Thu nhận cao chiết từ nấm linh chi đỏ (ganoderma lucidum) bằng kỹ thuật co2 siêu tới hạn và đánh giá hoạt tính sinh học

1.GIA TP.HCM
ĐẠI HỌC QUỐC
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
---------------o0o---------------

NGUYỄN THỊ VÂN ANH

THU NHẬN CAO CHIẾT TỪ NẤM LINH CHI ĐỎ
(Ganoderma lucidum) BẰNG KỸ THUẬT CO2 SIÊU TỚI HẠN VÀ
ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC
(Supercritical fluid extraction of Ganoderma lucidum to obtain extracts and
bioactivity evaluation)

Chuyên ngành: KỸ THUẬT HÓA HỌC
Mã số: 60520301

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2021

HVTH:

NGUYỄN THỊ VÂN ANH


Cơng trình được hồn thành tại: Trường Đại Học Bách Khoa - ĐHQG TP.HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. Hoàng Minh Nam
PGS. TS Nguyễn Hữu Hiếu
Cán bộ chấm nhận xét 1: TS. Huỳnh Ngọc Oanh
Cán bộ chấm nhận xét 2: TS. Nguyễn Quốc Thắng
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại Học Bách Khoa - ĐHQG TP.HCM,

tháng 01 năm 2021
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. PGS.TS Lê Thị Thuỷ Tiên - Chủ tịch
2. TS. Huỳnh Ngọc Oanh - Ủy viên phản biện 1
3. TS. Nguyễn Quốc Thắng - Ủy viên phản biện 2
4. TS. Nguyễn Huỳnh Bạch Sơn Long - Ủy viên
5. TS. Đặng Bảo Trung - Thư ký
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành
sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(Họ tên và chữ ký)

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
(Họ tên và chữ ký)


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Nguyễn Thị Vân Anh

MSHV: 1770003

Ngày, tháng, năm sinh: 12/06/1994

Nơi sinh: Hưng Yên

Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học

Mã số: 60520301

I. TÊN ĐỀ TÀI
Tên tiếng Việt: Thu nhận cao chiết từ nấm linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) bằng kỹ thuật
CO2 siêu tới hạn và đánh giá hoạt tính sinh học.
Tên tiếng Anh: Supercritical fluid extraction from Ganoderma lucidum to obtain extracts
and bioactivity evaluation.
II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
2.1. Tổng quan: Nấm linh chi, triterpenoid, hoạt tính của nấm linh chi, kỹ thuật CO2 siêu
tới hạn, phương pháp định lượng axit ursolic, phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh
học của cao trích và quy hoạch thực nghiệm.
2.2. Thực nghiệm
 Trích ly triterpenoid (axit ursolic) từ nấm linh chi bằng kỹ thuật CO2 siêu tới hạn.
 Khảo sát ảnh hưởng của từng điều kiện trích ly đến hàm lượng axit ursolic bao gồm:
Áp suất, tỷ lệ etanol, thời gian và nhiệt độ.
 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời ba điều kiện áp suất, thời gian và nhiệt độ đến hàm
lượng axit ursolic bằng quy hoạch thực nghiệm theo mơ hình Box-Behnken.
 Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hố, kháng ung thư, kháng khuẩn và kháng
tiểu đường của cao chiết.
III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 09/2020
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 01/2021
V. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS. HOÀNG MINH NAM
PGS. TS NGUYỄN HỮU HIẾU
TP. HCM, ngày tháng năm 2021
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Trưởng PTN TĐ ĐHQG TP.HCM

