Khảo sát thành phần hóa học theo hướng tác dụng chống oxy hóa của cây cơm cháy tròn sambucus nigra l
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (5.65 MB, 101 trang )
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH
--------------------------------------
LÊ THỊ MAI HƯƠNG
KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC
THEO HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA
CỦA CÂY CƠM CHÁY TRÒN
Sambucus nigra L.
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
TP HỒ CHÍ MINH – 2020
.
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH
----------------------------------------
LÊ THỊ MAI HƯƠNG
KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC
THEO HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA
CỦA CÂY CƠM CHÁY TRÒN
Sambucus nigra L.
Ngành: Dược liệu – Dược học cổ truyền
Mã số: 8720206
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Trần Hùng
TP HỒ CHÍ MINH – 2020
.
.
LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong
luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Lê Thị Mai Hương
.
.
TÓM TẮT
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC KHÓA 2018 - 2020
Chuyên ngành: Dược liệu - Dược học cổ truyền
Mã số: 8720206
Tên đề tài: Khảo sát thành phần hóa học theo hướng tác dụng chống oxi hóa
của cây Cơm cháy tròn Sambucus nigra L.
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Trần Hùng
Học viên thực hiện: Lê Thị Mai Hương
Mở đầu: Các nghiên cứu đã công bố trên thế giới và ở Việt Nam về Sambucus nigra
L. (Cơm cháy tròn) chủ yếu được thực hiện trên hoa và quả, cho thấy nhiều cơng
dụng và tiềm năng ứng dụng của lồi này. Trong nghiên cứu này, thành phần hoá học
của lá Cơm cháy lá tròn được khảo sát theo hướng tác dụng chống oxy hóa nhằm
cung cấp thơng tin về hố học và tác dụng của loài cây thuốc này.
Đối tượng nghiên cứu: Lá cây Cơm cháy tròn được thu hái tại Đà Lạt, Lâm Đồng
vào tháng 09 năm 2019.
Phương pháp nghiên cứu:
Khảo sát đặc điểm thực vật, kiểm tra độ tinh khiết của nguyên liệu được bằng các
phương pháp thường quy. Khảo sát thành phần hóa học được được tiến hành theo
hướng tác dụng chống oxy hóa trên DPPH và ức chế xanthin oxydase (XO). Các chất
được phân lập bằng các kỹ thuật chiết phân bố và sắc ký. Cấu trúc các chất được xác
định bởi các phương pháp phổ học.
Kết quả:
Từ 4 kg lá cây Cơm cháy tròn, bằng phương pháp ngấm kiệt đã thu được 1,2 kg cao
cồn 70%. Cao cồn được chiết lỏng - lỏng cho 700 g phân đoạn CHCl3, 25,3 g phân
đoạn EtOAc, và 450 g cao nước. Phân đoạn EtOAc cho tác dụng tốt nhất trên cả 2
mơ hình thử.
Từ 25 g phân đoạn EtOAc, bằng sắc ký cột quá tải kết hợp kết tinh phân đoạn và tinh
chế qua Sephadex LH-20 đã thu được 4 chất. Cấu trúc của 4 chất này đã được xác
định bởi các kỹ thuật phổ là: kaempferol (SNE1, 42,3 mg), quercetin (SNE2, 57,8
mg), acid trans 4-hydroxy cinnamic (SNE3, 35,5 mg) và trollin (SNE4, 18,2 mg).
Về tác dụng in vitro, kaempferol và quercetin cho tác dụng tốt trên cả hai mô hình
DPPH và XO. Acid 4-hydroxy cinnamic cho tác dụng ức chế XO với IC50 = 14,51
µM, mạnh hơn allopurinol. Trolline cho tác dụng ức chế DPPH tốt với IC 50 = 12,47
µM, tốt hơn so với chất đối chứng là acid ascorbic.
Bàn luận: Phân đoạn ethyl acetat và các chất phân lập được từ phân đoạn này đã cho
thấy tiềm năng ứng dụng chống oxy hoá của lá cơm cháy lá tròn. Tác dụng tốt trên
xanthinoxidase của SNE3 mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng cho lá trên các bệnh,
chứng liên quan tới xanthin oxidase và tác dụng chống oxy hóa.
.
.
SUMMARY
THESIS OF MASTER OF PHARMACY - Course: 2018 - 2020
Major: Traditional Pharmacy - Code: 8720206
ANTIOXIDANT ACTIVE-GUIDED ISOLATION FROM
Sambucus nigra L.
Instructor: Tran Hung, Assoc. Prof., Dr
Student: Le Thi Mai Huong
Introduction: Researches on Sambucus nigra L. (Elder or European elder) that have
been internationally and nationally published mainly focused on chemical
constituents and bioactivities of the its flowers and fruits. Numbers of them showed
their potential activities and efficacy against various diseases. In this study, chemical
constituents of leaves of elder was investiagated by antioxidantive activity guided for
more information about chemistry and bioactivity of the leaves of this plants.
Materials: Leaves of Sambucus nigra L. were collected in Dalat, Lam dong province
in September, 2019.
Methods: Botanical investigation was done by common methods. Extraction,
seperation, isolation and purification were done as routine work. Structure
elucidation was based on NMR and MS spectrometric methods. In vitro
antioxidative activity of fractions, isolated compounds were measured by DPPH
radical scavenging and xanthin oxydase (XO) inhibitory tests.
Results:
From 4 kg of leaves powder, 1.2 kg ethanolic 70% extract which was obtained by
percolation, was succesively liquid-liquid partioned to give CHCl3 (700 g), EtOAc
(25.3 g) and water (400 g) fractions. The most active EtOAc fraction was further
separated by overloaded-column chromatography to obtain 11 sub-fractions. From
these, by column chromatography and frational crystallization, kaempferol (SNE1,
42.3 mg), quercetin (SNE2, 57.8 mg), trans 4-hydroxy cinnamic acid (SNE3, 35.5
mg) and trolline (SNE4, 18.2 mg) were isolated and their structure were deduced
from their spectral data.
On antioxidative activities, kaempferol and quercetin showed high activity in both
DPPH radical scavenging and xanthin oxidase inhibitory. Trans 4-hydroxy cinnamic
acid (IC50= 14.51 µM) showed better activity in XO inhibitory than allopurino in
control test and trolline had the better result in DPPH radical scavenging than ascorbic
acid (IC50= 12.47 µM)
Conclusion:
Ethyl acetate fraction from leaves of Sambusus nigra and its chromatographic subfractions and isolated compounds have showm their potetial on antioxidative and XO
inhibitory activities. These results were also open the opprtunities for futher studies
on application of Elder in treatment of deseases concerning to XO and antioxidents.
.
.
