Khảo sát tác động kháng staphylococcus aureus của phối hợp dẫn chất 2 salicyloylbenzofuran và một số kháng sinh

.

BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG KHÁNG STAPHYLOCOCCUS
AUREUS CỦA PHỐI HỢP DẪN CHẤT
2-SALICYLOYLBENZOFURAN VÀ MỘT SỐ KHÁNG SINH

Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: ĐH Y dược Tp. Hồ Chí Minh
Chủ trì nhiệm vụ: TS. Phạm Ngọc Tuấn Anh

Thành phố Hồ Chí Minh - 2019
.


.

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG KHÁNG STAPHYLOCOCCUS

AUREUS CỦA PHỐI HỢP DẪN CHẤT
2-SALICYLOYLBENZOFURAN VÀ MỘT SỐ KHÁNG SINH
(Đã chỉnh sửa theo kết luận của Hội đồng nghiệm thu ngày …………...)

Cơ quan chủ quản
(ký tên và đóng dấu)

Chủ trì nhiệm vụ
(ký tên)

Phạm Ngọc Tuấn Anh
Cơ quan chủ trì nhiệm vụ
(ký tên và đóng dấu)

.


.

MỤC LỤC
MỤC LỤC ...................................................................................................................i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................. ii
DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG, SƠ ĐỒ ............................................................. iii
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3
1.1. TÌNH TRẠNG ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH Ở CÁC CHỦNG
STAPHYLOCOCCUS AUREUS ................................................................................. 3
1.2. KHÁNG SINH SỬ DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ MRSA .................................... 6
1.3. TỔNG QUAN VỀ BENZOFURAN VÀ DIARYLKETON .............................. 8
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 14

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .......................................................................... 14
2.2. NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ ....................................................................... 14
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................... 16
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ – BÀN LUẬN ............................................................... 22
3.1. TỔNG HỢP HÓA HỌC .................................................................................... 22
3.2. HOẠT TÍNH SINH HỌC ................................................................................. 27
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................... 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO

i
.


.

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AcOH

Acid acetic

CFU

Colony - forming unit (đơn vị khuẩn lạc)

CTCT

Công thức cấu tạo

DCM

Dicloromethan

4-DMAP

4-Dimethylaminopyridin

DMF

Dimethylformamid

DMSO

Dimethylsulfoxid

FICI

Chỉ số ức chế riêng phần

NBS

N-Bromosuccinimid

FDA

Cơ quan Quản lý Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ

MeOH

Methanol

MIC

Nồng độ ức chế tối thiểu

ZOI

Zone of inhibition

MRSA

Staphylococcus aureus kháng methicillin

MSSA

Staphylococcus aureus nhạy methicillin

PTSA

Acid p-toluensulfonic

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

THF

Tetrahydrofuran

TSA

Tryptic Soy Agar

TSB

Tryptic Soy Broth

ii
.


.

DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG, SƠ ĐỒ
Hình 1.1. Ảnh chụp MRSA dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM) .......................... 4

Bảng 1.1. Tỉ lệ nhiễm MRSA ở một số quốc gia trên thế giới .................................. 5
Bảng 2.1. Danh sách các ngun liệu, hóa chất và dung mơi ................................. 14
Bảng 3.1. Kết quả tổng hợp dẫn xuất 2-bromo-2’-methoxyacetophenon ............... 23
Bảng 3.2. Kết quả tổng hợp dẫn xuất 2-(2-methoxybenzoyl)-5,7dibromobenzofuran .................................................................................................. 24
Bảng 3.3. Kết quả tổng hợp dẫn xuất 2-(2-hydroxybenzoyl)5,7-dibromobenzofuran ............................................................................................ 25
Bảng 3.4. Kết quả tổng hợp dẫn xuất ester của 2-salicyloyl5,7-dibromobenzofuran ............................................................................................ 26
Bảng 3.5. Kết quả tổng hợp và kiểm nghiệm sản phẩm 1a-f .................................. 27
Bảng 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn (MIC) của các sản phẩm 1a-f và kháng sinh ..... 28
Bảng 3.7. Kết quả định tính khả năng hiệp đồng kháng khuẩn ............................... 29
Bảng 3.8. Kết quả định lượng khả năng hiệp đồng kháng khuẩn ............................ 29

Sơ đồ 2.1. Sơ đồ tổng hợp dẫn chất acid carboxylic của 5,7-dibromo-2salicyloylbenzofuran 1a–f ....................................................................................... 17

iii
.

.

Đặt vấn đề

ĐẶT VẤN ĐỀ
Vấn đề đề kháng kháng sinh đã mang tính tồn cầu, đặc biệt ở các nước đang phát
triển với gánh nặng của các bệnh nhiễm khuẩn. Các bệnh nhiễm khuẩn có tỉ lệ mắc
cũng như tử vong cao và việc kiểm soát các loại bệnh này chịu sự tác động bất lợi
của tình trạng đề kháng kháng sinh

[1-4]

. Trong các chủng đề kháng kháng sinh thì

Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) là tác nhân chính gây các bệnh
nhiễm khuẩn nguy hiểm trên da, mô mềm, xương, đường hô hấp và máu [1-3]. Tại Mỹ,
MRSA gây ra khoảng 90.000 ca và ước tính khoảng 19.000 trường hợp tử vong trong
năm 2005 [2]. Tại Châu Âu, MRSA liên quan tới hơn 150.000 bệnh nhân nhiễm trùng
và làm tăng chi phí điều trị lên tới 380 triệu euro mỗi năm [3]. Do đó, việc nhiễm vi
khuẩn này hiện là vấn đề nghiêm trọng trên lâm sàng nên việc kiểm soát và điều trị
chủng MRSA được xác định là một trong những nhiệm vụ cấp bách của hệ thống y
tế trên tồn thế giới [1-4].
Kháng sinh chính được sử dụng điều trị MRSA trên lâm sàng hiện nay là vancomycin
[5], [6]
[5]

