lignocellulose khác. Theo kết quả của Tổng cục thống kê, năm 2012 cả nước
có khoảng 297,9 nghìn ha trồng mía với sản lượng cả nước đạt khoảng 19040,8 nghìn
tấn. Vì thế lượng bã mía thải ra hàng năm rất lớn, gây nguy cơ ô nhiễm môi trường

cao. Để tận dụng nguồn bã mía thải ra hằng năm và góp phần giảm thiểu tác động đến
môi trường cũng như giải quyết vấn đề năng lượng, sử dụng bã mía như nguồn nguyên
liệu đầu vào để sản xuất ethanol là hướng đi mới đầy tiềm năng và triển vọng ở vùng
Đồng bằng sông Cửu Long hiện nay.
Việc nghiên cứu sử dụng phụ phẩm nông nghiệp giàu hợp chất carbonhydrat làm
nguyên liệu sản xuất ethanol nhiên liệu có sử dụng sự trợ giúp của các vi sinh vật đang
là một trong những giải pháp đầy hứa hẹn cho việc thay thế cho nguồn nguyên liệu
hóa thạch dần cạn kiệt, giảm thiểu sự tác động của môi trường là một trong những
hướng nghiên cứu đang dần thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trong và ngoài
nước.
Trong lên men ethanol sinh học, giai đoan lên men là một giai đoạn quan trọng.
Trong đó nấm men giữ vai trị quyết định trong quá trình lên men. Chúng phân bố rộng
rãi khắp nơi, đặc biệt hiện diện nhiều trong đất trồng hoa quả và các nhà máy chế biến
đường. Ngồi ra, chúng cịn xuất hiện trong trái cây chín, trong nhụy hoa, trong khơng
khí và cả nơi sản xuất rượu vang. Nấm men lên men ethanol thường được phân lập từ
quá trình lên men rượu, bã quả, mật rỉ của củ cải đường hay mía đường,... Trên bánh
1
Chủ nhiệm đề tài: Ths. Võ Văn Song Tồn

Viện NC&PT Cơng nghệ Sinh học


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Trường TNCS2013-13

Trường Đại học Cần Thơ

men là sản phẩm hỗn hợp phong phú của vi sinh vật, trong đó có nấm men. Các loài
nấm men thường gặp là Saccharomyces cerevisiae, Hyphopichia burtonii, Pichia
anomada,… và một số nấm men dại khác. Đây là nguồn phân lập nấm men cho quá
trình lên men ethanol. Do đó đề tài “Phân lập và tuyển chọn nấm men từ men rượu để

lên men cồn trên cơ chất bã mía” được tiến hành nhằm để tuyển chọn một số dịng
nấm men có khả năng sử dụng cơ chất bã mía để lên men cồn.

2
Chủ nhiệm đề tài: Ths. Võ Văn Song Tồn

Viện NC&PT Cơng nghệ Sinh học


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Trường TNCS2013-13

Trường Đại học Cần Thơ

1.2. Giới thiệu về bã mía, cellulose, cellulase
1.2.1. Tổng quan bã mía
Bã mía là một lại thức ăn khó tiêu do hàm lượng xơ rất cao trong đó hàm
lượng lignin (khoảng hơn 20%) rất lớn và rất nghèo protein là một trong những trở
ngại cho sự tiêu hóa của gia súc nhai lại (Lê Đức Ngoan, 2005). Theo Kamstra et al.
(1958) sự tăng lignin cùng với sự sinh trưởng của thực vật làm giảm tỷ lệ tiêu hóa
cellulose xuống 30 – 50% do lignin rất bền vững đối với acid mạnh và enzyme của vi
khuẩn. Lớp ngoài thành tế bào được tạo thành chủ yếu từ các phức chất lignohemicellulose mà các enzyme vi sinh vật dạ cỏ thủy phân vô cùng chậm (Lê Đức
Ngoan, 2005). Thực vật càng trưởng thành số lượng lignin càng tăng nên mức độ tiêu
hóa cellulose cũng giảm (Trần Cừ, 1979).
Bảng 1. Thành phần hóa học của bã mía

(*Nguồn : Lê Đức Ngoan, 2005)