CNHH & DK

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC


2. LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, đầu tiên tác giả xin trân trọng cảm ơn đến người thân và
gia đình đã ln quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tác giả trong
suốt thời gian thực hiện luận văn này.
Tác giả xin chân thành cảm ơn thầy TS. Hoàng Minh Nam và thầy PGS.TS Nguyễn
Hữu Hiếu đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho tác giả trong suốt quá trình
học tập và thực hiện luận văn.
Tác giả xin gửi lời cảm ơn đến các học viên, nghiên cứu viên và các bạn sinh viên ở
Phịng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG-HCM Cơng nghệ Hóa học & Dầu khí (KEY CEPP
LAb), Trường Đại Học Bách Khoa - ĐHQG TP.HCM đã hỗ trợ tác giả trong suốt quá
trình học tập và nghiên cứu.
Tác giả
Nguyễn Thị Vân Anh

i


3. TÓM TẮT LUẬN VĂN
Trong luận văn này, triterpenoid (axit ursolic) được trích ly từ nấm linh chi đỏ
Việt Nam bằng kỹ thuật CO2 siêu tới hạn. Hàm lượng axit ursolic trong cao trích được
xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Thành phần dinh dưỡng và kim loại có trong nấm linh chi đã được khảo sát cho thấy
nấm linh chi có hàm lượng lipit, protein và cacbohydrate cao. Ngồi ra, trong nấm cịn
chứa các ngun tố vi lượng và đa lượng như Cu, Fe, Zn và Mg, bên cạnh đó các kim
loại nặng như Pb, Ni, Hg và Cd nằm trong giới hạn cho phép.

Ảnh hưởng của từng điều kiện trích ly như áp suất, tỷ lệ etanol, nhiệt độ và thời gian
đến hàm lượng axit ursolic được khảo sát bằng phương pháp luân phiên từng biến để
tìm ra khoảng biến thiên phù hợp. Sau đó, tiến hành khảo sát đồng thời bằng quy hoạch
thí nghiệm với ba điều kiện là áp suất, tỷ lệ etanol và nhiệt độ sử dụng mơ hình BoxBehnken. Số liệu được xử lý bằng phần mềm Design Expert 11.0 để tìm điều kiện trích
ly cho hàm lượng axit ursolic cao nhất. Đồng thời phương pháp trích ly bằng nước nóng
và siêu âm cũng được thực hiện để đối chứng.
Cao trích tại điều kiện tối ưu được khảo sát hoạt tính sinh học thơng qua khả năng
kháng oxy hóa sử dụng phương pháp bắt gốc tự do 1,1–diphenyl–1–picrylhydrazyl
(DPPH) và năng lực khử sắt với đối chứng dương là axit ascorbic; kháng ung thư trên
bốn dòng tế bào ung thư là dịng tế bào ung thư biểu mơ (KB), ung thư phổi (Lu1), ung
thư gan (Hep-G2) và ung thư vú (MCF-7) bằng phương pháp tetrazolium (MTT assay);
khả năng kháng khuẩn của cao chiết được thử nghiệm trên các vi khuẩn Staphylococcus
aureus, Bacillus subtilis, Lactobacillus fermentum, Salmonella enterica, Escherichia
coli và Pseudomonas aeruginosa bằng phương pháp xác định IC50; và kháng tiểu đường
bằng phương pháp ức chế enzym α-glucosidase.

ii


4. ABSTRACT
In this thesis, triterpenoid (ursolic acid) was extracted from Vietnamese red
Ganoderma by supercritical CO2 technique. The ursolic acid content in the extract was
determined by high-performance liquid chromatography (HPLC).
The nutritional and metallic composition in Ganoderma lucidum has been
investigated, showing that it has a high content of lipids, proteins, and carbohydrates. In
addition, the fungus also contains trace elements and macronutrients such as Cu, Fe, Zn,
and Mg, besides, heavy metals such as Pb, Ni, Hg, and Cd are within the allowable
limits.
The effects of each extraction factors including pressure, ethanol concentration,
temperature, and time on ursolic acid content were investigated by the single-factor

experiment o choose the impact range. After that, three factors were simultaneously
investigated: pressure, ethanol concentration, and temperature using Box-Behnken
model. Data were analyzed by Design Expert 11.0 software to find optimal extraction
conditions for the highest ursolic acid content. At the same time, hot water extraction
and ultrasonic extraction were also carried out for the control samples.
The as-prepared extract with optimal route condition was investigated the biological
activity via the Radical Scavenging capacity with 1,1–diphenyl–1–picrylhydrazyl
(DPPH) and ferric reducing ability with Ascorbic acid as a positive control; cytotoxicity
with KB, Lu1, Hep-G2, and MCF-7 cell line by MTT assay; Antibacterial performance
was studied against Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Lactobacillus fermentum,
Salmonella enterica, Escherichia coli, and Pseudomonas aeruginosa by IC50; and
antidiabetic activity by α-glucosidase enzyme inhibition method.