, cũng như một số hoạt chất mới gồm linezolid [5], [7], tigecyclin [5], daptomycin

, telavancin

[5],

ceftarolin

[5]

, và phối hợp quinupristin/ dalfopristin

[5]

. Dù vậy,

vancomycin vẫn được xem là lựa chọn chính trong các phác đồ điều trị của hầu hết
các bệnh nhiễm khuẩn do MRSA

[5,6]

. Tuy nhiên, vancomycin chưa hiệu quả hay

thậm chí thất bại trên lâm sàng trong một số trường hợp nhiễm trùng nặng [5,6,8]. Thêm
vào đó, một số nghiên cứu cho thấy tình trạng đề kháng đã xuất hiện trên các kháng
sinh mới như linezolid, daptomycin [8], [9]. Đứng trước thực trạng này, cần thiết phải
có sự hợp tác toàn cầu nhằm hướng tới giải quyết các thách thức của tình trạng đề
kháng kháng sinh, trong đó thúc đẩy việc nghiên cứu, tìm kiếm thuốc kháng sinh mới
kháng MRSA là một trong những hành động quan trọng và thiết thực

[10–12]

.Khung

cấu trúc 2-aroylbenzofuran đã được tổng hợp và sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn trên
các chủng vi khuẩn Gram-(+) và Gram-(–) trong các nghiên cứu trước [13-15]. Kết quả
ban đầu cho thấy các dẫn chất acid carboxylic của khung dị vòng 21
.


.

Đặt vấn đề

salicyloylbenzofuran sở hữu hoạt tính kháng MRSA tiềm năng (MIC = 32 – 1024
µg/mL) [15]. Tiếp nối các nghiên cứu trước, chúng tôi tiến hành đề tài “Khảo sát tác
động kháng Staphylococcus aureus của phối hợp dẫn chất 2-salicyloylbenzofuran và
một số kháng sinh” nhằm mở rộng đánh giá tiềm năng kháng khuẩn của các dẫn chất
này góp phần định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Mục tiêu cụ thể của đề tài gồm:
1. Tổng hợp 6 dẫn chất acid carboxylic của 2-salicyloylbenzofuran 1a-f.
2. Định tính, định lượng tác động kháng khuẩn của dẫn chất 1a-f và một số kháng
sinh.
2. Định tính tác động hiệp đồng kháng khuẩn của dẫn chất 1a-f với một số kháng
sinh.
3. Định lượng khả năng hiệp đồng kháng khuẩn của dẫn chất 1a-f với một số kháng
sinh.
4. Đánh giá kết quả các phối hợp có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn thử
nghiệm.

2
.

.

Tổng quan tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TÌNH TRẠNG ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH Ở CÁC CHỦNG
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Staphylococcus aureus là một trong những tác nhân gây ra các bệnh nhiễm khuẩn
như mụn nhọt, viêm nang lông, chốc lở, viêm vú, nhiễm trùng vết thương và hội
chứng bỏng da do tụ cầu ở người. Những tổn thương nặng hơn như nhiễm khuẩn
huyết, viêm phổi, viêm nội tâm mạc, nhiễm khuẩn xương khớp, hội chứng sốc do độc
tố vi khuẩn cũng được ghi nhận có sự hiện diện của S. aureus trong mẫu bệnh phẩm.
Ngồi ra, S. aureus cịn là ngun nhân chính gây ngộ độc thực phẩm.
S. aureus là vi khuẩn Gram-(+), khơng di động , hình cầu, đường kính 0,5-1,5 μm,
các tế bào xếp thành hình chùm nho, có khả năng thích ứng với nhiều mơi trường. Vi
khuẩn có thể lây lan được ở cả người và các động vật khác, da và niêm mạc là đường
lây truyền chính của S. aureus.
Trước những năm 1940, khi kháng sinh chưa được phát hiện và đưa vào sử dụng, tỉ
lệ tử vong ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết do S. aureus hơn 80%

[16]

. Penicillin G

(benzyl penicillin) được đưa vào sử dụng đã mở ra giai đoạn mới trong điều trị bệnh
nhiễm khuẩn do S. aureus. Năm 1942 những ca đề kháng penicillin G đầu tiên được
phát hiện.[17]. Vi khuẩn đề kháng theo cơ chế tổng hợp enzym penicillinase/ βlactamase, có khả năng mở vịng β-lactam, làm mất hoạt tính của penicillin

[18], [19]

.

Enzym β-lactamase được mã hóa bởi blaZ, một gen nằm trên plasmid của vi khuẩn.
Theo các nghiên cứu tại thời điểm đó, 90% các chủng S. aureus phân lập từ mẫu bệnh
phẩm của bệnh nhân nhiểm khuẩn có mang gen này.
Methicillin và những kháng sinh thuộc nhóm penicillin thế hệ tiếp theo được thiết kế
với mục tiêu kháng enzym β-lactamase. Biệt dược Celbenin® của methicillin được
đưa vào sử dụng lâm sàng năm 1959 và nhanh chóng bị đề kháng vào năm 1960 [20].
Phát hiện này là khởi đầu cho những phát hiện liên tiếp sau đó về các chủng MRSA
[21-23]

.
3
.


.

Tổng quan tài liệu

MRSA có khả năng đề kháng với tất cả các kháng sinh β-lactam trừ các cephalosporin
thế hệ thứ 5. Một số báo cáo cho thấy MRSA kháng được nhiều nhóm kháng sinh
khác như aminoglycosid, macrolid, chloramphenicol, tetracyclin và fluoroquinolon
[24]

. Vancomycin và các kháng sinh tương đối mới như linezolid, daptomycin là những

lựa chọn điều trị cuối cùng trong nhiễm trùng MRSA cũng cho thấy tình trạng đề

kháng [25].

