Nghiên cứu thành phần hoá học hướng tác dụng chống oxy hóa của dây phục linh adenia cardiophylla (mast ) engl , passifloraceae

.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐỒNG THANH HẠNH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC HƯỚNG
TÁC DỤNG CHỚNG OXY HĨA CỦA DÂY PHỤC LINH
Adenia cardiophylla (Mast.) Engl., Passifloraceae

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

TP. Hồ Chí Minh, năm 2020

.


.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐỒNG THANH HẠNH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC HƯỚNG
TÁC DỤNG CHỚNG OXY HĨA CỦA DÂY PHỤC LINH
Adenia cardiophylla (Mast.) Engl., Passifloraceae

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
Ngành: Dược liệu - Dược học cổ truyền
Mã số: 8720206

Người hướng dẫn khoa học: TS. MÃ CHÍ THÀNH

TP. Hồ Chí Minh, năm 2020

i
.


.

LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bớ
trong bất kỳ cơng trình nào khác.

Đồng Thanh Hạnh

ii
.


.

TĨM TẮT
Luận văn thạc sĩ – Khóa 2018-2020
Ngành: Dược liệu- Dược học cổ truyền – Mã số: 8720206
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG
CHỜNG OXY HĨA CỦA DÂY PHỤC LINH
(Adenia cardiophylla (Mast.) Engl., Passifloraceae)
Đồng Thanh Hạnh
Người hướng dẫn khoa học: TS. Mã Chí Thành
Đặt vấn đề
Dây Phục linh là một loài thuộc chi Adenia, họ Passifloraceae. Rễ cây có vị hơi ngọt, tính
nóng; dùng làm th́c bở phởi cho người yếu phổi, hay đau ran vùng phổi và phía trên bả
vai. Cho đến nay, hầu hết những cơng bớ về thành phần hóa học của các lồi trong chi Adenia
chủ yếu được thực hiện trên loài A. volkensii và A. digitata, cịn đới với Dây Phục Linh
(Adenia cardiophylla) vẫn chưa có nghiên cứu về cả thành phần hóa học và tác dụng dược
lý. Đề tài “Nghiên cứu thành phần hố học hướng tác dụng chống oxy hóa của Dây
Phục linh (Adenia cardiophylla (Mast.) Engl., Passifloraceae)” được tiến hành nhằm đóng
góp về mặt khoa học và thực tiễn của dược liệu này.
Đối tượng
Thân và rễ Dây phục linh được thu hái tại tại huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang vào tháng
11/2018.
Phương pháp nghiên cứu
Sàng lọc hoạt tính chớng oxy hóa bằng phương pháp DPPH. Sử dụng các phương pháp chiết
ngấm kiệt với cồn 70%, chiết phân bố lỏng - lỏng, sắc ký cột pha thuận, sắc ký rây phân tử,
kết tinh phân đoạn để phân lập các hợp chất tinh khiết. Xác định cấu trúc của các chất đã
phân lập bằng phương pháp phổ học (MS, NMR).
Kết quả và bàn luận
Khảo sát hoạt tính chớng oxy hóa cho thấy hoạt tính các cao phân đoạn giảm dần theo thứ
tự: cao ethyl acetat > cao n-BuOH > cao nước > cao n-Hexan. 7 kg bột dược liệu được chiết
xuất với cồn 70%, phân tách lỏng – lỏng thu được các cao phân đoạn: n-hexan (48 g), ethyl

acetat (45 g), n-BuOH (37 g) và nước (254 g). Từ cao ethyl acetat đã phân lập và xác định
cấu trúc của 6 hợp chất: AC1; 2,3-epoxydeca-4,6,8-triyn-1-ol; acid vanillic;
demethoxypinoresinol; acid succinic; tetraphyllin A và deidaclin. Trong đó, AC1 là hợp chất
mới, lần đầu tiên được phân lập trong tự nhiên. Khảo sát hoạt tính chớng oxy hóa của các
hợp chất phân lập được cho thấy hầu hết các hợp chất đều thể hiện tác dụng rất yếu, chỉ có
hợp chất demethoxypinoresinol có tác dụng ở mức độ trung bình (IC50 = 214,75 µg/ml).
Kết luận
Từ cao phân đoạn ethyl acetat có hoạt tính chớng oxy hóa mạnh nhất đã phân lập và xác định
được cấu trúc của 6 hợp chất: AC1; 2,3-epoxydeca-4,6,8-triyn-1-ol; acid vanillic;
demethoxypinoresinol; acid succinic; tetraphyllin A và deidaclin. Trong đó, AC1 là hợp chất
mới, lần đầu tiên được phân lập trong tự nhiên. Các hợp chất phân lập được thử nghiệm hoạt
tính chớng oxy hóa cho thấy hầu hết các hợp chất đều thể hiện tác dụng rất yếu, chỉ có hợp
chất demethoxypinoresinol có tác dụng ở mức độ trung bình.

iii
.


.

