Khảo sát tác động của cao chiết từ nụ hoa thanh long trên chuột swiss albino bị chiếu tia uvb

.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH
-----------------

BỘ Y TẾ

Vũ Thu Hiền

KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA CAO CHIẾT TỪ NỤ HOA
THANH LONG TRÊN CHUỘT Swiss albino BỊ CHIẾU TIA UVB

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2019

.


.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH
-----------------

Vũ Thu Hiền

KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA CAO CHIẾT TỪ NỤ HOA
THANH LONG TRÊN CHUỘT Swiss albino BỊ CHIẾU TIA UVB

Ngành: Dược lý và Dược lâm sàng
Mã số: 8720205

Luận văn Thạc sĩ Dược học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. ĐỖ THỊ HỒNG TƯƠI

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2019

.


.

LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả trong luận
văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác

Vũ Thu Hiền

.


.

Tóm tắt
KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA CAO CHIẾT TỪ NỤ HOA THANH LONG

TRÊN CHUỘT Swiss albino BỊ CHIẾU TIA UVB
Giới thiệu: Hoa Thanh long là nguồn phế phẩm dồi dào chưa được tận dụng hiệu quả
ở Việt Nam. Theo nhiều tài liệu nghiên cứu, flavonoid trong hoa có tác dụng chống
oxy hóa và ức chế tyrosinase. Đó là lý do đề tài khảo sát tác động của cao chiết từ nụ
hoa Thanh long trên chuột nhắt trắng bị chiếu tia UVB, từ đó cung cấp cơ sở cho tính
an tồn và tác dụng dược lý của hoa Thanh long.
Phương pháp nghiên cứu: 16 cao toàn phần được chiết với 2 dung môi là cồn 96%,
cồn 70% bằng phương pháp ngấm kiệt. Khảo sát tác dụng ức chế tyrosinase in vitro
để xác định IC50 và chọn ra cao tiềm năng. Độc tính cấp và LD0 của cao tiềm năng
được khảo sát bằng phương pháp Behrens. Khảo sát tác động của cao chiết ở liều 100
mg/kg, 200 mg/kg, 300 mg/kg trên chuột nhắt trắng bị chiếu tia UVB thông qua các
chỉ số độ dày da lưng, da tai, khối lượng da, nồng độ MDA, GSH, collagen và tổn
thương đại thể - vi thể ở da.
Kết quả: Dựa trên kết quả sàng lọc in vitro và đặc điểm phát triển, chăm sóc của hoa,
chọn nụ hoa Thanh long ruột trắng 8-18 ngày tuổi để chiết ngấm kiệt với cồn 70% là
cao chiết tiềm năng. LD0 của cao là 125 g cao/kg. Chuột được tiếp xúc với tia UVB
bị tăng khối lượng da, giảm nồng độ GSH có ý nghĩa thống kê so với lô sinh lý. Tác
động của cao hoa Thanh long ở các liều khác nhau không thể hiện sự khác biệt có ý
nghĩa thống kê so với lơ chiếu UVB.
Kết luận: Cao cồn 70% của hoa Thanh long trắng từ 8-18 ngày tuổi có hoạt tính ức
chế tyrosinase tốt nhất, có độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt với giá trị LD0 là
125 g cao/kg. Chuột được chiếu UVB chưa thể hiện rõ tổn thương so với lô sinh lý
nên chưa đánh giá được tác động của cao hoa Thanh long trên chuột nhắt bị chiếu tia
UVB.
Từ khóa: hoa Thanh long, độc tính cấp, ức chế tyrosinase, chống oxy hóa, bảo vệ da,
tia UVB.

.

.

Abstract
THE EFFECT OF PITAYA BUDS ON UVB-MEDIATED SKIN DAMAGE IN
SWISS ALBINO MICE
Introduction: Although Pitaya flower is a giant source of waste in Viet Nam, it has
not been yet exploited. Flavonoids of this flower have been reported as antioxidants
and tyrosinase inhibitors The aim of this study is to evaluate the effect of Pitaya
flower extract on mice skin damage due to UVB.
Method: Pitaya flowers of red and white flesh kinds from 4 growing stages were
immersed with alcohol solvent 96% and 70%. The tyrosinase inhibitory activity was
carried out to choose the potential extract. The acute toxicity was evaluated and LD0
was determined by Behrens method. Mice were administrated orally the potential
extract at doses of 100 mg/kg, 200 mg/kg, 300 mg/kg then investigated UVB-induced
skin damage through skin adema, MDA, GSH, collagen test; macro and micro skin
injuries.
Results: Based on the screening result and characteristics of flowers, extracts from
5-18 day-old flowers of the white one with ethanol 70% were chosen as potential
ones. For the oral acute toxicity on mice, LD0 was 125 g/kg. The UVB alone group
was observed to have increasing skin weight, and declining GSH concentration with
statistically significant differences compared to the control one. The effect treatment
groups has no statistically significant differences compared with the UVB alone
group.
Conclusion: The extract from 5-18 day-old flowers of the white one with ethanol
70% was the best tyrosinase inhibitor, and had the oral acute toxicity with the LD0
valued at 125 g/kg. There had no significant skin damage between the UVB alone
and the control group. Therefore, the impact of Pitaya extracts could not be evaluated.
Key words: Pitaya, acute toxicity,tyrosinase inhibitor, antioxidant, skin protection,
UVB

.


.

MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.................................................................................. iv
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... vi
CHƯƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................... 1
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3
2.1. TỔNG QUAN VỀ THANH LONG .............................................................. 3
2.1.1. Vị trí phân loại thực vật ............................................................................3
2.1.2.Đặc điểm thực vật ...................................................................................... 3
2.1.3.Đặc điểm phát triển và chăm sóc của hoa Thanh long .............................. 3
2.1.4.Thành phần hóa học của hoa ......................................................................4
2.1.5.Tác dụng dược lý của hoa Thanh long ....................................................... 5
2.1.6.Công dụng của hoa .....................................................................................6
2.2. TỔNG QUAN VỀ DA ..................................................................................7
2.2.1.Cấu tạo .......................................................................................................7
2.2.2.Chức năng sinh lý....................................................................................... 8
2.2.3.Tác động của bức xạ UV lên da .................................................................9
2.2.4.Các tình trạng tăng sắc tố da ....................................................................10
2.3. TỔNG QUAN VỀ TYROSINASE ............................................................. 11
2.3.1.Đặc điểm ..................................................................................................12
2.3.2.Vai trò của tyrosinase ...............................................................................12
2.3.3.Các chất ức chế tyrosinase .......................................................................13
2.3.4.Khảo sát hoạt tính ức chế tyrosinase in vitro theo phương pháp
DOPAchrom ......................................................................................................15

i
.


.

2.4. CÁC THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TYROSINASE IN VITRO
VÀ THỬ NGHIỆM GÂY TỔN THƯƠNG DA IN VIVO BẰNG TIA UVB ....15
2.4.1.Thử nghiệm hoạt tính ức chế tyrosinase in vitro .....................................15
2.4.2.Thử nghiệm gây tổn thương da in vivo bằng tia UVB ............................ 17
2.4.3.Các thử nghiệm đánh giá tác động bảo vệ trên chuột nhắt gây tổn thương
da cấp bằng tia UVB ......................................................................................... 18
CHƯƠNG 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 21
3.1. NGUYÊN VẬT LIỆU .................................................................................21
3.1.1.Mẫu thử ....................................................................................................21
3.1.2.Động vật thử nghiệm ................................................................................22
3.1.3.Hóa chất và thuốc thử ..............................................................................22
3.1.4.Dụng cụ và thiết bị ...................................................................................23
3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 24
3.2.1.Chiết xuất dược liệu .................................................................................24
3.2.2.Xác định hiệu suất chiết ...........................................................................25
3.2.3.Khảo sát tính chất của cao tồn phần tiềm năng ......................................25
3.2.4.Khảo sát hoạt tính ức chế tyrosinase in vitro theo phương pháp
DOPAchrom ......................................................................................................27
3.2.5.Khảo sát độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt của cao tiềm năng ...28
3.2.6.Khảo sát tác động bảo vệ da trên chuột nhắt gây tổn thương da cấp bằng
tia UVB . ……………………………………………………………………...29
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ ........................................................................................... 35
4.1. SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TYROSINASE CỦA CÁC CAO CHIẾT
TỪ HOA THANH LONG .................................................................................... 35

4.2. CHIẾT XUẤT CAO TIỀM NĂNG ............................................................... 39

ii
.


.

i

4.3. TÍNH CHẤT CAO TIỀM NĂNG .................................................................40
4.3.1. Thử độ tinh khiết ..................................................................................... 40
4.3.2. Định tính và định lượng flavonoid tồn phần .........................................40
4.3.3. Định tính và định lượng polyphenol tồn phần ......................................42
4.4.4. Hoạt tính ức chế tyrosinase của cao tiềm năng .......................................43
4.4. ĐỘC TÍNH CẤP ĐƯỜNG UỐNG TRÊN CHUỘT NHẮT CỦA CAO TIỀM
NĂNG ...................................................................................................................44
4.5. Tác động BẢO VỆ DA của cao hoa Thanh long TRÊN CHUỘT NHẮT ....45
4.5.1. Tác động lên tình trạng phù da do viêm .................................................45
4.5.2. Tác động chống oxy hóa in vivo của cao hoa Thanh long...................... 46
4.5.3. Tác động lên hàm lượng collagen trong da .............................................50
CHƯƠNG 5. BÀN LUẬN ........................................................................................ 53
CHƯƠNG 6. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 57

iii
.


.

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Tiếng Anh

DĐVN

Tiếng Việt
Dược điển Việt Nam
Cực tím

UV

Ultraviolet

DHI

5,6-Dihydroxyindole

DHICA

5,6-dihydroxyindole-2carboxylic acid

GSH

Glutathione

GSSG

Glutathione disulfide

DTNB

5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoic
acid)

MDA

Malondialdehyd

TBA

Thiobarbituric acid

MMP

Matrix metalloproteinase

HE

Hemotoxin - Eosin

BSA

Bovine Serum Albumins

NW

Nucos White

TBARS

Thiobarbituric acid reactive

Các chất phản ứng axit

substances

thiobarbituric

CAT

Catalase

GPx

Glutathione peroxidase

SOD

Superoxide dismutase

iv
.

Albumin huyết thanh bò


.