iii


5. LỜI CAM ĐOAN
Tác giả xin cam đoan luận văn này là cơng trình nghiên cứu thực sự của cá nhân
tác giả và được thực hiện dưới sự hướng dẫn của hai thầy TS. Hoàng Minh Nam và PGS.
TS Nguyễn Hữu Hiếu, Phịng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG HCM Cơng nghệ Hóa học
và Dầu khí (KEY CEPP LAB), Trường Đại học Bách Khoa - ĐHQG TP. HCM.
Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực, chưa từng
được công bố trong bất cứ một cơng trình nào khác trước đây. Mọi sự giúp đỡ cho việc
hoàn thành luận văn này đều đã được cảm ơn, các thơng tin trích dẫn trong luận văn này
đều đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Tác giả xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.
Tác giả
Nguyễn Thị Vân Anh

iv

6. MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................... i
TÓM TẮT LUẬN VĂN .................................................................................................... ii
ABSTRACT ...................................................................................................................... iii
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................. iv
MỤC LỤC .......................................................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ...................................................................................................... xviii
DANH MỤC BẢNG ....................................................................................................... xix
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................ xx
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................................. 2
1.1. Tổng quan về nấm linh chi ........................................................................................ 2
1.1.1. Giới thiệu chung về nấm linh chi ............................................................................ 2
1.1.2. Thành phần hoá học ............................................................................................... 3
1.1.2.1. Polysaccharide ................................................................................................ 3
1.1.2.2. Saponin ............................................................................................................ 4
1.1.2.3. Triterpenoid ..................................................................................................... 4
1.2. Hoạt tính sinh học của triterpenoid .......................................................................... 7
1.2.1. Kháng oxy hoá ........................................................................................................ 7
1.2.2. Kháng ung thư ........................................................................................................ 8
1.2.3. Kháng khuẩn ........................................................................................................... 9
1.2.4. Kháng tiểu đường ................................................................................................. 10
1.3. Các phương pháp trích ly hoạt chất trong nấm linh chi ...................................... 11
1.3.1. Phương pháp trích Soxhlet ................................................................................. 11
1.3.2. Phương pháp siêu âm .......................................................................................... 12
1.3.3. Phương pháp vi sóng ........................................................................................... 13
1.3.4. Phương pháp enzym ............................................................................................ 14
1.3.5. Phương pháp trích ly bằng lưu chất siêu tới hạn .............................................. 15

1.3.5.1. Trạng thái siêu tới hạn của lưu chất ............................................................. 15
1.3.5.2. Tính chất của lưu chất siêu tới hạn ............................................................... 16
1.3.5.3. Trích ly dùng CO2 siêu tới hạn ...................................................................... 16
v


1.3.5.4. Phân loại........................................................................................................ 17
1.3.5.5. Hệ thống trích ly bằng CO2 siêu tới hạn ....................................................... 18
1.3.6. Tình hình nghiên cứu trong nước ...................................................................... 20
1.3.7. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .................................................................... 21
1.3.8. Tính cấp thiết ....................................................................................................... 21
1.4. Mục tiêu, nội dung, phương pháp nghiên cứu, tính mới và đóng góp của luận văn
.................................................................................................................................... 22
1.4.1. Mục tiêu................................................................................................................ 22
1.4.2. Nội dung ............................................................................................................... 22
1.4.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 22
1.4.3.1. Xác định thành phần hố học có trong nấm linh chi .................................... 22
1.4.3.2. Phương pháp khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện trích ly đến hàm lượng axit
ursolic ......................................................................................................................... 25
1.4.3.3. Thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích ................................................ 31
1.4.4. Tính mới của luận văn ........................................................................................ 34
1.4.5. Đóng góp của luận văn........................................................................................ 34
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM...................................................................................... 36
2.1. Hoá chất, dụng cụ, thiết bị và địa điểm thực hiện ................................................. 36
2.1.1. Hóa chất................................................................................................................ 36
2.1.2. Thiết bị .................................................................................................................. 36
2.1.3. Địa điểm thực hiện luận văn................................................................................. 39
2.2. Thí nghiệm................................................................................................................. 39
2.2.1. Xác định thành phần trong nguyên liệu nấm linh chi ban đầu ........................ 39
2.2.1.1. Xác định độ ẩm nguyên liệu .......................................................................... 39

