Sàng lọc và tuyển chọn thực khuẩn thể nhằm trị bệnh trên cá tra tại đồng bằng sông cửu long

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
-----o0o------

MAI HOÀNG YẾN

SÀNG LỌC VÀ TUYỂN CHỌN THỰC KHUẨN THỂ
NHẰM TRỊ BỆNH TRÊN CÁ TRA TẠI ĐỒNG BẰNG
SÔNG CỬU LONG
Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
Mã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, tháng 1 năm 2018


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS.HOÀNG ANH HOÀNG

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS.NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS.TRẦN TRUNG HIẾU

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp.
HCM ngày 12 tháng 01 năm 2018

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. Chủ tịch hội đồng: PGS.TS.NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

2. Phản biện 1: PGS.TS.NGUYỄN THÚY HƯƠNG
3. Phản biện 2: TS.TRẦN TRUNG HIẾU
4. Ủy viên: TS.PHAN THỊ HUYỀN
5. Ủy viên, thư ký: TS.HOÀNG MỸ DUNG

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý
chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: Mai Hoàng Yến

MSHV: 1570262

Ngày sinh: 28/10/1991

Nơi sinh: Tây Ninh

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Mã số: 60420201

I.Tên Đề Tài
Sàng lọc và tuyển chọn thực khuẩn thể nhằm trị bệnh trên cá tra tại Đồng
bằng Sông Cửu Long
II.Nhiệm vụ và nội dung
-

Phân lập thực khuẩn thể có khả năng xâm nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri từ
mẫu gan-thận cá tra ở Đồng bằng Sơng Cửu Long.

-

Xác định hoạt tính xâm nhiễm (chu kỳ xâm nhiễm và hệ số nhân lên) và xác định
phổ xâm nhiễm của các thực khuẩn thể phân lập được

-

Nghiên cứu khả năng ức của các thực khuẩn thể đối với vi khuẩn Edwardsiella
ictaluri trong môi trường dinh dưỡng chuẩn và trong môi trường nước ao nuôi cá
tra.
III.Ngày giao nhiệm vụ: 06/02/2017
IV.Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 05/01/2018
V.Cán bộ hướng dẫn: TS.Hoàng Anh Hoàng
TP.HCM, ngày 04 tháng 01 năm 2018
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MƠN

TS.Hồng Anh Hồng
TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC


Luận văn thạc sĩ

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập tại trường Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh,
em đã được học tập và nhận được sự chỉ dẫn tận tình của các thầy cơ, điều đó đã
giúp em trang bị được nhiều kiến thức để có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.
Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong trường Đại học Bách Khoa Tp
Hồ Chí Minh, các thầy cơ khoa Kỹ thuật Hóa học và đặc biệt là các thầy cơ Bộ môn
Công nghệ Sinh học đã cung cấp cho em những kiến thức cần thiết, đã nhiệt tình chỉ
dạy và tạo mọi điều kiện để em có thể tiến hành luận văn thuận lợi.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy hướng dẫn - TS. Hoàng Anh
Hoàng đã tận tình hướng dẫn, hỗ trợ và động viên em trong suốt quá trình thực hiện
luận văn.
Xin cảm ơn đến chị Nhung, bạn Xuân, Ngoan, Trâm và các thành viên phịng
107B2 đã cùng đồng hành và chia sẻ khó khăn, giúp đỡ tơi trong suốt q trình thực
hiện đề tài luận văn.
Xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc.
Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn!
Tp Hồ Chí Minh, ngày 02 tháng 01 năm 2018
Mai Hoàng Yến

HVTH: Mai Hoàng Yến

i

Luận văn thạc sĩ

TĨM TẮT
Tình hình dịch bệnh trên cá tra tại Đồng bằng sông Cửu Long đang ngày
càng gia tăng và gây ra nhiều thiệt hại nghiêm trọng cho người dân. Trong khi việc
sử dụng kháng sinh khơng cịn mang lại hiệu quả cao, bên cạnh đó cịn mang lại
nhiều tác hại nghiêm trọng. Lúc này, liệu pháp thực khuẩn thể xuất hiện như một
liệu pháp đầy tiềm năng và an toàn trong việc thay thế kháng sinh được sử dụng để
phòng và trị bệnh cho cá tra. Việc phân lập thực khuẩn thể xâm nhiễm chủng vi
khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra chính là bước đầu tiên trong việc
ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể trong thực tế.
Trong luận văn này, 29 mẫu gan-thận được thu nhận từ Đồng Bằng Sông
Cửu Long được sử dụng để phân lập thực khuẩn thể xâm nhiễm chủng vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra. Kết quả phân lập được 3 thực khuẩn thể
pGA1, pGA2 và pGA3. Các chủng thực khuẩn thể này được tiến hành khảo sát hoạt
tính. với hai thông số quan trọng trong đánh giá hoạt tính xâm nhiễm thực khuẩn thể
là chu kỳ xâm nhiễm (latent period) và hệ số nhân (burst size). Chu kỳ xâm nhiễm
thuộc khoảng 55 – 65 phút. Hệ số nhân thuộc khoảng từ 18-77. Tiếp theo, các phage
được khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn đích trong điều kiện môi trường dinh
dưỡng chuẩn. Khả năng ức chế được khảo sát riêng rẽ hoặc kết hợp các phage với
nhau. Bằng việc đo giá trị OD 600nm, khả năng ức chế được thể hiện trong khoảng
13-14 giờ. Ngoài ra khả năng ức chế của các thực khuẩn thể cũng được thử nghiệm
trong nước ao nuôi cá tra. Khả năng ức chế vi khuẩn của thực khuẩn thể được thể
hiện tốt trong 51 giờ khảo sát. Đây là những bước đầu tiên nhưng quan trọng trong
nghiên cứu ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể trong phòng và trị bệnh gan thận mủ
cho cá tra.