Hình 1.1. Ảnh chụp MRSA dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM) (Nguồn: Trung
tâm kiểm soát và ngăn ngừa bệnh Hoa Kỳ – CDC).
Cơ chế đề kháng penicillin của MRSA độc lập với enzym β-lactamase. MRSA làm
thay đổi cấu trúc của các protein gắn penicillin (penicillin-binding proteins-PBPs),
đích tác động của các thuốc nhóm penicillin. Các nghiên cứu genomics và proteomic
đã chứng minh trên nhiễm sắc thể của MRSA có một vùng ADN “ngoại lai” mà trong
nhiễm sắc thể MSSA (S. aureus nhạy cảm với methicillin) khơng có. Vùng ADN này
được gọi là mec, mã hóa là PBP 2a, có ái lực thấp với các penicillin [26a-e]. Những báo
cáo gần đây phát hiện một gen đề kháng Methicillin mới trên các chủng MRSA là
gen mec [27a-d].
Trước đây MRSA chỉ được tìm thấy ở bệnh viện, nhưng gần đây đã có các nghiên
cứu cho thấy các chủng MRSA bắt đầu được tìm thấy trong cộng đồng và động vật
với tần suất ngày càng cao [28a], [28b]. Một số tác giả đề nghị đưa một số loài gia súc và
gia cầm vào danh mục các nguồn nguy cơ lây nhiễm MRSA cho người [29a], [29b].
Những nghiên cứu gần đây, đã phân lập được 17 chủng MRSA gây bệnh nhiễm khuẩn
ở con người, trong đó phổ biến nhất là 2 chủng EMRSA-15 và EMRSA-16 [30a], [30b].
4
.


.

Tổng quan tài liệu

Những chủng MRSA có nguồn gốc ở con người là CC1, CC5, CC8, CC22, CC30 và
CC45. Chủng CC398 được tìm thấy ở lợn và các lồi gia súc, gia cầm khác [31a], [31b].
Sự lây truyền MRSA từ động vật sang người tiềm ẩn nhiều nguy hiểm. Quá trình tiếp
xúc lâu dài giữa người và động vật trong như trong chăn nuôi, môi trường bẩn và sự

suy giảm miễn dịch cũng góp phần gia tăng sự lây truyền [32]. Hiện nay, các con đường
lây truyền chủ yếu của MRSA là từ bệnh viện (HA-MRSA), từ cộng đồng (CAMRSA) và từ vật ni, gia cầm (LA-MRSA), trong đó nguồn từ bệnh viện là nguy
hiểm nhất với tỉ lệ lây nhiễm cao ở nhiều quốc gia trên thế giới (Bảng 1.1).
Bảng 1.1. Tỉ lệ nhiễm MRSA ở một số quốc gia trên thế giới [28b].

Quốc gia
Argentina

Tỉ lệ lây nhiễm (%) Nguồn lây nhiễm
16

Bệnh viện

Bangladesh

53.1

Bệnh viện

Bolivia

0.5

Cộng đồng

Cameroon

34.6

Bệnh viện

80

Bệnh viện

92.4

Bệnh viện

Congo

60

Bệnh viện

Costa Rica

58

Bệnh viện

Cuba

6

Bệnh viện

44.1

Bệnh viện

Guatemala

64

Bệnh viện

Indonesia

4.3

Bệnh viện

Japan

44.4

Bề mặt môi trường

Kenya

7

Bệnh viện

Malaysia

26

Bệnh viện

Singapore

35

Bệnh viện

Chile
Columbia

Ethiopia

5
.


.

Tổng quan tài liệu
Thailand

41.5

Bệnh viện

Tỉ lệ nhiễm MRSA ở mỗi quốc gia, khu vực rất khác nhau. Những nơi có tỉ lệ nhiễm
cao là Hoa Kỳ, Châu Á và Malta (> 50%), những nơi có tỉ lệ nhiễm trung bình (2550%) là Trung Quốc, Châu Phi và Châu Âu, một số quốc gia ở Châu Âu có tỉ lệ nhiễm
thấp (< 25%) [33a], [33b].
Stefani và các cộng sự đã xác định cho thấy số ca nhiễm MRSA bệnh viện ở các nước
châu Âu như Anh, Pháp, Ireland đang giảm. Tuy nhiên con số đó ở các nước châu Á

vẫn cịn cao, cụ thể Hàn Quốc (77.6%), Việt Nam (74.1%), Đài Loan (65%), Hồng
Kơng (56.8%)

[33b]

. MRSA ở bệnh viện có thể thâm nhập qua đường hơ hấp là con

đường chính, ngồi ra MRSA cịn có thể xâm nhập qua các vết thương hở ở bàn tay,
vùng đáy chậu, cổ họng, đường sinh dục, đường tiêu hóa.
Từ những thơng tin trên, chúng tơi nhận thấy tình hình lây nhiễm MRSA đang ngày
càng nghiêm trọng, ảnh hưởng lớn tới sự phát triển y tế toàn cầu. Khả năng đề kháng
với nhiều kháng sinh của MRSA làm cho việc điều trị bệnh nhiễm khuẩn trở nên khó
khăn hơn và chi phí cao hơn.
1.2. KHÁNG SINH SỬ DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ MRSA
Tùy theo vị trí và nguyên nhân dẫn đến nhiễm trùng để quyết định việc điều trị và lộ
trình sử dụng kháng sinh. Kháng sinh có hiệu quả chống lại MRSA có thể được dùng
bằng tiêm, uống hoặc kết hợp cả hai. Trước đây, các kháng sinh đường uống như:
clindamycin, trimethoprim-sulfamethoxazol được khuyến cáo dùng để điều trị nhiễm
khuẩn theo kinh nghiệm cho bệnh nhân ngoại trú có nhiễm CA-MRSA

[25], [34]

.