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Một số phương pháp gây tổn thương da bằng tia UVB............................ 17
Bảng 2.2. Kí hiệu các cao tồn phần thử nghiệm...................................................... 21
Bảng 3.3. Danh mục hóa chất và thuốc thử .............................................................. 22
Bảng 3.4. Danh mục thiết bị...................................................................................... 23
Bảng 3.5. Bảng bố trí tiến hành thí nghiệm .............................................................. 28
Bảng 4.6. Hoạt tính ức chế tyrosinase của 16 cao thử ở nồng độ 1000 µg/ml .........35
Bảng 4.7. Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế tyrosinase in vitro của acid kojic ........36
Bảng 4.8. IC50 của 16 cao hoa Thanh long được khảo sát ........................................38
Bảng 4.9. Độ ẩm cao toàn phần tiềm năng ............................................................... 40
Bảng 4.10. Độ tro toàn phần cao tiềm năng .............................................................. 40
Bảng 4.11. Hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao hoa Thanh long ...................41
Bảng 4.12. Hàm lượng polyphenol của cao tiềm năng tính theo pyrogallol ...........43
Bảng 4.13. Kết quả hoạt tính ức chế tyrosinase của cao tiềm năng .......................... 43
Bảng 4.14. Theo dõi chuột thí nghiệm thử độc tính cấp cao tiềm năng ...................45
Bảng 4.15. Kết quả các chỉ số đánh giá mức độ sưng phù .......................................45
Bảng 4.16. Hàm lượng MDA da chuột ở các lô thử nghiệm ....................................48
Bảng 4.17. Hàm lượng GSH da chuột ở các lô thử nghiệm .....................................49
Bảng 4.18. Hàm lượng hydroxyprolin da chuột ở các lô thử nghiệm....................... 50
Bảng 4.19. Kết quả phân tích vi thể da chuột ở các lơ thử nghiệm ......................... 52

v
.


i.

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.2.1. Hình thái cây Thanh Long .......................................................................3
Hình 2.2.2. Các flavonoid từ hoa Thanh long và cấu trúc của undatusid A, B, C ......5

Hình 2.2.3. Cấu tạo da .................................................................................................7
Hình 2.2.4. Sự trao đổi chéo melanin giưa tế bào sừng và tế bào sắc tố ....................9
Hình 2.2.5. Phản ứng có xúc tác của tyrosinase ....................................................... 12
Hình 2.2.6. Con đường tổng hợp melanin .................................................................13
Hình 2.2.7. Sơ đồ thể hiện nguyên tắc ức chế tyrosinase in vitro theo phương pháp
DOPAchrom ..............................................................................................................15
Hình 2.2.8. Phản ứng của GSH và DTNB ................................................................ 19
Hình 2.2.9. Phản ứng MDA và TBA ........................................................................20
Hình 3.2.10. Bố trí thí nghiệm chiếu UVB trên chuột ..............................................30
Hình 4.4.11. Hoạt tính ức chế tyrosinase của acid kojic ...........................................37
Hình 4.4.12. Đồ thị biểu diễn toạt tính ức chế tyrosinase theo nồng độ cao thử ......38
Hình 4.4.13. Cao cồn 70% từ hoa Thanh long ruột trắng .........................................39
Hình 4.4.14. Đồ thị thể hiện mối liên quan giữa nồng độ quercetin và OD415nm ......41
Hình 4.4.15. Tương quan giữa nồng độ pyrogallol chuẩn và OD760......................... 42
Hình 4.4.16. Đồ thị thể hiện mối liên quan giữa nồng độ cao thử và OD410nm .........44
Hình 4.4.17. Tương quan giữa nồng độ protein và OD590 ........................................47
Hình 4.4.18. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ MDA chuẩn và OD532nm .48
Hình 4.4.19. Tương quan giữa nồng độ GSH và OD412............................................49
Hình 4.4.20. Đồ thị thể hiện mối liên quan giữa nồng độ hydroxyprolin và OD560nm ...50
Hình 4.4.21. Hình ảnh vi thể bất thường của da ....................................................... 51

vi
.


.

CHƯƠNG 1.ĐẶT VẤN ĐỀ
Ánh sáng mặt trời đóng vai trị quan trọng trong cuộc sống của con người. Nghiên
cứu cho thấy với thời gian tiếp xúc vừa phải với ánh nắng mặt trời kích thích tế bào

hoạt động, giúp bảo vệ thân nhiệt và hình thành lớp cấu trúc mang đến độ ẩm bảo vệ
da. Ánh nắng mặt trời giúp tổng hợp vitamin D, giúp phát triển xương, giúp giảm một
số chứng bệnh trầm cảm do thời tiết. Tuy nhiên, khi tiếp xúc quá lâu, ánh nắng mặt
trời thúc đẩy q trình lão hố da, có thể gây thương tổn trên da như bỏng nắng, viêm
da do ánh nắng, phát ban nhẹ, mụn và các bệnh lý về da khác như rối loạn sắc tố da,
đốm nâu, nám, tàn nhang, đồi mồi, suy giảm miễn dịch, ung thư da.
Tác hại của ánh nắng mặt trời chủ yếu đến từ tia UV. UVB kích thích q trình rám
màu da và gây bỏng nắng, UVA xâm nhập sâu vào bên trong da, thúc đẩy q trình
lão hố, phân hủy collagen và elastin, gây tình trạng da khơng dung nạp ánh nắng,
thường biểu hiện dưới dạng kích ứng với ánh nắng và rối loạn sắc tố da. Bức xạ từ tia
UVB và UVA cịn có thể gây biến đổi tế bào, gây tổn thương ADN của tế bào thông
qua trung gian các gốc tự do. Vì vậy, các sản phẩm có tác động chống oxy hóa, đặc
biệt có nguồn gốc dược liệu được sử dụng rộng rãi.
Hắc sắc tố melanin hình thành trong hạt sắc tố melanosom được xúc tác tổng hợp bởi
tyrosinase, có vai trị bảo vệ da chống lại tác hại của ánh nắng mặt trời. Tuy nhiên,
nếu melanin tăng một cách quá mức dẫn đến rối loạn sắc tố da. Vì vậy, việc nghiên
cứu các hoạt chất có tác động ức chế tyrosinase đang được quan tâm, đặc biệt là các
chất có nguồn gốc tự nhiên với ưu điểm an toàn khi sử dụng lâu dài.
Cây Thanh long (Hylocereus undatus), họ Cactaceae, là loại cây ăn quả có giá trị
dinh dưỡng cao do quả chứa nhiều chất xơ, pectin, vitamin và khống chất cần thiết
cho cơ thể, cung cấp ít năng lượng, có tác dụng giải nhiệt, nhuận tràng [1]. Việt Nam
là nước trồng Thanh long nhiều nhất ở Đông Nam Á. Theo thống kê của Bộ Nơng
nghiệp, tồn quốc có 32 tỉnh thành trồng Thanh long. Trong đó, "thủ phủ" của trái
Thanh long ở Bình Thuận với 22000 ha trồng Thanh long chiếm 70% tổng diện tích
trồng Thanh long cả nước, cung cấp gần 500.000 tấn ra thị trường mỗi năm.