2.2.1.2. Xác định độ tro .............................................................................................. 39
2.2.1.3. Xác định hàm lượng nitơ tổng ....................................................................... 39
2.2.1.4. Xác định hàm lượng lipit ............................................................................... 40
2.2.1.5. Xác định hàm lượng cacbohydrate ................................................................ 40
2.2.1.6. Xác định hàm lượng kim loại ........................................................................ 41
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng triterpenoid (axit ursolic) .. .
...................................................................................................................................... 43
vi


2.2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của từng yếu tố ............................................................. 43
2.2.2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng đồng thời các yếu tố đến hàm lượng triterpenoid ... 46
2.2.2.3. Xác định các thành phần dễ bay hơi có trong cao trích ............................... 47
2.2.2.4. Định lượng axit ursolic .................................................................................. 47
2.2.3. Phân tích các nhóm chức trong cao trích .......................................................... 48
2.2.4. Thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích .................................................... 48
2.2.4.1. Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hố ............................................................ 48
2.2.4.2. Ức chế tế bào ung thư .................................................................................... 48
2.2.4.3. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn ............................................................... 49
2.2.4.4. Kháng tiểu đường .......................................................................................... 50
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..................................................................... 51
3.1. Thành phần hoá học trong nấm linh chi ................................................................ 51
3.2. Ảnh hưởng của điều kiện trích ly đến hàm luợng axit ursolic ............................. 52
3.2.1. Ảnh hưởng của từng điều kiện ........................................................................... 52
3.2.1.1. Áp suất ........................................................................................................... 52
3.2.1.2. Tỷ lệ etanol .................................................................................................... 54
3.2.1.3. Thời gian ........................................................................................................ 54
3.2.1.4. Nhiệt độ.......................................................................................................... 55
3.2.2. Ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố .................................................................. 56
3.2.2.1. Ảnh hưởng của thời gian và áp suất .............................................................. 59

3.2.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ và áp suất ............................................................... 60
3.2.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian trích ly ................................................ 62
3.2.2.4. Kiểm chứng mơ hình ...................................................................................... 62
3.2.2.5. Phân tích các thành phần dễ bay hơi có trong cao chiết .............................. 64
3.2.2.6. Phân tích các nhóm chức trong cao trích ..................................................... 65
3.3. Hoạt tính sinh học của cao trích .............................................................................. 67
3.3.1. Hoạt tính kháng oxy hố ..................................................................................... 67
3.3.1.1. Khả năng bắt gốc tự do DPPH ...................................................................... 67
3.3.1.2. Năng lực khử sắt ............................................................................................ 68
3.3.2. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư ......................................................................... 69
3.3.3. Hoạt tính kháng khuẩn ....................................................................................... 70
vii


CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN ............................................................................................... 73
PHỤ LỤC

7.

viii


8. DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Nấm linh chi .................................................................................................... 2
Hình 1.2: Cấu trúc β-glucan phân lập từ nấm linh chi ................................................... 4
Hình 1.3: Cơng thức cấu tạo của squalen ........................................................................ 5
Hình 1.4: Các triterpenoid thuộc nhóm α amyrin............................................................ 6
Hình 1.5: Các triterpenoid thuộc nhóm β amyrin ............................................................ 6
Hình 1.6: Các triterpenoid thuộc nhóm lupeol ................................................................ 6
Hình 1.7: Cơ chế kháng oxy hóa bằng cách cho điện tử ................................................. 8

