Nghiên cứu sự tương tác giữa protein p53 và protein bcl2 trong quá trình apoptosis gây ra bởi h2o2 trên dòng tế bào ung thư vú người
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.08 MB, 30 trang )
.
BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH
BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI (TOÀN VĂN)
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG
NGHIÊN CỨU SỰ TƯƠNG TÁC GIỮA PROTEIN P53 VÀ
PROTEIN BCL2 TRONG QUÁ TRÌNH APOPTOSIS GÂY RA BỞI
H2O2 TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ VÚ NGƯỜI.
Mã số:
Chủ nhiệm đề tài: Cử nhân. Võ Văn Thành Niệm
.
.
BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH
BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI (TOÀN VĂN)
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG
NGHIÊN CỨU SỰ TƯƠNG TÁC GIỮA PROTEIN P53 VÀ
PROTEIN BCL2 TRONG QUÁ TRÌNH APOPTOSIS GÂY RA BỞI
H2O2 TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ VÚ NGƯỜI.
Mã số:
Chủ nhiệm đề tài
(ký, họ tên)
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2019
.
.
DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU
Chức danh trong q
STT
Họ và tên
trình thực hiện
Đơn vị cơng tác
nhiệm vụ
1
CN. Võ Văn Thành Niệm
Chủ nhiệm đề tài
2
TS. Bùi Chí Bảo
Thành viên
3
CN. Nguyễn Hoàng Kiều
Anh
.
Thành viên
Trung tâm Y Sinh học Phân tử Đại học Y Dược TP.HCM
Trung tâm Y Sinh học Phân tử Đại học Y Dược TP.HCM
Đại học Quốc Tế - Đại học
Quốc Gia TP.HCM
.
MỤC LỤC
DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU .......................................... i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................................................... iii
DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................................... iii
CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ........................................................................ iv
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc ......................................................................................................... iv
........................................................................................................................................................ iv
............., ngày
tháng
năm 200... ............................................................................................ iv
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1:
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU.......................................................... 2
CHƯƠNG 2:
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................................................... 4
1.
Đối tượng nghiên cứu và địa điểm .................................................................................. 4
2.
Đối tượng và vật liệu ...................................................................................................... 4
3.
Phương pháp thí nghiệm ................................................................................................. 4
3.1.
Nuôi cấy tế bào ......................................................................................................... 4
3.2.
Xử lý H2O2 ................................................................................................................ 4
3.3.
Phương pháp dòng chảy tế bào ................................................................................. 5
3.4.
Nhuộm miễn dịch ...................................................................................................... 5
3.5.
Phương pháp PLA ..................................................................................................... 5
3.6.
Phân tích dữ liệu ....................................................................................................... 6
CHƯƠNG 3:
1.
KẾT QUẢ .......................................................................................................... 7
Khả năng gây apoptosis của H2O2 trên 2 dòng tế bào ung thư vú .................................. 7
1.1.
Sự thay đổi hình thái tế bào ...................................................................................... 7
1.2.
Sự thay đổi về biểu hiện protein do được bằng phương pháp dòng chảy tế bào ...... 7
1.2.1.
Khả năng gây apoptosis của H2O2 trên tế bào MCF-7 ...................................... 8
1.2.2.
Khả năng gây apoptosis của H2O2 trên tế bào MDA-MB-231 .......................... 9
1.2.3. So sanh khả năng gây apoptosis của H2O2 trên 2 dòng tế bào MCF-7 và MDAMB-231 ......................................................................................................................... 10
2. Sự đồng khu trú của P53 và BCl-2 trên 2 dòng tế bào ung thư vú khi xảy ra quá trình
apoptosis ................................................................................................................................ 10
3. Tương tác giữa P53 và BCl-2 trên 2 dòng tế bào ung thư vú khi xảy ra quá trình
apoptosis ................................................................................................................................ 12
CHƯƠNG 4:
THẢO LUẬN .................................................................................................. 13
.
i
.
CHƯƠNG 5:
KẾT LUẬN ..................................................................................................... 15
Tài liệu tham khảo ........................................................................................................................ 16
.
ii
.