HVTH: Mai Hoàng Yến

ii


Luận văn thạc sĩ

ABSTRACT
Striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) farmed in the Mekong Delta
Vietnam (MKDVN) importantly contributes to national aqua export. Currently,
however, aqua diseases occur more frequently across the entire MKDVN region.
One of the most common types is the white spots in internal organs caused by
Edwardsiella ictaluri. In this study, phage therapy was investigated its possibility to
treat Edw. ictaluri in vitro. Firstly, isolation and characteristics of phages specific to
Edw. ictaluri from striped catfish farms in the MKDVN were conducted. Lytic
activity of three phages pGA1, pGA2 and pGA3 isolated from 29 samples was
clarified. Latent period of three phages were about 55 to 65 minutes. Burst size of
these phages were about 18-77. Secondly, inactivation of host bacteria by single
phage or cocktail of phages were evaluated. By measuring OD600nm, inactivation
was shown for 13-14 hours. In addition, the challenge was conduted in sterilize
pond water and inactivation was well shown for 51 hours. Some prelimilary and
important data was obtained to achieve strategies to control Edw. ictaluri in vivo in
prospective studies.

HVTH: Mai Hoàng Yến

iii


Luận văn thạc sĩ

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu do chính tơi thực hiện dưới sự
hướng dẫn khoa học, hướng dẫn thực nghiệm của TS.Hồng Anh Hồng.
Các số liệu, kết quả mà tơi đưa ra trong luận văn này là trung thực, chưa từng
được cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào trước đây.

Tác giả

Mai Hoàng Yến

HVTH: Mai Hoàng Yến

iv


Luận văn thạc sĩ

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i
TÓM TẮT .................................................................................................................. ii
ABSTRACT .............................................................................................................. iii
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... iv
MỤC LỤC ...................................................................................................................v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................ vii
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ viii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. ix
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
Chương 1 TỔNG QUAN ............................................................................................ 3
1.1 Tổng quan tình hình ni cá tra ở Việt Nam ........................................................3
1.2 Cá tra (Pangasianodon hypopthalmus) .................................................................4

1.3 Dịch bệnh trên cá tra .............................................................................................5
1.4 Bệnh gan thận mủ..................................................................................................6
1.5 Các phương pháp phòng và trị bệnh gan thận mủ trên cá tra ...............................9
1.5.1 Sử dụng thuốc kháng sinh ..................................................................................9
1.5.2 Sử dụng vaccine ...............................................................................................11
1.6 Thực khuẩn thể (bacteriophage) ..........................................................................12
1.6.1 Lịch sử phát hiện phát hiện thực khuẩn thể .....................................................12
1.6.2 Phân loại thực khuẩn thể ..................................................................................13
1.6.3 Cơ chế xâm nhiễm của thực khuẩn thể lên vi khuẩn: ......................................14
1.6.4 Liệu pháp thực khuẩn thể trong phòng và trị bệnh trên thủy sản.....................15
Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 20
2.1 Vật liệu ................................................................................................................20
2.1.1 Hóa chất và mơi trường ....................................................................................20

HVTH: Mai Hồng Yến

v


Luận văn thạc sĩ
2.1.2 Thiết bị và dụng cụ ...........................................................................................20
2.2 Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................21
2.2.1 Thu và xử lý mẫu .............................................................................................21
2.2.2 Tăng sinh và phân lập thực khuẩn thể ..............................................................22
2.2.3 Tạo stock ..........................................................................................................23
2.2.4 Khảo sát chu kỳ xâm nhiễm (latent period) và hệ số nhân (burst size) ...........23
2.2.5 Khảo sát thời gian ức chế vi khuẩn trong môi trường chuẩn ...........................25
2.2.6 Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Edw.ictaluri trong môi trường nước ao ..26
2.2.7 Khảo sát phổ xâm nhiễm của thực khuẩn thể ..................................................27
2.2.8 Xử lý số liệu .....................................................................................................27

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ................................................................... 28
3.1 Kết quả phân lập thực khuẩn thể .........................................................................28
3.2 Kết quả tạo stock thực khuẩn thể ........................................................................29
3.3 Chu kỳ xâm nhiễm (latent period) và hệ số nhân (burst size) ............................29
3.4 Thời gian duy trì ức chế vi khuẩn trong điều kiện mơi trường dinh dưỡng chuẩn
sử dụng thực khuẩn thể riêng lẻ ................................................................................32
3.5 Thời gian duy trì ức chế vi khuẩn trong điều kiện môi trường dinh dưỡng chuẩn
sử dụng hỗn hợp thực khuẩn thể ...............................................................................37
3.6 Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Edw.ictaluri trong môi trường nước ao .....38
3.7 Khảo sát phổ xâm nhiễm .....................................................................................42
Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................. 44
4.1 Kết luận ...............................................................................................................44
4.2 Kiến nghị .............................................................................................................44
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................45
PHỤ LỤC
LÝ LỊCH TRÍCH NGANG

HVTH: Mai Hồng Yến

vi


Luận văn thạc sĩ

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BHI:

Môi trường Brain Heart Infusion

CS:

Cộng sự

EMB:

Eosine Methylene Blue lactase Agar

ĐBSCL:

Đồng bằng Sông Cửu Long

ĐHCT:

Đại học Cần Thơ

LB:

Lysogeny Broth

MOI:

Multiplicity of infection - Tỷ lệ giữa số lượng
thực khuẩn thể và số lượng vi khuẩn

TSB:

Tryptone Soya Broth

SM:

Sterile Solution

VK:

Vi khuẩn

VTS:

Viện Thủy Sản

HVTH: Mai Hoàng Yến

vii


Luận văn thạc sĩ

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Diện tích – sản lượng cá tra qua các năm ....................................................3
Hình 1.2 Hình thái cá tra .............................................................................................4
Hình 1.3 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri .....................................................................7
Hình 1.4 Biểu hiện bệnh gan thận mủ trên cá tra ........................................................8
Hình 1.5 Thực khuẩn thể xâm nhiễm vi khuẩn .........................................................13
Hình 1.6 Cơ chế xâm nhiễm thực khuẩn thể lên vi khuẩn ........................................14
Hình 3.1 Hình thái vịng sinh tan của các phage pGA1, pGA2, pGA3 ....................28
Hình 3.2 Tỉ lệ thực khuẩn thể pGA1 tương đối theo thời gian .................................29
Hình 3.3 Tỉ lệ thực khuẩn thể pGA2 tương đối theo thời gian .................................30
Hình 3.4 Tỉ lệ thực khuẩn thể pAG3 tương đối theo thời gian .................................31
Hình 3.5 (A) Biến thiên OD600 và (B) Biến thiên nồng độ thực khuẩn thể pGA1 theo

thời gian khảo sát ......................................................................................................33
Hình 3.6 (A) Biến thiên OD600 và (B) Biến thiên nồng độ thực khuẩn thể pGA2 theo
thời gian khảo sát ......................................................................................................34
Hình 3.7 A) Biến thiên OD600 và (B) Biến thiên nồng độ thực khuẩn thể pGA3 theo
thời gian khảo sát ......................................................................................................35
Hình 3.8 (A) Biến thiên OD600 và (B) Biến thiên nồng độ hỗn hợp thực khuẩn thể
pGA1, pGA2, pGA3 theo thời gian khảo sát ............................................................37
Hình 3.9 A) Biến thiên OD600 của các nghiệm thức theo thời gian khảo sát ...........39
Hình 3.10 (A) Biến thiên nồng độ thực khuẩn thể pGA1, (B) Biến thiên nồng độ
thực khuẩn thể pGA2, (C) Biến thiên nồng độ thực khuẩn thể pGA3 theo thời gian
khảo sát ......................................................................................................................41

HVTH: Mai Hoàng Yến

viii


Luận văn thạc sĩ

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng một số loài cá .......................................................5
Bảng 1.2 Một số bệnh thường gặp ở cá tra .................................................................6
Bảng 1.3 Tình hình kháng kháng sinh của 30 chủng Edw.ictaluri ...........................10
Bảng 1.4 Bảng phân loại thực khuẩn thể ..................................................................13
Bảng 1.5 Các nghiên cứu ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể trên các bệnh thủy sản
...................................................................................................................................17
Bảng 2.1 Bảng tính số lượng thực khuẩn sinh ra theo thời gian ...............................24
Bảng 2.2 Các nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát thời gian ức chế khuẩn trong
môi trường chuẩn ......................................................................................................26
Bảng 2.3 Các nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát thời gian ức chế khuẩn trong

môi trường nước ao ...................................................................................................26
Bảng 2.4 Các chủng vi khuẩn được sử dụng trong thí nghiệm khảo sát phổ xâm
nhiễm .........................................................................................................................27
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát chu kì xâm nhiễm và hệ số nhân của 3 thực khuẩn thể .31
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát phổ xâm nhiễm của 3 phage pGA1, pGA2, pGA3 ........42

HVTH: Mai Hoàng Yến

ix


Luận văn thạc sĩ

MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, ngành nuôi trồng thủy sản ở Đồng bằng Sông
Cửu Long đang là ngành rất phát triển và có đóng góp đáng kể trong kim ngạch
xuất khẩu. Cá tra là một trong những đối tượng cá nuôi nước ngọt chủ lực của Đồng
bằng Sông Cửu Long. Theo thống kê của Hiệp hội chế biến và xuất khẩu thủy sản
Việt Nam (VASEP), kim ngạch xuất khẩu cá tra 10 tháng đầu năm 2013 chiếm 26%
tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản cả nước. Tuy nhiên, cùng với sự phát triển
ngành nuôi cá tra và xu hướng thâm canh thì dịch bệnh trên cá tra cũng tăng theo,
gây thiệt hại lớn về kinh tế cho người nuôi cá tra thâm canh. Nhiều bệnh xuất hiện ở
hầu hết các vùng ni và có xu hướng gia tăng trong những năm gần đây. Chính vì
thế việc nhận biết và kiểm sốt tốt dịch bệnh có ý nghĩa rất quan trọng trong việc
nâng cao chất lượng cá tra, mang lại hiệu quả kinh tế cho người nông dân.
Một trong những bệnh phổ biến và gây thiệt hại nghiêm trọng trong nghề
ni cá tra đó chính là bệnh gan thận mủ. Bệnh được phát hiện lần đầu tiên vào năm
1988. Bệnh có thể xảy ra ở tất cả các giai đoạn ni, lây lan nhanh và có thể gây
hao hụt từ 70-90% (Từ Thanh Dung, 2008). Bệnh được ghi nhận nguyên nhân do vi
khuẩn Edw.ictaluri gây ra. Hiện nay việc điều trị bệnh gan thận mủ trên cá tra ở

Đồng bằng Sông Cửu Long vẫn chủ yếu dựa vào kháng sinh. Tuy nhiên, việc sử
dụng kháng sinh vẫn còn thiếu những quy định chặt chẽ dẫn đến xuất hiện ngày
càng nhiều các vi khuẩn kháng một hoặc thậm chí nhiều loại kháng sinh, gây nhiều
khó khăn trong q trình điều trị. Vì vậy việc tìm một liệu pháp điều trị an toàn và
hiệu quả lâu dài thay thế kháng sinh đang ngày càng trở nên cấp bách hiện nay.
Với nhiều ưu điểm về độ đặc hiệu và an toàn. Liệu pháp thực khuẩn thể đã
và đang được nghiên cứu ứng dụng trong phòng và điều trị bệnh trên thủy sản do
nhiều loại vi khuẩn gây ra (Richards GP, 2014). Những năm gần đây, việc nghiên
cứu Edw.ictaluri và tìm kiếm các giải pháp trong phòng và trị bệnh gan thận mủ
trên cá tra ở ĐBSCL đã được thực hiện khá nhiều và đạt được nhiều kết quả đáng
ghi nhận. Tuy nhiên việc nghiên cứu ứng dụng thực khuẩn thể trong phòng và điều
trị bệnh này vẫn còn bỏ ngỏ và chưa có những kết quả cụ thể. Đây vừa là thách thức
và cũng chính là động lực để nhóm nghiên cứu thực hiện đề tài “Sàng lọc và tuyển