ABSTRACT
Master’s thesis – Academic course: 2018 – 2020
Speciality: Pharmacognosy – Traditional Pharmacy Speciality code: 8720206
CHEMICAL CONSTITUENTS AND ANTIOXIDANT ACTIVITIES OF ADENIA
CARDIOPHYLLA (MAST.) ENGL., PASSIFLORACEAE
Dong Thanh Hanh
Supervisors: PhD. Ma Chi Thanh
Introduction
Adenia cardiophylla is a specie of the genus Adenia, Passifloraceae. The roots of the plant
have a slightly sweet taste; used as a tonic for people with lungs inflamatory diseases. Up to

now, most of the published chemical composition of species in the genus Adenia has been
made mainly on A. volkensii and A. digitata, while there has not been any research for A.
cardiophylla. The project "Chemical constituents and antioxidant activities of Adenia
cardiophylla (Mast.) Engl., Passifloraceae)" was conducted to contribute scientifically and
practically of this medicinal herb.
Materials
Stems and roots of A. cardiophylla were collected from Tinh Bien district, An Giang
province in November 2018.
Methods
The antioxidant activities of extracts, fractions and isolated compounds were tested by invitro DPPH assay. Percolation, liquid-liquid distribution, column chromatography, sizeexclusion chromatography, recrystallization were used for extracting and isolating. Structure
of isolated compound were determined by MS and NMR spectrometric methods.
Results and discussion
The antioxidant activity survey showed that the results of fractions decreased in order: ethyl
acetate > n-BuOH > water > n-hexane. 7 kg of medicinal powder was extracted with 70%
alcohol, then liquid-liquid separated to give four fractions: n-hexane (48 g), ethyl acetate (45
g), n-BuOH (37 g) and water (254 g). From ethyl acetate fraction was isolated and
determined the structure of 6 compounds: AC1; 2,3-epoxydeca-4,6,8-triyn-1-ol; vanillic
acid; demethoxypinoresinol; succinic acid; tetraphyllin A and deidaclin. In which, AC1 is a
novel compound, isolated in nature for the first time. Investigation of antioxidant activity of
isolated compounds showed that most of the compounds showed very weak effects, only the
demethoxypinoresinol showed a moderate effect (IC50 = 214.75 µg / ml).
Conclutions
From the ethyl acetate fraction with the strongest antioxidant activity, 6 compounds were
isolated: AC1; 2,3-epoxydeca-4,6,8-triyn-1-ol; vanillic acid; demethoxypinoresinol;
succinic acid; tetraphyllin A and deidaclin. In which, AC1 is a novel compound. The
isolates tested for antioxidant activity showed that most of the compounds exhibited very
weak effects, only the demethoxypinoresinol compound with a moderate effect.

iv
.

.

MỤC LỤC
MỤC LỤC ................................................................................................................ iii
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ vii
DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. viii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...............................................................................ix
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
1. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3
1.1.

THỰC VẬT HỌC ................................................................................................... 3

1.1.1

Vị trí phân loại ................................................................................................. 3

1.1.2

Đặc điểm thực vật học của họ Lạc tiên (Passifloraceae) ................................. 3

1.1.3

Đặc điểm lồi Adenia cardiophylla ................................................................. 4

1.2.

THÀNH PHẦN HĨA HỌC .................................................................................... 5

1.3.

TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA CHI ADENIA ......................................................... 7

1.3.1

Gây độc tế bào ................................................................................................. 7

1.3.2

Tác dụng an thần .............................................................................................. 7

1.3.3

Tác dụng chống đông máu ............................................................................... 7

1.3.4

Tác dụng hạ đường huyết ................................................................................ 7

1.3.5

Tác dụng chống sốt rét ..................................................................................... 8

1.3.6

Tác dụng chống oxy hóa .................................................................................. 8

1.3.7

Tác dụng giảm đau ........................................................................................... 8

1.4.

CƠNG DỤNG CỦA DÂY PHỤC LINH ............................................................... 8

1.5. CHẤT CHỐNG OXY HÓA VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC TÁC DỤNG
CHỐNG OXY HÓA .......................................................................................................... 9
1.5.1

Chất chớng oxy hóa ......................................................................................... 9

1.5.2

Cơ chế hoạt động của chất chớng oxy hóa ...................................................... 9

1.5.3

Các phương pháp nghiên cứu tác dụng chớng oxy hóa in vitro .................... 10

2. CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....... 12
2.1.

NGUYÊN LIỆU .................................................................................................... 12

2.2.

DUNG MƠI VÀ HĨA CHẤT .............................................................................. 12

2.3.

TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ..................................................................... 13

v
.


.

2.4.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................................... 14

2.4.1

Nghiên cứu về thực vật học ........................................................................... 14

2.4.2

Thử tinh khiết................................................................................................. 14

2.4.3

Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật ....................................................... 14

2.4.4

Chiết xuất, phân lập các chất ......................................................................... 14

2.4.5

Thử tác dụng sinh học .................................................................................... 16

3. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...................................................... 19
3.1.

KHẢO SÁT THỰC VẬT HỌC ............................................................................ 19

3.1.1

Đặc điểm hình thái ......................................................................................... 19

3.1.2

Đặc điểm vi phẫu lá ....................................................................................... 19

3.1.3

Đặc điểm vi phẫu thân ................................................................................... 21

3.1.4

Soi bột dược liệu ............................................................................................ 23

3.2.

THỬ TINH KHIẾT ............................................................................................... 23

3.3.

HÀM LƯỢNG CHẤT CHIẾT ĐƯỢC ................................................................. 24

3.4.

KHẢO SÁT HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HĨA......................... 24

3.4.1

Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật ....................................................... 24

3.4.2

Chiết xuất và tách phân đoạn ......................................................................... 26

3.4.3

Đánh giá hoạt tính chớng oxy hóa của các cao phân đoạn ............................ 27

3.4.4

Phân lập các hợp chất từ cao ethyl acetat (ACE) ........................................... 28

3.4.5

Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập được trên SKLM .................... 39

3.4.6

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được .............................................. 40

3.4.7

Đánh giá tác dụng chớng oxy hóa của các chất phân lập được từ cao ACE.. 51

3.5.

BÀN LUẬN .......................................................................................................... 52

4. CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................... 55
4.1.

KẾT LUẬN ........................................................................................................... 55

4.2.

ĐỀ NGHỊ .............................................................................................................. 56

5. TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 57
6. PHỤ LỤC ......................................................................................................PL.1

vi
.