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
H2O2
Hydro peroxit
7-AAD
7-Amino-Actinomycin
TP53
Tumor protein p53
BCL2
B-cell lymphoma 2
PLA
Proximity Ligation Assay
DANH MỤC HÌNH
Hình 1: H2O2 thay đổi kiểu hình tế bào sau 10 phút xử lý.............................................................. 7
Hình 2: Phân tích % tế bào apoptotic khi xử lý H2O2 0,16M ở các mốc thời gian khác nhau trên
tế bào MCF-7.A: 10 phút, B: 20 phút, C: 60 phút, D: 90 phút xử lý. E: biểu đồ đại diện cho tỷ lệ
phần trăm tế bào sống, apoptosis sớm, apop apoptosis muộn và các tế bào hoại tử. ..................... 8
Hình 3: Phân tích % tế bào apoptotic khi xử lý H2O2 0,16M ở các mốc thời gian khác nhau trên
tế bào MDA-MB-231. A: 10 phút, B: 20 phút, C: 60 phút, D: 90 phút xử lý. E: biểu đồ đại diện
cho tỷ lệ phần trăm tế bào sống, apoptosis sớm, apop apoptosis muộn và các tế bào hoại tử........ 9
Hình 4: So sánh tỷ lệ phần trăm tế bào sống, apoptosis sớm, apop apoptosis muộn và các tế bào
hoại tử khi xử lý H2O2 0.16M trên 2 dòng tế bào MCF-7 và MDA-MB-231. ............................. 10
Hình 5: . Trong quá trình apoptosis, P53 và BCL-2 đồng khu trú trên dòng tế bào MCF-7 nhưng
khơng có trên dịng tế bào MDA-MB-231 .................................................................................... 11
Hình 6: Trong quá trình apoptosis, sự tương tác giữa P53 và BCL-2 xảy ra trên dịng tế bào
MCF-7 nhưng khơng xảy ra trên dòng tế bào MDA-MB-231. ..................................................... 12
.
iii
.
CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
............., ngày
tháng
năm 200...
BÁO CÁO THỐNG KÊ
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
I. THÔNG TIN CHUNG
1. Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU SỰ TƯƠNG TÁC GIỮA PROTEIN P53 VÀ PROTEIN BCL2 TRONG QUÁ
TRÌNH APOPTOSIS GÂY RA BỞI H2O2 TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ VÚ NGƯỜI.
2. Chủ nhiệm nhiệm vụ:
Họ và tên: Võ Văn Thành Niệm
Ngày, tháng, năm sinh: 26/11/1990
Nam/ Nữ: Nam
Học hàm, học vị: Không
Chức danh khoa học: Không
Chức vụ: Nghiên cứu viên
Điện thoại: Tổ chức: (+84-28) 3855 8411
Nhà riêng: Không
Mobile: 0938512888
Fax: Không
E-mail:
Tên tổ chức đang công tác: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Địa chỉ tổ chức: 217 Hồng Bàng, phường 11, quận 5, TP.HCM
Địa chỉ nhà riêng: 306/20 Quốc lộ 50, thị trấn Cần Giuộc, huyện Cần Giuộc, tỉnh Long
An
3. Tổ chức chủ trì nhiệm vụ(1):
Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Điện thoại: (+84-28) 3855 8411
Fax: (+84-28) 3855 2304
E-mail:
Website: />Địa chỉ: 217 Hồng Bàng, phường 11, quận 5, TP.HCM
1
Tên Khoa hoặc Trung tâm, đơn vị - nơi quản lý trực tiếp cá nhân làm chủ nhiệm đề tài.
.
iv
.
4. Tên cơ quan chủ quản đề tài: Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh
II. TÌNH HÌNH THỰC HIỆN
1. Thời gian thực hiện nhiệm vụ:
- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ tháng 6 năm 2018 đến tháng 6 năm 2019
- Thực tế thực hiện: từ tháng 6 năm 2018 đến tháng 6 năm 2019
- Được gia hạn (nếu có): Khơng
Từ tháng…. năm…. đến tháng…. năm….
2. Kinh phí và sử dụng kinh phí:
a) Tổng số kinh phí thực hiện: 5 tr.đ, trong đó:
+ Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học của nhà trường: 5 tr.đ.