Luận văn Thạc sĩ dược học
Lê Thị Mai Hương
MỤC LỤC
MỤC LỤC ................................................................................................................... i
DANH MỤC BẢNG BIỂU ......................................................................................iii
DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................ iv
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................... v
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
Chương 1. TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU ................................... 2
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY CƠM CHÁY TRÒN (Sambucus nigra L.) ........... 2
1.1.1. Vị trí phân loại thực vật .............................................................................. 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật, sinh thái và phân bố .................................................... 2
1.1.3. Bộ phận dùng, thu hái, chế biến ................................................................. 5
1.1.4. Thành phần hóa học ................................................................................... 5
1.1.5. Tác dụng dược lý ........................................................................................ 7
1.2. GỐC TỰ DO VÀ MÔ HÌNH DẬP TẮT GỐC TỰ DO DPPH ............... 9
1.3. XANTHIN OXIDASE VÀ TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE . 10
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 11
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ....................................................................... 11
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 11
2.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị .............................................................................. 11
2.1.3. Dung mơi, hóa chất .................................................................................. 12
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................. 12
2.2.1. Định danh dược liệu .................................................................................... 12
2.2.2. Kiểm tinh khiết ......................................................................................... 13
2.2.3. Đánh giá bộ phận dùng có tính chống oxi hóa mạnh nhất ....................... 13
2.2.4. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật ................................................... 13
2.2.5. Chiết xuất và tách phân đoạn ................................................................... 13
2.2.6. Phân lập và tinh chế.................................................................................. 15
2.2.7. Xác định cấu trúc chất phân lập được ...................................................... 15
2.2.8. Sàng lọc sinh học...................................................................................... 15
2.2.9. Phân tích kết quả và xử lý số liệu thống kê .............................................. 18
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................... 18
3.1. KHẢO SÁT THỰC VẬT HỌC .................................................................... 18
3.1.1. Khảo sát đặc điểm hình thái ..................................................................... 18
3.1.2. Khảo sát đặc điểm vi học ......................................................................... 18
3.1.2.1. Lá ........................................................................................................... 18
3.1.2.2. Thân ....................................................................................................... 21
3.1.3. Định danh bằng phương pháp giải trình tự ADN ..................................... 23
i
.
.
Luận văn Thạc sĩ dược học
Lê Thị Mai Hương
3.2. ĐÁNH GIÁ ĐỘ TINH KHIẾT CỦA NGUYÊN LIỆU ................................ 23
3.3. ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÁC BỘ PHẬN
DÙNG .................................................................................................................... 24
3.4. KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT ............................ 25
3.5. CHIẾT XUẤT VÀ TÁCH CÁC PHÂN ĐOẠN ........................................... 26
3.5.1. Khảo sát lựa chọn dung môi chiết ............................................................ 26
3.5.2. Chiết và tách các phân đoạn từ cao cồn lá Sambucus nigra .................... 27
3.5.3. Phân tách các phân đoạn từ phân đoạn EtOAc ........................................ 30
3.6. PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ CÁC PHÂN ĐOẠN CĨ HOẠT TÍNH ......... 33
3.6.1 Phân lập SNE1 từ Se3 ........................................................................... 33
3.6.2 Phân lập SNE2 từ Se5 ........................................................................... 33
3.6.3 Phân lập SNE3 từ Se4 ........................................................................... 33
3.6.4. Phân lập SNE4 từ Se8 ........................................................................... 34
3.7. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC ........................ 35
3.7.1. Chất SNE1 ............................................................................................ 35
3.7.2. Chất SNE2 ............................................................................................ 38
3.7.3. Chất SNE3 ............................................................................................ 39
3.7.4. Chất SNE4 ............................................................................................ 42
3.8. THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG SINH HỌC CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC
............................................................................................................................... 45
3.8.1. Tác dụng dập tắt gốc tự do DPPH ............................................................ 45
3.8.2. Xác định khả năng ức chế xanthin oxidase .............................................. 46
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 51
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 54
ii
.
.
Luận văn Thạc sĩ dược học
Lê Thị Mai Hương
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1-1: So sánh đặc điểm hình thái giữa cây Cơm cháy tròn và cây Cơm cháy. .. 3
Bảng 1-2: Một số chất phân lập được từ hoa cây Cơm cháy tròn.............................. 6
Bảng 2-1: Các loại mẫu dùng cho thử nghiệm tác dụng ức chế DPPH ................... 16
Bảng 2-2: Thiết kế thí nghiệm cho thử nghiệm tác dụng ức chế XO ...................... 17
Bảng 3-1: Kết quả kiểm tra độ tinh khiết lá Cơm cháy tròn .................................... 24
Bảng 3-2: Mức độ ức chế XO của cao cồn rễ, thân, lá Cơm cháy tròn ................... 24
Bảng 3-3: Hàm lượng chất chiết được của rễ, thân và lá Cơm cháy tròn ................ 25
Bảng 3-4: Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật lá Cơm cháy trịn ........ 26
Bảng 3-5: Hàm lượng chất chiết được của lá Cơm cháy tròn trong các dung môi.. 26
Bảng 3-6: Kết quả ức chế enzym XO các cao phân đoạn từ cao cồn toàn phần ..... 29
Bảng 3-7: Kết quả các phân đoạn thu được từ sắc ký cột quá tải phân đoạn Se ..... 31
Bảng 3-8: Các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cao phân đoạn Se8 ..................... 35
Bảng 3-9: Bảng so sánh phổ 13C-NMR của SNE1 và Kaempferol [25]................. 37
Bảng 3-10: Bảng so sánh phổ 13C-NMR của SNE1 và Quercetin [10] .................. 39
Bảng 3-11: Bảng dữ liệu phổ NMR của SNE3 ........................................................ 41
Bảng 3-12: Bảng so sánh phổ 13C-NMR của SNE3 và acid trans 4-hydroxy cinnamic
................................................................................................................................... 41
Bảng 3-13: Bảng dữ liệu phổ NMR của SNE4 ........................................................ 43
Bảng 3-14: Bảng so sánh phổ 13C-NMR của SNE4 và trolline [21] , [19] ............. 44
Bảng 3-15: Kết quả thử nghiệm ức chế DPPH của các chất tinh khiết ................... 45
Bảng 3-16: Giá trị IC50 của các chất phân lập được trên mơ hình DPPH ................ 46
Bảng 3-17: Kết quả thử nghiệm ức chế XO của các chất phân lập được ................ 46
Bảng 3-18: Giá trị IC50 của các chất phân lập được trên mơ hình XO .................... 47
iii
.
.