1
.

.

Thanh long có năng suất cao, một gốc có nhiều cành, mỗi cành cho nhiều hoa. Hoa
Thanh long sau khi nở vài ngày, phần hoa sẽ được loại bỏ để cây tập trung nuôi trái
và làm cho trái to, đẹp. Ngoài ra, ở mỗi cành, người trồng thường chỉ giữ 1-2 hoa để
thụ phấn, những búp hoa còn lại thường được bỏ đi. Thông thường, đa số phần hoa
bỏ đi được để ngay tại vườn tự phân hủy. Khi hoa chưa được phân hủy hồn tồn có
thể sẽ tạo mùi khó chịu, ảnh hưởng đến mơi trường khơng khí xung quanh.
Trong khi đó, theo một số tài liệu báo cáo, bên cạnh búp hoa Thanh long tươi có thể
dùng làm rau ăn, hoa Thanh Long khô đã được sử dụng trong y học dân gian. Ở Trung
Quốc, Đài Loan, hoa Thanh long khô được tiêu thụ dưới dạng thuốc đông y. Hoa
được dùng trong trị viêm phế quản, viêm hạch bạch huyết thể lao, lao phổi, say rượu
[1]. Ngoài ra, flavonoid trong hoa được báo cáo có tác dụng chống oxy hóa và ức chế
tyrosinase, có ý nghĩa lớn trong y dược học và mỹ phẩm [35], [38], [52]. Tuy nhiên,
ở nước ta, tác dụng sinh học của hoa Thanh long chưa được quan tâm nghiên cứu,
đặc biệt về khả năng tận dụng phần hoa bỏ đi để ứng dụng trong công nghiệp thực
phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm.
Từ những lý do trên, đề tài thực hiện “Khảo sát tác động của cao chiết từ nụ hoa
thanh long trên chuột Swiss albino bị chiếu tia UVB” nhằm tận thu nguồn phế
phẩm bao hoa Thanh Long để tạo ra những sản phẩm phục vụ cho cơng tác chăm sóc
sức khỏe cho người dân, nâng cao đời sống kinh tế của người dân trồng Thang long
tại Bình Thuận, phát triển xã hội. Đề tài được thực hiện với các mục tiêu cụ thể như
sau:
 Sàng lọc hoạt tính ức chế tyrosinase in vitro của các cao thử để tìm ra cao tiềm
năng dùng cho các thử nghiệm dược lý.
 Khảo sát độc tính cấp đường uống và tác động của cao chiết hoa Thanh long trên
chuột nhắt bị chiếu tia UVB.

2
.

.

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.

TỔNG QUAN VỀ THANH LONG

Tên Việt Nam: Thanh long, cây Mắt rồng
Tên khoa học: Hylocereus undatus (Haw.) Britt & Rose
Tên nước ngoài: Pitaya (Mexico), dragon fruit (Anh), liang tian chi (Trung Quốc) [1]

2.1.1. Vị trí phân loại thực vật
Theo Takhtajan (2009), vị trí phân loại thực vật của Thanh long như sau [30]:
Ngành: Spermatophyta
Lớp: Dicotyledonae
Bộ: Caryophyllales
Họ: Cataceae
Chi: Hylocereus
Loài: Hylocereus undatus

2.1.2. Đặc điểm thực vật
Thanh long có thân bị với 3 cánh dẹt, màu xanh lục nhạt, nhiều lá đài. Hoa đường
kính 30 cm, trắng hay vàng nhạt. Lá đài và cánh hoa nhiều, dính nhau thành ống, nhị
nhiều, bầu dưới. Nhiều tiểu nhụy, bầu hạ cho quả thịt với lớp vỏ ngoài đỏ tươi với phiến
hoa còn lại. Qủa dài 18 - 20 cm, đường kính 12 - 15 cm. Sau lớp vỏ hơi dầy màu đỏ là
phần thịt màu trắng hoặc đỏ với nhiều hạt màu đen nhỏ, ăn mát và ngọt. Sinh thái: Cây
trồng cho leo lên các giá tựa, làm tường [1].

Hình 2.2.1. Hình thái cây Thanh Long

2.1.3. Đặc điểm phát triển và chăm sóc của hoa Thanh long
Thanh long thường được kích thích ra hoa bằng cách sử dụng đèn thắp sáng 4 giờ liên
tục trong 10 - 15 đêm để cảm ứng ra hoa. Sau khi ngưng thắp đèn 4 - 7 ngày, nụ hoa
3
.