+ Kinh phí từ các nguồn khác: 0 tr.đ.
b) Tình hình cấp và sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học:
Thực tế đạt được
Theo kế hoạch
Ghi chú
Số
TT
1
Thời gian
Kinh phí
Thời gian
Kinh phí
(Số đề nghị
(Tháng, năm)
(Tr.đ)
(Tháng, năm)
(Tr.đ)
quyết tốn)
6 năm 2018
đến tháng 6
năm 2019
5
5
5
2
c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:
Đơn vị tính: Triệu đồng
Thực tế đạt được
Theo kế hoạch
Số
Nội dung
TT
các khoản chi
Tổng
NSKH
Nguồn
khác
Tổng
NSKH
Nguồn
khác
Trả công lao động
(khoa học, phổ
thông)
5
5
0
5
5
0
2
Nguyên, vật liệu,
năng lượng
0
0
0
0
0
0
3
Thiết bị, máy móc
0
0
0
0
0
0
1
.
v
.
4
Xây dựng, sửa chữa
nhỏ
0
0
0
0
0
0
5
Chi khác
0
0
0
0
0
0
5
5
0
5
5
0
Tổng cộng
- Lý do thay đổi (nếu có):
3. Tổ chức phối hợp thực hiện nhiệm vụ:
Số
TT
Tên tổ chức đã
tham gia thực
hiện
Tên tổ chức
đăng ký theo
Thuyết minh
Nội dung
tham gia chủ
yếu
Sản phẩm
chủ yếu đạt
được
Ghi chú*
1
2
- Lý do thay đổi (nếu có):
4. Cá nhân tham gia thực hiện nhiệm vụ:
(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, khơng q 10 người kể
cả chủ nhiệm)
Số
TT
1
Tên cá nhân đã
tham gia thực
hiện
Nội dung tham
gia chính
Võ Văn Thành
Niệm
Chủ nhiệm đề
tài
Tên cá nhân
đăng ký theo
Thuyết minh
Võ Văn Thành
Niệm
Sản phẩm
chủ yếu đạt
được
Ghi
chú*
2
- Lý do thay đổi ( nếu có):
5. Tình hình hợp tác quốc tế:
Thực tế đạt được
Theo kế hoạch
Số
TT
(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa
điểm, tên tổ chức hợp tác, số
đoàn, số lượng người tham gia...)
.
(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa
điểm, tên tổ chức hợp tác, số
đoàn, số lượng người tham gia...)
vi
Ghi chú*
.
1
2
...
- Lý do thay đổi (nếu có):
6. Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:
Số
TT
Theo kế hoạch
Thực tế đạt được
(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa
điểm )
(Nội dung, thời gian, kinh
phí, địa điểm )
Ghi chú*
1
2
...
- Lý do thay đổi (nếu có):
7. Tóm tắt các nội dung, cơng việc chủ yếu:
(Nêu tại mục .....của đề cương, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước
và nước ngoài)
Thời gian
Số
TT
Các nội dung, công việc
chủ yếu
(Các mốc đánh giá chủ yếu)
(Bắt đầu, kết thúc
- tháng … năm)
Theo kế
hoạch
Thực tế đạt
được
1
Nuôi tế bào
4-5 /2018
4-5 /2018
2
Độc tính tế bào
6-7 /2018
6-7 /2018
3
Thiết kế mồi chuyên biệt cho gene
ARID1A
7-9 /2018
7-9 /2018
4
Tách chiết RNA
10-11 /2018
10-11 /2018
5
Tổng hợp cDNA
11-12 /2018
11-12 /2018
6
Khuếch đại gene ARID1A
1-2 /2019
1-2 /2019
.
vii
Người,
cơ quan
thực hiện
.
7
Kiểm tra sự thay đổi hình thái
2-3/2019
2-3/2019
8
Viết báo cáo và tiến hành nghiệm
thu đề tài.
3-4 /2019
3-4 /2019
Số lượng
Theo kế
hoạch
- Lý do thay đổi (nếu có):
III. SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI
1. Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:
a) Sản phẩm Dạng I:
Số
TT
Tên sản phẩm và chỉ
tiêu chất lượng chủ
yếu
Đơn
vị đo
Thực tế
đạt được
1
2
...