Luận văn Thạc sĩ dược học
Lê Thị Mai Hương
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Một số đặc điểm cây Cơm cháy trịn ........................................................ 3
Hình 2.1: Quy trình chiết xuất và phân lập dự kiến ................................................ 14
Hình 3.1: Một số đặc điểm của cây Cơm cháy trịn ................................................ 18
Hình 3.2: Khí khổng dạng hỗn bào của lá Cơm cháy trịn ...................................... 19
Hình 3.3: Vi phẫu và sơ đồ tổng quát lá Cơm cháy trịn ........................................ 19
Hình 3.4: Vi phẫu chi tiết lá cây Cơm cháy trịn .................................................... 20
Hình 3.5: Các cấu tử trong bột lá cây Cơm cháy trịn............................................. 21
Hình 3.6: Vi phẫu và sơ đơ thân cây Cơm cháy trịn .............................................. 21
Hình 3.7: Vi phẫu chi tiết thân cây Cơm cháy trịn ................................................ 22
Hình 3.8: Các cấu tử có trong bột thân Cơm cháy trồn .......................................... 23
Hình 3.9: Kết quả ức chế DPPH của cao cồn rễ, thân, lá Cơm cháy trịn .............. 24
Hình 3.10: Kết quả ức chế DPPH của cao chiết lá Cơm cháy tròn với các nồng độ
cồn khác nhau ........................................................................................................... 27
Hình 3.11: Khả năng ức chế DPPH của các chất chiết được trong cao lá Cơm cháy
tròn khi chiết với các nồng độ cồn khác nhau. ......................................................... 27
Hình 3.12: Sắc ký đồ tổng kết các cao phân đoạn từ cao cồn tồn phần ................ 28
Hình 3.13: Kết quả ức chế DPPH của các cao phân đoạn từ cao cồn tồn phần .... 28
Hình 3.14: Biểu đồ biểu diễ % ức chế enzym XO theo nồng độ của các cao phân
đoạn từ cao tồn phần .............................................................................................. 29
Hình 3.15: Sắc ký đồ cao phân đoạn Se .................................................................. 30
Hình 3.16: Sắc ký đồ các phân đoạn từ cột quá tải Se ............................................ 32
Hình 3.17: Kết quả ức chế DPPH của các cao phân đoạn từ cao Se ...................... 32
Hình 3.18: Sắc ký đồ các phân đoạn tách SNE3..................................................... 34
Hình 3.19: Sắc ký đồ các phân đoạn thu được từ sắc ký cột phân đoạn Se8 .......... 35
Hình 3.20: Sắc ký đồ kiểm tinh khiết SNE1 ........................................................... 36
Hình 3.21: So sánh phổ 1H-NMR của Kaempferol [24] và SNE1......................... 37
Hình 3.22: Sắc ký đồ kiểm tinh khiết SNE2 ........................................................... 38
Hình 3.23: Sắc ký đồ kiểm tinh khiết SNE3 ........................................................... 40
Hình 3.24: Sắc ký đồ kiểm tinh khiết SNE4 ........................................................... 42
Hình 3.25: Biểu đồ thể hiện IC50 của các chất phân lập được trên mơ hình DPPH 46
Hình 3.26: Biểu đồ thể hiện IC50 của các chất phân lập được trên mơ hình DPPH 47
iv
.
.
Luận văn Thạc sĩ dược học
Lê Thị Mai Hương
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
COSY
CTPT
d
dd
DMSO
DPPH
ESI
EtOAc
Collerated Spectroscopy - (phổ) tương quan 1H-1H
công thức phân tử
doublet
doublet of doublets
dimethyl sulfoxid
2,2-diphenyl-2-picrylhydralazyl hydrat
Electrospray ionization
ethyl acetat
HMBC
HPLC
HSQC
IC
m
MS
n-Hex
NMR
NOESY
PTK
XO
Heteronuclear Multiple Bond Correlation
High Performance Liquid Chromatography
Heteronuclear Single Bond Correlation
Inhibitory concentration
multiplet
Mass Spectrometry - Phổ khối
n-hexan
Nuclear Magnetic Resonance - Cộng hưởng từ hạt nhân
Nuclear Overhauser Spectroscopy
phân tử khối
Xanthin oxidase
v
.
.
Luận văn Thạc sĩ dược học
Lê Thị Mai Hương
ĐẶT VẤN ĐỀ
Môi trường ô nhiễm, sức khỏe của con người bị đe dọa. Việc dùng các thuốc có nguồn
gốc tự nhiên và các thực phẩm chức năng trong bảo vệ và chăm sóc sức khỏe để ngăn
ngừa, hỗ trợ và điều trị bệnh đang được phát triển thành xu hướng mới hiện nay. Dược
liệu là nguồn nguyên liệu dồi dào để làm ra các thuốc có nguồn gốc tự nhiên và thực
phẩm bảo vệ sức khỏe.
Cây Cơm cháy tròn Sambucus nigra L. là cây mọc hoang và hiện được trồng ở Đà Lạt,
Lâm Đồng. Dù có nhiều tác dụng có lợi cho sức khỏe như kháng khuẩn, kháng nấm,
chống viêm cấp, chống oxi hóa... nhưng chưa được sử dụng rộng rãi hay có chế phẩm
trên thị trường trong nước. Đã có các đề tài trên thế giới cũng như ở Việt Nam nghiên
cứu về thành phần hóa học cũng như tác dụng dược lý của cây Cơm cháy tròn Sambucus
nigra L. Nhưng các nghiên cứu chủ yếu quan tâm đến bộ phận dùng là quả và hoa,
chứng minh hoa có thành phần flavonoid cao và có tác dụng chống oxi hóa mạnh [1],
[2], [4].
Đề tài “Khảo sát thành phần hóa học theo hướng tác dụng chống oxi hóa trên mơ
hình DPPH và ức chế xanthin oxidase của cây Cơm cháy tròn Sambucus nigra L.”
được thực hiện nhằm góp phần tìm hiểu, chứng minh tác dụng và nâng cao giá trị sử
dụng cây Cơm cháy tròn với mục tiêu chính như sau:
‒ Nghiên cứu thành phần hoá học và phân lập các chất từ Cơm cháy tròn theo định
hướng của tác dụng chống oxy hoá trên mơ hình dập tắt gốc tự do DPPH và ức chế
xanthin oxidase.
Để thực hiện mục tiêu trên, các nội dung chính được thực hiện là:
Khảo sát Cơm cháy tròn về giải phẫu và đặc điểm bột dược liệu.
Xác định ADN của cơm cháy tròn để xác định tính đúng của mẫu nghiên cứu.
Đánh giá tác dụng chống oxy hoá của các bộ phận, các phân đoạn của Cơm cháy
tròn định hướng cho nghiên cứu hóa học và tác dụng của các chất phân lập được.
Nghiên cứu thành phần hóa học, chiết xuất, phân lập các chất trong bộ phận có
tác dụng chống oxi hoá mạnh nhất.