.

sẽ xuất hiện. Thời gian từ khi chớm nụ hoa đến khi hoa nở khoảng 18 - 20 ngày, cần
2-3 ngày để nở và thụ quả. Khoảng thời gian này dài ngắn tùy vào điều kiện khí hậu
nơi trồng. Sau khi hoa nhú 5 - 7 ngày, tiến hành tỉa bỏ các hoa dị dạng, bị sâu bệnh
và tỉa bớt trên những cành có quá nhiều hoa, để lại những hoa phát triển tốt, mọc cách
xa nhau. Đối với trái, sau khi hoa nở 3 - 5 ngày, cần tỉa bỏ nhụy đã héo rũ ở đỉnh.
Hoa nở từng đợt liên tục, kế tiếp nhau. Hoa Thanh long mọc đơn hay chùm 2 - 3 cái
trên 1 đoạn cành. Để Thanh long có năng suất cao, thường người trồng sẽ theo dõi
tình hình hoa nở và ngắt bớt hoa, để phù hợp tính ưa ánh sáng trực tiếp, đảm bảo ít
cạnh tranh dinh dưỡng ánh sáng [4]

2.1.4. Thành phần hóa học của hoa
Hoa Thanh long có 3 glycosid là undatusid A, B, C [50], acid gallic là phenolic chính
[35], và 13 loại flavonoid gồm kaempferol, quercetin, isorhamnetin, kaempferol 3-Oalpha-L-arabinfuranosid, kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosid, quercetin 3-O-β-Dglucopyranosid,

isorhamnetin

galactopyranosid,

quercetin

3-O-β-D-glucopyranosid,

kaempferol

3-O-β-D-

3-O-β-D-galactopyranosid,

kaempferol

3-O-β-D-

rutinosid, isorhamnetin 3-O-β-D-rutinosid, kaempferol 3-O-alpha-L-rhamopyranosyl(1->6)-β-D-galactopyranosid, isorhamnetin 3-O-alpha-L-rhamopyranosyl-(1-> 6)-βD-galactopyranosid [53]. Rutin, quercetin, kaempferol và isorhamnetin là hợp chất
flavonoid chính của hoa Thanh long. Flavonoid có nhiều hoạt tính sinh học, ức chế
sự tăng sinh tế bào, kích hoạt apoptosis, ức chế enzym, kháng khuẩn và chống oxy
hóa. Acid gallic, rutin, quercetin, kaempferol và isorhamnetin chiếm tỉ lệ 48,55%,
20,12%, 2,77%, 5,39% và 5,41% tương ứng trong sắc tố. Đây cũng là những hợp chất
chính đóng vai trị trong tác dụng chống oxy hóa của hoa [35]

4
.


.

Hình 2.2.2. Các flavonoid từ hoa Thanh long và cấu trúc của undatusid A, B,
C[50], [53]

2.1.5. Tác dụng dược lý của hoa Thanh long

 Tác dụng điều hòa lipid
Hoa Thanh long làm giảm lượng cholesterol toàn phần trong huyết thanh chuột [33]
 Ức chế tyrosinase

5
.


.

Các cao chiết từ cánh hoa, lá và nhụy hoa thể hiện tác dụng ức chế tyrosinase, trong
đó cao chiết từ đài hoa thể hiện tác dụng ức chế cao nhất [55].
 Chống oxy hóa
Hoa Thanh long có tác dụng chống oxy hóa, chủ yếu do flavonoid tồn phần, trong
đó kaempferol là thành phần hoạt tính sinh học chính. Tác dụng chống oxy hóa được
thể hiện qua tạo phức với kim loại và trung hịa các gốc tự do thơng qua cung cấp
hydrogen nguyên tử (H •) và electron (e) [32].
 Làm lành vết thương
Trong y học cổ truyền, Thanh long được sử dụng để điều trị vết thương [12]. Nghiên
cứu của Perez và cộng sự (2005) báo cáo kem bôi từ dịch chiết hoa và lá của Thanh
long tăng làm lành vết thương trên chuột đái tháo đường, làm tăng hàm lượng và
ADN của mô hạt, giúp vết thương có độ đàn hồi tốt, tăng tổng hợp collagen, hỗ trợ
liên kết ngang của protein [37].
 Kháng khuẩn:
Cao chiết ethyl acetat của hoa Thanh long cho tác dụng chống oxy hóa tốt nhất và
cho hiệu quả kháng Salmonella typhi với nồng độ ức chế tối thiểu 12,5 mg/ml [54].
 Giảm ho, long đờm, ngừa hen suyễn
Cao chiết hoa Thanh long làm giảm tỷ lệ ho ở chuột gây ra bởi amoniac. Cao chiết
nước và cồn của hoa Thanh long có thể làm tăng bài tiết phenolsulfonphthalein trong
đường hô hấp của chuột, làm loãng đờm bằng cách tăng lượng chất nhầy do khí quản

tiết ra. Hai cao chiết này làm giảm co thắt cơ trơn khí quản và giãn cơ trơn khí quản
ở chuột gây hen bằng acid citric [42]

2.1.6. Cơng dụng của hoa
Hoa Thanh long được dùng trị viêm phế quản, viêm hạch bạch huyết thể lao, lao phổi,
say rượu. Liều dùng 15 - 30 g, dạng thuốc sắc.
Đơn thuốc: Chữa viêm phế quản, lao và viêm hạch bạch huyết não gồm hoa Thanh
long 30 g nấu canh với thịt lợn để ăn [1].

6
.


.

2.2.