.

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Vị trí phân loại của chi Adenia ............................................................................. 3
Hình 1.2. Thân, lá, hoa, quả của lồi Adenia cardiophylla ................................................... 5

Hình 2.1. Nguyên liệu nghiên cứu dược liệu Dây phục linh............................................... 12
Hình 3.1. Một sớ hình ảnh của dược liệu Dây phục linh .................................................... 19
Hình 3.2. Vi phẫu và sơ đồ lá Dây phục linh ...................................................................... 20
Hình 3.3. Vi phẫu phiến lá Dây phục linh........................................................................... 21
Hình 3.4. Vi phẫu thân Dây phục linh ................................................................................ 22
Hình 3.5. Một số cấu tử trong bột dược liệu Dây phục linh ............................................... 23
Hình 3.6. Sơ đồ chiết – tách phân đoạn của dược liệu Dây phục linh ................................ 26
Hình 3.7. Sắc ký đồ các cao phân đoạn Dây phục linh ....................................................... 27
Hình 3.8. Sắc ký đồ các phân đoạn thu được từ sắc ký cột nhanh cao ACE ...................... 29
Hình 3.9. Sắc ký đồ các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cở điển ACE4 ......................... 31
Hình 3.10. Sắc ký đồ các phân đoạn thu được từ sắc ký rây phân tử ACE4.34 ................. 32
Hình 3.11. Sắc ký đồ các phân đoạn thu được từ sắc ký rây phân tử ACE4.9 ................... 34
Hình 3.12. Sắc ký đồ các phân đoạn thu được từ sắc ký rây phân tử ACE4.11 ................. 35
Hình 3.13. Sắc ký đồ các phân đoạn sắc ký cột cở điển ACE11 ........................................ 37
Hình 3.14. Sắc ký đồ các phân đoạn sắc ký rây phân tử ACE11.3 ..................................... 38
Hình 3.15. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao ethyl acetat Dây phục linh ........................ 38
Hình 3.16. Sắc ký kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập từ cao ACE ..................... 39
Hình 3.17. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC, COSY của AC2 ............................ 42
Hình 3.18. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của AC3............................... 43
Hình 3.19. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC, COSY chính của AC4 .................. 46
Hình 3.20. Cấu trúc hóa học của AC7 ................................................................................ 47
Hình 3.21. Các tương tác HMBC và COSY chính của AC9 .............................................. 48
Hình 3.22. Cấu trúc hóa học của Deidaclin (1R) và Tetraphyllin A (1S) ........................... 49
Hình 3.23. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC, COSY chính của AC1 .................. 51

vii
.


.

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả thử tinh khiết của bột dược liệu Dây phục linh ..................................... 24
Bảng 3.2. Hàm lượng chất chiết được của dược liệu Dây phục linh................................... 24
Bảng 3.3. Kết quả phân tích sơ bộ hóa thực vật của dược liệu Dây phục linh.................... 24
Bảng 3.4. Kết quả đánh giá HTCO của các cao phân đoạn ................................................ 27
Bảng 3.5. Kết quả sắc ký cột nhanh cao ACE ..................................................................... 28
Bảng 3.6. Kết quả sắc ký cột cổ điển phân đoạn ACE4 ...................................................... 30
Bảng 3.7. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn ACE4.34 ................................................ 32
Bảng 3.8. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn ACE4.9 .................................................. 33
Bảng 3.9. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn ACE4.11 ................................................ 34
Bảng 3.10. Kết quả sắc ký cột cổ điển phân đoạn ACE11 .................................................. 36
Bảng 3.11. Kết quả sắc ký cột cổ điển phân đoạn ACE11.3 ............................................... 37
Bảng 3.12. Đặc điểm trên sắc ký lớp mỏng của các chất phân lập được từ cao ACE ........ 40
Bảng 3.13. Dữ liệu phổ NMR của AC2 .............................................................................. 41
Bảng 3.14. Dữ liệu phổ NMR của chất AC3....................................................................... 43
Bảng 3.15. Dữ liệu phổ NMR của AC4 .............................................................................. 45
Bảng 3.16. Dữ liệu phổ NMR của AC7 .............................................................................. 46
Bảng 3.17. Dữ liệu phổ NMR của AC9 .............................................................................. 48
Bảng 3.18. Dữ liệu phổ NMR của AC1 .............................................................................. 50
Bảng 3.19. Kết quả thử nghiệm HTCO của các chất tinh khiết .......................................... 52

viii
.


.

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ tắt

Ý nghĩa

Chữ nguyên

br

broad

Đỉnh rộng

d

doublet

Đỉnh đôi

DĐVN

Dược điển Việt Nam
Distortionless Enhancement by
Polarization Transfer
Dimethyl sulfoxide

DEPT
DMSO
DPPH

HTCO

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
Heteronuclear Multiple Bond
Correlation
Heteronuclear Single Quantum
Correlation
Hoạt tính chớng oxy hóa

IC50

Inhibitory concentration 50%

Nồng độ ức chế 50%

J

Coupling constant

Hằng số ghép

m

multiplet

Đỉnh phức tạp

MS

Mass Spectroscopy

Phổ khối

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

Cộng hưởng từ hạt nhân

ppm

parts per million

Phần triệu

PDA

Photodiode array

Dãy diod quang

s

Singlet

Đỉnh đơn

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

TLTK

Tài liệu tham khảo

TT

Thuốc thử

UV-Vis

Ultraviolet - Visible

VS

Vanillin-acid sulfuric

HMBC
HSQC

Tử ngoại - khả kiến

ix
.