1
.
.
Luận văn Thạc sĩ dược học
Lê Thị Mai Hương
Chương 1. TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
1.1.
TỔNG QUAN VỀ CÂY CƠM CHÁY TRÒN (Sambucus nigra L.)
Tên Việt Nam: Cơm cháy tròn, Mậu mạ
Tên khoa học: Sambucus nigra L.
Đồng danh: Sambucus simpsonii Rehd, Sambucus eberhardtii Danguy [1].
1.1.1. Vị trí phân loại thực vật
Chi Sambucus có 9 lồi là: S. ebulus; S. wightiana; S. adnata ; S. gaudichaudiana; S.
australasica; S. javanica; S. nigra; S. Australis và S. racemosa.
Ở Việt Nam có nhiều 2 loài: cơm cháy (Sambucus javanica Reinw. Ex Blume) và cơm
cháy trịn (Sambucus nigra L. hay Sambucus simponii Rehd). Lồi cơm cháy phân bố
rộng rãi ở các tỉnh miền núi phía Bắc, cịn cơm cháy trịn phân bố ở Thừa Thiên Huế
(Bạch Mã) và Lâm Đồng
Trên thế giới, cây cơm cháy tròn xuất hiện phổ biến ở quần đảo Anh và các nước Tây
Âu từ thời Trung cổ [4]. Ngoài ra, cây cơm cháy tròn còn có ở Lào [1], [2]
Chi Sambucus có vị trí phân loại như sau [3]
Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Lớp: Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Bộ:
Tục đoạn (Dipsacales)
Họ:
Cơm cháy (Caprifoliaceae)
Chi:
Sambucus
Loài: Sambucus nigra L. [1].
1.1.2. Đặc điểm thực vật, sinh thái và phân bố
Cây bụi cao 3-4m. Thân có lõi to, xốp. Lá kép lông chim, mọc đối, gồm 7-13 lá chét
hình trứng nhọn, mép khía răng, mặt trên nhẵn màu lục bóng, mặt dưới nhạt, lá chét ở
gốc thường chẻ thêm hai lần, ở cành mang hoa số lá chét ít hơn (3-7 lá).
Cụm hoa mọc ở đầu cành thành ngù phân nhánh, có ít lông, hoa nhiều, đường kính 4-5
mm, có mùi đặc biệt, đài nhỏ, hình đấu, 5 răng màu trắng, tràng có năm cánh tròn màu
ngà vàng, nhị có 5 bao phấn màu vàng, thuôn dài, bầu có 3-5 ô, núm nhụy chia 5 thùy.
2
.
.
Luận văn Thạc sĩ dược học
Lê Thị Mai Hương
Quả mọng hình cầu, đường kính 4-5 mm, khi chín màu hồng sau tím đen, thịt quả có
màu xám, vị ngọt, có 4-5 hạt, hình thn hay elip.
Mùa hoa quả gần như quanh năm [1], [4].
Hình 1.1: Một số đặc điểm cây Cơm cháy tròn
Cơm cháy tròn là loại cây bụi ưa ẩm, ưa sáng, thường mọc rải rác ở chỗ đất trống ven
rừng hoặc gần các nguồn nước. Độ cao phân bố dưới 1.500 m. Cây sinh trưởng gần như
quanh năm và mùa hoa quả của cây cũng không rõ ràng, vì trên cây thường xuyên thấy
hoa hoặc quả. Cơm cháy tròn tái sinh tự nhiên bằng hạt. Phần gốc còn lại sau khi chặt
cũng có khả năng tái sinh cây chồi mới.
Bảng 1-1: So sánh đặc điểm hình thái giữa cây Cơm cháy tròn (Sambucus nigra L.) và cây Cơm
cháy (Sambucus javanica Reinw. Ex Blume)[2].
Sambucus nigra L.
Sambucus javanica
Blume
Cây
Cây bụi lớn, cao 2 - 3
m.
Cây bụi nhỡ, cao 1 – 2
m.
Kích thước của lá
kép
(13 - 14 cm) x (9 – 10
cm)
(25 - 28 cm) x (12 – 14
cm)
Số lượng lá chét
(3 -) 5 - 7
(5 -) 7 - 9
Kích thước của lá
chét
(5 -7 cm) x (1 - 3 cm)
(9 -10 cm) x (3 - 4 cm)
Phiến lá
Dày, cứng và nhẵn
bóng.
Mỏng, mềm, sờ thấy
ráp tay.
Số đôi gân phụ của
lá chét
6-8
9 - 12
Đặc điểm
Hình
Thái
3
.
.
Luận văn Thạc sĩ dược học
Vi phẫu
lá
Lê Thị Mai Hương
Chiều dài của cuốn
lá chét
1 – 2 mm
5 - 10 mm
Đường kính của
hoa
5 – 7 mm
1,5 - 2,5 mm
Đài hoa
Đỉnh trịn
Đỉnh nhọn
Cánh hoa
Đỉnh trịn
Đỉnh nhọn
Số ơ của bầu
5
3
Số thùy của núm
nhụy
5
3
Thể tuyến
Khơng có
Cụm hoa có các thể
tuyến hình chén, đường
kính 2 – 3 mm, màu
vàng hay xanh
Lơng che chở
Có cả ở biểu bì trên và
dưới
Chỉ có ở biểu bì trên
Mơ dày
Gồm 6 - 7 hàng tế bào
Gồm 3 - 4 hàng tế bào
Số đám libe-gỗ
hình vịng cung ở
gân chính
3
1
Vi phẫu
thân
Mơ dày
Phân bố đều đặn tạo
Chủ yếu tập trung ở
thành vòng theo thiết
những chỗ lồi của thân
diện của thân
Bần
Ở một số chỗ lớp bần bị Lớp bần không bị bong
bong ra
ra
Các khuyết trong
phần mơ mềm vỏ
Có
Khơng có
Tia ruột
Gồm 1 dãy tế bào
Tia ruột rộng gồm 2 - 4
dãy tế bào
Mô mềm ruột
Không có
Có
Bột lá
Lơng che chở đơn
bào
Đầu nhọn
Đầu tù
Bột thân
Hạt tinh bột
Khơng có
Có các hạt tinh bột với
hình dạng đặc trưng.
Vi phẫu
rễ
4
.
.
Luận văn Thạc sĩ dược học
Bột hoa
Đường kính của hạt
phấn hoa
Hạt tinh bột
Bột rễ
Lê Thị Mai Hương
16 - 18 µm
18 - 21 µm
Hạt tinh bột đơn, khơng
Hạt tinh bột đơn, kép
có hạt kép đơi hay kép
đơi hay kép ba.
ba.