TỔNG QUAN VỀ DA

2.2.1. Cấu tạo
Da là cơ quan lớn nhất, chiếm 16% khối lượng của cơ thể, hoạt động như lớp ngăn
cách, bảo vệ cơ thể khỏi điều kiện khắc nghiệt của mơi trường bên ngồi [2], [3].
Cấu trúc của da được chia thành 3 lớp: thượng bì, trung bì và hạ bì.

Hình 2.2.3. Cấu tạo da
- Lớp thượng bì (epidermis): Lớp ngồi cùng và đóng vai trị là điểm tiếp xúc cơ thể
với mơi trường, có 4 lớp: lớp đáy, lớp gai, lớp hạt, lớp sừng (từ dưới lên).
 Lớp đáy (basal cells) gồm một lớp tế bào hình trụ nằm sát ngay trên màng đáy.
Nguyên sinh chất ưa kiềm chứa những hạt melanin. Rải rác xen giữa những tế bào cơ
bản có những tế bào sáng, tế bào có tua. Đó là tế bào sắc tố (melanocyte), tế bào này

sản xuất ra sắc tố. Tế bào sắc tố có nhiều nhất ở mặt và những vùng tiếp xúc với ánh
sáng. Lớp đáy sản xuất ra tế bào mới thay thế tế bào cũ đã biệt hóa, tạo nên sự đổi
mới của biểu bì
 Lớp gai (Prickle cells) gồm 5-12 lớp tế bào hình đa diện. Các tế bào gai nằm sát
nhau, nối với nhau bằng cầu nối gian bào, làm cho thượng bì vững chắc, làm da khơng
bị ngấm nước từ mơi trường bên ngồi vào cơ thể, khơng bị thốt nước từ cơ thể ra
ngồi.

7
.


.

 Lớp tế bào hạt (Granular cell) gồm bốn hàng tế bào dẹt hơn tế bào gai. Nhân tế bào
sáng hơn và có hiện tượng hư biến. Nguyên sinh chất có nhiều hạt keratohyalin do
mỡ và sợi keratin tạo thành.
 Lớp sừng (Horny cells) là lớp ngoài cùng của thượng bì, bản chất là các mơ chết
đã bị sừng hóa, dày mỏng tùy theo từng vùng trên cơ thể và tế bào trên cùng dễ bị
bong ra ngoài.
 Ngoài ra, lớp biểu bì cịn có tế bào Langerhans và tế bào Merkel.
- Trung bì: Trung bì và thượng bì ngăn cách nhau bởi màng đáy. Các dịch từ trung bì
ngấm qua màng đáy để ni dưỡng thượng bì. Trung bì chứa các phần phụ của da
như tuyến mồ hôi, tuyến nang lông, hệ thống tĩnh mạch, mạch hạch bạch huyết và
các vi thần kinh.
- Hạ bì: Nằm giữa trung bì và cân cơ hoặc màng xương, là tổ chức đệm biệt hóa thành
tổ chức mỡ, có nhiều ơ ngăn cách bởi những vách, nối liền với trung bì trong đó có
những mạch máu, thần kinh phân nhánh lên phía trên.
Ngồi ra, da cịn có các phần phụ: các tuyến mồ hôi, các tuyến bã, nang lông.

Chức năng sinh lý
Che chở: da người là một hàng rào bảo vệ, che chắn các cơ quan khỏi bị tấn công của
các yếu tố có hại về sinh học, hóa học và lý học.
Điều hòa nhiệt độ: da điều hòa nhiệt độ, giữ cho thân nhiệt ở mức hằng định nhờ hai
cơ chế: ra mồ hôi và phản ứng vận mạch.
Bài tiết: gồm chức năng bài tiết mồ hôi và bài tiết chất bã.
Chuyển hóa: Dưới tác dụng của tia cực tím, cholesterol dưới da được chuyển hóa
thành vitamin D cần thiết cho hấp thu calci ở xương. Da tham gia q trình chuyển
hóa đạm, đường, mỡ,…
Chuyên biệt tạo keratin và melanin: Là hai chức năng đặc biệt của tế bào thượng bì.
Chất sừng, sắc tố giúp bảo đảm tính tồn vẹn, lành mạnh của da, chống lại các tác
động có hại của sinh học, cơ học, vật lý và hóa học. Số lượng và loại melanin thượng
bì là yếu tố chính quyết định sự phức tạp của da và độ nhạy tia cực tím. Melanin tồn
tại ở hai dạng hóa học chính: eumelanin và pheomelanin. Eumelanin hiệu quả hơn
8
.


.

trong việc ngăn chặn các photon UV so với pheomelanin [48], do đó càng nhiều
eumelanin trong da, thì càng ít thấm UV vào lớp thượng bì. Nồng độ pheomelanin
tương tự nhau giữa người da sẫm màu và da sáng vì thế eumelanin thượng bì quyết
định sự phức tạp của da, độ nhạy tia cực tím và nguy cơ ung thư. Pheomelanin có thể
thúc đẩy tổn thương ADN oxy hóa và melanomagenesis bằng cách tạo các gốc tự do
trong tế bào sắc tố cả khi khơng có UV [18], [36].
Thụ cảm: cảm giác sờ mó, đụng chạm, tỳ đè, nóng lạnh được tiếp nhận nhờ các thụ
thể. Cảm giác đau do tận cùng các dây thần kinh đảm nhận.
Miễn dịch: Da có nhiều tế bào tham gia miễn dịch như Langerhans, lympho T.