- Lý do thay đổi (nếu có):
b) Sản phẩm Dạng II:
Yêu cầu khoa học
cần đạt
Số
Tên sản phẩm
TT
Ghi chú
Theo kế hoạch
Thực tế
đạt được
1
2
...
- Lý do thay đổi (nếu có):
c) Sản phẩm Dạng III:
Số
Yêu cầu khoa học
Tên sản phẩm
cần đạt
TT
.
viii
Số lượng, nơi
công bố
.
Theo
Thực tế
kế hoạch
đạt được
(Tạp chí, nhà
xuất bản)
1
2
...
- Lý do thay đổi (nếu có):
d) Kết quả đào tạo:
Số
TT
Cấp đào tạo, Chuyên ngành
đào tạo
1
Thạc sỹ
2
Tiến sỹ
Số lượng
Theo kế hoạch
Ghi chú
Thực tế đạt
được
(Thời gian kết
thúc)
- Lý do thay đổi (nếu có):
đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp:
Kết quả
Số
Tên sản phẩm
TT
đăng ký
Ghi chú
Theo
Thực tế
kế hoạch
đạt được
(Thời gian kết
thúc)
1
2
...
- Lý do thay đổi (nếu có):
e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế
Số
TT
Địa điểm
Tên kết quả
đã được ứng dụng
.
Thời gian
ix
(Ghi rõ tên, địa
chỉ nơi ứng dụng)
Kết quả
sơ bộ
.
1
2
2. Đánh giá về hiệu quả do đề tài mang lại:
a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:
(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ cơng nghệ so
với khu vực và thế giới…)
b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:
(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do nhiệm vụ tạo ra so với các sản phẩm cùng
loại trên thị trường…)
3. Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài:
Số
Thời gian
Nội dung
TT
I
thực hiện
Ghi chú
(Tóm tắt kết quả, kết luận
chính, người chủ trì…)
Báo cáo tiến độ
Lần 1
…
II
Báo cáo giám định giữa kỳ
Lần 1
….
Chủ nhiệm đề tài
(Họ tên, chữ ký)
.
Thủ trưởng tổ chức chủ trì
(Họ tên, chữ ký và đóng dấu)
x
.
MỞ ĐẦU
TP53 là gen đột biến thường xuyên nhất được tìm thấy trong các khối u ở người và
protein của nó đóng vai trị then chốt trong việc điều chỉnh q trình apoptosis. Thật vậy, kích
hoạt TP53 trong các tế bào ung thư đã được coi là một chiến lược hứa hẹn có thể được theo đuổi
cho các thử nghiệm lâm sàng. Trong điều kiện bình thường, xét về chức năng của nó trong q
trình apoptosis, P53 kích hoạt sự kiện này thông qua các con đường phụ thuộc phiên mã và con
đường không phụ thuộc phiên mã. Trong con đường phiên mã, P53 gây tăng biểu hiện các gen
tiền apoptosis và ngược lại, ức chế các gen kháng apoptosis. Mặt khác, sự tương tác giữa P53 và
các thành viên khác trong gia đình protein BCL-2, chủ yếu là trong ty thể, khởi đầu q trình
apoptosis khơng phụ thuộc phiên mã. Sự biến dạng về cấu trúc trong các dòng tế bào có P53 đột
biến làm có thể giảm khả năng liên kết của nó với BCL-2. Một nghiên cứu gần đây cho thấy
trong các dòng tế bào ung thư vú, chỉ có loại P53 hoang dã có khả năng liên kết với các thành
viên gia đình protein BCL-2, tiến hành quá trình apoptosis. Trong nghiên cứu này, chúng đưa ra
giả thuyết rằng sự tương tác của P53 và BCL-2 trong trường hợp apoptosis bị ảnh hưởng bởi cấu
trúc bất thường của P53 gây ra bởi đột biến. Để kiểm tra giả thuyết, các dòng tế bào P53 hoang
dã và đột biến (MCF-7 và MDA-MB-231, tương ứng) đã được xử lý 10 phút với hydro peroxide
0,16M để trải qua quá trình apoptosis. Sau đó, các tế bào đượcnhuộm miễn dịch huỳnh quang với
các kháng thể thích hợp để kiểm ra các tín hiệu đồng định vị của hai protein này, sau đó sử dụng
phương pháp PLA để kiểm tra sự liên kết của 2 protein nói trên. Kết quả cho thấy dịng tế bào
MCF-7 có lượng tín hiệu tương tác giữa P53 và BCL-2 cao hơn đáng kể so với MDA-MB-231
(P <0,0001). Phát hiện này cho thấy rằng P53 đột biến, có sự biến dạng về cấu trúc, dẫn đến
tương tác khơng đáng kể với BCL-2, và do đó ảnh hưởng tiêu cực đến vai trị của nó trong điều
hịa
q
.
