ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC (HOÀN CHỈNH) Nghiên cứu đặc tính của Chitinase tự nhiên và biểu hiện Chitinase tái tổ hợp từ chủng nấm Lecanicillium Lecanii

i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan bản luận án là cơng trình nghiên cứu của tơi dưới sự
hướng dẫn của PGS.TS. Quyền Đình Thi, PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, sự
giúp đỡ của các cán bộ Phịng Cơng nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ
Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các số liệu
luận án là trung thực, một phần kết quả đã được công bố trên
các tạp chí

chuyên ngành dưới sự cho phép của các đồng tác giả, phần

cịn lại chưa được ai cơng bố trong bất kỳ các cơng trình nào khác. M
.

Tác giả luận án


ii

LỜI CẢM ƠN
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới PGS.TS. Quyền Đình Thi đã định hướng
nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện hóa chất, thiết bị
kinh phí để tơi hồn thành luận án này.
Tơi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh
đã chỉ bảo, sửa luận án để tơi hồn thành luận án này.
Tơi xin chân thành cảm ơn

Phịng Cơng nghệ

sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ
nghiệm chun mơn cho tơi trong q trình

thực nghiệm

chia sẻ kinh
.

Nghiên cứu sản xuất và sử dụng chế
phẩm từ nấm Lecanicillium

thơn do PGS.TS. Quyền Đình Thi và TS. Vũ Văn Hạnh làm chủ nhiệm, 20102013. Tôi xin cảm ơn Khoa Khoa học Sự sống, Phòng Đào tạo Trường Đại
học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong q
trình
.
Tơi xin cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Giáo dục T
-K

, Khoa Sinh

, Phòng Khoa học Công nghệ và Hợp tác quốc tế, Ban

Giám hiệu Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và các bạn đồng
nghiệp đã ủng hộ, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành luận án.
Lời cảm ơn sau cùng tơi xin dành cho gia đình và những người thân, bạn bè
đã luôn động viên giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho tơi trong suốt q trình làm
nghiên cứu sinh.
Tác giả luận án


ii

3

MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN........................................................................................

i

LỜI CẢM ƠN..............................................................................................

ii

MỤC LỤC...................................................................................................

iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT..........................................................

vii

DANH MỤC HÌNH.....................................................................................

ix

DANH MỤC BẢNG....................................................................................

xii

MỞ ĐẦU....................................................................................... .............

1

1. Đặt vấn đề....................................................................................... ........

1

2. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................

2

3. Nội dung nghiên cứu................................................................................

2

4. Những đóng góp mới của luận án............................................................

3

....................................

3

.............................................. .........

5

1.1. Nấm Lecanicillium lecanii ..................................................................

5

1.2. Chitinase ..............................................................................................

5

1.2.1. Nguồn gốc của chitinase.....................................................................

6

1.2.2. Phân loại chitinase..............................................................................

7

1.2.3. Cấu trúc và trung tâm hoạt động của chitinase...................................

9

1.2.4. Cơ chế phản ứng của chitinase...........................................................

12

1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính của chitinase...............................

14

1.2.6. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp chitinase..............

16

1.3. Ứng dụng của nấm L. lecanii và chitinase.........................................

19

1.3.1. Trong lĩnh vực nông nghiệp và bảo vệ môi trường............................

19

1.3.2. Trong lĩnh vực y học..........................................................................

23

1.3.3. Trong lĩnh vực công nghệ sinh học....................................................

24

1.4. Một số nghiên cứu về gen và biểu hiện gen mã hóa chitinase.........

25

1.4.1. Trên thế giới.......................................................................................

25

1.4.2. Ở Việt Nam.........................................................................................

29

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP..........................................

33

2.1. Vật liệu và hóa chất.............................................................................

33

2.1.1. Chủng giống.......................................................................................

33

2.1.2. Thiết bị...............................................................................................

33

2.1.3. Hóa chất.............................................................................................

33

2.1.4. Dung dịch và đệm..............................................................................

34

2.1.5. Môi trường nuôi cấy...........................................................................

34

2.1.6. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận án .....................................