Hình 1.8: Ảnh hưởng của triterpenoid đến quá trình tế bào chết theo chu kì ................. 9
Hình 1.9: Cơ chế kháng khuẩn của triterpenoid ............................................................ 10
Hình 1.10: Các nhóm chức ức chế enzym α-glucosidase.............................................. 11
Hình 1.11: Hệ thống trích Soxhlet ................................................................................. 12
Hình 1.12: Thiết bị siêu âm ........................................................................................... 13
Hình 1.13: Thiết bị phá mẫu vi sóng ............................................................................. 14
Hình 1.14: Một số loại enzym thơng dụng .................................................................... 14
Hình 1.15: Giản đồ pha của CO2 ................................................................................... 17
Hình 1.16: Hệ thống CO2 siêu tới hạn ........................................................................... 18
Hình 1.17: Hệ thống làm lạnh ....................................................................................... 19
Hình 1.18: Bơm đồng dung mơi .................................................................................... 19
Hình 1.19: Màng hình điều khiển .................................................................................. 19
Hình 1.20: Mơ hình Box-Behnken ................................................................................ 26
Hình 1.21: Mơ hình hệ thống sắc ký khí khối phổ – GC-MS ....................................... 28
Hình 1.22: Sơ đồ nguyên lý máy đo phổ UV–Vis ........................................................ 29
Hình 1.23: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ................................................ 30
Hình 1.24: Phản ứng mất màu của DPPH với chất kháng oxy hố............................... 31
Hình 1.25: Nguyên tắc thử nghiệm hoạt tính kháng tiểu đường ................................... 34
Hình 2.1: Sơ đồ quy trình trích ly triterpenoid từ nấm linh chi bằng kỹ thuật CO2 siêu tới
hạn ................................................................................................................................. 43
Hình 2.2: Máy TECAN ................................................................................................. 50
Hình 3.1: Ảnh hưởng của áp suất .................................................................................. 53
Hình 3.2: Ảnh hưởng của tỷ lệ etanol ........................................................................... 54
Hình 3.3: Ảnh hưởng của thời gian ............................................................................... 55
ix


Hình 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................................ 56
Hình 3.5: Hàm lượng axit ursolic từ số liệu thực nghiệm và dự đốn .......................... 59
Hình 3.6: Ảnh hưởng đồng thời của thời gian và áp suất.............................................. 60

Hình 3.7: Ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ và áp suất ............................................... 61
Hình 3.8: Ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ và thời gian ............................................ 62
Hình 3.9: Hàm lượng triterpenoid của mẫu tối ưu và các mẫu đối chứng .................... 64
Hình 3.10: Phổ FTIR của axit ursolic, axit ganoderic A và cao trích ........................... 66
Hình 3.11: Khả năng bắt gốc tự do DPPH của axit ascorbic ........................................ 67
Hình 3.12: Khả năng bắt gốc tự do DPPH của cao chiết .............................................. 68
Hình 3.13: Khả năng khử sắt của axit ascorbic và cao trích ......................................... 69
Hình 3.14: Hoạt tính kháng ung thư của cao trích nấm linh chi đối với bốn dòng tế bào
ung thư KB, Hep-G2, Lu1 và MCF7 ............................................................................. 70
Hình 3.15: Kết quả thử nghiệm kháng khuẩn bằng phương pháp xác định giá trị IC50 71
Hình 3.16: Hoạt tính kháng tiểu đường của cao trích ................................................... 72

9.

x


10. DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Hàm lượng chất khoáng và vitamin có trong nấm linh chi............................. 3
Bảng 1.2: Trạng thái tới hạn của số của một số lưu chất .............................................. 15
Bảng 1.3: So sánh khối lượng riêng, độ nhớt, độ phân tán giữa chất khí, dung mơi siêu
tới hạn và chất lỏng ....................................................................................................... 16
Bảng 2.1: Các hóa chất sử dụng .................................................................................... 36
Bảng 2.2: Các dụng cụ và thiết bị sử dụng .................................................................... 37
Bảng 2.3: Dãy chuẩn các kim loại ................................................................................. 41
Bảng 2.4: Các yếu tố khảo sát ....................................................................................... 44
Bảng 2.5: Khảo sát sự ảnh hưởng của áp suất ............................................................... 44
Bảng 2.6: Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian trích ly ............................................... 45
Bảng 2.7: Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian trích ly ............................................... 45
Bảng 2.8: Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly................................................. 45