HVTH: Mai Hoàng Yến

1


Luận văn thạc sĩ
chọn thực khuẩn thể nhằm trị bệnh trên cá tra tại Đồng bằng Sông Cửu
Long”.
Mục tiêu của đề tài:
Sàng lọc và tuyển chọn thực khuẩn thể nhằm trị bệnh gan thận mủ trên cá tra
do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra tại Đồng bằng Sông Cửu Long.
Ý Nghĩa thực tiễn
-

Nghiên cứu và tìm ra phương pháp phịng và trị bệnh gan thận mủ trên cá
tra hiệu quả và đặc hiệu hơn.

-

Đề tài góp phần hạn chế tình trạng gia tăng vi khuẩn kháng kháng sinh
trong điều trị bệnh thủy sản.

Nội dung nghiên cứu
-

Phân lập thực khuẩn thể có khả năng xâm nhiễm vi khuẩn Edwardsiella
ictaluri từ mẫu gan-thận cá tra ở Đồng bằng Sông Cửu Long.

-

Xác định hoạt tính xâm nhiễm (chu kỳ xâm nhiễm và hệ số nhân lên) và
xác định phổ xâm nhiễm của các thực khuẩn thể phân lập được.

-

Nghiên cứu khả năng ức của các thực khuẩn thể đối với vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri trong mơi trường dinh dưỡng chuẩn và trong mơ
hình nước ao ni cá tra.

HVTH: Mai Hồng Yến

2


Luận văn thạc sĩ

Chương 1 TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan tình hình ni cá tra ở Việt Nam
Ngành ni trồng thủy sản đang ngày một phát triển và trở thành một ngành
có đóng góp đáng kể trong kim ngạch xuất khẩu. Cá tra là một trong những đối
tượng cá nuôi nước ngọt chủ lực của Đồng bằng Sông Cửu Long. Những năm gần
đây, việc nuôi cá tra phát triển mạnh nhằm phục vụ tiêu thụ nội địa và cung cấp
nguyên liệu cho chế biến xuất khẩu. Theo tổng cục Thủy Sản Việt Nam, diện tích
hiện ni cá tra trong 5 tháng đầu năm 2015 ước đa ̣t 2.999 ha (bằng 100,1% so với
cùng kỳ), sản lượng thu hoạch ước đa ̣t 346.636 tấ n (bằng 101,9% so với cùng kỳ).
Diê ̣n tić h cá tra gia tăng liên tiếp trong giai đoa ̣n 2012 đế n 2014 và có xu hướng ở n
đinh
̣ từ 2014 đến nay.

Hình 1.1 Diện tích – sản lượng cá tra qua các năm (tongcucthuysan.gov.vn)

Kim ngạch xuất khẩu cá tra năm 2015 đạt trên 1,5 tỉ USD. Trong đó, kim
ngạch thị trường Mỹ đạt 315 triệu USD, kim ngạch thị trường EU đạt 285 triệu
USD; kim ngạch thị trường Trung Quốc và Hồng Kông đạt 161 triệu USD.

HVTH: Mai Hoàng Yến

3


Luận văn thạc sĩ
1.2 Cá tra (Pangasianodon hypopthalmus)
Cá tra là loài cá kinh tế phổ biến nhất khu vực châu Á, là một trong 30 loài
cá thuộc họ Pangasiidae. Tên loài Pangasianodon hypopthalmus được Rainboth
W.J sử dụng lần đầu tiên vào năm 1996 để chỉ định cho loài cá Tra và sau đó được
nhiều tác giả sử dụng phổ biến đến nay (Nguyễn Văn Thường, 2008).

Đặc điểm hình thái:
-

Cơ thể dẹp theo chiều hông.

-

Vi lưng ngắn với 1-2 gai cứng.

-

Vi mỡ khá phát triển.

-

Vi hậu mơn dài.

-

Có hai đơi râu hàm.

-

Lược mang phát triển.

-

Có cấu tạo miệng trước.

-

Có bong bóng khí một thùy.

Hình 1.2 Hình thái cá tra (vi.wikipedia.org)

Đặc điểm sinh trưởng:
Cá Tra tăng trưởng tương đối nhanh, lúc nhỏ cá tăng nhanh về chiều dài;
ương trong ao sau 2 tháng đã đạt chiều dài 10 - 12 cm (14 - 15 g). Từ khoảng 2,5
kg trở đi, cá tăng trọng nhanh hơn tăng chiều dài cơ thể. Trong tự nhiên cá trên 10
tuổi tăng trọng rất ít và có thể số ng trên 20 năm, đã gặp cỡ cá 18 kg trong tự nhiên
hoặc có mẫu cá dài tới 1,8 m.
Trong ao ni vỗ, cá bớ mẹ có thể đạt tới 25 kg ở cá 10 năm tuổi. Nuôi trong
ao năm đầu cá đạt 1 - 1,5 kg/con, những năm về sau cá tăng trọng nhanh hơn, có khi
đạt tới 5 - 6 kg/năm tùy thuộc môi trường số ng, sự cung cấp thức ăn và hàm lượng
đạm (Nguyễn Tường Anh, 2004).