33

2.2. Phương pháp nghiên cứu....................................................................

33

2.2.1. Phương pháp nuôi cấy........................................................................

33

2.2.2. Phương pháp nghiên cứu trên enzyme/protein…...............................

35

2.2.3. Các phương pháp sinh học phân tử....................................................

42

2.2.4. Các phương pháp thử nghiệm.............................................................

47

2.2.7. Xử lý số liệu.......................................................................................

49

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.....................

50

3.1. Sàng lọc, kiểm tra và khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase

từ nấm L. lecanii.........................................................................................

50

3.1.1. Sàng lọc chủng nấm L. lecanii sinh tổng hợp chitinase cao...............

50

3.1.2. Kiểm tra chủng nấm L. lecanii 43H dựa vào đoạn gen 28S rRNA...

50

3.1.3. Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase........................................

53

3.2. Tinh sạch và đánh giá đặc tính lý hóa của chitinase từ chủng
nấm L. Lecanii 43H.....................................................................................

61

3.2.1. Tinh sạch chitinase.............................................................................

61

3.2.2. Đánh giá đặc tính lý hóa của chitinase từ chủng nấm L. lecanii
43H...............................................................................................................

64

3.3. Nhân dịng gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H......

67

3.4. Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của rChit trong
nấm men P. pastoris X33............................................................................

71

3.4.1. Thiết kế plasmid pPChit biểu hiện gen Chit trong nấm men.............

71

3.4.2. Biểu hiện chitinase tái tổ hợp trong nấm men P. pastoris.................

72

3.4.3. Tinh sạch rChit...................................................................................

77

3.4.4. Đánh giá đặc tính lý hóa của rChit từ nấm men P. pastoris X33.......

79

3.5. Thử nghiệm khả năng ức chế rệp và nấm bệnh của chitinase và
bào tử từ nấm L. lecanii.............................................................................

85

3.5.1. Ảnh hưởng của chitinase tới sự phát triển của nấm bệnh hại cây
trồng.............................................................................................................

85

3.5.2. Ảnh hưởng của rChit tới khả năng phát triển của rệp........................

87

3.5.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của sợi nấm...........

88

3.5.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng nẩy mầm của bào tử nấm...... 89
3.5.5. Khả năng diệt rệp của chủng nấm L. lecanii 43H..............................

90


KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................

93

1. KẾT LUẬN..............................................................................................

93

2. KIẾN NGHỊ.............................................................................................

93

... 94
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................

95

DANH MỤC PHỤ LỤC.............................................................................

114


vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tiếng Anh

Tiếng Việt

BLAST

Basic local alignment search tool Phần mềm so sánh trình tự

bp

Base pair

Cặp bazơ

cDNA

Complement DNA

DNA bổ sung

Chit

Gene encoding chitinase

Gen mã hóa chitinase

CMC

Cacboxyl methyl cellulose

Cacboxyl methyl cellulose

DEPC

Diethylpyrocarbonate

Diethylpyrocarbonate

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axit deoxyribonucleic

DNase

Deoxyribonuclease

Enzyme thủy phân DNA

dNTPs

2 -Deoxynucleoside 5 -

Các nucleotide

triphosphate
ĐC

Control

Đối chứng

IPTG

Isopropyl-beta-D-

Isopropyl-beta-D-

thiogalactopyranoside

thiogalactopyranoside

EDTA

Ethylenediamine tetraacetic acid

Axit ethylenediamine tetraacetic

EtBr

Ethidium bromide

Ethidium bromide

kb

Kilo base

Kilo base

kDa

Kilo Dalton

Kilo Dalton

M

Marker

Thang chuẩn

OD

Optical density

Mật độ quang

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng khuếch đại gen

RNA

Ribonucleic acid

Axit ribonucleic


8

RNase

Ribonuclease

Enzyme thủy phân RNA

RT-PCR

Reverse transcription polymerase

Phản ứng khuếch đại gen

chain reaction
rChit

Recombinante chitinase

Chitinase tái tổ hợp

SDS-

Sodium dodecyl sulfate

Điện di biến tính protein trên gel

PAGE

Polyacrylamide gel

polyacrylamide

electrophoresis
Taq

Thermus aquaticus

Thermus aquaticus

TBE

Tris boric acid EDTA

Tris boric acid EDTA

TE

Tris EDTA

Tris EDTA

TEMED

N,N,N ,N -

N,N,N ,N -

Tetramethylethylenediamine

Tetramethylethylenediamine

v/v

Volume/volume

Thể tích/thể tích

w/v

Weight/volume

Khối lượng/thể tích

9

DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Cấu trúc bậc 2 của chitinase từ nấm C. immitis...........................