Bảng 2.9: Bảng bố trí thí nghiệm .................................................................................. 46
Bảng 3.1: Thành phần dinh dưỡng trong nấm linh chi.................................................. 51
Bảng 3.2: Hàm lượng kim loại có trong nấm linh chi đỏ Việt Nam ............................. 51
Bảng 3.3: Kết quả thí nghiệm thiết kế theo mơ hình Box-Behnken đối với axit ursolic
....................................................................................................................................... 57
Bảng 3.4: Kết quả phân tích ANOVA ........................................................................... 57
Bảng 3.5: Kết quả phân tích sự phù hợp của mơ hình với thực nghiệm ....................... 58

xi


11. DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

AAS

Atomic Absorption Spectrometer

Quang phổ hấp thu nguyên tử

AOAC

Association of Official Agricultural
Chemists

Hiệp hội các nhà hóa học

phân tích chính thức

ASK

Apoptosis Signalregulated Kinase

Kích hoạt tế bào chết theo
chu kì

DPPH

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

FRAP

Ferric Reducing Antioxidant Power

Năng lực khử sắt

FTIR

Fourier – transform infrared
spectroscopy – FTIR

Phổ hồng ngoại chuyển hóa
Fourier

GC-MS

Gas chromatography mass

spectrometry

Sắc ký khí đầu dị khối phổ

HPLC

High performance liquid
chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IC50

Half Maximal Inhibitory
Concentration

Nồng độ ức chế 50 %

MMP

Mitochondrial membrane potential

Điện thế màng ty thể

MTT

(3–[4,5–dimetylthiazol–2–yl]–2,5
diphenyltetrazol brom).

OD

Optical density

Mật độ quang

ROS

Reactive Oxgen Species

Các gốc oxy hoá tự do

xii


RSM

Response surface methodology

Phương pháp bề mặt đáp ứng

SFE

Supercritical fluid extraction

Trích ly bằng dung môi siêu
tới hạn

TCVN

UV-vis

Tiêu chuẩn Việt Nam

Ultraviolet–visible spectroscopy

xiii

Phổ hấp thụ tử ngoại-khả kiến


12. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, xu hướng sử dụng các loại thảo dược thiên nhiên để ngăn ngừa và hỗ trợ
điều trị bệnh đã trở nên phổ biến. Dó đó, việc tìm ra những hoạt chất có khả năng chữa
bệnh từ các loại thảo dược đã được nghiên cứu ở nhiều nơi trên thế giới. Trong đó, nấm
linh chi là đối tượng đang được nghiên cứu ở nhiều nước. Đặc biệt là các nước châu Á
như Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Malaysia, Thái Lan và Việt Nam. Ở Trung Quốc,
nấm linh chi đã được nghiên cứu rất nhiều và sử dụng như một loại thảo dược để trị
bệnh, điều hịa huyết áp, chống lão hóa, kéo dài tuổi thọ, tăng trí nhớ, điều hịa hoạt động
tim mạch, hơ hấp, lợi tiểu, bổ thận và trị đau nhức xương khớp. Các thành phần hóa học
có trong nấm linh chi rất phong phú bao gồm các nhóm: Axit béo, steroid, alkaloid,
polysaccharide và triterpenoid. Trong đó, thành phần có tác dụng dược học đặc trưng
cho nấm linh chi phần lớn thuộc về nhóm triterpenoid. Các nhà nghiên cứu đã nhận định
rằng triterpenoid có các hoạt tính sinh học như: Kháng oxy hóa, bảo vệ gan, chống dị
ứng, chống khối u và làm giảm lượng cholesterol trong máu. Các hoạt chất trong nấm
linh chi thường được trích ly bằng phương pháp truyền thống sử dụng dung mơi hữu cơ
hoặc nước nóng, nhưng những phương pháp này có nhiều hạn chế như hiệu quả trích ly
thấp, làm biến tính các hoạt chất, tồn tại các dung môi hữu cơ độc trong sản phẩm thu
được. Phương pháp trích ly CO2 siêu tới hạn sử dụng dung mơi là CO2 có một số tính
chất như dung mơi sạch, an tồn, ít tốn kém, khơng bắt lửa, không độc, thân thiện với
môi trường, không gây ô nhiễm, chính vì thế trích ly bằng CO2 siêu tới hạn được lựa