HVTH: Mai Hoàng Yến

4


Luận văn thạc sĩ
Giá trị dinh dưỡng cá tra:
Cá tra là lồi có giá trị dinh dưỡng cao vì thành phần dinh dưỡng chứa
nhiều chất đạm, ít béo, nhiều EPA và DHA, ít cholesterol.
Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng một số lồi cá (nutrineat.com)
Tên lồi
Cá Tra

Tên khoa học

Nước(%)

Protein(%)

Lipid(%)

Khống(%)

Pangasianodon

72,9

17,8

2,7

1,16

81,2

17,3

0,3

1,2

69

17,3

11,3

2,1

81,6

16

2,1

63,3

22,5

13,4

hypopthalmus
Cá Tuyết

Gadus morhua

Cá Trích

Clupea
harengus

Cá Chép

Cyprinus

carpio

Cá Hồi

Salmo trutta

1,4

Từ bảng trên cho thấy lượng protein trong cá tra vào khoảng 17,8% cao hơn
các loài cá khác như cá tuyết (17,3%), Cá trích (17,3%), Cá chép (16%) và chỉ thấp
hơn cá Hồi (22,5%), thành phần các protein trong cá tra dễ tiêu hóa và hấp thu hơn
thịt, vừa có chứa đầy đủ các acid amin cần thiết cho cơ thể lại vừa có tỷ lệ các acid
amin thiết yếu (EAA) rất cân bằng và phù hợp với nhu cầu EAA của con người. Cá
Tra có nhiều acid béo chưa no hoạt tính cao chiếm từ 50% đến 70% tổng hàm lượng
lipid, đây là các acid béo chúng ta không thể tự tổng hợp được mà phải được cung
cấp từ thức ăn.
1.3 Dịch bệnh trên cá tra
Với xu hướng thâm canh trong nghề ni cá tra thì bệnh cá xảy ra là điều
khó có thể tránh khỏi. Cá tra dễ bị nhiễm nhiều loại bệnh phổ biến, các tác nhân gây
bênh cho cá gồm 2 nhóm: Bệnh truyền nhiễm (do virus, vi khuẩn và ký sinh trùng)
và bệnh khơng truyền nhiễm do mơi trường.

HVTH: Mai Hồng Yến

5


Luận văn thạc sĩ
Một số bệnh thường gặp ở cá tra:
Bảng 1.2 Một số bệnh thường gặp ở cá tra (Từ Thanh Dung, 2008)

Tên bệnh
Gan

thận

mủ

Nguyên nhân

Dấu hiệu bệnh lý
Da bị mất màu, bụng căn to và mắt hơi lồi,

VK Edw.ictaluri

khi mổ ra thì gan, thận, tỳ tạng có nhiều
đốm trắng.

Xuất huyết

Tuột nhớt

Phù đầu

VK Aromonas sp.

VK Flexibacter
colummaris

Môi trường

Xuất huyết từng đốm nhỏ trên da, chung
quanh miệng và nắp mang, phía mặt bụng
Đầu tiên xuất hiện một đốm trắng ở đi,
sau đó lan về phía trước thân và cuối cùng
cả đoạn thân sau đều có màu trắng
Phần đầu bị phù, mắt thường lồi ra, da
nhợt nhạt

Trắng

Cá thường nổi đầu bơi lờ đờ trên mặt

mang, trắng Môi trường

nước, bỏ ăn, xuất huyết nhẹ ngồi da,

gan

mang nhợt nhạt

Vàng da

Mơi trường

Cá bỏ ăn, bơi lảo đảo, da cá có màu vàng
tái nhạt hoặc vàng nghệ

1.4 Bệnh gan thận mủ
Bệnh gan thận mủ xuất hiện lần đầu tiên vào cuối năm 1998 và có tên gọi là
bệnh do vi khuẩn hình que gây hoại tử trên cá tra. Bệnh có thể xảy ra ở tất cả các

giai đoạn ni, tỉ lệ hao hụt có thể lên đến 90%. Trong những năm gần đây đã trở
thành một bệnh phổ biến, gây thiệt hại lớn về kinh tế ở các vùng nuôi cá tra thâm
canh. (Từ Thanh Dung, 2008).
Cá Tra thường bị nhiễm bệnh vào các tháng cuố i năm khi nhiệt độ nước hạ
thấp dưới 280C (khoảng tháng 9 đến tháng 1 năm sau); đồng thời vào khoảng thời
gian này là mùa lũ do đó hàm lượng cao của phù sa trong nước, biến động tình
trạng nước, tác động mạnh của nước chảy làm cho cá dễ bị stress, sức đề kháng
HVTH: Mai Hoàng Yến

6


Luận văn thạc sĩ
kém dẫn đến dễ bị bệnh và sau đó bùng phát dịch. Tuy nhiên, ngày nay bệnh này
còn xảy ra ở những thời điểm khác trong năm do việc tăng diện tích và tăng mức độ
thâm canh, cũng như việc không sát trùng nguồn nước của những ao nuôi bị nhiễm
bệnh trước khi thải ra môi trường.
Nguyên nhân: do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra, đây là nhóm vi
khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae, vi khuẩn gram âm, hình que ngắn, kích thước
khoảng 0,75 x 1,5-2,5 m.