Tinh thể calci
oxalat hình khối
Có
Khơng có
Tế bào có thành dày
hóa gỗ
Khơng có
Có
1.1.3. Bộ phận dùng, thu hái, chế biến
Bộ phận dùng: Toàn cây.
Thu hái, chế biến: Thu hái hoa, quả, cành và lá rồi phơi khơ.
1.1.4. Thành phần hóa học
Các nhóm chất chủ yếu trong cây cơm cháy tròn: glycosid cyanogenic: sambunigrin;
các anthocyanin: (1) cyanidin-3-O-[6-O-(E-P-coumaroyl)-2-O-(β-D-xylopyranosyl)-βD-glucopyranosid]-5-O-β-D-glucopyranosid (69,8%); (2) cyanidin-3-sambubiosid-5glucosid (22,7%); (3) cyanidin-3- sambubiosid; (4) cyanidin-3- glucosid (2,1%)
(chrysanthemin); (5) cyanidin-3-O-(6-O-Z-P-coumaroyl-2-O-β-D-xylopyranosyl-β-Dglucopyranosid)-5-O-β-D-glucopyranosid. Các glycosid irridoid: morronisid. Các
triterpen như α-amyrin, β-amyrin, acid ursolic, acid oleanolic, tinh dầu, protein, đặc
biệt là các protein làm bất hoạt ribosom của tế bào (RIPs) [2].
Morronisid
Sambunigrin
5
.
.
Luận văn Thạc sĩ dược học
Lê Thị Mai Hương
(1) R1= D-glucopyranosyl
R2=P-coumaroyl
(2) R1= xycosa-glucosa
R2= glucosa
(3) R1= xycosa-glucosa
R2 = H
(4) R1= glucosa
R2 = H
(5) R1= H
R2=P-coumaroyl
Thành phần của lá, thân, hoa và quả có flavonoid, saponin, steroid, đường khử, acid
hữu cơ và acid amin. Riêng quả có thêm các anthocyan. Ngồi ra lá và thân cịn có thêm
alkaloid và coumarin. Rễ khơng có flavonoid, chỉ có saponin steroid và đường khử [4].
Từ hoa Sambucus nigra người ta phân lập được một số chất như trong bảng 1.2 [1], [3].
Bảng 1-2: Một số chất phân lập được từ hoa cây Cơm cháy tròn
STT
Tên chất
1
Kaempferol
2
Quercetin
3
n-Hexacosane
4
Hỗn hợp của
Urs-12-ene, βamyrene và βamyrin
Công thức cấu tạo
Urs-12-ene
6
.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
Luận văn Thạc sĩ dược học
Lê Thị Mai Hương
1.1.5. Tác dụng dược lý
Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm.
Khi nghiên cứu sàng lọc các cây thuốc trong y học dân gian Guatemala để chữa nhiễm
khuẩn đường ruột, các tác giả đã phát hiện thấy dịch chiết toàn cây cơm cháy tròn có
tác dụng trên một số vi khuẩn đường ruột [10]. Dịch chiết cơm cháy tròn cũng có tác
dụng trên phẩy khuẩn tả Vibrio cholera [15]. Kết quả sàng lọc một số cây thuốc dùng
trong y học dân gian Brazil điều trị các bệnh nhiễm khuẩn cũng cho thấy cao Cơm cháy
có tác dụng ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn ở mức độ vừa phải (MIC = 250
µg/ml), kể cả một số vi khuẩn gây nhiễm khuẩn đường hô hấp [17], [20].
Kết quả sàng lọc 44 cây thuốc chữa nhiễm nấm ngoài da, trong y học dân gian
Guatemala, thấy cao cơm cháy tròn còn có tác dụng ức chế 4 chủng nấm gây bệnh là
Epidermophyton floccosum, Trichophyton metagrophytes var algodmosa, T.
mentagrophytes var granulare và T. Rubrum. [10]
Tác dụng chống viêm cấp
Trong y học cổ truyền Iran, dịch chiết lá và rễ cây Cơm cháy được sử dụng để kháng
viêm trong các trường hợp ong hay côn trùng cắn, viêm khớp, viêm họng...[14]
Ở Việt Nam, tác dụng chống viêm cấp đã được nghiên cứu trên mơ hình gây phù chân
chuột bằng carragenin ở chuột cống trắng. Kết quả cho thấy dịch chiết toàn cây cơm
cháy tròn với liều 3 lần là 15g/kg làm giảm phù 18,9% (P>0.05); với liều 20g/kg, phù
giảm 25,9% (P>0.05). Tác dụng này có kém hơn so với cơm cháy Sambucus javanica
Reinw. Ex Blume.[2]
Tác dụng bảo vệ tế bào lách bị hủy do oxy hóa
Kết quả thử tác dụng in vitro bảo vệ tế bào của flavonoid chiết từ hoa và lá cây cơm
cháy trịn (có so sánh với flavonoid lá cơm cháy) chống lại tổn thương do hydrogen
peroxyd (H2O2) trên mơ hình MTT (3-[4,5 – dimethyl thiazol – 2 –yl] – 2,5 – diphenyl
tetrazolium bromid trên tế bào lách cô lập từ chuột nhắt trắng cho thấy Sambucus có
tác dụng bảo vệ tế bào. Flavonoid lá cơm cháy tròn có tác dụng bảo vệ tế bào lách mạnh
hơn lá cơm cháy Sambuscus javanica Blume 1,5 lần.[2]
Tác dụng chống oxy hóa
Cây cơm cháy trịn có khả năng chống oxy hóa. Quả cơm cháy tròn có chứa cyanidin
glucosid cũng có tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym cyclooxygenase.[31]
7
.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
Luận văn Thạc sĩ dược học
Lê Thị Mai Hương
Tác dụng chống oxy hóa của flavonoid hoa và lá cơm cháy tròn đã được tiến hành trên
dịch đồng thể não và gan chuột nhắt trắng có so sánh với flavonoid chiết từ lá cơm
cháy. Kết quả cho thấy, flavonoid hoa cơm cháy tròn, flavonoid lá cơm cháy trịn và
flavonoid lá cơm cháy S. javanica có tác dụng chống oxy hóa, và mức độ tác dụng
tương tự nhau trên dịch đồng thể gan chuột nhắt trắng theo thứ tự là 0,254; 0,295 và
0,276 mg/ml. Tuy nhiên, ở dịch đồng thể não, tác dụng chống oxy hóa của flavonoid
hoa cơm cháy tròn có tác dụng rất mạnh, mạnh hơn nhiều so với flavonoid lá cơm cháy
tròn, và flavonoid lá cơm cháy (theo thứ tự là 0,047; 0,245 và 0,321 mg/ml) [2].