.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là một trong những quốc gia có nền y học cở trùn lâu đời sử dụng nhiều
loại thảo dược trong điều trị bệnh và nâng cao sức khoẻ. Việc sử dụng các cây thuốc
ngày càng được chú trọng do có tiềm năng to lớn trong việc nghiên cứu phát triển các

loại cây thuốc trong điều trị bệnh.
Hướng nghiên cứu tìm ra các hợp chất có hoạt tính sinh học từ các loại thảo dược
đang là lĩnh vực được nhiều nhà khoa học quan tâm. Đó là những nghiên cứu cơ bản
về xác định thành phần hoá học và tìm ra hoạt chất có tác dụng chữa bệnh và nâng
cao sức khoẻ con người.
Dây Phục linh là một loài thuộc chi Adenia, họ Passifloraceae. Tập trung chủ yếu ở
Bình Dương, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu, An Giang, Kiên Giang. Cịn có ở Ấn
Độ, Butan, Trung Quốc, Mianma, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaixia. Lương y
Nguyễn Văn Ẩn (An Giang) cho rằng sau khi đã chế biến, rễ cây có vị hơi ngọt, tính
nóng; dùng làm th́c bổ phổi cho người yếu phổi, hay đau ran vùng phởi và phía
trên bả vai, thường phới hợp với các vị th́c khác như Bí kỳ nam, Dây Bình bát, gỗ
cây Ngái, củ Cỏ ống và Rau dền gai, liều lượng bằng nhau, mỗi thứ một nắm nhỏ,
sắc nước uống. [3]
Theo các nghiên cứu trên thế giới cho thấy, thành phần hóa học chính của các cây
cùng chi Adenia là protein độc, cyanogenic, lectin, polyacetylen và flavonoid, ngồi
ra cịn có alkaloid.
Cho đến nay, hầu hết những công bố về thành phần hóa học của các lồi trong chi
Adenia chủ yếu được thực hiện trên loài A. volkensii và A. digitata, cịn đới với Dây
Phục Linh (Adenia cardiophylla) vẫn chưa có nghiên cứu về thành phần hóa học và
tác dụng dược lý.
Chi Adenia có nhiều tác dụng dược lý nởi bật như: kháng khuẩn, kháng viêm, chớng
oxy hóa, chớng đơng máu, gây độc tế bào, có tác dụng trong điều trị trầm cảm, giải
lo âu.

1
.


.

Để đóng góp về mặt khoa học và thực tiễn của loài này, đề tài “Nghiên cứu thành
phần hoá học hướng tác dụng chống oxy hóa của Dây Phục linh (Adenia
cardiophylla (Mast.) Engl., Passifloraceae)” được tiến hành với các mục tiêu chính
sau:
-

Khảo sát đặc điểm thực vật học của Dây Phục linh.

-

Chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn của Dây phục linh.

-

Đánh giá tác dụng chớng oxy hố trên các cao phân đoạn.

-

Phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất từ phân đoạn tiềm năng.

-

Thử tác dụng chớng oxy hố trên hợp chất phân lập được.

2
.


.

1.
1.1.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

THỰC VẬT HỌC

1.1.1 Vị trí phân loại
Theo phân loại của Takhtajan (2009) [37], chi Adenia được xếp vào họ Lạc tiên
(Passifloraceae) với sơ đồ vị trí phân loại được trình bày ở Hình 1.1.

Hình 1.1. Vị trí phân loại của chi Adenia

1.1.2 Đặc điểm thực vật học của họ Lạc tiên (Passifloraceae)
Đặc điểm thực vật chung của họ Lạc tiên như sau: Dây leo thân cỏ hay thân gỗ, có
thể dài đến 20 m; ngoại trừ chi Passiflora tổ Astrophea ở vùng Nam Mỹ và 2 hoặc 3
lồi Adenia ở Đơng Phi, là cây nhỡ khơng có hay có gai. Lá rụng sớm, mọc so le
(ngoại trừ Passiflora cochinchinensis), có lá kèm, mép nguyên hay khía răng, đơn
hay có thùy, đơi khi rất sâu (Deidamia) như một lá kép; thường có tuyến trên ćng
lá, mép lá hay phiến lá, đơi khi (ví dụ Passiflora foetida) có lơng giả có tuyến. Cụm
hoa ln ở nách lá và là xim, nhưng thường thay đổi do sự trụy hay do các bộ phận
bị thay thế (thông thường hoa giữa và ćng của nó biến đởi thành vịi ćn). Hoa

3
.


.

đều hoặc hơi khơng đều, lưỡng tính, đơn tính khác gớc, cùng gớc hay tạp tính (Adenia,