chọn để phân tách các cấu tử mong muốn mà không để lại các chất thải độc hại trong
quá trình trích ly và giảm thiếu các rủi ro về sự biến tính vì nhiệt của các sản phẩm trong
q trình trích. Trích ly bằng lưu chất siêu tới hạn có thể thay thế khả quan cho những
phương pháp sử dụng dung mơi thơng thường trong các q trình trích ly và sản xuất
các sản phẩm dược thảo. Đồng thời, CO2 siêu tới hạn là dung mơi “xanh” và có thể được
lựa chọn cho q trình trích ly và phân tách các thành phần hoạt tính từ các cây thuốc
quý. Vì vậy, đề tài này được thực hiện với tiêu đề “Thu nhận cao chiết từ nấm linh
chi đỏ (Ganoderma lucidum) bằng kỹ thuật CO2 siêu tới hạn và đánh giá hoạt tính
sinh học”.

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về nấm linh chi
1.1.1. Giới thiệu chung về nấm linh chi
Chi Ganoderma trên thế giới có trên 250 lồi, nhưng chỉ có sáu loại là linh chi đỏ,
đen, xanh, trắng, vàng và tím là được nghiên cứu để phát hiện ra tiềm năng có lợi cho
sức khỏe tính chất. Trong số đó, linh chi đen (G. sinensis) và linh chi đỏ (G. lucidum)
có tác dụng tăng cường sức khỏe đáng kể nhất [1]. Nấm linh chi ở Việt Nam thường gọi
là tiên thảo, nấm trường thọ, phân bố khắp nơi trên thế giới, chủ yếu là vùng nhiệt đới
và cận nhiệt đới như châu Á và Bắc Mỹ, nấm thường kí sinh hoặc hoại sinh trên nhiều
loại cây hoặc phát triển trên các giá thể là gỗ mục. Chất lượng của nấm phụ thuộc vào
thành phần dinh dưỡng nơi chúng sống [2, 3]. Nấm linh chi gồm hai phần cuống nấm và
mũ nấm. Cuống nấm dài hoặc ngắn, thường hình trụ, đường kính 0,5-3 cm. Cuống nấm
thường không phân nhánh, đôi khi uốn khúc cong. Lớp vỏ cuống màu đỏ – nâu đỏ – nâu
đen, bóng. Mũ nấm dạng thận – gần trịn, đơi khi xịe hình quạt. Trên mặt mũ có vân
gạch đồng tâm màu sắc từ vàng chanh – vàng nghệ – vàng nâu – vàng cam – đỏ nâu –
nâu tím, nhẵn bóng. Khi già, sẫm màu lớp vỏ láng, lớp phấn đỏ nâu trên bề mặt ngày
càng nhiều, và dày hơn. Kích thước mũ nấm thường 5-12 cm, dày 0,8-3,3 cm. Phần đỉnh

cuống thường gồ lên hoặc hơi lõm [4]. Hình 1.1 là ảnh chụp của nấm linh chi.

Hình 1.1: Nấm linh chi

2


Về cơng dụng dân gian, nấm linh chi có rất nhiều tác dụng hiệu quả lên các hệ cơ
quan của cơ thể, từ hệ miễn dịch, hệ thần kinh, hệ tuần hồn, hệ tiêu hóa đến việc bài
tiết các độc tố trong cơ thể, điều trị bệnh tiểu đường. Phần lớn các nghiên cứu về dược
tính của nấm linh chi chủ yếu xoay quanh khả năng tăng cường hệ miễn dịch, điều hòa
tim mạch, hạ huyết áp và bảo vệ gan [5].
1.1.2. Thành phần hố học
Nấm linh chi có nhiều lợi ích đối với sức khỏe và chứa hơn 400 hợp chất hoạt tính
sinh học, bao gồm triterpenoid, polysaccharide, nucleotide, sterol, steroid, axit béo và
protein [6, 7], có khả năng chống khối u [8], chống vi trùng, chống xơ vữa động mạch,
chống viêm [9]. Thành phần chủ yếu của nấm là nước, chiếm đến 90 %. 10 % khối lượng
còn lại bao gồm các thành phần dinh dưỡng như protein (10–40 %), chất béo (28 %),
carbohydrate (3–28 %), chất xơ (3–32 %), tro (8–10 %) [10]. Ngoài ra trong nấm cịn
chứa các vitamin, axit béo, các khống chất thiết yếu như đồng, kẽm [11] và selen [12].
Bảng 1.1 trình bày hàm lượng chất khống và vitamin có trong nấm.
Bảng 1.1: Hàm lượng chất khống và vitamin có trong nấm linh chi [13]
Chất khoáng và vitamin