1.2.2. Tổng quan về cellulose
Cellulose là một hợp chất bền vững. Đó là một loại polysaccharide cao phân tử,
chúng được cấu tạo bởi nhiều gốc β-glucose liên kết với nhau nhờ cầu nối β-1,4

glucosid. Mỗi phân tử cellulose thường có chứa từ 1400 – 10000 gốc glucose (Nguyễn
Lân Dũng, 2007).
Cellulose có cấu trúc và tính chất rất đặc biệt. Gốc glucose trong công thức cấu
tạo của cellulose thường tồn tại dưới dạng ghế bành, không phân bố theo mặt phẳng cố
định. Chính vì thế chúng tạo ra sự vững chắc cho cellulose. Cellulose chỉ bị phá hủy
bởi vi sinh vật trong những điều kiện thích hợp (Nguyễn Lân Dũng, 2007).
Cellulose là một trong những thành phần chủ yếu của tổ chức tế bào thực vật.
Trong xác bả thực vật thành phần hữu cơ chiếm tỉ lệ cao nhất bao giờ cũng là cellulose
(thay đổi trong khoảng 50-80% trọng lượng khô) (Nguyễn Lân Dũng, 2007).
3
Chủ nhiệm đề tài: Ths. Võ Văn Song Tồn

Viện NC&PT Cơng nghệ Sinh học


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Trường TNCS2013-13

Trường Đại học Cần Thơ

Hình 1: Cấu trúc cellulose
(*Nguồn : ngày 26/05/2008)
1.2.3. Tổng quan cellulase
- Enzyme tham gia phân hủy cellulose được phân làm 3 nhóm:
+ Exocellulase (1,4 β - D- glucan cellobiohydrolase) (EC.3.2.1.91) cắt đầu không
khử của chuỗi polyme để tạo thành cellobiose, khơng có khả năng phân hủy polyme
dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng, giúp cho enzyme
endocellulase phân hủy chúng tốt hơn. Enzyme này cịn có tên khác như:
cellobiohydrolase, exocellulase, cellobiosidase và avicecellase (Nguyễn Đức Lượng,
2004).
+ Endoglucanase (1,4 β-D-glucan 4 glucanohydrolase) (EC.3.2.1.4): thủy phân

liên kết β-1,4 glucosid trong vùng vô định hình của cellulose và β-D-glucan thành
cellodextrin, cellobiose và glucose và tác đơng yếu đến cellulose kết tinh. Enzyme này
cịn có tên khác như: endo 1,4- β-glucanase, C- cellulase. Một số nghiên cứu tìm thấy
enzyme này ở Clostridium thermocellum, cellulomonas fimi và các VSV khác (Nguyễn
Đức Lượng, 2004).
+ β-D glucoside glucohydrolase (EC.3.2.1.21) : phân hủy các gốc đường đôi
cellobiose thành glucose, khơng có khả năng phân hủy cellulose ngun thủy. Các tên
gọi khác như : β- glucosidase (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
- Cơ chế tác động của cellulase
Trong thiên nhiên, thủy phân cellulose có sự tham gia của tất cả 3 loại enzyme
cellulase như: endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase. Từ những nghiên cứu
của nhiều tác giả đều đưa ra kết luận chung là các enzyme cellulase sẽ thay phiên nhau
phân hủy cellulose để tạo sản phẩm cuối cùng là glucose. Có nhiều cách trình bày khác

4
Chủ nhiệm đề tài: Ths. Võ Văn Song Tồn

Viện NC&PT Cơng nghệ Sinh học


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Trường TNCS2013-13

Trường Đại học Cần Thơ

nhau, cách trình bày cơ chế tác động của cellulase do Erikson đưa ra được nhiều người
công nhận hơn cả.

Hình 2. Cơ chế tác động của enzyme cellulase
Các lồi vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên
thường bị ảnh hưởng bởi yếu tố ngoại cảnh nên có lồi phát triển rất mạnh, có lồi

phát triển yếu. Vì vậy, việc phân hủy cellulose trong tự nhiên tiến hành không đồng bộ,
xảy ra rất chậm.

1.3. Sự sinh trưởng của vi khuẩn trong điều kiện nuôi cấy tĩnh
5
Chủ nhiệm đề tài: Ths. Võ Văn Song Tồn

Viện NC&PT Cơng nghệ Sinh học


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Trường TNCS2013-13

Trường Đại học Cần Thơ

Sự phân cắt của vi khuẩn trải qua 4 giai đoạn, giai đoạn chậm, giai đoạn log, giai
đoạn quân bình và giai đoạn chết.
* Đường tăng trưởng của vi khuẩn
Đường tăng trưởng của vi khuẩn là đường biểu diễn sự gia tăng mật số của vi
khuẩn trong mẻ cấy theo thời gian.