10

Hình 1.2. Cấu trúc của chitinase từ vi khuẩn Ralstonia sp. A-471 .............

11

Hình 1.3. Cơ chế xúc tác của chitinase B từ vi khuẩn S. mecescens...........

12

Hình 1.4. Cơ chế thủy phân β-chitin bởi chitinase A từ vi khuẩn
B. circulans...................................................................................................

13

Hình 2.1. Đường chuẩn nồng độ N-acetyl glucosamine theo phương pháp
Miller............................................................................................................

37

Hình 2.2. Các bước tinh sạch chitinase........................................................

38

Hình 2.3. Đường chuẩn hàm lượng albumin huyết thanh bị theo
Bradford........................................................................................................

39

Hình 2.4. Đồ thị Lineawever-Burk..............................................................

40

Hình 2.5. Sơ đồ mơ tả vị trí gắn của gen Chit vào genome của nấm men
P. pastoris X33.............................................................................................

47

Hình 3.1. Hoạt tính chitinase của 8 chủng nấm L. lecanii...........................

50

Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ khn DNA của chủng nấm
L. lecanii 43H; Sản phẩm Plasmid và Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng
XhoI và XbaI...................... ..........................................................................

51

Hình 3.3. Trình tự đoạn gen 28S rRNA và cây phân loại trình tự gen 28S
rRNA từ chủng nấm L. lecanii 43H với các lồi khác…………………….

52

Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng
sinh tổng hợp chitinase ................................................................................

53

Hình 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ chitin huyền phù và nguồn nitơ đến
khả năng sinh tổng hợp chitinase ................................................................

55


Hình 3.6. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và pH ni cấy lên khả năng
sinh tổng hợp chitinase ................................................................................

56

Hình 3.7. Hình ảnh điện di SDS-PAGE của chitinase tinh sạch từ chủng
nấm L. lecanii 43H và hoạt tính chitinase của các phân đoạn qua cột
DEAE-Sephadex A-50 trên đĩa thạch có bổ sung cơ chất chitin huyền phù
0,5%..............................................................................................................

59

Hình 3.8. Nhiệt độ và pH thích hợp của chitinase ......................................

61

Hình 3.9. Độ bền nhiệt và độ bền pH của chitinase ....................................

62

Hình 3.10. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa lên hoạt tính
chitinase .......................................................................................................

65

Hình 3.11. Phân tích TLC các sản phẩm thủy phân chitin bởi chitinase....... 67
Hình 3.12. Kết quả nhân dịng gen Chit từ DNA hệ gen.............................

67

Hình 3.13. Trình tự gen Chit và amino acid suy diễn từ L. lecanii 43H.....

68

Hình 3.14. Cây phân loại dựa vào so sánh trình tự gen Chit của chủng
L. Lecanii 43H và các chủng khác trong GenBank......................................

69

Hình 3.15. Kết quả nhân dịng gen Chit từ mRNA......................................

70

Hình 3.16. Cây phân loại dựa vào so sánh trình tự amino acid của rChit
từ L. Lecanii 43H và các chủng khác trong GenBank..................................

71

Hình 3.17. Kết quả thiết kế cấu trúc vector biểu hiện pPChit.....................

72

Hình 3.18. Điện di sản phẩm kiểm tra hệ biểu hiện rChit trong P. pastoris
X33...............................................................................................................

71

Hình 3.19. Khả năng sinh tổng hợp rChit của chủng tái tổ hợp khi được
cảm ứng ở các nồng độ methanol khác nhau................................................

74

Hình 3.20. Khả năng sinh tổng hợp rChit ở các khoảng thời gian khác
nhau..............................................................................................................

75


Hình 3.21. Điện di SDS-PAGE của rChit tinh sạch từ P. pastoris X33......

78

Hình 3.22. Nhiệt độ và pH thích hợp của rChit...........................................

80

Hình 3.23. Độ bền nhiệt và độ bền pH của rChit.........................................

81

Hình 3.24. Ảnh hưởng của dung mơi hữu cơ và chất tẩy rửa lên hoạt tính
rChit .............................................................................................................