trình
1
apoptosis.
.
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Ung thư vú là một trong những loại ung thư ác tính phổ biến nhất ở phụ nữ, chiếm 18%
trong số tất cả các loại ung thư ở phụ nữ [1]. Tỷ lệ tử vong của bệnh đã giảm hơn 25% do những
tiến bộ trong hóa trị liệu cùng với việc sử dụng tamoxifen. Tuy nhiên, ung thư vú vẫn gây chết
người và nghiên cứu trong lĩnh vực này đang tập trung làm nổi bật các cơ chế đáp ứng và kháng
thuốc điều trị, trong đó apoptosis đóng vai trị quan trọng. Cụ thể, sự phát triển vú bình thường
địi hỏi phải có apoptosis thích hợp, trong khi sự phát triển khối u tương quan với sự tăng tỷ lệ
apoptosis và tăng sinh [2]. Các trường hợp gây ra sự xáo trộn trong sự cân bằng giữa apoptosis
và tăng sinh dễ bị tích lũy các đột biến gây ung thư. Trong số các chất gây cảm ứng apoptotic
khác nhau, hydro peroxide (H2O2) được coi là mạnh nhất vì khả năng tạo ra các gốc hydroxil [3].
Những phân tử này sau đó gây ra vô số thiệt hại, bao gồm các liên kết ngang DNA-protein, đứt
sợi DNA, khi không thể sửa chữa được sẽ gây ra apoptosis.
Apoptosis gây ra bởi kháng nguyên khối u tế bào P53 (TP53) được thừa nhận rộng rãi
như là một cơ chế trung tâm của ức chế khối u. Khái niệm này được thiết lập dựa trên thực tế
rằng P53 là gen đột biến thường xuyên nhất được tìm thấy trong các khối u ở người. Thật vậy,
kích hoạt P53 trong các tế bào ung thư đã được coi là một chiến lược đầy hứa hẹn có thể được
theo đuổi cho các thử nghiệm lâm sàng [4]. Trong các tế bào bình thường, P53 hoạt động như
một protein giữ cửa quyết định, dưới tác động của đột biến gen, các tế bào bị ảnh hưởng sẽ phải
trải qua quá trình tự hủy, và bị bắt giữ chu kỳ tế bào hoặc lão hóa[5]. Về chức năng của nó trong
apoptosis, P53 điều hịa sự kiện này thơng qua các con đường phụ thuộc vào phiên mã và độc lập
phiên mã. Trong con đường phụ thuộc vào phiên mã, P53 tạo ra các gen proapoptotic và ngược
lại, ức chế các gen chống apoptotic [6]. Trong con đường độc lập phiên mã, sau khi các kích
thích căng thẳng như thuốc thử gây tổn hại DNA gây ra tác dụng không thể đảo ngược của chúng
trên các tế bào, P53 tích lũy trong cytosol và nhanh chóng chuyển sang ty thể. Vùng liên kết đầu
cuối N của P53 sau đó liên kết với các thành viên gia đình protein BCL-2, cư trú chủ yếu ở ty thể
và đóng vai trị chủ chốt trong việc điều chỉnh các sự kiện gây căng thẳng oxy hóa, khởi đầu sự
kiện apoptotic độc lập với phiên mã[7]. Đặc biệt, sự gắn kết của P53 nội sinh với BCL-2, một
loại protein chống ung thư, vơ hiệu hóa các tác động của nó và kích hoạt một chuỗi các sự kiện
báo hiệu trong ty thể mà sau đó thấm vào bên ngoài màng ty thể và thúc đẩy hoạt hóa caspase 9
[8]. Cơ chế mà P53 tương tác với BCL-2, tuy nhiên, vẫn khó nắm bắt.