Hình 3. Đường tăng trưởng của tập đoàn vi khuẩn
(a) Giai đoạn chậm, (b) giai đoạn log, (c) giai đoạn quân bình, (d) giai đoạn chết
(*Nguồn: Nguyễn Hữu Hiệp, 2007)



Giai đoạn chậm.

Giai đoạn chậm được giải thích là khi chuyển vi khuẩn sang môi trường nuôi cấy
mới vi khuẩn thiếu các enzyme cần thiết để có thể sử dụng các hợp chất mới trong môi

trường nên chúng cần có thời gian để tổng hợp các enzyme thích hợp để có thể sử
dụng các hợp chất mới. Độ dốc của đường biểu diễn sự tăng trưởng của vi khuẩn trong
giai đoạn chậm rất nhỏ. Giai đoạn chậm không xảy ra khi ta chuyển vi khuẩn sang môi
trường mới có thành phần thức ăn giống mơi trường cũ (Nguyễn Hữu Hiệp, 2007).


Giai đoạn log

Khi vi khuẩn đã thích nghi được với môi trường nuôi mới chúng sẽ tăng trưởng
và phân cắt nhanh chóng. Đường biểu diễn có độ dốc lớn. Đây là giai đoạn tăng trưởng
mạnh nhất của của tế bào trong mẻ cấy vi khuẩn. Cường độ tăng trưởng của giai đoạn

6
Chủ nhiệm đề tài: Ths. Võ Văn Song Tồn

Viện NC&PT Cơng nghệ Sinh học


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Trường TNCS2013-13

Trường Đại học Cần Thơ

này tùy thuộc vào điều kiện môi trường như nhiệt độ, thành phần cấu tạo môi trường
cũng như đặc tính di truyền của tế bào vi khuẩn (Nguyễn Hữu Hiệp, 2007).


Giai đoạn quân bình

Tế bào vi sinh vật không thể tiếp tục phát triển mãi do các chất dinh dưỡng chủ
yếu trong môi trường ngày càng cạn kiệt và lượng chất bài tiết do hoạt động sống của

tế bào tiết ra càng nhiều. Trong giai đoạn này số lượng tế bào không tăng cũng không
giảm (Nguyễn Hữu Hiệp, 2007).


Giai đoạn chết

Nếu tiếp tục nuôi cấy sau khi mẽ cấy đạt đến giai đoạn quân bình, tế bào vẫn có
thể tiếp tục sống sót và tiếp tục biến dưỡng nhưng đa số chúng sẽ chết đi. Vì vậy, mẽ
cấy sẽ dần dần đi vào giai đoạn chết. Giai đoạn này xảy ra do chất dinh dưỡng ngày
càng cạn kiệt và nồng độ chất bài tiết tích lũy trong mơi trường ngày càng cao trở nên
độc đã giết chết các tế bào tiết ra chúng (Nguyễn Hữu Hiệp, 2007).

7
Chủ nhiệm đề tài: Ths. Võ Văn Song Tồn

Viện NC&PT Cơng nghệ Sinh học


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Trường TNCS2013-13

Trường Đại học Cần Thơ

1.4. Giới thiệu chung về men rượu
Thực chất men rượu là môi trường không thuần khiết của hệ sinh vật có khả năng
sinh trưởng, tổng hợp hệ enzyme đường hóa và lên men rượu. Nói cách khác, hệ vi
sinh vật trong men rượu rất đa dạng. Trong đó, có ba lồi phổ biến nhất, có số lượng
đơng đảo nhất và có vai trị quan trọng nhất: nấm men, nấm mốc và vi khuẩn.
Các kết quả nghiên cứu khoa học cho thấy các giá trị pH bánh men rượu ở Việt
Nam trong khoảng 5,76, độ ẩm khoảng 13,6, hàm lượng vi sinh vật trong nấm men
tương ứng là vi khuẩn 2,6 × 106, nấm mốc 3,4 × 106, nấm men 5,8 × 107 CFU/gram