Rifampin hiện khơng cịn được khuyến cáo sử dụng đơn trị liệu hay hỗ trợ điều trị
MRSA do sự đề kháng. Tetracyclin và trimethoprim-sulfamethoxazol cũng cho thấy
hoạt tính kháng khuẩn hạn chế với MRSA và cần phải phối hợp thêm với 1 chất βlactam. Ngồi ra, clindamycin dùng đơn trị liệu cũng có thể được xem xét, tuy nhiên
vẫn có những trường hợp xuất hiện đề kháng. Có thể sử dụng xét nghiệm D-zone với
erythromycin để phát hiện MRSA đề kháng được với clindamycin ở bệnh nhân [35].
Sau hơn 50 năm kể từ khi được đưa vào sử dụng lâm sàng, vancomycin vẫn được các

6
.


.

Tổng quan tài liệu

hướng dẫn điều trị xem là một tác nhân hiệu quả trong điều trị nhiễm khuẩn MRSA
mặc dù một số các tranh cãi liệu nó có lỗi thời hay không [36]. Hầu hết các bác sĩ sử
dụng vancomycin theo kinh nghiệm để điều trị nhiễm trùng MRSA toàn thân, như
được nêu trong hướng dẫn điều trị của Hiệp hội các bệnh truyền nhiễm Hoa Kỳ
(IDSA) [37]. Theo đó, vancomycin có thể được sử dụng tiếp cho bệnh nhân khi bệnh
nhân còn đáp ứng về lâm sàng và vi sinh đối với quá trình trị liệu, các ổ nhiễm khuẩn
khác MRSA đã được loại bỏ và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) không vượt quá 2
μg/mL. Tuy nhiên, một số đánh giá gần đây cho thấy có sự tăng tỉ lệ thất bại trong trị
liệu ngay cả khi MIC < 2 μg/ml, và đề nghị thay thế liệu pháp điều trị khi MIC > 1
μg/ml

[27], [38]

. Gần đây, một số báo cáo cho thấy MIC của vancomycin đối với các

chủng MSSA và MRSA đang tăng lên [39a], [39b].
Trong vài năm gần đây, 5 kháng sinh được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược
phẩm Hoa Kỳ (FDA) phê chuẩn để điều trị MRSA dựa trên các thử nghiệm lâm sàng
được kiểm soát tốt là: linezolid, daptomycin, tigecyclin, telavancin và ceftarolin.
Trong số các tác nhân này, chỉ có linezolid có sẵn ở cả dạng uống và dạng tiêm tĩnh
mạch và có thể được xem xét cho đơn trị liệu theo kinh nghiệm CA-MRSA. Tuy
nhiên, việc sử dụng lâm sàng của nó đã bị giới hạn ở những bệnh nhân đề kháng thứ

phát do chi phí thuốc cao. Một cách tiếp cận khác trong điều trị MRSA hiện nay là
phối hợp các kháng sinh thường dùng trong lâm sàng với nhau như: vancomycin (hay
daptomycin) và các kháng sinh β-lactam (flucloxacillin, cloxacillin, hay cefazolin)
[40]

. Ngoài ra, các cephalosporin thế hệ thứ 5 (ceftarolin và ceftobiprol) là những

kháng sinh kháng được MRSA, thường được sử dụng riêng lẽ hay phối hợp với
vancomycin [40], [41].
Năm 2014, FDA đã chấp thuận 2 kháng sinh mới, là dalbavancin và tedizolid, trong
điều trị nhiễm khuẩn da cấp tính và nhiễm khuẩn cấu trúc da gây ra bởi MRSA [42].
Dalbavancin thuộc nhóm kháng sinh lipoglycopeptid, có cơ chế tác dụng là ức chế
sinh tổng hợp thành tế bào vi khuẩn, tương tự như vancomycin. Dalbavancin có ưu
điểm hơn vancomycin do có thời gian bán thải dài hơn, giúp việc dùng thuốc dễ dàng
hơn. Trong một công bố năm 2019, Maya Azrad và các cộng sự đã thử nghiệm khả
năng đề kháng dalbavancin và tedizolid của 275 chủng MRSA được phân lập từ các
7
.


.

Tổng quan tài liệu

mẫu máu và dịch vết thương. Đối với từng chủng, tác giả đo MIC của dalbavancin và
tedizolid. Kết quả cho thấy có 1 chủng MRSA đề kháng được dalbavancin (MIC =
0.19 μg/ml), khơng có chủng MRSA nào đề kháng được tedizolid. Qua đó, có thể
thấy dalbavancin và tedizolid hiện nay là 2 kháng sinh tiềm năng trong điều trị nhiễm
khuẩn do MRSA [43].
1.3. TỔNG QUAN VỀ BENZOFURAN VÀ DIARYLKETON

1.3.1. Đại cương về benzofuran
1.3.1.1. Giới thiệu chung về khung benzofuran
Benzofuran là hợp chất dị vòng ngưng tụ của benzen và furan.

Khung cấu trúc benzofuran là một nhóm lớn có mặt trong nhiều hợp chất tự nhiên và
tổng hợp, có hoạt tính sinh học đa dạng, sự liên quan về cấu trúc và tác dụng đã tạo
nên sự quan tâm cho các nhà khoa học. Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu
liên quan khung cấu trúc benzofuran với những hoạt tính sinh học phong phú như
kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, chống viêm, giảm đau…đã được tiến hành.
Đặc biệt được coi như chìa khóa để tìm ra những kháng sinh mới.[44-57]
1.3.1.2. Nghiên cứu liên quan tới hoạt tính sinh học dẫn xuất benzofuran
Hoạt tính kháng khuẩn
Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn trên các dẫn xuất
benzofuran, nổi bật là cơng trình của Lei Fu và các cộng sự. Cho thấy một vài dẫn
xuất benzofuran có hoạt tính kháng khuẩn khá tốt (MIC80 = 0.78-3.12 µgmL-1) trên
vi khuẩn E. coli, S. aureus, MRSA, Bacillus subtilis. Kết quả từ các nghiên cứu này
cho thấy các nhóm hydroxy tự do đóng vai trị quan trọng đối với hoạt tính kháng
khuẩn [51].