Phân loại vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (Abbott,2006)
-

Giới: Bacteria

-

Ngành: Proteobacteria

-

Lớp: Gamma Proteobacteria

-

Bộ: Enterobacteriales

-

Họ: Enterobacteriaceae

-

Chi: Edwardsiella

-

Lồi: Edwardsiella ictaluri
Hình 1.3 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (chungvisinh.com)

Vi khuẩn Edw.ictaluri khơng sinh bào tử, là vi khuẩn yếm khí tùy tiện, phản
ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, khơng oxy hố, lên men trong mơi
trường glucose. Có 1 - 3 plasmid liên kết với Edw.ictaluri những plasmid có thể
đóng vai trò quan trọng trong việc đề kháng với kháng sinh.
Edw.ictaluri là một trong những lồi khó tính nhất của chủng Edwarsiella.
Tăng trưởng chậm trên môi trường nuôi cấy, cần từ 36 - 48 giờ ở 28 – 300C để phát
triển mọc thành khuẩn lạc nhỏ trên môi trường Brain Heart Infusion Agar (BHIA)
và vi khuẩn tăng trưởng chậm hoặc khơng tăng trưởng khi ủ ở 370C. Vi khuẩn có
thể được phân lập từ mẫu cá bệnh (gan, thận, lách) trên môi trường Trytone Soya

Agar (TSA) hoặc Eosine Methylene Blue lactase Agar (EMB) sau 48 giờ ở 28oC tạo
thành khuẩn lạc màu trắng đục. Edw.ictaluri phát triển tốt trong môi trường có pH =
6 và giảm dần ở pH = 7 và 8 (Crumlish M, 2002).
HVTH: Mai Hoàng Yến

7


Luận văn thạc sĩ
Dấu hiệu bệnh lý bệnh gan thận mủ và các biến đổi mơ học:

Hình 1.4 Biểu hiện bệnh gan thận mủ trên cá tra (thuysanvietnam.com.vn)
Bệnh gan thận mủ thường khó được phát hiện sớm do cá bệnh ít có biểu hiện
bên ngồi. Cá bị nhiễm bệnh gan thận mủ thường ăn kém hoặc bỏ ăn tùy theo bệnh
nhẹ hay nặng. Ở giai đoạn chớm bệnh, cá vẫn bắt mồi nhưng ăn giảm, một số
trường hợp có biểu hiện gầy, bơi lờ đờ, da nhợt nhạt, có biểu hiện xuất huyết trên da
và hậu môn. Sự lây lan của bệnh rất nhanh, trong điều kiện thí nghiệm, chỉ khoảng
3 - 4 ngày là tồn bộ sớ cá ni trong bể đều nhiễm bệnh.
Nghiên cứu của Nguyễn Quốc Thịnh và cs (2004) cho thấy nhiều thay đổi về
cấu trúc, đặc biệt là gan, thận và tỳ tạng có hiện tượng sung huyết, xuất huyết và
hoại tử xuất hiện ở các vùng chức năng của các cơ quan kể trên. Ngồi ra, ở cá bệnh
có hiện tượng dính lại của các tia mang nhưng khơng tìm thấy các biến đổi ở cơ và
tim của cá bệnh. Tuy nhiên, trong nghiên cứu của Ferguson và cs (2001) cho thấy
ngoài hiện tượng hoại tử ở gan, thận và tỳ tạng thì vi khuẩn Edw. ictaluri còn gây
hoại tử trên cơ của cá. Các đặc điểm về mô học cá tra nhiễm vi khuẩn E. ictaluri
cũng được mô tả và báo cáo tương tự qua các nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng
Oanh và Nguyễn Thanh Phương (2009), Đặng Thụy Mai Thy và Đặng Thị Hồng
Oanh (2010). Nhìn chung, qua kết quả nghiên cứu của các tác giả này cho thấy khi
bị nhiễm vi khuẩn E. ictaluri thì các cơ quan như gan, thận và tỳ tạng thường dễ bị

HVTH: Mai Hoàng Yến

8


Luận văn thạc sĩ
thay đổi và các biểu hiện thường gặp là sung huyết, xuất và hoại tử. Trong khi đó,
các cơ quan như mang, da-cơ ít hay khơng bị biến đổi.
1.5 Các phương pháp phòng và trị bệnh gan thận mủ trên cá tra
1.5.1 Sử dụng thuốc kháng sinh
Kháng sinh (antibiotic) là 1 hợp chất được sản xuất bởi sinh vật mà ở nồng
độ thấp có thể ức chế hoặc giết chết sinh vật khác. Thuật ngữ kháng sinh đôi khi
được sử dụng với tên gọi khác là chất kháng khuẩn (antimicrobial agents). Kháng
sinh có thể là các chất tự nhiên, bán tổng hợp hoặc là các chất hoàn tồn tổng hợp
nhưng chúng gây ít hoặc khơng làm tổn thương tế bào chủ. Các kháng sinh có tác
dụng làm ngừng sự sinh trưởng của vi khuẩn hoặc nấm được gọi là chất kiềm khuẩn
(bacteriostatic agents) hoặc giết chết chúng, gọi là chất diệt khuẩn (bactericidal
agents) (Prescott và cs, 2000; Walsh, 2003).
Cơ chế tác động của kháng sinh
Theo Tenover (2006) và Levy, Marshall (2004) kháng sinh tác động lên tế
bào vi khuẩn theo 1 số cơ chế chủ yếu sau:
- Can thiệp vào quá trình tổng hợp vách tế bào (nhóm β-lactam: penicillin,
ampicillin, amoxicillin, cephalosporin, monobactams; nhóm glycopeptide:
vancomycin, teicoplanin)
- Ức chế sinh tổng hợp protein (nhóm macrolide, chloramphenicol, clindamycin,
quinupristin-dalfoppristin, linezolid)
- Can thiệp vào q trình tổng hợp acid nucleic (nhóm flouroquinolone và
rifampin)
- Ức chế quá trình biến dưỡng acid folic (nhóm sulfonamide, trimethoprim và
nhóm đồng phân của acid folic)

- Kháng sinh có thể phá hủy cấu trúc màng tế bào vi khuẩn Gram âm (các kháng
sinh polymyxin và daptomycin).
Một số nhóm kháng sinh được sử dụng phổ biến hiện nay: Amoxicillin,
Ampicillin, Cephalosporin, Tetracylin, Quinolon…(Vũ Tiến Dũng, 2013).
Cho đến nay, thuốc kháng sinh vẫn còn sử dụng một các phổ biến để phịng
trị bệnh vi khuẩn trong ni thủy sản ở Việt Nam và nhiều nước trên thế giới. Tuy
HVTH: Mai Hoàng Yến