84

Hình 3.25. Ức chế sự phát triển của nấm bệnh F. oxysporum và R. solani
bởi chitinase .................................................................................................

87

Hình 3.26. Sợi nấm của R. solani và F. oxysporum được xử lý với nước
và với chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H..............................................

87

Hình 3.27. Hỗn hợp chitin của rệp được xử lý với nước và rChit từ nấm
men P. pastoris X33 ...................................................................................

88

Hình 3.28. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỉ lệ nẩy mầm của
bào tử nấm L. lecanii 43H ...........................................................................

90

Hình 3.29. Mơ hình lá cải có rệp sau khi được phun dịch bào tử nấm và
biểu đồ thể hiện khả năng diệt rệp bằng bào tử của chủng nấm L. lecanii
43H ..............................................................................................................

92


xii

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Các mơi trường thí nghiệm..........................................................

32

Bảng 2.2. Các điều kiện nuôi cấy chủng nấm L. lecanii 43H sinh tổng
hợp chitinase.................................................................................................

34

Bảng 2.3. Thành phần gel cô và gel tách....................................................

39

Bảng 2.4. Quan hệ giữa 1/[S] và 1/V...........................................................

40

Bảng 2.5. Các cặp mồi sử dụng...................................................................

44

Bảng 2.6. Thành phần PCR..........................................................................

45

Bảng 3.1. Kết quả tinh sạch chitinase từ chủng nấm L .lecanii 43H...........

59

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của ion kim loại và EDTA đến hoạt tính chitinase...

63

Bảng

3.3.

Hoạt

tính

chitinase

của

các

dịng

nấm

men

P. pastoris X33/pPChit tái tổ hợp...............................................................

73

Bảng 3.4. Hoạt tính rChit ở các mơi trường biểu hiện khác nhau................

74

Bảng 3.5. Kết quả tinh sạch rChit từ nấm men P. pastoris X33..................

77

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của các ion kim loại và EDTA lên hoạt tính rChit...

82

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề

tâm nghiên cứu. Các chế phẩm sinh học từ nấm ra đời đã được sử dụng để diệt
trừ các loại sâu
. Cùng
với sự phát triển kinh tế -

nhanh và chỉ diệt các lồi cơn trùng có hại mà không ảnh hưởng tới nguồn nước,
môi trường sinh thái và sức khỏe con người, vật ni.
Nấm kí sinh côn trùng thường tác động đến những loại mô nhất định như
tuyến mỡ và các mơ khác bị hịa tan là do các enzyme (chitinase, protease) của
nấm. Trong quá trình tác động lên côn trùng, nấm tiết ra các enzyme càng mạnh
thì tốc độ hủy hoại và tiêu diệt cơn trùng gây bệnh càng nhanh, tiết kiệm được
thời gian. Dựa vào đặc tính này của nấm, việc tạo ra một lượng lớn enzyme đặc
biệt là chitinase bổ sung vào chế phẩm sinh học là rất cần thiết.
Chitinase là enzyme thuỷ phân chitin thành các đơn phân N-acetyl
glucosamine, chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết
β-1,4-glucoside giữa C1 và C4 của 2 phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp nhau
trong chitin. Chitinase có ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực nông nghiệp, y học.
Từ thực tế trên, việc nghiên cứu đặc tính chitinase và qui trình tạo ra chitinase
cao góp phần làm tăng hiệu quả của chế phẩm bào tử nấm là rất cần thiết.


Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành lựa chọn đề tài luận án:
“Nghiên cứu đặc tính của chitinase tự nhiên và biểu hiện chitinase tái tổ hợp
từ chủng nấm Lecanicillium lecanii”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Mục tiêu chung
nấm
L. lecanii

biểu hiện

chitinase

trong nấm men Pichia pastoris

X33

.