.
2
.
Trong nghiên cứu này, tương tác P53 và BCL-2 trong MCF-7 (P53 loại hoang dã) và
MDA-MB-231 (P53 đột biến ) đã được nghiên cứu. Liều H2O2 được sử dụng để gây ra apoptosis
sẽ được phân tích bằng phương pháp dịng chảy tế bào, và tín hiệu đồng khu trú sẽ được xác định
bằng nhuộm miễn dịch huỳnh quang, sự tương tác protein được xác nhận bằng phương pháp
PLA. Giả thuyết ảnh hưởng đến tương tác P53 và BCL-2 do thay đỗi cấu trúc P53, nên trong các
tế bào P53 đột biến (MDA-MB-231), tín hiệu đồng khu trú của và tương tác giữa P53-BCL-2 sẽ
ít hơn đáng kể những tế bào P53 kiểu hoang dã (MCF-7). Bất kể, tỷ lệ apoptosis của MDA-MB231,
so
với
MCF-7,
.
trong
cùng
một
3
điều
trị
có
thể
sẽ
thấp
hơn.
.
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
1.
Đối tượng nghiên cứu và địa điểm
Nghiên cứu được thực hiện trong phịng thí nghiệm Thần kinh học và Liệu pháp miễn
dịch, Trung tâm Sinh học phân tử tại Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh.
2.
Đối tượng và vật liệu
Dịng tế bào ung thư vú MCF-7 và MDA-MB-231 là quà tặng từ các đối tác nước ngồi
của phịng thí nghiệm.
Các kháng thể đã được sử dụng cho miễn dịch huỳnh quang: P53 ( độ pha lỗng 1/100,
Cơng nghệ sinh học Santa Cruz), BCL-2 (độ pha lỗng 1: 100, Cơng nghệ sinh học Santa Cruz),
kháng thể thứ cấp IgG Alexa (độ pha loãng 1: 2000, Invitrogen)
Bộ hóa chất phát hiện Apoptosis (The PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I - BD
Biosciences, Sandiego, CA)
Bộ hóa chất phát hiện tương tác protein ( Duolink® In Situ Red Starter Kit Mouse/Rabbit
- DUO92101, Sigma-Aldrich)
3.
Phương pháp thí nghiệm
3.1.
Ni cấy tế bào
Các dòng tế bào được sử dụng trong nghiên cứu này là MDA-MB-231 và MCF-7. MDAMB-231 và MCF-7 (ATCC) được tăng trưởng thường xuyên ở mức 5% CO2, 95% khơng khí ở
37oC trong DMEM chứa 10 mM glucose và được bổ sung 10% FBS, 1 mM pyruvate, HEPES
10mM, 50μM 2-mercaptoethanol, 100U penicillin / mL và 100g streptomycin / mL trước khi thí
nghiệm.
3.2.
Xử lý H2O2
H2O2 thương mại với nồng độ được tính tốn là 1,6M. Các tế bào được cấy vào đĩa 6
giếng (3 x 105 tế bào / giếng) và ni cấy trong 24 giờ. Sau đó, các tế bào được rửa với 1x PBS
và được xử lý bằng 0,16 M H2O2 trong 2 ml môi trường nuôi cấy. Các tế bào sau đó được ổn
định ở 37oC, 5% CO2 và 95% khơng khí trong 10 phút sau đó tế bào được rửa hai lần với 1X
PBS.
.
4
.
3.3.