9


Luận văn thạc sĩ
nhiên, vẫn còn thiếu những quy định chặt chẽ trong giấy phép sử dụng kháng sinh
và cần có sự thống nhất quốc tế của việc sử dụng kháng sinh trong ni trồng thủy
sản. Việc hóa trị khơng phải lúc nào cũng thành cơng vì đa số các thuốc kháng sinh
đều được kết hợp với thức ăn mà thủy sản mắc bệnh thì thường kém ăn. Hơn nữa,
các nghiên cứu cho thấy ngày càng có nhiều vi khuẩn kháng được một hay nhiều
loại kháng sinh gây khó khăn hơn trong q trình điều trị. Bên cạnh đó, vi khuẩn
cịn có khả năng truyền ngang các gen kháng thuốc giữa các dịng cùng lồi và khác
lồi với nhau thơng qua tiếp hợp, nguy cơ truyền gen kháng thuốc sang vi khuẩn
gây bệnh ở người rất cao, đây là mối đe dọa rất lớn đối với cộng đồng (Từ Thanh
Dung, 2010).
Tình trạng kháng kháng sinh của khuẩn Edw.ictaluri
Nghiên cứu gần đây của Quách văn Cao Thi và cs, (2014) về khả năng kháng
thuốc của 30 chủng vi khuẩn Edw.ictaluri phân lập từ các ao nuôi ở ĐBSCL được
thể hiện trong bảng 1.3 dưới đây:
Bảng 1.3 Tình hình kháng kháng sinh của 30 chủng Edw.ictaluri
Thuốc kháng
sinh
Ampicillin

Amoxicillin
Cefalexin
Cefotaxim
Ciprofloxacin
Enrofloxacin
Norfloxacin
Doxycyclin
Tetracyclin
Florfenicol
Chloramfenicol
Neomycin
Gentamycin
Streptomycin
Trimethoprim/
sunfamethoxazol

Kháng
(%)
26.7
30
46.7
43.3
30.3
80
46.7
26.7
26.7
93.3
90
43.3

46.7
80
100

Nhạy
(%)
70
66.7
46.7
40
36.7
13.3
23.3
50
6.67
6.67
6.67
33.3
40
13.3

Nhạy trung bình
(%)
3.33
3.33
6.67
16.7
30
6.67
30

23.3
10
0
3.33
23.3
13.3
6.67

0

0

Kết quả kháng sinh đồ cho thấy đa số các dòng vi khuẩn Edw.ictaluri nhạy
cao với kháng sinh ampicillin và amoxicillin; kháng cao với các kháng sinh
tetracyclin, enrofloxacin, streptomycin và kháng sinh nhóm fenicol; kháng hoàn
HVTH: Mai Hoàng Yến

10


Luận văn thạc sĩ
toàn với trimethoprim/sunfamethoxazol. Đặc biệt hầu hết tất cả 15 chủng vi khuẩn
trong nghiên cứu đều thể hiện sự kháng đa thuốc.
Ngoài ra, sự kháng thuốc của vi khuẩn Edw. ictaluri trên cá tra ở khu vực
ĐBSCL cũng được nhiều tác giả nghiên cứu. Crumlish và cs, (2002) đã tiến hành
kiểm tra kháng sinh đồ vi khuẩn Edw.ictaluri phân lập từ cá tra nuôi ở tỉnh An
Giang và Cần Thơ. Kết quả cho thấy vi khuẩn Edw.ictaluri phân lập trên cá tra ở
tỉnh An Giang chỉ kháng với oxolinic acid trong khi vi khuẩn được phân lập từ Cần
Thơ thì kháng với oxytetracyline và sulfonamide. Nghiên cứu của Từ Thanh Dung
và cs, (2004) cho thấy vi khuẩn Edw.ictaluri phân lập từ cá tra bệnh tại An Giang,

Cần Thơ, Đồng Tháp và Vĩnh Long cũng kháng với oxytetracyline, oxolinic acid và
sulfonamide. Tuy nhiên, đến năm 2008, ngoài 2 loại kháng sinh oxytetracyline và
sulfonamide thì vi khuẩn này đã kháng thêm với streptomycin, trimethoprim,
flumequine và enrofloxacin (Từ Thanh Dung và cs, 2008). Điểm nổi bật trong
nghiên cứu này là đã xác định có trên 73% chủng vi khuẩn E. ictaluri biểu hiện sự
đa kháng thuốc. Gần đây nhất, theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thiện Nam và
cs, (2010) cho thấy hầu hết vi khuẩn Edw.ictaluri kháng với streptomycin,
chloramphenicol (95%), florfenicol, enrofloxacin (77,5%) và doxycycline (67,5%).
Đặc biệt, nghiên cứu này đã xác định 97,5% chủng vi khuẩn biểu hiện sự đa kháng
thuốc. Các nghiên cứu trên cho thấy việc sử dụng kháng sinh tuy vẫn đang là
phương pháp phổ biến trong điều trị bệnh gan thận mủ nhưng đây khơng phải là giải
pháp lâu dài. Vì vậy việc tìm một liệu pháp điều trị thay thế kháng sinh đang ngày
càng trở nên cấp bách hiện nay.
1.5.2 Sử dụng vaccine
Nhiều nghiên cứu cho thấy triển vọng sản xuất ra được vaccine cho bệnh
gan thận mủ trên cá Tra là khả thi. Viện NCNTTS II kết hợp với NAVETCO đã
thiết lập qui trình gây bệnh thực nghiệm ngược bằng phương pháp tiêm vào cơ
thịt cá, áp dụng kỹ thuật kháng nguyên bất hoạt toàn bộ tế bào bằng formaline của
chủng vi khuẩn Edw.ictaluri để làm kháng nguyên chế tạo vaccine và tìm ra được
LD50 là 2,25x104 và 3,65x104 tế bào vi khuẩn/0,2ml/cá. Kết quả cho thấy cá
được tiêm vaccine có tỉ lệ số ng tương đố i (Relative Percent Survival) sau ngày 21
đạt 96,7%. Cchủng ngừa bằng cách kết hợp phương pháp ngâm/cho ăn để gây miễn
HVTH: Mai Hoàng Yến