8
.


.

Tổng quan tài liệu

Báo cáo về nghiên cứu của Kirilmis và cộng sự cho thấy khả năng ức chế sự phát
triển của vi sinh vật ở mức độ in vitro với MIC trung bình 4-256 µgmL-1. Nổi bật là
hợp chất (E)-1-(1-benzofuran-2-yl)-2-mesitylethanon-O-benzoyloxim có hoạt tính

mạnh nhất trên chủng S. aureus và E. coli (MIC tương ứng 4 và 32 µgmL-1) [52].

Nghiên cứu của Wahab và cộng sự trên một số hợp chất 2-(3-(benzofuran-2yl)pyrazol-1-yl)thiazol cho thấy một số dẫn xuất có khả năng kháng khuẩn tốt trên
các chủng S. aureus, Klebsiella pneumoniae , Pseudomonas aeruginosa,
Saccharomyces cerevisiae…[58]

Cơng trình của R.Chowdhury đã cho thấy hợp chất 2-benzoylbenzofuran có hoạt tính
kháng khuẩn tốt trên nhiều chủng vi khuẩn và nấm. MIC đối với các chủng Bacillus
subtilis, P. aeruginosa, S. aureus, Vibrio parahemolyticus, Candida albicans là 64
µgmL-1, đối với E.coli là 16 µgmL-1[59].
Các cơng trình nghiên cứu của Essam M.Ahmed [44], [60] và Cavit Kazaz [46] đã chứng
minh khung cấu trúc benzofuran sở hữu hoạt tính kháng khuẩn khá tốt.
9
.


.

Tổng quan tài liệu

Cơng trình của Manna và cộng sự trên những dẫn xuất của benzofuran mới cho thấy
các chất này có tác động tốt trên những vi khuẩn đa kháng thuốc như Escherichia
coli,

Pseudomonas

aeruginosa,

Streptococcus

pneumoniae,

Streptococcus

agalactiae, Salmonella typhi, Streptococcus aureus và Streptococcus pyrogen... Một
số hợp chất có MIC dưới 10 µgmL-1 trên các chủng vi khuẩn Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa và Streptococcus aureus [53].
Khả năng kháng lao
Nhiều cơng trình nghiên cứu khác về tính kháng lao của vịng benzofuran cũng đã
được tiến hành mang lại nhiều tiềm năng phát triển thành thuốc mới điều trị lao như
cơng trình của Zhong-Yin Zhang và các cộng sự, đã chứng minh các dẫn xuất acid 6hydroxybenzofuran-5-carboxylic có hoạt tính ức chế mạnh enzym protein tyrosin
phosphatase B (mPTPB) [49].

Nghiên cứu của Manna K. và cộng sự cho thấy kết quả tốt với các vi khuẩn lao khi
thế ở vị trí 2 trên khung benzofuran tạo ra dãy hoạt chất có khả năng kháng lao hữu
hiệu, với giá trị MIC tốt nhất là 1.2 µgmL-1, giá trị IC50 thấp hơn 157 µM và giá trị
MIC của vi khuẩn lao đa kháng thuốc 6.4 µgmL-1 [54].

10
.


.

Tổng quan tài liệu

Yempala và cộng sự đã nghiên cứu in vitro khả năng kháng lao trên chủng Mtb
H37Rv và đã tìm ra 2-(4-methoxy-2-methylphenyl)-3H-benzofuro[3,2-e]benzofuran
có MIC = 3.12 µgmL-1 cùng với biểu hiện độc tế bào thấp và chỉ số trị liệu tốt [57].

Các tác dụng sinh học khác
Agasti và cộng sự đã tìm ra hợp chất có hoạt tính kháng các chủng nấm Candida
albican mạnh hơn mẫu đối chiếu fluconazol [61].

Galal và cộng sự đã thiết kế và tổng hợp các phức hợp kim loại với dẫn xuất
benzofuran và bước đầu có những tác động khả quan lên virus HIV và virus viêm gan
C (HCV) [48].

11
.


.

Tổng quan tài liệu

S.S Rindhe và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tổng hợp và đánh giá khả năng chống
oxy hóa và cho thấy một số dẫn xuất của N-(2-aroyl)-3-methyl-benzofuran-5-yl)-6aminoalkylnicotinamid có khả năng chống oxy hóa tốt khi so với acid L-ascorbic [62].

Ngồi ra cịn rất nhiều nghiên cứu khác về tác động của các dẫn chất benzofuran tới
khả năng chống khối u, tác dụng ức chế enzym protein tyrosin phosphatase 1B (PTP1B) (đích tác động của nhiều tế bào ứng dụng trong điều trị nhiều bệnh khác nhau),
tác động lên Aβ trong điều trị bệnh alzheimer...[46],[47],[50],[56] cho thấy tiềm năng lớn
của khung cấu trúc benzofuran.
1.3.2. Nghiên cứu liên quan đến hoạt tính kháng khuẩn của diarylceton
Nhiều cơng trình nghiên cứu đã cho thấy hoạt tính kháng khuẩn mạnh của các hợp
chất tự nhiên mang cấu trúc diarylceton ngay cả trên các chủng đề kháng kháng sinh
như MRSA, vancomycin-resistant Enterococcus faecium.
Pestalon được sản xuất từ môi trường lên men của hỗn hợp nấm Pestalotia sp. CNL365, được lấy từ bề mặt tảo Rosenvingea sp. và một loại vi khuẩn đề kháng kháng
sinh có nguồn gốc từ biển. Pestalon có tác dụng độc tế bào trung bình nhưng lại sở
hữu hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh, đặc biệt trên các chủng đề kháng kháng sinh

MRSA (MIC = 37 ngmL-1) và vancomycin-resistant Enterococcus faecium (MIC =
78 ngmL-1) [63].