Tetrapathea), thường được bao bởi 3 lá bắc (thật ra là 1 lá bắc và 2 lá bắc con mọc
trên ćng hoa); đài dính nhau ở gớc thành hình hũ hay hình ớng, trên chia 5 thùy (4
ở Dilkea và Mitostemma); cánh hoa thường là 4, 5, đôi khi 0, 3, 6 hay 8, rời, đính trên
ớng đài; tràng phụ rời hay dính, gồm những sợi đính thành nhiều vịng; 5 hay 10 nhị,
đơi khi 4, 6 hay 8, đính trên ćng nhị nhụy hoặc đính trên ớng đài, chỉ nhị rời hay
dính thành ống; bao phấn 2 ô, nứt dọc; hoa cái có khi có nhị lép dạng giùi (Adenia,
Tetrapathea); 3-5, đơi khi 4 hay 8, lá noãn tạo thành bầu 1 ô, nhiều nỗn, bầu khơng
ćng (ngoại trừ ở Passiflora, hoa đực của Adenia và Tetrapathea) hoặc được mang
bởi cuống nhụy hay ćng nhị nhụy, noãn đảo; vịi nhụy có hay khơng có; 3-5, đơi
khi 4, đầu nhụy hình đầu hay hình thận. Quả mọng (có thể to bằng quả dưa hấu như
Passiflora quadrangularis) hình cầu hay hình trứng, hiếm khi thn dài, thịt nhày và
chua, vỏ quả ngoài đôi khi dai (Dilkea) hoặc quả nang chẻ ơ hình thoi, mở thành 3
mảnh vỏ. Hạt có ćng dài, dẹp, có nội nhũ, mầm thẳng; vỏ hạt thường có chấm hay
núm. [11]
1.1.3 Đặc điểm loài Adenia cardiophylla
Tên khoa học: Adenia cardiophylla, họ Lạc tiên – Passifloraceae.
Tên khác: Thư diệp tim.
Mô tả: Dây leo dài hàng chục mét, đường kính 10 mm, có tua ćn. Lá hình trái xoan
rộng hoặc trái xoan mắt chim, hình tim sâu ở gớc, có tai nữa trịn, đột ngột thót nhọn
thành đi ở chóp, dài 12 – 18 cm, có gân hình chân vịt, với hai tuyến ở trên cuống
lá. Hoa thành xim dạng ngù trải ra, mang một tua ćn. Quả hình thoi rộng, dài 5 – 7
cm, rộng 25 mm, màu vàng – đỏ xỉn. Hạt hình lăng kính, 7 – 8 mm, có lỗ tở ong ở
giữa. [3]
Sinh thái: mọc rải rác trong rừng rậm.

4
.


.

Hình 1.2. Thân, lá, hoa, quả của lồi Adenia cardiophylla

1.2.

THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Theo các nghiên cứu trên thế giới cho thấy, thành phần hóa học chính của các cây
cùng chi Adenia là protein độc, cyanogenic, lectin, polyacetylen và flavonoid, ngoài
ra cịn có alkaloid.
Năm 1995, theo nghiên cứu của Fekadu Fullas và cộng sự, một polyacetylen được
phân lập từ lá Adennia gummifera là gummiferol [15].

Gummiferol
Năm 1982, nghiên cứu của A. Ulubelen và cộng sự, phân lập được hai flavonoid từ
lá Adenia manni: 2’’-xylosylvitexin và vitexin [38].

5
.


.

2″-xylosylvitexin

vitexin

Năm 1978, nghiên cứu của A.T.D. Gondwe và cộng sự, phân lập được hai cyanogenic
glycosid từ Adenia volkensii: tetraphyllin B và epi-tetraphyllin B [17].

tetraphyllin B
Năm 1985, nghiên cứu của Fiorenzo Stirpe và cộng sự, phân lập được một lectin độc
từ Adenia volkensii là volkensin [36].

volkensin
Năm 2018, nghiên cứu của Mamta Sharma và cộng sự, phân lập và xác định cấu trúc
một lectin từ Adenia hondala là N-Acetylgalactosamin [32].
Năm 1978, nghiên cứu của Anna Gasperi-Campani và cộng sự, phân lập được một
protein độc từ Adenia digitata là modeccin [16].
Thành phần hóa học của Dây Phục Linh
Cho đến nay, hầu hết những cơng bớ về thành phần hóa học của các lồi trong chi
Adenia chủ yếu được thực hiện trên loài A. volkensii và A. digitata, cịn đới với Dây
Phục Linh (Adenia cardiophylla) vẫn chưa có nghiên cứu về thành phần hóa học.

6
.


.

1.3.

TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA CHI ADENIA

Chi Adenia có nhiều tác dụng dược lý nổi bật và quan trọng như: kháng khuẩn, kháng
viêm, chớng oxy hóa, chớng đơng máu, gây độc tế bào, có tác dụng trong điều trị
trầm cảm, giải lo âu.
Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để chứng minh các tác dụng của chi Adenia.
1.3.1 Gây độc tế bào
Năm 2018, nghiên cứu của Mamta Sharma và cộng sự, thử nghiệm của hợp chất Nacetylgalactosamin trên sự ức chế phát triển của lectin từ lồi Adenia hondala trên

dịng tế bào HepG2 với IC50 là 4,8 μg/ml [32].
1.3.2 Tác dụng an thần
Năm 2015, nghiên cứu của Ismail O. Ishola và cộng sự, thử nghiệm ảnh hưởng của
dịch chiết ethanol của lá Adenia cissampeloides trên tác dụng chống trầm cảm, giải
lo âu. Kết quả cho thấy ở liều 100-200 mg/kg có tác dụng đáng kể trên hoạt động bơi
của chuột. Cơ chế được giải thích là do tương tác của các thành phần dịch chiết thông
qua recepter dopamin D2 [19].
1.3.3 Tác dụng chống đông máu
Năm 2016, nghiên cứu của Wilson Bright Nyansah và cộng sự, thử nghiệm tác dụng
chống đông máu của dịch nước phần trên mặt đất Adenia cissampeloides kết hợp với
Pseudocedrela kotschyi. Kết quả cho thấy dịch chiết nước có tác dụng đáng kể trên tác
dụng chớng đơng máu in vitro và an toàn để sự dụng ở liều nhỏ hơn 2000 mg/kg [26].
1.3.4 Tác dụng hạ đường huyết
Năm 2013, nghiên cứu của J.A. Sarkodie và cộng sự, thử nghiệm in vivo tác dụng hạ
đường huyết của dịch chiết cồn của A. lobata và hợp chất phân lập được acid palmatic
trên mơ hình chuột đái tháo đường bởi Streptozocin. Kết quả cho thấy dịch chiết ở
liều 150-600 mg/kg và hợp chất tinh khiết ở liều 180 mg/kg có tiềm năng trên tác
dụng hạ đường huyết [31].

7
.


.