bánh men rượu. Trong tổng số 119 vi sinh vật phân lập được thì có 53 tế bào nấm mốc,
51 tế bào nấm men và 15 tế bào vi khuẩn.
Nấm mốc thường có mặt trong bánh men chủ yếu là các chủng Rhizopus, Mucor,
Aspergilluls, Amylomyces. Chúng giữ vai trị đường hóa( Trần Thị Thanh,2001). Lồi
Mucor, đặc biệt là Mucor rouxii có khả năng chịu nhiệt cao (32-35oC), chúng vừa có
khả năng đường hóa vừa có khả năng rượu hóa.
Nấm men gồm hai chi khác nhau là Endomycopsis fibuligenes là loài nấm men
rất giàu enzyme amylase, glucoamilase, do đó chúng vừa có khả năng đường hóa, vừa
có khả năng rượu hóa; và Saccharomyces cerevisiae có khả năng lên men rất nhiều
loại đường khác nhau như glucose, saccarose, maltose, fructose, raffinose, galactose.
Chúng có khả năng lên men ở nhiệt độ cao (khoảng 36-40 oC) và có khả năng chịu
được acid. Đặc biệt có khả năng chịu được thuốc sát trùng Na 2SiF6 với nồng độ 0,020,025% và có khả năng lên men các loại nguyên liệu khác nhau như gạo, ngô, khoai,
sắn với lượng đường trong dung dịch từ 12-14% có khi đến 16-18%. Nồng độ rượu
trong dịch lên men là 10-12%. Nhiệt độ lên men thích hợp là 28-32oC.
Ngoài hai chi nấm men kể trên, trong men thuốc bắc cịn thấy nhiều lồi nấm
men hoang dại khác nhau. Chúng vừa có khả năng thủy phân tinh bột, vừa có khả năng
chuyển hóa đường thành cồn, tuy rằng sự chuyển hóa này cịn rất thấp. Điều đặc biệt là
các loài nấm men dại này chịu nhiệt rất cao có khi tới 60-65 oC và chịu được chất sát
trùng ở nồng độ 0,05-1% (Nguyễn Đức Lượng, 1998).
Ngoài ra trong bánh men thuốc bắc cịn có sự hiện diện của một số lồi vi khuẩn
phát triển, trong đó chủ yếu là các loài vi khuẩn lactic và vi khuẩn acetic. Các lồi vi
khuẩn thường làm chua mơi trường. Thời gian đầu của quá trình lên men, quá trình
này xảy ra có lợi vì pH mơi trường do chúng tạo ra sẽ thích hợp cho nấm men và nấm
8
Chủ nhiệm đề tài: Ths. Võ Văn Song Tồn

Viện NC&PT Cơng nghệ Sinh học


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Trường TNCS2013-13

Trường Đại học Cần Thơ

mốc phát triển, tuy nhiên pH xuống quá thấp lại ảnh hưởng xấu cho quá trình lên men.
Mặt khác nếu trong dịch lên men có mặt oxy thì vi khuẩn acetic sẽ oxy hóa rượu thành
acid acetic. Quá trình này làm tổn hao lượng cồn tạo thành (Nguyễn Thị Hiền, 2004)
1.4.1. Giới thiệu chung về nấm men
Nấm men là tên gọi chung của nhóm nấm có những đặc điểm như cấu tạo đơn
bào, đa số sinh sôi nảy nở bằng cách nảy chồi hoặc phân cắt tế bào, nhiều loại có khả
năng lên men đường. Nấm men phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong các
mơi trường có chứa đường, có pH thấp, chẳng hạn như trong hoa quả, mật mía, rỉ
đường, mật ong, trong đất ruộng trồng mía, đất vườn cây ăn quả, trong các đất có
nhiễm dầu mỏ (Nguyễn Lân Dũng, 1999). Nấm men có nhiều ứng dụng rộng rãi trong
lĩnh vực thực phẩm, con người từ lâu đã biết ứng dụng nấm men vào sản xuất các loại
thực phẩm truyền thống như rượu, bia, bánh mì…

Hình 4. Tế bào nấm men
(* Nguồn: ngày 20.7.2013)

1.4.2. Hình dạng và kích thước của nấm men
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc: do cấu tạo đơn bào nên chúng tạo ra các khuẩn
lạc có những đặc trưng như: hình dạng khuẩn lạc thường trịn, khơng đều hoặc hình
thoi, bìa của khuẩn lạc thường là bìa nguyên, chia thùy, gợn sóng hoặc răng cưa
(Huỳnh Xn Phong, 2010).
Hình dạng tế bào: Nấm men thường có hình cầu, hình elip, hình ovan và có cả
dạng hình dài. Chúng hầu hết tồn tại dưới dạng đơn bào, một số loài như Candida
albicans không chỉ nảy chồi mà các tế bào nối lại với nhau tạo thành khuẩn ty giả và
Eremothecium gossypii hình thành khuẩn ty thật (Kurtzman và Piškur, 2006).
9
Chủ nhiệm đề tài: Ths. Võ Văn Song Tồn