Tác dụng dọn gốc tự do
Tác dụng dập tắt gốc tự do của các flavonoid chiết từ hoa cơm cháy trịn, lá cơm cháy
trịn có so sánh với flavonoid lá cơm cháy đã được tiến hành trên mơ hình dập tắt gốc
tự do superoxyd O2-. Kết quả cho thấy flavonoid hoa cơm cháy tròn, flavonoid lá cơm
cháy tròn và flavonoid lá cơm cháy đều có tác dụng dập tắt gốc tự do superoxyd cháy
(theo thứ tự là 61,3; 31,9 và 62,2 µg/ml); trong đó, flavonoid lá cơm cháy trịn có tác
dụng dập tắt gốc tự do mạnh nhất. [2]
Tác dụng trên sự sản sinh cytokin
Chế phẩm mà trong thành phần có quả cơm cháy trịn (Sambucol) sản xuất các cytokin,
có tác dụng tăng cường miễn dịch, làm tăng sản xuất cả các cytokin gây viêm, cả cytokin
chống viêm so với lơ đối chứng, có ích khi dùng cho bệnh nhân bị cúm hoặc bệnh nhân
có hệ miễn dịch bị ức chế do ung thư hoặc AIDS đã dùng các hóa trị liệu. [6]
Tác dụng hạ glucose huyết
Tác dụng làm hạ glucose huyết của dịch chiết nước hoa cơm cháy trịn đã được nghiên
cứu trên hai mơ hình gây tăng glucose huyết bằng streptozotocin (STZ) và bằng alloxan
ở chuột nhắt trắng.
Trên mơ hình gây tăng glucose huyết bằng STZ, kết quả cho thấy nếu cho chuột
dùngdịch chiết hoa cơm cháy tròn liều 0,4 g/kg mỗi ngày trong 10 ngày, sau khi tiêm
STZ, thì glucose chỉ cịn 7,1 mM (giảm 36,6 %, P < 0,001), và có khuynh hướng gần
với glucose huyết của chuột bình thường.
Trên mơ hình gây tăng glucose huyết bằng alloxan, sau 8 ngày, đường huyết của chuột
bị tiêm alloxan có sử dụng dịch chiết nước (1:1) của hoa khơ cơm cháy trịn giảm 41,7%
(P< 0,01) so với chuột không sử dụng dịch chiết [2].
Sự hấp thu và chuyển hóa của anthocyanin
8
.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
Luận văn Thạc sĩ dược học
Lê Thị Mai Hương
Sự hấp thu và chuyển hóa của anthocyannin ở người được nghiên cứu ở 4 phụ nữ cao
tuổi, mỗi người uống 12g cao chiết từ quả Cơm cháy tròn, tương đương với 720mg
anthocyannin. Trong nước tiểu trong 4 giờ sau khi uống vẫn phát hiện được 2
anthocyannin chính là cyanidin-3-glucosid và cyanidin-3-sambubiosid, cùng 3 chất
chủn
hóa
là
peonidin-3-glucosid;
peonidin-3-sambubiosid;
peonidin
monoglucuronid nhưng khơng thể phát hiện được anthocyannin trong huyết tương. Các
kết quả cũng cho thấy anthocyannin hấp thu kém và sự thải trừ nguyên dạng thấp hơn
so với nhiều flavonoid khác.
Con đường chuyển hóa của anthocyannin in vitro là methyl hóa cyanidin thành peonidin
và tạo thành các chất liên hợp glucuronid [36].
Độc tính của cơm cháy tròn
Cơm cháy tròn được xếp vào danh mục các lồi cây có độc do có chứa acid hydrocyanic
(HCN), mandelonitril và trigonellin. [13]
Cao nước hoa khô ở liều là 50g/kg không gây chết chuột. Chuột uống cao chiết từ lá
khơ Cơm cháy trịn liều 20g/kg và 30g/kg vẫn ăn uống và hoạt động bình thường, khơng
có biểu hiện độc và khơng có chuột chết. ở liều 40g/kg và 50g/kg, sau khi uống, hầu
hết chuột giảm hoạt động, không ăn, biểu hiện mệt mỏi, dựng lông; với liều 40g/kg có
10% (1/10) chuột chết và liều 50g/kg có 3/10 chuột chết trong vịng 1 giờ. Khơng xác
định được LD50 [2].
Ngồi ra,trong dân gian,người ta sử dụng lá và ngọn cây cơm cháy dùng ngoài đắp lên
chỗ viêm nhiễm, mụn nhọt, nấm ngoài da, làm lành vết thương. Vỏ cây cơm cháy làm
trà lợi tiểu. Hoa dùng để chữa cảm lạnh, cúm, giảm dau. Quả chữa cảm lạnh, cúm, ho,
hen, viêm dây thần kinh [1].
1.2.
GỐC TỰ DO VÀ MƠ HÌNH DẬP TẮT GỐC TỰ DO DPPH
Các gốc tự do được tạo ra trong các hệ thống sinh học cũng như do ngoại sinh, và gây
ra các rối loạn thoái hóa khác nhau, như gây đột biến, gây ung thư, rối loạn tim mạch
và lão hóa. Chất chống oxy hóa là các hợp chất chống lại các gốc tự do bằng cách can
thiệp vào một trong ba bước chính của quá trình oxy hóa qua trung gian gốc tự do: khởi
đầu, lan truyền và chấm dứt. Những chất chống oxy hóa này cũng được sản xuất bởi hệ
thống sinh học và xuất hiện tự nhiên trong nhiều loại thực phẩm. Sự cân bằng giữa chất
oxy hóa và chất chống oxy hóa quyết định sức khỏe và tuổi thọ sinh vật.
Thử nghiệm đánh giá khả năng loại gốc tự do DPPH được sử dụng đầu tiên bởi
Marsden Blois vào năm 1958 [7]. DPPH• là một gốc tự do bền, dạng dung dịch có màu
9
.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
Luận văn Thạc sĩ dược học
Lê Thị Mai Hương
tím (đỉnh hấp thu cực đại ở 515 nm). Các chất có khả năng chống oxi hóa sẽ trung hịa
gốc DPPH• bằng cách cho hydro tạo DPPH-H làm DPPH• bị khử thành sản phẩm có
màu vàng nhạt. Mức độ hình thành màu vàng nhạt trên bản mỏng hay mức độ giảm
cường độ hấp thu khi đo quang ở bước sóng 515 nm nói lên mức độ chống oxi hóa của
chất khử.