2.2. Mục tiêu cụ thể
chủng nấm L. lecanii có khả năng sinh tổng hợp chitinase
cao.
;

L. lecanii

;

nấm L. lecanii

Pichia pastoris X33;

trò diệt rệp, nấm bệnh hại cây trồng của chitinase.
3. Nội dung nghiên cứu
(1)

uyển chọn chủng nấm L. lecanii sinh chitinase cao và khảo sát

điều kiện sinh tổng hợp chitinase.
(2)

tinh sạch

chủng nấm đã tuyển chọn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

.

tính chất lí hóa của chitinase
tái tổ hợp.
/>

, tinh sạch và nghiên cứu một số

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

nấm bệnh và rệp hại cây trồng.
4. Những đóng góp mới của luận án
4.1. Luận án đã

, đánh giá một số tính chất lý hóa

khả năng ức chế sự phát triển sợi nấm Fusarium oxysporum và Rhizoctonia
solani của exochitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H
khả năng diệt được rệp

bào tử nấm L. lecanii.

: (i) Gen
Chit từ chủng nấm L. lecanii 43H
định đư

; đoạn gen Chit được đăng kí trong GenBank với mã số

JX665045. (ii) Biểu hiện thành công gen Chit mã hóa endochitinase thuộc họ
18 glycosyl hydrolase trong nấm men P. pastoris X33 cho hoạt tính cao. Tinh
sạch được chitinase tái tổ hợp và đánh giá được một số tính chất lý hóa cơ bản.
(iii) Chứng minh được rChit

làm suy giảm lớp vỏ chitin của rệp.

i) Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp dẫn liệu khoa học về phương pháp
tinh sạch chitinase, các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính của chitinase và khả năng
diệt nấm bệnh của chitinase từ chủng nấm L. lecanii.
ii) Cung cấp những thông tin về gen mã hóa chitinase ở chủng nấm L. lecanii
43H, chitinase tái tổ hợp và các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính rChit và khả năng
thủy phân lớp vỏ rệp của rChit.
iii) Cung cấp thông tin về khả năng diệt rệp của bào tử và đặc điểm sinh học của
nấm L. lecanii.


Những kết quả đánh giá toàn diện từ khâu lựa chọn điều kiện sinh tổng hợp
chitinase, tinh sạch và xác định tính chất lý hóa, khả năng diệt nấm bệnh và rệp
của chitinase, cũng như q trình nhân dịng và biểu hiện gen mã hóa chitinase


làm căn cứ để đánh giá và ứng dụng của chitinase với bào tử nấm trong quá trình
tạo chế phẩm sinh học diệt rệp của chủng nấm L. lecanii.


Chương 1
1.1. Nấm Lecanicillium lecanii

Lecanicillium là chi nấm kí sinh côn trùng thuộc ngành nấm túi
Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Clavicipitaceae. Chi nấm
Lecanicillium gồm nhiều loài như: Lecanicillium lecanii, L. attenuatum,
L. longisporum, L. muscarium hoặc L. nodulosum. Nấm L. lecanii trước đây
được gọi là Verticillium lecanii. Ngày nay, L. lecanii được biết là một hình thức
sinh sản vơ tính trong nhóm trùng thảo Cordyceps confragosa [124].
Nấm Lecanicillium có khả năng kí sinh tự nhiên và giết chết nhiều loại côn
trùng như rệp, ruồi trắng, bộ cánh đều, bộ cánh cứng, bộ cánh thẳng, bướm [22],
[47], [49], [60], [93]. Cơ chế diệt côn trùng của Lecanicillium dựa trên sự tiếp
xúc trực tiếp của bào tử với côn trùng. Sau khi bám vào cơ thể côn trùng, các bào
tử nảy mầm và tạo thành sợi nấm đâm sâu vào các khoang trong cơ thể, tại đây
chúng sinh trưởng và phá hủy mơ. Sau đó, sợi nấm sẽ phát triển xun qua các
lớp biểu bì của cơn trùng. Trong điều kiện độ ẩm cao, bào tử được tạo thành bên
ngoài cơ thể cơn trùng và có thể lây truyền bệnh cho cơn trùng khác [95].
Dựa vào đặc tính diệt cơn trùng của nấm L. lecanii, các nghiên cứu hiện
nay đi theo hai hướng chính là: đi sâu khai thác đặc điểm sinh học của chế phẩm
bào tử nấm L. lecanii sử dụng trong kiểm sốt cơn trùng; và tìm hiểu vai trị của
hệ enzyme (chitinase, protease, lipase) hoặc độc tố do nấm L. lecanii sinh ra
trong q trình diệt cơn trùng.
Các nghiên cứu về chitinase từ nấm Lecanicillium đã được các tác giả
nghiên cứu theo các hướng chính là (i) tối ưu quá trình sinh tổng hợp chitinase;
(ii) tinh sạch và xác định khả năng thủy phân lớp vỏ trứng của côn trùng và (iii)
nhân dịng và biểu hiện gen mã hóa chitinase. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu
chỉ dừng lại ở từng khâu nghiên cứu riêng lẻ và hoạt tính chitinase sinh ra còn rất
thấp. Mặt khác, chủng nấm L. lecanii nói riêng và các vi sinh vật nói chung