Viện NC&PT Cơng nghệ Sinh học


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Trường TNCS2013-13

Trường Đại học Cần Thơ

Kích thước tế bào: Nấm men là lồi vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thực.
Tế bào nấm men thường lớn gấp 10 lần so với tế bào vi khuẩn. Kích thước của nấm
men khác nhau tùy theo loài và thời kỳ sinh trưởng của nấm men. Saccharomyces
cerevisiae là nấm men thường được sử dụng trong lên men rượu, bia có kích thước
chiều rộng khoảng 2,5 – 10µm và chiều dài 4,5 – 21µm, có thể thấy rõ dưới kính hiển
vi quang học (Nguyễn Lân Dũng, 1999).

Hình 5. Các dạng tế bào nấm men quan sát dưới kính hiển vi điện tử
(*Nguồn: ngày 20/07/2013)

1.4.3. Cấu tạo của nấm men
Theo Nguyễn Đức Lượng (2004) nấm men có thành phần hóa học như sau:
Bảng 2: Thành phần hóa học của nấm men
Các chất Thành phần (%) Các chất Thành phần
Carbon
49,8
Na2O
Nitơ
12,4
MgO
0,42
Hydro

6,7
CaO
0,38
P2O5
3,54
Fe2O3
0,035
K2 O
2,34
SiO2
0,09
SO3
0,04
(*Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Thành tế bào: Thành tế bào nấm men dày khoảng 25nm, chiếm 15 – 30%
trọng lượng khô của tế bào nấm men, được cấu tạo chủ yếu từ glucan (60% khối lượng
thành tế bào), mannoprotein, chitin và một lượng nhỏ lipid.
10
Chủ nhiệm đề tài: Ths. Võ Văn Song Tồn

Viện NC&PT Cơng nghệ Sinh học


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Trường TNCS2013-13

Trường Đại học Cần Thơ

Màng nguyên sinh chất: Màng nguyên sinh chất có 3 tầng kết cấu khác nhau,
được cấu tạo chủ yếu từ protein (50% khối lượng khơ), phần cịn lại là lipid và một ít

polysaccharide (Nguyễn Lân Dũng, 1999).
Chất nguyên sinh: Chất nguyên sinh của nấm men cũng tương tự như chất
nguyên sinh của vi khuẩn, thành phần chủ yếu là nước, protein, glucid, lipid, enzyme.
Nhân tế bào: Nhân tế bào nấm men là nhân điển hình, có màng nhân, bên
trong là chất dịch nhân có chứa hạch nhân. Nhân tế bào nấm men Saccharomyces
cerevisiae có chứa 17 đơi nhiễm sắc thể.
Các bào quan và thành phần khác: ty thể, không bào, ribosome,…
1.4.4. Sự sinh sản và phát triển của nấm men
Theo Nguyễn Lân Dũng (1999), nấm men có hai hình thức sinh sản là sinh sản
vơ tính và sinh sản hữu tính.
- Sinh sản vơ tính: chủ yếu bằng hình thức nảy chồi (diễn ra ở hầu hết các chi
nấm men), hình thức phân cắt (ở chi Schizosaccharomyces), bằng bào tử (ở chi
Geotrichum, Sporobolomyces, Candida albicans).
- Sinh sản hữu tính: nấm men hình thành bào tử túi ở các chi Saccharomyces,
Zygosaccharomyces và nhiều chi nấm men khác thuộc bộ Endomycetales.
Nấm men là các vi sinh vật hóa dị dưỡng vì chúng sử dụng các hợp chất hữu cơ
làm nguồn cung cấp năng lượng cho sự sinh trưởng và phát triển. Nguồn carbon được
nấm men sử dụng hầu hết là đường sáu carbon như glucose và fructose hoặc các
đường đôi như sucrose hoặc maltose. Một số lồi có thể sử dụng đường năm carbon
(đường ribose). Nguồn nitrogen cần thiết cho tổng hợp các cấu tử chứa nitrogen của tế
bào là các hợp chất hữu cơ hay vơ cơ có sẵn trong mơi trường. Nấm men có khả năng
tổng hợp tất cả acid amin. Đa số nấm men khơng đồng hóa được nitrat. Song, giống
Hansenula và giống Pichia lại đồng hóa được chất này. Một số loài thuộc giống
Brettanomyces cũng đồng hóa được nitrat. Về nhu cầu dinh dưỡng các nguyên tố vô
cơ, phospho là nguyên tố được quan tâm nhiều nhất, sau đó là kali, magie, lưu huỳnh,..
Nấm men có thể tồn tại được trong điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí với khoảng nhệt độ
tương đối rộng và pH acid thích hợp cho sự phát triển của nấm men.
1.4.5. Vai trò và ứng dụng của nấm men