1.3.5 Tác dụng chống sốt rét
Năm 2012, nghiên cứu của Kofi Annan và cộng sự, thử nghiệm chống sốt rét in vitro
trên chủng Plasmodium falciparum kháng chloroquin. Kết quả cho thấy dịch chiết
ethanol của Adenia cissampeloides có tác dụng kháng ký sinh trùng với IC50 là 8,52
µg/ml [9].

1.3.6 Tác dụng chống oxy hóa
Năm 2012, thử nghiệm in vitro tác dụng chớng oxy hóa của các dịch chiết phân đoạn
khác nhau của Adenia lobata được thực hiện bởi Agoreyo và cộng sự tại Pakistan.
Kết quả cho thấy phân đoạn ethyl acetat thể hiện hoạt tính chớng oxy hóa mạnh mẽ
với phần trăm hoạt tính chớng oxy hóa là 63,87 % [6].
1.3.7 Tác dụng giảm đau
Thử nghiệm in vivo gây đau bằng acid acetic trên chuột cho kết quả cao chiết nước
lá của loài A. cissampeloides với liều 400 mg/kg cho tác dụng làm giảm số lần đau
quặn bụng ở chuột rõ rệt, số lần đau quặn bụng giảm nhiều hơn so với chứng dương
dùng diclofenac liều 1 mg/kg. Cơ chế được đưa ra do sự ức chế enzyme
cyclooxygenase làm giảm sự phóng thích prostaglandin [26].
Tác dụng dược lý của cây Dây Phục linh
Cho đến nay, hầu hết những công bố về tác dụng dược lý của các loài trong chi Adenia
là chủ yếu, cịn đới với Dây Phục Linh (Adenia cardiophylla) vẫn chưa có nghiên cứu
về thành phần tác dụng dược lý mà chỉ được sử dụng trong dân gian với những bài
th́c cở trùn trị giảm đau, kháng viêm.
1.4.

CƠNG DỤNG CỦA DÂY PHỤC LINH

Người Campuchia dùng nó để bẫy chim bằng cách dùng thóc đã ngâm nước ủ những
bộ phận khác nhau của cây này, thả cho chim ăn, chim sẽ chết khá nhanh sau khi ăn
thóc, nhưng thịt chim vẫn ăn được. Lương y Nguyễn Văn Ẩn (An Giang) cho rằng
sau khi đã chế biến, rễ cây có vị hơi ngọt, tính nóng; dùng làm th́c bở phởi cho
người yếu phởi, hay đau ran vùng phởi và phía trên bả vai, thường phối hợp với các

8
.

.

vị th́c khác như Bí kỳ nam, Dây bình bát, gỗ cây Ngái, củ Cỏ ống và Rau dền gai,
liều lượng bằng nhau, mỗi thứ một nắm nhỏ, sắc nước uống.
Ở Vân Nam (Trung Quốc) thân dây và rễ dùng làm th́c thú y như Qua lâu. [3]
1.5. CHẤT CHỚNG OXY HĨA VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC TÁC
DỤNG CHỚNG OXY HĨA
1.5.1 Chất chống oxy hóa
Chất chớng oxy hóa là một chất hoặc một nhóm hợp chất có trong các loại thực vật
hay dược phẩm, khi hiện diện ở nồng độ thấp vẫn có thể làm giảm đáng kể hoặc ngăn
ngừa các tác động có hại của các loại phản ứng oxy hố về chức năng sinh lý bình
thường ở người. Theo định nghĩa này, không phải tất cả các chất khử tham gia vào
phản ứng hóa học là chất chớng oxy hóa, mà chỉ những hợp chất có khả năng bảo vệ
các mục tiêu sinh học đối với quá trình oxy hóa mới đáp ứng tiêu chí này [22]. Các
hợp chất chớng oxy hóa có thể là enzym hoặc không phải là enzym.
1.5.2 Cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa
Hiện nay, q trình ức chế gớc tự do của chất chớng oxy hóa được giải thích chủ yếu
dựa trên 2 cơ chế:
- Cơ chế 1: Quá trình chuyển electron từ chất chớng oxy hóa sang gớc tự do (Electron
Transfer – ET).
M (III) + AH → AH· + M(II)
- Cơ chế 2: Quá trình chuyển nguyên tử hydro từ chất chớng oxy hóa sang gớc tự do
(Hydrogen Atom Transfer – HAT).
AH + X· → XH + A·
(AH: chất chớng oxy hóa; X·: gớc tự do; M: kim loại chuyển tiếp)
Theo cơ chế cho electron thì năng lượng ion hóa là yếu tớ chính, trong khi theo cơ
chế cho nguyên tử hydro thì năng lượng phân ly liên kết lại là yếu tớ chính quyết định
hiệu quả của q trình chớng oxy hóa. Hai cơ chế này ln xuất hiện đan xen trong
q trình chớng oxy hóa và việc phân biệt chúng rất khó khăn.

9
.


.