2.2.2. Tác động của bức xạ UV lên da
Tăng sắc tố da
Melanin là bảo vệ da khỏi tác hại của tia UV, đặc biệt là tia UVB bằng cách hấp thụ
và tán xạ ánh sáng mặt trời, loại bỏ các gốc oxy hóa tự do. Cơ chế liên quan đến việc
trao đổi chéo giữa các tế bào sừng và tế bào sắc, dẫn đến chuyển melanosom chứa
melanin vào các tế bào sừng nằm ở bề mặt nhiều hơn, các sắc tố này thành màng che
chắn cho nhân tế bào khỏi tiếp xúc với ánh nắng mặt trời [22]. Bên cạnh yếu tố di
truyền, rối loạn chuyển hoá, nội tiết,… tiếp xúc liên tục với tia UV là yếu tố làm tăng
sắc tố da: tàn nhang, nám má, bớt sắc tố… gây ảnh hưởng đến thẩm mỹ.

Hình 2.2.4. Sự trao đổi chéo melanin giưa tế bào sừng và tế bào sắc tố
Cảm ứng viêm
Tia UV gây ra nhiều ảnh hưởng lên hoạt đông sinh lý của da, gây ra những biến đổi
cấp tính hoặc mạn tính Một trong những tác động cấp tính rõ ràng nhất của tia cực

9
.


.

tím đối với da là cảm ứng viêm. UVB tạo ra một loạt các cytokine gây ra phản ứng
viêm và gây ra tình trạng cháy nắng. Nếu liều UV vượt quá ngưỡng, tế bào sừng sẽ
bị chết theo chương trình. UV cũng dẫn đến sự gia tăng độ dày biểu bì, được gọi là
chứng tăng sừng. Bằng cách gây tổn thương tế bào, UV kích hoạt con đường phá hủy
trong tế bào sừng. Các tín hiệu tổn thương bao gồm kích hoạt p53 làm thay đổi sâu
sắc sinh lý tế bào sừng, kích hoạt sửa chữa DNA và thậm chí là gây ra apoptosis. Tuy
nhiên, một vài giờ sau khi tiếp xúc với tia cực tím và các tín hiệu phản ứng phá hủy
giảm đi, tế bào sừng tăng sinh mạnh mẽ làm tăng độ dày biểu bì. Tăng sản biểu bì
bảo vệ da tốt hơn chống lại sự xâm nhập của tia cực tím [21].

Tổn thương do stress oxy hóa
Tia UV tạo ra các gốc oxy hóa tự do. Các photon UV tương tác với oxy nguyên tử để
thúc đẩy sự hình thành các dẫn xuất gốc tự do như superoxide, hydro peroxide và gốc
hydroxyl có khả năng phản ứng cao. Các gốc tự do sẵn sàng tấn công các đại phân tử
như protein, lipid, RNA và DNA, làm thay đổi cấu trúc và can thiệp vào chức năng
của chúng. Các enzym giải độc và bảo vệ như superoxide effutase, catalase và
glutathione peroxidase giải độc và giảm các gốc tự do trong tế bào [21]
Ức chế miễn dịch
Ức chế miễn dịch do tia UV có thể ảnh hưởng đến phản ứng quá mẫn loại chậm, tăng
nguy cơ bị nhiễm trùng, gây phản ứng thu hồi phóng xạ, miễn dịch vaccin [46]
Ung thư da
Tia cực tím UV là yếu tố gây ung thư trong ánh sáng mặt trời; tổn thương tế bào da
do tiếp xúc nhiều lần có thể dẫn đến sự phát triển của ung thư do sự tích lũy các đột
biến gây ra bởi tác hại của tia cực tím. Bình thường tế bào có cơ chế để sửa chữa các
tổn thương ADN, hoặc gây ra apoptosis để loại bỏ các tế bào bị hư hỏng nghiêm
trọng; tuy nhiên sự đột biến gen ức chế khối u p53 có liên quan đến các cơ chế này
có thể dẫn đến sự tăng sinh tế bào bất thường và phát triển ung thư [44].

2.2.3. Các tình trạng tăng sắc tố da
Các tình trạng có biểu hiện tăng sắc tố ở da bao gồm một số bệnh có căn nguyên di
truyền hay bẩm sinh, do rối loạn chuyển hoá, nguyên nhân do nội tiết, do hoá chất

10
.


.

hoặc thuốc, do dinh dưỡng, yếu tố vật lý, sau nhiễm khuẩn hay viêm, các khối u sắc
tố và các nguyên nhân khác.

Tàn nhang:
Tàn nhang là những đốm màu nâu hoặc cafê sữa. Các đốm này rải rác màu nâu, kích
thước thường nhỏ hơn 0,5 cm, hay xuất hiện ở những vùng tiếp xúc ánh sáng mặt
trời, biểu hiện sẫm màu ngay. Nguyên nhân có thể là do di truyền trội trên nhễm sắc
thể.
Bệnh rám má (Melasma)
Bệnh thường có các biểu hiện lâm sàng ở hai bên má, trán, cằm, mũi xuất hiện những
vết màụ nâu hay xanh đen, sắp xếp đối xứng. Kích thước của thương tổn thay đổi. Bờ
rõ nhưng không đều. Màu sắc thương tổn thường xạm như chì, đồng đều, đơi khi có
nâu hay đen xạm.
Viêm hay nhiễm khuẩn
Có thể tăng sắc tố da sau một viêm cấp tính hay mạn tính, tăng sắc tố có thể đơn thuần
khu trú ở lớp thượng bì, cũng có khi ở cả lớp trung bì là do đại thực bào ăn sắc tố sau
đó khu trú ở trung bì nông.
Bớt sắc tố
Hai dạng bớt sắc tố thường gặp là Hori và Ota. Chúng có biểu hiện là những mảng
trịn hoặc dạng đốm dẹt phẳng với màu xám, xanh xám, xanh đen hay nâu. Bớt sắc tố
thường gặp phải ở mặt, một bên hoặc hai bên đối xứng. Bớt sắc tố là do sắc tố melanin
đóng thành từng mảng, có thể nằm ở mọi lớp của da (thượng bì, trung bì hay hạ bì).
U hắc tố ác tính
Những u của tế bào sinh hắc tố melanin xuất hiện trên da hay niêm mạch, đa số từ
những nốt ruồi. Thông thường nhất là lồi lên mặt da thành cục. Hiếm khi biểu hiện là
một mảng đen phẳng hoặc chấm hoa. Do ngứa gãi hay loét mặt, chảy nước vàng, chảy
máu, bội nhiễm có mùi hơi thối.
2.3.