11


Luận văn thạc sĩ
dịch ban đầu và cho ăn tăng cường cho kết quả bảo hộ tương đố i tố t khi cá bị nhiễm
vi khuẩn Edw.ictaluri. Lặp lại việc cho ăn tăng cường có thể sẽ là một phương pháp

thay thế để duy trì hiệu quả miễn dịch cho cá Tra đố i với việc phơi nhiễm các loại
tác nhân gây bệnh có độc lực cao (Nguyễn Mạnh Thắng, 2009). Tuy nhiên, đến nay
vẫn chưa có một sản phẩm vaccine cụ thể phịng bệnh có mặt trên thị trường Việt
Nam. Ngoài ra, phương pháp tăng khả năng kháng bệnh cho cá bằng vaccine có một
sớ nhược điểm như: giá thành có khả năng cao làm tăng chi phí sản xuất, khó áp
dụng rộng raĩ do phải tiêm từng con và tiêm nhắc lại, cá chỉ kháng được bệnh tạm
thời mà không di truyền được cho đời sau.
1.6 Thực khuẩn thể (bacteriophage)
1.6.1 Lịch sử phát hiện phát hiện thực khuẩn thể
Thực khuẩn thể là những thể phong phú nhất trên trái đất, thực khuẩn thể là
một phần quan trọng góp phần ổn định quần thể vi sinh vật, chúng cũng rất linh
hoạt và có khả năng thích nghi với rất nhiều ứng dụng. Thực khuẩn thể là loại virus
xâm nhiễm vi khuẩn, sự sao chép của chúng phụ thuộc vào việc sử dụng các vật liệu
di truyền từ tế bào vi khuẩn bị xâm nhiễm. Thực khuẩn thể được phát hiện một cách
độc lập bởi Frederick Twort năm 1915 và Félix d'Herelle năm 1917 (Irshad Ul Haq
và cs, 2012). Twort đã quan sát thấy xuất hiện các khuẩn lạc trong suốt phát triển
trên bề mặt nuôi cấy vi khuẩn. Khi chuyển các khuẩn lạc trong suốt sang bề mặt vi
khuẩn mới cũng tạo ra các khuẩn lạc trong suốt tương tự. Sau khi kiểm tra vi khuẩn
từ các khuẩn lạc trong suốt, Twort nhận thấy rằng vi khuẩn đã phân hủy thành
những mảnh nhỏ và ông đã đưa ra giả thuyết rằng các virus truyền nhiễm nhỏ hơn
vi khuẩn đã gây ra sự phân hủy vi khuẩn (Summers, 2005). D'Herelle quan sát thấy
những gì mà ơng gọi là "bacteriophage" đã gây ra sự ly giải, hoặc vỡ vi khuẩn trong
chất lỏng cũng như trong các đốm rõ ràng trên thạch, ông cho rằng bacteriophage là
ký sinh trùng của vi khuẩn. Các nghiên cứu của ông cũng cho thấy rằng các tế bào
bacteriophage cần các tế bào chủ (vi khuẩn) để tăng sinh. Sáng chế của kính hiển vi
điện tử trong những năm 1940 cho phép các nhà khoa học quan sát các vi khuẩn và
quan hệ giữa các thực khuẩn thể và vi khuẩn, chứng minh rằng các loài thực khuẩn
thể có các hình thái khác nhau và các tế bào thực khuẩn thể chứa DNA. Năm 1952,
Hershey và Chase cho thấy rằng khi một tế bào chủ gắn vào một tế bào chủ, DNA
HVTH: Mai Hoàng Yến

12


Luận văn thạc sĩ
của nó sẽ được tiêm vào tế bào và lớp protein của chúng không vào tế bào chủ
(Summers, 2005).

Hình 1.5 Thực khuẩn thể xâm nhiễm vi khuẩn (news-medical.net)
1.6.2 Phân loại thực khuẩn thể
Dựa vào kiểu gen và hình thái, Ủy ban quốc tế về phân loại virus
(International Committee on Taxonomy of Viruses hay ICTV) đã xếp thực khuẩn
thể vào 10 họ
Bảng 1.4 Bảng phân loại thực khuẩn thể (talk.ictvonline.org)
Hình thái vỏ
Đặc trưng
Kiểu gen
capsid
Myoviridae
Khối 20 mặt Có đi ( có thể co rút)
dsDNA, thẳng
Siphoviridae
Khối 20 mặt Có đi (dài khơng co rút) dsDNA, thẳng
Podoviridae
Khối 20 mặt Có đi (ngắn khơng có dsDNA, thẳng
rút)
Tectiviridae
Khối 20 mặt Có màng trong phía trong dsDNA, thẳng
vỏ capsid
Corticoviridae Khối 20 mặt Có màng trong phía trong dsDNA, vịng

vỏ capsid
Plasmaviridae Đa hình
Có màng bao
dsDNA, vịng
Microviridae Khối 20 mặt Khơng có màng bao
ssDNA, vịng
Inoviridae
Hình sợi
Dài, linh động hoặc ngắn, ssDNA, vịng
khơng linh động
Cystoviridae
Khối 20 mặt Có màng bao, có nhiều lớp dsRNA,thẳng,
phân đoạn
Leviviridae
Khối 20 mặt Khơng có màng bao
ssRNA, thẳng
Họ

HVTH: Mai Hồng Yến

Ví dụ
T4
λ
T7
PRD1
PM2
L2
X174
M13
6

MS2
13