12
.


.

Tổng quan tài liệu

Cadiolid C được chiết xuất từ vỏ Pseudodistoma antiboja có hoạt tính kháng khuẩn
mạnh thậm chí cịn mạnh hơn cả vancomycin và linezolid trên tất cả các chủng MRSA
thử nghiệm (MIC = 0.13-0.5 µgmL-1) [64].
Marinopyrrol A được sản xuất bởi chủng vi khuẩn Streptomyces sp. CNQ-418 ở đáy
biển La Jolla, California cho hoạt tính chống lại MRSA với MIC90 = 0.61 µgmL-1,
cùng với độc tính tế bào thấp (IC50 = 8.8 µgmL-1) [65], [66].

Khung cấu trúc 2-aroylbenzofuran đã được chúng tôi tổng hợp và sàng lọc hoạt tính
kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn Gram (+) và Gram (–) trong các nghiên cứu
trước đây

[13-15]

. Kết quả cho thấy một số dẫn chất acid carboxylic của 2-

salicyloylbenzofuran cho tác động kháng khuẩn trên chủng vi khuẩn S. aureus bao
gồm cả chủng đề kháng kháng sinh MRSA (MIC = 32 – 1024 µgmL-1)

13

.

[15]

.


.

Đối tượng – PP nghiên cứu

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
- Dẫn chất acid carboxylic của 5,7-dibromo-2-salicyloylbenzofuran 1a–f

- Kháng sinh: ampicillin, cefuroxim, doxycyclin, ciprofloxacin, vancomycin
2.2. NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ
2.2.1. Nguyên liệu và hóa chất
Các ngun liệu và hóa chất được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Danh sách các nguyên liệu, hóa chất và dung môi
STT

Tên nguyên liệu

Xuất xứ

1

2’-Methoxyacetophenon

Acros, Bỉ

2

Ethyl cloroacetat

Acros, Bỉ

3

3,5-Dibromo-2-hydroxybenzaldehyd

Acros, Bỉ

4

4-DMAP

Acros, Bỉ

5

Aceton

Trung Quốc

6

Acetonitril

Trung Quốc

7

Acid hydroclorid

Trung Quốc

8

AcOH

Trung Quốc

9

Amoni acetat (NH4OAc)

Trung Quốc

10

Cloroform

Trung Quốc

11

DCM

Trung Quốc

12

DMF

Trung Quốc
14

.


.

Đối tượng – PP nghiên cứu

13

Dimethyl sulfoxid (DMSO)

Merk, Đức

14

Ethyl 2-bromopropionat

Acros, Bỉ

15

Ethyl 4-bromocrotonat

New Jersey, Mỹ

16

Ethyl acetat

Trung Quốc

17

Kali carbonat

Merk, Đức

18

Methanol

Trung Quốc

19

Methyl 5-(cloromethyl)-2-furoat

Fisher, Mỹ

20

Natri carbonat

Trung quốc

21

Natri hydroxyd

Trung Quốc

22

Natri sulfat

Trung Quốc

23

NBS

Acros, Bỉ

24

N-hexan

Trung Quốc

25

Nhôm clorid khan

Trung Quốc

26

Petroleum ether

Trung Quốc

27

PTSA

Merk, Đức

28

Môi trường tăng sinh: NB, TSB, TSA

Merck, Đức

2.2.2. Trang thiết bị
Các dụng cụ thủy tinh: bình cầu 1 cổ và 2 cổ dung tích 100 ml, 250 ml, 500 ml; bình
cơ quay 50 ml, 100 ml và 250 ml; sinh hàn, nhiệt kế, bình lắng gạn 250 ml và 500
ml; ống đong 10 ml, 50 ml, 100 ml; becher 100 ml, 250 ml, 500 ml; pipet khắc vạch
1 ml, 5 ml, 10 ml; pipet pasteur; phễu thủy tinh, bình nón nút mài 100 ml và 250 ml,
cột sắc ký, bình sắc ký, đũa thủy tinh, chai đựng mẫu.
Tủ sấy chân không Jeiotech (Hàn Quốc).
Vảy kim loại, chày, cối, kẹp gắp.

Bộ lọc Buchner.
Bản mỏng silicagel F254 và silicagel 60 (0.040 - 0.063 mm) (Merck).
Đèn tử ngoại Vilber Lourmat CN - 6 (Pháp), hai bước sóng 254 nm và 365 nm.
15
.


.

Đối tượng – PP nghiên cứu

Máy xác định điểm chảy Gallenkamp Sanyo.
Máy cô quay chân không R210S, Buchi (Thụy Sĩ), bơm hút chân khơng Buchi (Thụy
Sĩ), bếp khuấy từ có gia nhiệt IKA® C-MAG HS7 (Đức), que khuấy từ bọc teflon.
Tủ lạnh, tủ đá, tủ hốt, nồi cách thủy Memmert (Đức), nhiệt kế.
Cân phân tích Sartorius CP - 224S (Đức).
Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AC-500 MHz (Mỹ)- Viện Hóa học Khoa
học và Cơng nghệ Việt Nam, máy đo sắc ký lỏng ghép khối phổ Shimadzu LC-MS
IT TOF (Nhật)