TỔNG QUAN VỀ TYROSINASE

11
.

.

2.3.1. Đặc điểm
Tyrosinase hay còn gọi là enzym polyphenol oxidase (PPO), là monooxygenase chứa
đồng tham gia vào hai phản ứng riêng biệt của q trình chuyển hóa melanin; một là
hydroxyl hóa monophenol thành O-diphenol, hai là oxi hóa O-diphenol thành Odiphenol sau đó, O-diphenol tham gia một loạt các phản ứng để tạo thành melanin.

Hình 2.2.5. Phản ứng có xúc tác của tyrosinase

2.3.2. Vai trò của tyrosinase
Tyrosinase tham gia vào phản ứng đầu của quá trình hình thành sắc tố da melanin.
Bước đầu tiên và bắt buộc trong quá trình hình thành sắc tố là oxy hóa tyrosin thành
dopaquinon. Đây là bước giới hạn tốc độ trong sinh tổng hợp tyrosin do chuỗi phản
ứng cịn lại có thể tự diễn ra tại pH sinh lý nhất định. Dopaquinon sinh ra chuyển
thành leukodopachrom, sau đó chuyển thành dopacrom. Cuối cùng eumelanin được
hình thành thơng qua một loạt phản ứng oxy hóa từ các sản phẩm chuyển hóa của
dopacrom là 5,6-dihydroxyindol (DHI) và acid 5,6-dihydroxyindol-2-cacboxylic
(DHICA). Trường hợp có mặt cystein hoặc glutathion, dopaquinon sẽ được chuyển
hóa thành cysteyldopa hoặc glutathionyldopa. Cysteinyldopa hoặc glutathionyldopa
tiếp tục trải qua một loạt các phản ứng để tạo thành pheomelanin [15].

12
.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

Hình 2.2.6. Con đường tổng hợp melanin [45]

2.3.3. Các chất ức chế tyrosinase
Các chất ức chế tyrosinase có nguồn gốc tự nhiên [15]
Các flavonoid trong thực vật có tác dụng bảo vệ da bằng cách chống lại tia UV và tác
nhân gây bệnh. Một số flavonoid như kaempferol, quercetin và morin ức chế
tyrosinase, trong khi catechin và rhamnetin là cơ chất của tyrosinase. Nhiều aldehyd
có tác dụng ức chế tyrosinase như cinnamaldehyd, (2E)-alkenal, 2-hydroxy-4methoxybenzaldehyd, anisaldehyd, cuminaldehyd và acid cumic. Acid dicacboxylic
gây độc nhất định trên các tế bào biểu bì tạo sắc tố của khối u ác tính ở da. Acid kojic,
13
.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

5-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-γ-pyron ức chế sự hình thành sắc tố từ phản ứng oxy
hóa L-DOPA, norepinephrin và dopamin dưới sự xúc tác của tyrosinase.
Các chất ức chế tyrosinase có nguồn gốc tổng hợp
Một số hợp chất tổng hợp như hydroxylamin, hợp chất chứa thiol, acid cacboxylic thơm,
dẫn xuất acid cinnamic, trihydroxy chalcon, peptid, acid alkylbenzoic, N-hydroxy-N’phenyl ure và N-hydroxy-N’-phenyl thioure ức chế tyrosinase. Tropolon (2-hydroxy2,4,6-cycloheptatrien-1-on) là một trong những chất ức chế tyrosinase mạnh, có cấu
trúc tương tự cơ chất O-diphenolic của tyrosinase. 4-hexyl resorcinol ức chế
tyrosinase hiệu quả, sử dụng trong cơng nghiệp thực phẩm vì tan trong nước, ổn định,
không độc hại, không gây đột biến, không gây ung thư [29], [23].
Hydroquinon làm giảm 90% hoạt tính của tyrosinase, ức chế hiệu quả q trình sản
xuất melanin in vitro và in vivo. Hydroquinon ảnh hưởng đến sắc tố của mắt, gây tổn
thương giác mạc vĩnh viễn. Hydroquinon đã bị Hoa Kỳ, Châu Âu cấm sử dụng trong
mỹ phẩm vì khơng an tồn khi sử dụng trong thời gian dài
Arbutin sử dụng rộng rãi với hiệu quả làm sáng da. Arbutin tự nhiên tương đối an
toàn tuy nhiên có độ ổn định thấp, dễ chuyển hóa thành hydroquinon. Vì thế, năm
2008, Hiệp hội Mỹ phẩm Châu Âu cấm sử dụng các đồng dạng của beta-arbutin [10].

14
.