thường hay xuất hiện các biến dị và quá trình sinh chitinase luôn thay đổi ở các
điều kiện môi trường, dẫn tới tính chất của chitinase sinh ra từ các chủng nấm là
khác nhau. Do vậy, quá trình nghiên cứu đầy đủ về chitinase từ bước lựa chọn

điều kiện môi trường thích hợp cho việc nâng cao khả năng tổng hợp chitinase
đến tinh sạch và xác định các điều kiện ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme; cũng
như việc nhân dịng và biểu hiện gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L. lecanii
trong nấm men để nâng cao khả năng biểu hiện, sau đó thử nghiệm hoạt tính của
chitinase và chế phẩm bào tử trong quá trình diệt rệp và nấm bệnh hại cây trồng
là hướng nghiên cứu cần thiết để nâng cao hiệu quả của chế phẩm sinh học.
1.2. Chitinase
Chitinase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng phân cắt liên kết β-1,4glycoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp nhau
trong phân tử chitin, chitobiose và chitotriose. Chitinase được chia thành 2 loại
chính là endochitinase (EC 3.2.1.14) và exochitinase. Exochitinase gồm
chitobiosidase (EC 3.2.1.29) và N-acetyl glucosaminidase (EC 3.2.1.30). Mỗi
loại enzyme tham gia vào thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờ sự
phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy phân hoàn
toàn tạo các đơn phân N-acetyl glucosamine.
Cơ chất thủy phân của chitinase thường là chitin. Chitin là một
polysacharide mạch thẳng khơng cuộn xoắn, có màu trắng, cứng và không đàn
hồi được tạo nên từ các đơn phân N-acetyl glucosamine thông qua liên kết
1,4-β glycoside. Chitin là chất hữu cơ đứng thứ 2 trong tự nhiên sau cellulose.
Trong tự nhiên, chitin gồm 3 dạng cấu trúc là α, β và γ-chitin. Trong đó,
dạng α-chitin có cấu trúc đối song song gồm các chuỗi polysaccharide xếp xen
kẽ nhau và là dạng phổ biến nhất trong tự nhiên. α-chitin là thành phần cấu tạo
nên bộ xương ngoài của côn trùng, giáp xác, nhuyễn thể và vách tế bào của nấm.
Dạng β-chitin thường hiếm hơn, có cấu trúc song song gồm các chuỗi
polysaccharide xếp xen kẽ nhau và tồn tại ở dạng liên kết với protein. Dạng


γ-chitin được tạo nên từ 2 chuỗi song song xen kẽ với 1 chuỗi đối song song.
Dạng γ-chitin thường tồn tại ở các lồi nấm [57].
Chitin ngun bản thường có màu trắng đục, mềm dẻo, đàn hồi và khá dai
nên khó bị thủy phân. Trong động vật chân đốt, chitin được sửa đổi và liên kết