Phương pháp dòng chảy tế bào
Các dòng tế bào MDA-MB-231 và MCF-7 đã được cấy (105 tế bào / đĩa) vào các đĩa nuôi
cấy 60 mm với môi trường 2 ml DMEM + 10% FBS và ổn định trong 24 giờ trong môi trường
5% CO2. Tiếp theo, các tế bào được xử lý trong môi trường nuôi cấy (đối chứng) và 0,16M H2O2
với thời gian thay đổi như sau: 10 phút, 20 phút, 60 phút và 90 phút. Bộ hóa chất phát hiện
apoptosis đã được sử dụng để đánh giá apoptosis. Cụ thể các tế bào được rửa hai lần bằng PBS
lạnh và tất cả dung dịch rửa được thu thập trong falcol 15 ml. Sau đó, 200μL Trypsin 1X đã
được sử dụng để tách các tế bào còn lại và tất cả các tế bào được ly tâm và đhuyền phù trong
dung dịch đệm Binding 1ml với mật độ 1x106 tế bào / ml trước khi chuyển 1x105 tế bào sang
eppendoft mới và nhuộm với 5μL Anexin V và 7-Amino-Actinomycin (7-AAD), lắc nhẹ và ủ
trong 15 phút ở nhiệt độ phịng trong bóng tối. Cuối cùng, thêm 400 μL dung dịch Binding vào
mỗi eppendorf, trước khi phân tích bằng phương pháp dòng chảy tế bào. 5000 tế bào được phân
tích ở mỗi phản ứng bằng máy BD FACSCanto II (BD Bioscatics, Sandiego, CA). Chứng âm
được thiết lập bởi các tế bào không nhuộm và chỉ nhuộm màu Anexin V hoặc 7AAD, trong khi
chứng dương sử dụng 10% H2O2 . Phần mềm BD FACSDiva đã được sử dụng để phân tích dữ
liệu.
3.4.
Nhuộm miễn dịch
Các tế bào được cấy trong một slide tám buồng (3 x 104 tế bào / giếng). Sau khi xử lý, các
slide được rửa với 1x PBS, cố định bằng 4% formaldehyd trong 5 phút, đtăng tinh thấm của
màng tế bào bằng 0,01% Triton X-100 ở 37oC trong 30 phút và bị khóa bằng huyết thanh 5%
trong PBS trong 1 giờ tại phòng nhiệt độ. Các tế bào được ủ đầu tiên với P53 (1: 100) trong 2 giờ
ở nhiệt độ phòng và được rửa 3 lần với 1x PBS. Sau đó chúng được ủ với MDM2 (1: 100) /
BCL-2 (1: 100) ở 4oC qua đêm. Các slide được rửa 3 lần bằng PBS và nhuộm với kháng thể 2
phát huỳnh quang trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Nhân tế bào được nhuộm với DAPI.
3.5.
Phương pháp PLA
Các tế bào được gieo hạt trong một slide tám buồng (3 x 104 tế bào / giếng). Sau khi điều
trị được chỉ định, các slide được rửa với 1x PBS, cố định bằng 4% formaldehyd trong 5 phút,
được thấm bằng 0,01% Triton X-100 ở 37oC trong 30 phút và bị chặn bằng huyết thanh tăng
trưởng 5% trong PBS trong 1 giờ tại phòng nhiệt độ. Các tế bào được ủ đầu tiên với P53 (1: 100)
.
5
.
trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng và được rửa 3 lần với 1x PBS. Sau đó chúng được ủ với BCL-2 (1:
100) ở 4oC qua đêm. Các slide được rửa 3 lần bằng PBS và tiếp tục nhuộm phát hiện tương tác
bằng bộ kít thương mại PLA theo quy trình của nhà sản xuất.
3.6.
Phân tích dữ liệu
Tất cả dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn của giá trị trung bình
(SE) của ba lần lặp lại. Các tính tốn thống kê được thực hiện bằng ANOVA hai chiều trong
phần mềm vẽ biểu đồ dữ liệu GraphPad Prism. Holm-testídák được sử dụng để phân tích sự khác
biệt
giữa
.
các
6
nhóm.
.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
1.
Khả năng gây apoptosis của H2O2 trên 2 dịng tế bào ung thư vú
1.1.
Sự thay đổi hình thái tế bào
Sự khác biệt về hình thái ở các tế bào trước và sau xử lý được kiểm tra dưới kính hiển vi
độ phóng đại 100X.
Hình 1: H2O2 thay đổi kiểu hình tế bào sau 10 phút xử lý
1.2.