Khi một gốc tự do nhận một electron hoặc một ngun tử hydro từ một phân tử chất
chớng oxy hóa thì sẽ tạo thành một phân tử, gớc tự do mới được tạo thành có khả
năng hoạt động yếu hơn gớc tự do ban đầu và khơng cịn khả năng gây hại nữa. Ngồi
ra, chất chớng oxy hóa cịn có khả năng ức chế sự phân hủy của các hydroperoxyd
tạo ra các gốc tự do gây hại. [1]
1.5.3 Các phương pháp nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro
Việc sàng lọc trong các thử nghiệm hóa học dựa trên cơ sở cơ chế hoạt động của chất
chớng oxy hóa, vì vậy có mơ hình thử nghiệm để đánh giá khả năng cho electron và
mơ hình thử nghiệm để đánh giá khả năng cho nguyên tử hydro của chất chống oxy
hóa. Mỗi mơ hình có thể sử dụng th́c thử (chất oxy hóa) khác nhau. Như vậy, mỗi
mơ hình thử nghiệm chỉ cho thấy một khía cạnh về hoạt tính chớng oxy hóa của chất,
do đó để đánh giá khả năng chớng oxy hóa cần phải sử dụng nhiều hơn một mơ hình
thử nghiệm.
Sàng lọc hóa học có ưu điểm là đơn giản, rẻ tiền, có thể thực hiện hàng loạt, nhưng
đây chỉ là thử nghiệm bước đầu, vì chất có hoạt tính chớng oxy hóa tớt trong mơ hình
thử nghiệm hóa học chưa chắc đã có hoạt tính chớng oxy hóa trong cơ thể sinh vật.
Ðể nghiên cứu tác dụng chớng oxy hóa in vitro của các chất, hiện nay có một sớ
phương pháp sau:
Đánh giá bằng khả năng bắt gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)
Ngun tắc:
Chất chớng oxy hóa được cho phản ứng với gốc tự do DPPH. Hoạt tính chớng oxy
hố của chất thể hiện qua tỷ lệ giảm nồng độ của DPPH trước và sau khi phản ứng,
được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng 517 nm.
Khả năng bắt gốc tự do của chất chống oxy hóa thể hiện qua giá trị IC50 (Giá trị IC50:

nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do). Giá trị IC50 càng thấp,
khả năng chớng oxy hóa của chất thử nghiệm càng cao [22].
Đánh giá bằng phản ứng bắt gốc superoxid
Nguyên tắc:

10
.


.

Đánh giá khả năng loại bỏ các gốc tự do của chất nghiên cứu qua việc ngăn chặn sự
tạo thành gớc superoxid. Gớc superoxid hình thành trong phản ứng giữa xanthin và
xanthin oxydase sẽ được định lượng bằng phương pháp khử, sử dụng nitroblue
tetrazolium (NBT), cho phức chất có màu tím được đo quang ở bước sóng 550 nm.
Hoạt tính chớng oxy hố của mẫu thử được thể hiện qua việc làm giảm sự hình thành
phức chất màu tím [7].
Đánh giá bằng phản ứng với hydro peroxid
Nguyên tắc:
Các phân tử H2O2 sinh ra từ chuyển hoá trong cơ thể với nồng độ vô cùng thấp, dễ
dàng bị loại bỏ và không độc hại cho cơ thể. Nhưng nếu hiện diện ở nồng độ cao, chúng
có thể tạo ra các gớc tự do có khả năng phản ứng rất cao, dễ dàng phản ứng với các
chất hữu cơ tạo ra các peroxid và từ đó tạo ra nhiều sản phẩm độc hại cho tế bào.
Hoạt tính chớng oxy hố của mẫu thử được thể hiện qua việc làm giảm lượng H2O2
dẫn đến làm giảm màu của phản ứng giữa H2O2 và đỏ phenol [35].
Đánh giá bằng hoạt tính ức chế gốc tự do NO
Nguyên tắc:
NO phản ứng với oxy tạo ra sản phẩm bền vững là nitrit và nitrat. Hoạt chất ức chế
NO được cho phản ứng cạnh tranh với oxy, kết quả là làm giảm sản phẩm nitrit tạo
thành trong dung dịch nước.

Nồng độ nitrit được xác định bằng phản ứng trắc quang sử dụng thuốc thử Griess tạo
thành hợp chất màu diazo bền vững và có bước sóng hấp thụ cực đại ở 540 nm (thuốc
thử Griess là hỗn hợp dung dịch N-1-napthylethylene diamine dihydrochloride (NED)
và sulfanilamide trong môi trường H3PO4). Dựa trên sự giảm nồng độ nitrit tạo thành,
tính được khả năng bắt gớc tự do NO của hoạt chất theo tỷ lệ phần trăm ức chế. [5]

11
.


.

2.

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.

NGUYÊN LIỆU

Dây Phục linh (Adenia cardiophylla (Mast.) Engl.), 35 kg thân và rễ dược liệu tươi
được thu hái vào tháng 11 năm 2018 tại huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang; mẫu được
lưu tại bộ môn Dược Liệu, Khoa Dược, Đại Học Y Dược TP.HCM. Dây Phục Linh
được phơi khô, xay thành bột, bảo quản ở nhiệt độ phịng.

Đoạn thân mang tua ćn

Thân rễ

Thân rễ cắt lát

Hình 2.1. Nguyên liệu nghiên cứu dược liệu Dây phục linh

2.2.

DUNG MƠI VÀ HĨA CHẤT

- Dung mơi dùng trong chiết xuất và phân lập: cồn 96%, n – hexan, ethyl acetat, n butanol, methanol, cloroform, acid acetic, aceton, acid formic, acid sulfuric.
- Bộ hố chất phân tích sơ bộ thành phần hố thực vật.
- Th́c thử: FeCl3, vanillin – sulfuric (VS).
- Silicagel GF254 bản nhôm tráng sẳn (Merck) dùng trong sắc ký lớp mỏng.
- Silica gel cỡ hạt 40-63 μm và 15-40 μm của Merck, Trung Quốc; sephadex LH-20
dùng cho sắc ký cột.

12
.


.

- Dùng cho mục đích đánh giá hoạt tính chớng oxy hóa: DPPH (Sigma-Aldrich, sớ
lơ: STBH0044), vitamin C (DSM-UK, sớ lơ: 00490114)
2.3.

TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

- Bình chiết ngấm kiệt.
- Máy cơ quay Buchi 1 lít, 20 lít.
- Bếp cách thuỷ (Memmert, Model ULM 500).
- Tủ sấy Gallenkamp (Anh), tủ sấy chân khơng.
- Đèn UV bước sóng 254/365 nm.

- Lị nung Carbolites CSF1200 (Anh).
- Cân điện tử độ nhạy 0,1 g (Sartorious)
- Cân phân tích BP-221S (Sartorious).
- Máy siêu âm.
- Kính hiển vi quang học CX-21 (Olympus).
- Phễu Buchner, bình hút chân không, máy bơm chân không.
- Máy đo phổ UV-Vis (Shimadzu, UV-1700).
- Máy đo LC/MS, máy HPLC.
- Tủ lạnh.
- Máy xác định độ ẩm MA-45 (Sartorious).
- Các thiết bị sắc ký, xác định cấu trúc:
+ Cột sắc ký: cột VLC (7 x 60 cm), (5 x 60 cm); cột sephadex LH-20 (2,5 x 60
cm); cột cổ điển (2,4 x 40 cm), (2,6 x 50 cm), (2 x 30 cm), (1,4 x 20 cm).
+ Hệ thống đo khối phổ (Micromass Quattro micro API – Waters).
+ Hệ thống đo phổ cộng từ hạt nhân (NMR) BRUKER NEO ADVANCED 400
MHz, tại Viện kiểm nghiệm th́c thành phớ Hồ Chí Minh.
- Các dụng cụ thí nghiệm khác: bình sắc ký, erlen, ớng đong, bình lắng gạn, becher,
đũa khuấy, kẹp ớng nghiệm, kẹp bản mỏng …

13
.


.

2.4.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Nghiên cứu về thực vật học

Khảo sát đặc điểm hình thái dược liệu
-

Mơ tả bộ phận dùng của dược liệu, đặc điểm thực vật học dựa trên quan sát cây
tươi.

-

Khảo sát đặc điểm vi phẫu của dược liệu: quan sát vi phẫu cắt ngang của thân, lá
của dây Phục linh sau khi nhuộm kép trên kính hiển vi.

-

Khảo sát vi học bột dược liệu: dược liệu khô được xay mịn hoàn toàn để làm mẫu
khảo sát vi học. nhận xét cảm quan, quan sát trên kính hiển vi để tìm các cấu tử
đặc trưng và so sánh với tài liệu (nếu có).

2.4.2 Thử tinh khiết
- Độ ẩm dược liệu được tiến hành bằng máy xác định độ ẩm MA-45.
- Tro toàn phần: thực hiện theo phụ lục 9.8, Dược điển Việt Nam V.
- Tro không tan trong acid hydroclorid theo phụ lục 9.7, Dược điển Việt Nam V.
- Kết quả là giá trị trung bình của 3 lần thực hiện độc lập và kết quả thu được có giá
trị ởn định.
2.4.3 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật
Ngun liệu chiết với các dung mơi có độ phân cực tăng dần theo thứ tự: diethyl
ether, cồn, nước.
Xác định các nhóm hoạt chất chính trong từng dịch chiết bằng các phản ứng hoá học
đặc trưng theo phương pháp Ciulei cải tiến.
2.4.4 Chiết xuất, phân lập các chất
Thăm dò phương pháp chiết

- Chọn kỹ thuật chiết: ngấm kiệt, đun hồi lưu, ngâm lạnh, …
- Kiểm tra dịch chiết bằng sắc ký lớp mỏng với các thuốc thử thích hợp: dung dịch
kiềm, FeCl3 hoặc UV254, UV365.

14
.


.

- Khảo sát sơ bộ tác dụng chớng oxy hố và/hoặc hoạt tính kháng viêm của các cao
chiết.
- Chọn dung mơi chiết thích hợp cho hoạt tính chớng oxy hố cao nhất.
Chiết xuất cao toàn phần
Các mẫu nguyên liệu sau khi thu hái được loại bỏ phần hư hỏng, rửa sạch, thái nhỏ, phơi
trong bóng râm rồi sấy ở 50 – 60 °C cho đến khơ, sau đó, mẫu được xay thành bột.
Mẫu dược liệu (7,0 kg mẫu dược liệu khô) được chiết bằng cồn 70%. Dịch chiết thu
được tiến hành lọc, cất loại dung môi dưới áp suất thấp, thu được cao toàn phần.
Cao toàn phần thu được từ dịch chiết của dược liệu được phân tán vào nước và được
chiết phân bớ bằng các dung mơi có độ phân cực tăng dần theo trình tự n-hexan, ethyl
acetat và n-BuOH để tiến hành phân tách các nhóm chức có độ phân cực khác nhau
ra khỏi cao tồn phần. Cơ quay áp suất thấp thu được các cao phân đoạn tương ứng.
Tách phân đoạn
Dùng kỹ thuật phân bố lỏng – lỏng với các dung mơi có độ phân cực khác nhau (nhexan, chloroform, ethyl acetat, …).
Theo dõi quá trình tách phân đoạn bằng phản ứng hố học trên ớng nghiệm và sắc ký
lớp mỏng, phát hiện bằng UV và các th́c thử thích hợp, thu được các phân đoạn
đơn giản.
Khảo sát tác dụng chớng oxy hố trên các phân đoạn này, chọn các phân đoạn có tác
dụng chớng oxy hố tiến hành phân lập các chất tinh khiết.
Phân lập các chất tinh khiết

Dùng phương pháp sắc ký cột nhanh, sắc ký cột cổ điển, sắc ký cột Sephadex cùng
với hệ dung môi đã khảo sát để tách các cao phân đoạn thành các phân đoạn nhỏ hơn.
Tinh khiết hoá
Dùng dung mơi thích hợp để kết tinh lại.

15
.