với protein giống như một ma trận và tạo thành bộ xương ngoài. Ở dạng tinh
khiết chitin thường dai, nhưng khi tham gia vào thành phần cấu tạo ở hầu hết các
động vật không xương chitin lại là nguyên liệu tổng hợp. Trong vỏ giáp xác và
động vật thân mềm, chitin kết hợp với canxi cacbonat tạo thành hỗn hợp bền
vững hơn. Sự kết hợp này giúp cho chitin cứng và đặc hơn so với dạng tinh
khiết, đồng thời bền vững và ít giịn hơn so với canxi cacbonat [27].
1.2.1. Nguồn gốc của chitinase
Chitinase được tổng hợp từ rất nhiều nguồn sinh vật khác nhau trong tự
nhiên như thực vật, động vật và vi sinh vật. Trong đó, vi sinh vật được xem là
nguồn cung cấp chitinase nhiều hơn so với động vật và thực vật.
Chitinase được sinh ra từ vi sinh vật gồm 2 loại là endochitinase và
exochitinase. Nấm mốc là một trong những nhóm vi sinh vật có khả năng sinh
tổng hợp chitinase mạnh nhất. Các loài nấm mốc thuộc các chi như Trichoderma
[32], [37]; Glicocladium; Metharhizium [61], [128]; Beauveria, Lecanicillium
[23], [42], [91]; Aspergillus [145]; Penicillium [80] đã được nghiên cứu là có
khả năng sinh tổng hợp chitinase mạnh. Bên cạnh đó, vi khuẩn cũng được xem là
đối tượng có khả năng sinh chitinase khá phong phú. Chitinase được sinh ra từ vi
khuẩn thuộc các chi như Serratia [148], Aeromonas [139], Arthrobacter [100],
Micrococcus [19], Clostridium, Bacillus [24], [137] và đặc biệt là nhóm
Streptomycetes [72], [144].
Chitinase được tạo ra từ vi sinh vật có vai trò phân giải chitin trong tự
nhiên. Thành tế bào của nấm sợi và nấm men được tạo nên từ các phân tử chitin
và các hợp chất khác (manan, glucan, cellulose). Tuy nhiên, cấu trúc chitin này
so với chitin trong tự nhiên có sự khác nhau về tính khơng tan, kích thước, độ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

nhớt, độ phức tạp phân tử và tính khơng đồng nhất nên không bị thủy phân bởi
chitinase của cơ thể.

Ở thực vật, chitinase có mặt chủ yếu trong thân, củ, hạt và hoa của các loài
như khoai tây, thuốc lá, đậu, cà chua, ngô, khoai lang và đậu Hà Lan. Chitinase
được sinh ra trong giai đoạn phát triển sớm của cơ thể có vai trị tham gia vào
q trình hình thành và phát triển phôi. Chitinase trong cây được sinh ra khi có
sự kích thích của mầm bệnh giúp cây chống lại sự tấn cơng của các nấm kí sinh
gây bệnh. Ở thực vật, chitinase chủ yếu thuộc loại endochitinase và có kích
thước nhỏ hơn so với các nhóm khác.
Bên cạnh đó, hệ chitinase có thể được thu nhận từ một số động vật nguyên
sinh và từ các mô, tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều lồi động vật
khơng xương như ruột khoang, giun trịn, chân đốt, thân mềm (ví dụ trong dịch
ruột của ốc sên Helix aspersa). Đối với động vật có xương sống, chitinase được
tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày của các loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ,
trong dịch dạ dày của các loài chim, thú ăn sâu bọ [89], [90].
Ngồi ra, hệ chitinase cịn được thu nhận từ dịch biểu bì của giun trịn trong
suốt q trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các lồi chân đốt vào thời điểm
thay vỏ, lột da. Chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng cuticun của chúng trong
q trình biến thái hay lột xác.
1.2.2. Phân loại chitinase
Theo danh pháp quốc tế, Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh
học phân tử quốc tế xếp chitinase vào phân lớp 3 (hydrolase, các enzyme xúc tác
phản ứng thủy phân), tổ 2 (glycosidase, thủy phân các liên kết glycoside), nhóm
1 (thủy phân liên kết O- và S-glycoside) (International Union of Biochemistry
and Molecular Biology, 1992; />Chitinase là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau. Tùy theo quan
điểm của từng tác giả mà các enzyme thuộc phức hệ chitinase được xếp thành
các nhóm khác nhau. Dựa vào phản ứng thủy phân cơ chất, chitinase được chia
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN
/>

thành 2 dạng: dạng 1 là endochitinase (EC.3.2.1.14), dạng 2 là exochitinase gồm
2 loại là chitobiosidase (EC.3.2.1.29) và N-acetyl glucosaminidase (EC.3.2.1.30).