Sự thay đổi về biểu hiện protein do được bằng phương pháp dòng chảy tế
bào
Hiệu quả gây ra apoptosis của H2O2 trên các dòng tế bào MCF-7 và MDA-MB-231 được
đo bằng phương pháp tế bào học dòng chảy. Nồng độ H2O2 (0,16M) được giữ không đổi trong
khi thời gian xử lý thay đổi như sau: 10 phút, 20 phút, 60 phút và 90 phút. Đối với mỗi dòng tế
bào, phương pháp điều trị 10 phút được chứng minh là mang lại kết quả mong muốn nhất - tỷ lệ
apoptosis sớm cao với số lượng apoptosis muộn chấp nhận được.
.
7
.
1.2.1.
Khả năng gây apoptosis của H2O2 trên tế bào MCF-7
Cũng có thể suy ra từ biểu đồ rằng xử lý 10 phút có tỷ lệ tế bào apoptosis sớm cao nhất
(33,40%) và tỷ lệ thấp nhất của các tế bào apoptosis muộn (33,20%) trong số 4 lơ xử lý.
Hình 2: Phân tích % tế bào apoptotic khi xử lý H2O2 0,16M ở các mốc thời gian khác nhau trên
tế bào MCF-7.A: 10 phút, B: 20 phút, C: 60 phút, D: 90 phút xử lý. E: biểu đồ đại diện cho tỷ lệ
phần trăm tế bào sống, apoptosis sớm, apop apoptosis muộn và các tế bào hoại tử.
.
8
.
1.2.2.
Khả năng gây apoptosis của H2O2 trên tế bào MDA-MB-231
Tương tự như vậy, tỷ lệ tế bào apoptosis sớm cao nhất trong điều trị 10 phút (18,60%), cùng với
tỷ lệ thấp nhất của các tế bào apoptosis muộn (12,50%)
Hình 3: Phân tích % tế bào apoptotic khi xử lý H2O2 0,16M ở các mốc thời gian khác nhau trên
tế bào MDA-MB-231. A: 10 phút, B: 20 phút, C: 60 phút, D: 90 phút xử lý. E: biểu đồ đại diện
cho tỷ lệ phần trăm tế bào sống, apoptosis sớm, apop apoptosis muộn và các tế bào hoại tử.
.
9
.
1.2.3.
So sanh khả năng gây apoptosis của H2O2 trên 2 dòng tế bào MCF-7 và
MDA-MB-231
Biểu đồ được xây dựng để so sánh hiệu quả gây ra apoptotic trong điều trị H2O2 10 phút
ở cả hai dịng tế bào. Có thể thấy rõ, các tế bào MDA-MB-231, có tỷ lệ tế bào khả thi cao gần
gấp đôi so với các tế bào MCF-7, cho thấy khả năng kháng H2O2 vượt trội so với các tế bào của
chúng.
Hình 4: So sánh tỷ lệ phần trăm tế bào sống, apoptosis sớm, apop apoptosis muộn và các tế bào
hoại tử khi xử lý H2O2 0.16M trên 2 dòng tế bào MCF-7 và MDA-MB-231.
2.
Sự đồng khu trú của P53 và BCl-2 trên 2 dòng tế bào ung thư vú khi xảy ra
quá trình apoptosis
P53 và BCL-2 tương ứng được miễn dịch bằng thuốc nhuộm bột màu xanh lá cây (AF
488) và đỏ (AF 633) sau khi được xử lý bằng 10 phút 0,16M H2O2. Các tế bào sau đó được quan
sát bằng kính hiển vi huỳnh quang với mục tiêu công suất cao là 40x. Các tín hiệu colocalization
.
10
.
được xác định là sự tích hợp của hai màu - vàng, có bước sóng nằm trong khoảng từ 597 nm.
577nm- (Hình 5).
Hình 5: . Trong quá trình apoptosis, P53 và BCL-2 đồng khu trú trên dòng tế bào MCF-7 nhưng
khơng có trên dịng tế bào MDA-MB-231
.
11
.
3.
Tương tác giữa P53 và BCl-2 trên 2 dòng tế bào ung thư vú khi xảy ra quá
trình apoptosis
Hình 6: Trong quá trình apoptosis, sự tương tác giữa P53 và BCL-2 xảy ra trên dịng tế bào
MCF-7 nhưng khơng xảy ra trên dòng tế bào MDA-MB-231.
.
12