ROO• + AH/ArOH ROOH + A•/ ArO• [22], [12]
Ưu điểm
Thời gian thử nghiệm khá nhanh chóng, đơn giản, rẻ tiền và được sử dụng rộng rãi để
sàng lọc tác dụng chống oxi hóa của các chất nghiên cứu. Thử nghiệm DPPH cịn được
dùng để khảo sát tính chất chống oxi hóa của ngũ cốc, cám, rau cải, acid linoleic liên
hợp, thảo mộc, dầu hạt ăn được và các loại bột trong các dung môi khác nhau bao gồm
ethanol, aceton trong nước, methanol, rượu cồn và benzen. [12], [22].
Hạn chế
Gốc DPPH tương tác với các gốc tự do khác làm đường cong đáp ứng thời gian để đạt
được trạng thái ổn định khơng tuyến tính với các tỷ lệ khác nhau của các chất chống
oxi hóa/DPPH.
DPPH nhạy với một số base Lewis và dung mơi.
DPPH chỉ có thể hịa tan trong dung mơi hữu cơ và cần có sự can thiệp của các tác nhân
khác.
Sự hấp thụ của DPPH trong methanol và aceton giảm dưới ánh sáng.
Thử nghiệm này khơng thích hợp để đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của huyết tương
[12], [22].
1.3. XANTHIN OXIDASE VÀ TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE
Gout (thống phong) là bệnh viêm khớp mạn tính có xu hướng phổ biến trong cộng đồng,
đặc trưng của bệnh là những đợt viêm khớp cấp, có sự lắng đọng tinh thể natri urat
trong khớp động, các mô do tăng acid uric trong máu [9].
Xanthin oxidase là enzym xúc tác phản ứng oxi hóa xanthin thành acid uric và sinh gốc
tự do anion superoxyd, do đó đóng vai trị quan trọng trong sinh lý bệnh.
Mơ hình thử nghiệm in vitro tác dụng ức chế xanthin oxidase sớm được phát triển và
trở thành công cụ đắc lực giúp tìm kiếm các sản phẩm phịng và điều trị gout hiệu quả
từ tự nhiên. Tại Việt Nam, mơ hình này cũng được quan tâm ứng dụng.
10
.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
Luận văn Thạc sĩ dược học
Lê Thị Mai Hương
Ngun tắc chung của các mơ hình thử nghiệm in vitro tác dụng ức chế enzym xanthin
oxidase dựa trên việc định lượng sơ bộ acid uric sinh ra từ phản ứng phân giải xanthin
dưới tác dụng của enzym xanthin oxidase bằng phương pháp đo quang. Sự hiện diện
của tác nhân ức chế kìm hãm phản ứng, dẫn đến giảm lượng acid uric sinh ra. Khi kết
thúc phản ứng, sản phẩm tạo thành được đo sự hấp thu ở bước sóng hấp thu cực đại của
acid uric là 290 nm. Mức độ làm giảm cường độ hấp thu tại bước sóng 290 nm nói lên
khả năng ức chế xanthin oxidase của chất thử nghiệm.[12], [25], [34].
Chương 2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Cây Cơm cháy tròn Sambucus nigra L. được thu hái vào tháng 09/2019 tại thành phố
Đà Lạt. Toàn cây được thu hái cho khảo sát thực vật học và đánh giá tác dụng chống
oxy hóa. Lá được thu hái cho nghiên cứu thành phần hóa học.
Mẫu được định danh sơ bộ là loài Sambucus nigra L. bằng cách so sánh đặc điểm mô
tả thực vật với các tài liệu tham khảo [1], [4].
Nguyên liệu sau khi thu hái, phơi khô rồi xay thành bột cho chiết xuất các chất.
2.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị
Dùng trong nghiên cứu thực vật, hóa học:
- Kính hiển vi quang học Olympus CX-21.
- Cân xác định độ ẩm MA-45 (Satorius).
- Máy cô quay chân không Buchii Rotavapor R-300 kèm bộ sinh hàn tự động
HAAKE K-20.
- Máy sấy chân khơng (Jeiotech, model OV-12).
- Bình sắc ký, cột sắc ký bằng thủy tinh.
- Khối phổ kế MS (máy LC-MS tại Viện Công nghệ hóa học Việt Nam).
- Máy đo phổ NMR AvanceNEO 400 MHz BRUKER – Thụy Sĩ, tại phòng Nghiên
11
.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
Luận văn Thạc sĩ dược học
Lê Thị Mai Hương
cứu và phát triển, Viện Kiểm nghiệm thuốc, Tp. Hồ Chí Minh.
- Máy đo quang phổ quét ELISA
- Máy đo quang phổ tử ngoại UV-Vis RA-XT Technicon (Bayer)
- Phần mềm Gen5
- Micropipet 12 kênh giới hạn thể tích 30-300 ml
2.1.3. Dung mơi, hóa chất
Dùng cho phân lập chất tinh khiết theo hướng tác dụng chống oxi hóa
Cồn 96% (Việt Nam), chloroform (Macron – Mỹ), ethyl acetat (Macron – Mỹ),
methanol (Chemsol – Trung Quốc), n-hexan (Chemsol – Trung Quốc).
- Silicagel F254 dùng trong sắc ký lớp mỏng (Merk)
- Silicagel cỡ hạt trung bình 40-63 µm dùng cho sắc ký cột (Ấn Độ)
- Methanol (Chemsol – Trung Quốc)
- DPPH (Sigma-Aldrich)
- Acid ascorbic (Sigma)
- Xanthin oxidase từ sữa bò (Sigma – Lot: #SLBZ204)
- Xanthin (Sigma – Lot: #SLBB5664V)
- Allopurinol (Sigma – Lot: #081M1112V)
- Muối kali hydrophosphat (Trung Quốc) và kali dihydrophosphat (Trung Quốc)
- Các dung môi, hóa chất và các thuốc thử thông dụng khác.
-
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Định danh dược liệu
-
-
Hình thái thực vật: Thu hái các bộ phận của mẫu, mô tả phân tính bằng mắt thường,
kính hiển vi, đối chiếu mẫu với khóa phân loại và với hình ảnh cũng như mơ tả
trong các tài liệu tham khảo để xác định tên loài. [4]
Khảo sát vi học: Vi phẫu lá, thân; đặc điểm bột dược liệu bằng các phương pháp
thường quy.
Xác định trình tự gen để dịnh danh loài: Mẫu DNA lục lạp từ lá non được chiết và
tinh khiết hóa, sau đó được giải trình tự gen tại công ty Phù Sa Biochem, thành phố
Vĩnh Long. Kết quả giải trình tự được đối chiếu với ngân hàng gene NCBI (National
Center for Biotechnology Information) dùng cho việc nhận diện loài.
12
.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
Luận văn Thạc sĩ dược học
Lê Thị Mai Hương
2.2.2. Kiểm tinh khiết
Bột dược liệu được kiểm tra độ tinh khiết với các chỉ tiêu về độ ẩm, độ tro tồn phần,
độ tro khơng tan trong acid, và hàm lượng chất chiết được.