11

Chủ nhiệm đề tài: Ths. Võ Văn Song Tồn

Viện NC&PT Cơng nghệ Sinh học


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Trường TNCS2013-13

Trường Đại học Cần Thơ

Nấm men có nhiều ứng dụng quan trọng trong công nghiệp thực phẩm như dùng
trong sản xuất ethanol, bánh mì, rượu vang, bia, tạo sinh khối protein và vitamin, sản
xuất enzyme, acid citrid… Trong đó việc ứng dụng nấm men vào việc lên men các sản
phẩm nông nghiệp để sản xuất ethanol rất đáng được quan tâm, nguồn ethanol giá
thành rẻ sẽ đóng góp đáng kể vào việc giải quyết vấn đề về nhiên liệu và ô nhiễm mơi
trường.

1.5. Sự lên men ethanol
Lên men ethanol là q trình chuyển hóa đường thành ethanol được thực hiện bởi
nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau nhưng chủ yếu là nấm men. Trong công nghiệp cồn,
12
Chủ nhiệm đề tài: Ths. Võ Văn Song Tồn

Viện NC&PT Cơng nghệ Sinh học


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Trường TNCS2013-13

Trường Đại học Cần Thơ

bia, rượu, các loại nước uống có cồn, người ta thường sử dụng nấm men

Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces trong quá
trình lên men tạo ethanol.
Ethanol được sản xuất chủ yếu từ các loại nguyên liệu từ thực vật có chứa đường,
hoặc tinh bột và cellulose thơng qua phản ứng trung gian thủy phân tạo đường.
- Các cơ chất có hàm lượng đường cao thường được dùng để lên men ethanol
thường là: rỉ đường, nước mía, củ cải đường, nước trái cây chín; sự lên men từ các
nguyên liệu này được thực hiện trực tiếp mà không thông qua quá trình thủy phân tạo
đường.
- Những cơ chất giàu tinh bột như: gạo, lúa mì, ngơ, khoai mì, khoai tây, khoai
lang…, đối với các loại nguyên liệu này cần phải có q trình thủy phân tinh bột tạo
đường cho nấm men sử dụng để lên men tạo ethanol.
(C6H10O5)n + nH2O → nC6H12O6
(tinh bột)
(glucose)
C6H12O6 → 2CH3CH2OH + 2CO2
(glucose)
(ethanol)
- Các nguồn nguyên liệu chứa cellulose như: gỗ, giấy, bã mía… cũng có thể sử
dụng để sản xuất ethanol nhưng việc xử lý để phân cắt cellulose tạo glucose khó khăn
và tốn kém. Các phương pháp xử lý được áp dụng gồm có xử lý cơ học, hóa học và
sinh học (dùng vi sinh vật).
Q trình chuyển hóa sinh khối cellulose thành ethanol yêu cầu việc xử lý
nguyên liệu thành đường đơn sẵn sàng cho quá trình lên men. Thủy phân hỗn hợp
cellulose khó hơn thủy phân tinh bột vì hỗn hợp cellulose là tập hợp các phân tử
đường liên kết với nhau thành mạch dài (polyme carbonhydrat) gồm khoảng 40 - 60%
cellulose và 20 - 40% hemicellulose, có cấu trúc tinh thể bền. Hemicellulose chứa hỗn
hợp các polyme có nguồn gốc từ xylose, mannose, galactose kém bền hơn cellulose.
Nói chung hỗn hợp cellulose khó hịa tan trong nước. Phức polyme thơm là lignin (10
- 25%) khơng thể lên men vì khó phân hủy sinh học.
Việc chuyển đổi cellulose thành nhiên liệu sinh học ethanol có ba bước cụ thể là

tiền xử lý, thủy phân và lên men. Các nguyên liệu trở nên dễ tiếp cận hơn với các
enzyme sau khi tiền xử lý. Cellulose phân cắt tạo thành đường khử mà đó là cơ chất
cho quá trình lên men. Cellulose là thành phần quan tâm chính và có thể xử lý bằng
13
Chủ nhiệm đề tài: Ths. Võ Văn Song Tồn

Viện NC&PT Cơng nghệ Sinh học