2.2.3. Thiết bị, môi trường và các chủng vi sinh dùng trong thử nghiệm
hoạt tính sinh học
Thiết bị: ống nghiệm, pipette, micropipette, eppendoff, microwave, đĩa petri, que cấy,
que bông, đèn cồn, bơng gịn, bếp cách thủy, máy vortex, nồi hấp, tủ sấy, tủ ấm, máy
đo quang Gene Quant 1300…
Dung môi pha mẫu DMSO.
Môi trường: Môi trường tăng sinh: NB, TSB, TSA; Môi trường thử nghiệm kháng
sinh: thạch Mueller-Hinton (MHA). Các môi trường được cung cấp dưới dạng bột
khô, khi sử dụng hòa tan vào nước theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các mơi trường
thạch phải đun nóng cho thạch tan. Tiệt trùng ở 121 °C, 1 atm. Môi trường đã hấp tiệt

trùng nhưng chưa được sử dụng được bảo quản trong tủ lạnh ở 2-8 °C.
Chủng vi sinh vật thử nghiệm:
1. Staphylococcus aureus ATCC 29213(MSSA)
2. Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA)
3. Staphylococcus aureus ATCC 33591(MRSA)
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp tổng hợp hóa học
Dẫn chất acid carboxylic của 5,7-dibromo-2-salicyloylbenzofuran 1a–f được tổng
hợp dựa trên qui trình đã được nghiên cứu trước đây (sơ đồ 3.1) [15].
16
.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

Đối tượng – PP nghiên cứu

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất acid carboxylic của 5,7-dibromo-2salicyloylbenzofuran 1a–f

2.3.2. Phương pháp phân lập và tinh chế sản phẩm

2.3.2.1. Phương pháp kết tinh lại
Để tinh chế các chất rắn, có thể sử dụng phương pháp kết tinh lại. Có thể kết tinh lại
bằng cách hịa tan các sản phẩm vào lượng tối thiểu dung mơi thích hợp đun nóng để
bảo đảm hịa tan hồn tồn. Sau đó làm lạnh dung dịch, để yên cho chất hữu cơ kết
tinh từ từ. Khi hạ nhiệt độ, độ tan của chất hữu cơ sẽ giảm nên được tách ra dưới dạng
tinh thể. Một cách khác là hòa tan sản phẩm vào lượng tối thiểu dung mơi sau đó cho
một lương dung môi kém tan vào dung dịch, chất hữu cơ sẽ kết tinh lại.

2.3.2.2. Phương pháp sắc ký cột

Sắc ký cột nhằm mục đích phân lập các hợp chất tinh khiết từ hỗn hợp nhiều thành
phần. Nguyên tắc: một mẫu thử được nạp lên đầu cột chứa chất hấp phụ (silicagel).
Cột chứa chất hấp phụ đóng vai trị pha tĩnh. Một dung môi khai triển (pha động) di
chuyển dọc theo cột. Các cấu tử sẽ tách nhau ra do ái lực khác nhau, vì vậy chúng bị
dung mơi giải hấp phụ và bị đẩy đi với vận tốc khác nhau, tạo thành các băng có vị
trí khác nhau, ra khỏi cột tại các thời điểm khác nhau.
2.3.3. Phương pháp kiểm nghiệm
Trong nghiên cứu này các sản phẩm được tổng hợp, tinh chế và so sánh trên SKLM
và nhiệt độ nóng chảy với các mẫu chuẩn là các sản phẩm đã được tổng hợp và xác
định cấu trúc trong các nghiên cứu trước [15], [67].
17
.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

Đối tượng – PP nghiên cứu

2.3.3.1. Sắc ký lớp mỏng
Một số hệ dung môi sử dụng trong nghiên cứu gồm:
n-Hexan : DCM = 1:1
n-Hexan : aceton = 5:2
n-Hexan : cloroform = 1:1
Petroleum ether : cloroform = 1:1
DCM : methanol : AcOH = 20:1:1 giọt
Cloroform : methanol : AcOH = 20:1:1 giọt
Cloroform : ethyl acetat : AcOH = 16:1:1 giọt

2.3.3.2. Đo nhiệt độ nóng chảy
Đo nhiệt độ nóng chảy trên máy đo điểm chảy Gallenkamp Sanyo, đọc kết quả

khoảng nhiệt độ nóng chảy từ nhiệt độ chất bắt đầu chảy đến khi chất chảy hoàn toàn.
2.3.4. Thử hoạt tính sinh học

2.3.4.1. Xác định MIC
Chuẩn bị
Mơi trường
Chất thử nghiệm được cân chính xác và pha thành dung dịch mẹ trong DMSO. Khi
sử dụng pha lỗng bằng mơi trường thử nghiệm hoặc pha trực tiếp với môi trường
thử nghiệm sao cho tạo thành giai nồng độ trong môi trường thử nghiệm (có nồng độ
sau bằng ½ nồng độ trước) như sau: 1024 µg/ml, 512 µg/ml, 256 µg/ml, 128 µg/ml,
64 µg/ml, 32 µg/ml, 16 µg/ml, 8 µg/ml, 4 µg/ml. Khi pha chất thử vào môi trường
phải đảm bảo nồng độ DMSO nằm trong khoảng từ 2 – 5 % nhằm tránh việc nồng độ
DMSO cao sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn thử nghiệm.
Kháng sinh ampicillin sử dụng dãy nồng độ thử nghiệm: 1 µg/ml, 0.5 µg/ml, 0.25
µg/ml,0.125 µg/ml, 0.0625 µg/ml, 0.03125 µg/ml;
Kháng sinh cefuroxim sử dụng dãy nồng độ thử nghiệm: 64 µg/ml, 32 µg/ml, 16
µg/ml, 8 µg/ml, 4 µg/ml, 2 µg/ml, 1µg/ml; 0.5 µg/ml, 0.25 µg/ml, 0.125 µg/ml.
Kháng sinh ciprofloxacin sử dụng dãy nồng độ thử nghiệm: 8 µg/ml, 4 µg/ml, 2
µg/ml;,1 µg/ml, 0.5 µg/ml, 0.25 µg/ml, 0.125 µg/ml, 0.0625 µg/ml; 0.03125 µg/ml.