Độ ẩm dược liệu được tiến hành bằng phương pháp “Xác định mất khối lượng do
làm khô” theo Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 9.6 (trang PL-182).
Độ tro tồn phần và tro khơng tan trong acid hydroclorid theo Dược điển Việt Nam
IV, phụ lục 9.7 và 9.8 (trang PL-182).
Tất cả các chỉ tiêu thử độ tinh khiết nói trên đều được lấy kết quả là giá trị trung bình
của 3 lần thử độc lập, có kết quả ổn định.
-
2.2.3. Đánh giá bộ phận dùng có tính chống oxi hóa mạnh nhất
Đánh giá khả năng chống oxi hóa (và hàm lượng chất chiết được trong ethanol 96%)
của dịch chiết ethanol 96% rễ, thân, lá cây Sambucus nigra được tiến hành trên sắc ký
lớp mỏng với thuốc thử DPPH. Mẫu thử được pha trong MeOH ở các nồng độ 1000;
500; 250; 125; 62,5 µg/ml. Chấm chính xác 5 µl mỗi mẫu lên bản mỏng silica F254,
triển khai và phát hiện bằng cách nhúng bản mỏng vào thuốc thử DPPH (0,2% trong
MeOH), để trong tối 5 phút và ghi nhận kết quả. Mẫu thử có khả năng ức chế DPPH
khi có các vết có vàng trên nền tím. Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử càng mạnh
khi nồng độ ức chế càng thấp và màu vàng càng rõ.
2.2.4. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật
Xác định sơ bộ thành phần hóa thực vật của dược liệu bằng phương pháp Ciulei cải tiến
bởi Đại học Y dược tp. HCM.
2.2.5. Chiết xuất và tách phân đoạn
Khảo sát dung môi chiết được thực hiện với ethanol 96%, 70%, 50% và nước. Đánh
giá hiệu suất chiết và khả năng ức chế DPPH của các cao chiết trên sắc ký lớp mỏng.
Từ kết quả khảo sát dung môi chiết, cao chiết cho nghiên cứu hóa học được chiết xuất
bằng phương ngấm kiệt trong cồn 70% theo tỷ lệ dược liệu – dung mơi là 1:10. Cao
chiết cồn tồn phần đậm đặc thu được được phân tán trong nước và tách các phân đoạn
có độ phân cực tăng dần bằng kỹ thuật chiết phân bố lỏng – lỏng với CHCl3 và EtOAc
để thu được 3 phân đoạn CHCl3 (Sc), EtOAc (Se) và nước (Sn). Phân đoạn có hoạt tính
chống oxi hóa mạnh nhất sẽ được dùng để nghiên cứu phân lập các chất.
13
.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
Luận văn Thạc sĩ dược học
Lê Thị Mai Hương
Phân đoạn EtOAc có tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất được tách thành các phân đoạn
có độ phân cực tăng dần bằng kỹ thuật chiết tách rắn – lỏng. Phân đoạn Se được thêm
một lượng dung môi thích hợp và trộn với silicagel hạt thơ, dung mơi được loại dưới
áp suất giảm đến dạng bột khô và được chiết hồi lưu lần lượt với các dung môi có độ
phân cực tăng dần để thu các phân đoạn đơn giản hơn cho thử tác dụng sinh học và
phân lập.
Các phân đoạn có tiềm năng về hoạt tính chống oxi hóa và phân lập các chất được tiếp
tục phân tách bằng các kỹ thuật sắc ký cột trên silicagel.
Quy trình chiết xuất và phân lập các chất được dự kiến như ở Hình 2.1.
Bột dược liệu
Ngấm kiệt, cồn 70%
Cao cồn
Lắc phân bố lỏng – lỏng
Cao nước
Cao EtOAc
Cao CF
Thử tác dụng chống oxy hóa
Cao có hoạt tính
Sắc ký cột
Phân đoạn 1, 2, 3, ....
Thử tác dụng chống oxy hóa
PĐ có hoạt tính
Sắc ký, kết tinh phân đoạn
Chất tinh khiết
Thử tác dụng chống oxy hóa
Chất tinh khiết có hoạt tính
Hình 2.1: Quy trình chiết xuất và phân lập dự kiến
14
.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
Luận văn Thạc sĩ dược học
Lê Thị Mai Hương
2.2.6. Phân lập và tinh chế
Phương pháp sắc ký
Sắc ký cột được sử dụng để tách các cao phân đoạn thành các phân đoạn đơn giản hơn
và phân lập các chất tinh khiết từ các phân đoạn. Điều kiện sắc ký được mô tả trong
từng phần thực nghiệm.
Phương pháp kết tinh phân đoạn, kết tinh lại
Dung môi dùng cho kết tinh phân đoạn, kết tinh lại để tinh chế các chất có thể là một
dung mơi hay hỗn hợp dung môi, dung môi được lựa chon tùy thuộc vào các phân đoạn
cụ thể. Các tinh thể thu được được lọc bằng phễu thủy tinh xốp, rửa bằng dung mơi
thích hợp, sấy chân khơng và cân khối lượng tinh thể thu được.
Kiểm tra độ tinh khiết
Các chất tinh khiết được kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng với
ba hệ dung môi và các cách phát hiện khác nhau (đèn UV 254, 365 nm, thuốc thử Vanillin
– acid sulfuric, ...). Quan sát sắc ký đồ. Chất được cho là tinh khiết sơ bộ khi trên các
sắc ký đồ chỉ hiện một vết gọn với Rf trong khoảng 0.25-0.75.
2.2.7. Xác định cấu trúc chất phân lập được
Các chất phân lập được xác định cấu trúc dựa trên các dữ liệu phổ MS và NMR, kết
hợp với các dữ liệu trong tài liệu tham khảo. Trong đó:
+ Phổ MS được đo bằng kỹ thuật ESI.
+ Phổ NMR được đo với các kỹ thuật 1-D, 2-D (1H-, 13C-, HSQC, HMBC, COSY).
Mẫu được hịa tan trong dung mơi thích hợp như CDCI3, MeOD, DMSO với chất
chuẩn nội là TMS (tetramethylsilan); thực hiện trên máy NMR BRUKERAscendTM400, tại phòng Nghiên cứu và phát triển, Viện Kiểm nghiệm thuốc, Tp. Hồ
Chí Minh. Độ dời hóa học tính theo thang δ(ppm) với δTMS = 0,00.
2.2.8. Sàng lọc sinh học
Thử nghiệm khả năng dập tắt gốc tự do DPPH in vitro
Thử nghiệm được thực hiện theo mô tả của Kulisic et al. (2004) [23], được cải tiến bởi
Obeid (2005) và Moein (2007) [27], [28].
15
.