Endochitinase thủy phân điểm cắt bên trong của phân tử chitin và chitodextrin
tạo ra các phân tử có khối lượng thấp như chitotriose, chitotetraose và diacetyl
chitobiose. Chitobiosidase xúc tác quá trình phân cắt các vi sợi chitin ở đầu
khơng khử giải phóng ra các diacetyl chitobiose. N-acetylglucosaminidase phân
cắt các oligomer (sản phẩm của sự thủy phân bởi endochitinase và
chitobiosidase) để tạo ra các đơn phân N-acetyl glucosamine [106].
Dựa vào cấu trúc phân tử, chitinase được sắp xếp vào 3 họ là glycosyl
hydrolase 18, 19 và 20 [52]. Họ glycosyl hydrolase 18 là họ chitinase lớn nhất
với khoảng 180 chi, có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, được tìm
thấy ở hầu hết các lồi thuộc Eukaryote, Prokaryote và virus. Họ này bao gồm
chủ yếu là chitinase, ngoài ra cịn có các enzyme khác như chitodextrinase,
chitobiase và N-acetyl glucosaminidase. Các chitinase này hoạt động thông qua
các cơ chế kiểm sốt mà trong đó các đoạn β-polymer bị phân cắt tạo ra sản
phẩm β-anomer. Các chitinase thuộc họ glycosyl hydrolase 18 rất nhạy cảm với
chất ức chế mạnh allosamidin [73]. Các chitinase thuộc họ glycosyl hydrolase 18
được tổng hợp từ Aeromonas hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma
harzianum, Aphanocladium album, Serratia marcescens. Họ glycosyl hydrolase
19 có hơn 130 chi, chủ yếu ở thực vật (như cà chua, cải, đậu Hà lan); xạ khuẩn
Streptomyces griceus và một số vi khuẩn (Haemophillus influenzae). Họ
glycosyl hydrolase 19 có cấu trúc giống với lysozyme và chitosanase, chúng có
cấu trúc hình cầu với một vịng xoắn và hoạt động thông qua cơ chế dịch chuyển.
Chitinase thuộc họ glycosyl hydrolase 19 từ vật bậc cao thì khơng bị ức chế bởi
allosamidin [73]. Họ glycosyl hydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-Glucosamine
acetyl hexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces và người.
Dựa vào trình tự amino acid đầu N, sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện,
peptide nhận biết và vùng cảm ứng, chitinase được phân chia thành 5 nhóm: là


nhóm I, II, III, IV và V. Nhóm I là những đồng phân enzyme trong phân tử có
đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc

prolin ở đầu cacboxyl (C) (peptide nhận biết). Vùng giàu cystein có vai trị quan
trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt
động xúc tác. Nhóm II là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc
tác, thiếu đoạn giàu cystein ở đầu N và peptide nhận biết ở đầu C, có trình tự
amino acid tương tự chitinase nhóm I. Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm, vi
khuẩn, chúng được cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài. Nhóm III là trình tự
amino acid hồn tồn khác với nhóm I và II. Nhóm IV là những đồng phân
enzyme chủ yếu có ở lá của cây 2 lá mầm, 41-47% trình tự amino acid ở tâm xúc
tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I, phân tử cũng có đoạn giàu cystein
nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I. Nhóm V
được nhận biết dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn
chitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong q trình tiến hóa ở
thực vật bậc cao [106].
1.2.3. Cấu trúc và trung tâm hoạt động của chitinase
1.2.3.1. Cấu trúc bậc một và bậc hai của chitinase
Các chitinase được sinh ra từ các cơ thể khác nhau có thành phần cấu tạo và
cấu trúc khác nhau. Sự khác nhau đó thể hiện trước hết ở sự đa dạng về khối
lượng phân tử, thành phần và trật tự sắp xếp của các amino acid trên chuỗi
polypeptide. Ở vi khuẩn, chitinase từ B. cereus có khối lượng 37 kDa được mã
hóa bởi 360 amino acid [53], từ Streptomyces sp. M-20 có khối lượng 20 kDa
[72], từ Streptomyces griserus HUT 6039 có khối lượng 49 kDa [132].
Ở nấm, chitinase từ Trichoderma atroviride có khối lượng phân tử 33 kDa
mã hóa bởi 321 amino acid [88]. Chitinase từ Coccidioides immitis gồm 427
amino acid [135]. Chitinase từ Clonostachys rosea (Crch1) có khối lượng
45 kDa được mã hóa bởi 426 amino acid, chứa 1 tín hiệu peptide với 22 amino
acid [43]. Chitinase từ L. psalliotae có khối lượng phân tử là 45 kDa, được mã