18
.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

Đối tượng – PP nghiên cứu

Kháng sinh gentamicin sử dụng dãy nồng độ thử nghiệm: 32 µg/ml, 16 µg/ml, 8
µg/ml, 4 µg/ml, 2 µg/ml, 1µg/ml, 0.5 µg/ml, 0.25 µg/ml, 0.125 µg/ml, 0.0625 µg/ml.

Kháng sinh vancomycin sử dụng dãy nồng độ thử nghiệm: 32 µg/ml, 16 µg/ml; 8
µg/ml, 4 µg/ml, 2 µg/ml, 1µg/ml; 0.5 µg/ml, 0.25 µg/ml, 0.125 µg/ml, 0.0625 µg/ml.
Cho chất thử vào mơi trường đã để nguội về 45 – 50 oC, phân tán đều để đạt được
nồng độ cuối cần thử nghiệm.
Vi khuẩn
Cấy ria vi khuẩn thử nghiệm trên môi trường thạch TSA, ủ ở 37 oC trong 24 giờ.
Lấy 3 – 5 khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào môi trường TSB.
Ủ từ 2 – 6 h ở 37 oC để hoạt hóa vi khuẩn.
Chỉnh độ đục vi khuẩn bằng nước muối sinh lý hoặc TSB, sao cho mật độ thu được
tương đương với McFarland 0.5, là khoảng 1,5 x 108 CFU/ml.
Pha loãng dịch vi khuẩn 10 lần để đạt mật độ khoảng 107 CFU/ml
Vi khuẩn đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vịng 15 phút
Tiến hành
Làm khơ mặt thạch có chất thử và chứng khơng có chất thử.
Cho 1 – 2 μl huyền phù dịch vi khuẩn lên mặt thạch để đạt được mật độ vi khuẩn trên
thạch là 104 CFU/ml.
Để yên khoảng 15 phút để vết chấm khô.
Ủ trong tủ ấm ở 37 oC trong 16-18 giờ. Đối với MRSA phải ủ trong 24 h.
Đọc kết quả
Kết quả chỉ có giá trị khi vi khuẩn trong mẫu chứng mọc bình thường.
Đặt đĩa thạch trên một bề mặt sẫm màu, không phản xạ ánh sáng, quan sát sự tạo
thành khóm của vi khuẩn thử nghiệm. Tìm đĩa có nồng độ thấp nhất ức chế hồn tồn
sự tạo khóm, nồng độ của đĩa thạch này làm MIC của chất thử đối với vi khuẩn thử
nghiệm.
Các khóm đơn lẻ hoặc vết mờ do đầu cấy để lại khơng được tính.
Nếu có vi khuẩn mọc ở nồng độ cao hơn và bị ức chế ở nồng độ thấp, mẫu cấy có thể
đã bị nhiễm và thử nghiệm phải được thực hiện lại.

2.3.4.2. Định tính tác dụng hiệp đồng kháng khuẩn của các chất thử với kháng
sinh

19
.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

Đối tượng – PP nghiên cứu

Tiến hành
Pha nồng độ các chất thử phối hợp với kháng sinh theo tỉ lệ ½ MIC của mỗi chất
trong mỗi giếng của phiến 96 giếng.
Vi khuẩn khảo sát được pha với nồng độ 107 CFU/ml được chấm khoảng 1-2 µL lên
bề mặt tất cả các giếng, ủ ở 37 oC/16-18 h.
Song song tiến hành chấm vi khuẩn lên một mẫu chứng không chứa chất thử và kháng
sinh.
Đọc kết quả
Kết quả chỉ có giá trị khi vi khuẩn trong mẫu chứng mọc bình thường.
Đặt phiến 96 giếng trên một bề mặt sẫm màu, không phản xạ ánh sáng, quan sát sự
tạo thành khóm của vi khuẩn thử nghiệm. Các phối hợp khơng có vi khuẩn mọc sẽ
được thực hiện định lượng khả năng hiệp đồng bằng thử nghiệm bàn cờ.
Các khóm đơn lẻ hoặc vết mờ do đầu cấy để lại khơng được tính.

2.3.4.3. Định lượng khả năng hiệp đồng của các chất thử với kháng sinh bằng
phương pháp bàn cờ
Tiến hành
Pha nồng độ các chất thử phối hợp với nhau theo tỉ lệ nhất định trong mỗi giếng của
phiến 96 giếng và dao động xung quanh MIC của mỗi chất thử.
Trên phiến 96 giếng xem chiều ngang là nồng độ của chất thử 1 phối hợp với kháng
sinh có nồng độ giảm dần ½ bắt đầu từ giếng chứa chất thử 1 và kháng sinh có nồng
độ gấp 2 lần MIC của mỗi chất, giếng tiếp theo nồng độ chất thử 1 giữ ngun cịn

kháng sinh có nồng độ giảm dần ½.
Vi khuẩn khảo sát được pha với nồng độ 107 CFU/ml được chấm khoảng 1-2 µl lên
bề mặt tất cả các giếng, ủ ở 37 oC/16-18 h.
Song song tiến hành chấm vi khuẩn lên một mẫu chứng không chứa chất thử và kháng
sinh.
Đọc kết quả
Kết quả chỉ có giá trị khi vi khuẩn trong mẫu chứng mọc bình thường.
Đặt phiến 96 giếng trên một bề mặt sẫm màu, không phản xạ ánh sáng, quan sát sự
tạo thành khóm của vi khuẩn thử nghiệm. Tìm giếng có nồng độ thấp nhất của chất
thử ức chế hồn tồn sự tạo khóm.
Các khóm đơn lẻ hoặc vết mờ do đầu cấy để lại khơng được tính.
20
.