Hàm lượng (mg/100g)

Canxi

832

Photpho

4,150

Sắt

82,6

Magie

1,030

Natri

375

Kali

3,590

Vitamin B1

3,49

Vitamin B2

17,10

Vitamin B6

0,71

Niacin

61,9

Inositol

307

Choline

1,150

1.1.2.1. Polysaccharide
Các polysaccharide của nấm linh chi có tác dụng sinh học như kháng viêm, hạ đường
huyết, chống loét, chống lại sự hình thành khối u, và tăng cường khả năng miễn dịch
3


[14, 15]. Có trên 200 loại polysaccharide được phân lập từ nấm linh chi, trong đó chủ

yếu gồm 2 loại chính là galactan và glucan. Đặc biệt, glucan có liên kết β (β-glucan) là
hoạt chất sinh học có nhiều cơng dụng quý, có lợi cho con người [16, 17]. β-glucan là
một chuỗi các phân tử D-glucose liên kết bởi liên kết (1,3)-β hay (1,6)-β. Các sản phẩm
tự nhiên có chứa β-glucan đã được sử dụng rất lâu, nhưng β-glucan chỉ mới được nghiên
cứu trong những năm gần đây. β-glucan được sử dụng để điều trị một số bệnh bao gồm
ung thư, bệnh truyền nhiễm, bệnh tiểu đường và các bệnh tim mạch [18, 19]. Cấu trúc
hóa học của hoạt chất β-glucan được trình bày như ở hình 1.2.

Hình 1.2: Cấu trúc β-glucan phân lập từ nấm linh chi [20]
1.1.2.2. Saponin
Saponin hay saponosid là một nhóm các glycosid có phần genin với cấu trúc triterpen
hay steroid và được tìm thấy ở thực vật, ngồi ra cũng được tìm thấy ở động vật thân
mềm như hải sâm, sao biển. Tên gọi saponin xuất phát từ sapo theo tiếng Latinh có nghĩa
là xà phịng do tính tạo bọt của nhóm hợp chất này. Dựa trên cấu trúc hóa học của phần
sapogenin saponin được chia thành 3 nhóm lớn là saponin triterpenoid, saponin steroid
và saponin steroid alkaloid. Các triterpenoid trong nấm linh chi thuộc nhóm saponin
triterpenoid [21, 22].
1.1.2.3. Triterpenoid
Triterpenoid được phân bố rộng rãi trong giới thực vật, động vật và tồn tại dưới dạng
tự do như các ester hoặc dạng glucosid. Triterpenoid là những hợp chất được tổng hợp
từ sáu đơn vị isopren. Các triterpenoid có bộ khung chính từ 30 ngun tử carbon
(C30H48) thường gặp trong thực vật. Các triterpenoid tồn tại dưới dạng tự do (khơng có
phần đường), có cấu trúc vịng, mang một số nhóm chức như: – OH, – O –, C=O. Đặc
tính chung là tan tốt trong etanol, metanol, ít tan trong nước ngoại trừ khi kết hợp với
đường để tạo thành glycosid. Các triterpenoid có độ nhớt vừa phải, bền với nhiệt độ và
tạo vị đắng trong nấm linh chi [11, 12]. Cấu trúc hoá học của các triterpenoid trong nấm
4


linh chi dựa trên lanostan, là một chất chuyển hoá của lanosterol. Có thể chia triterpenoid
thành 3 nhóm dựa vào cấu trúc: khơng vịng, 4 vịng và 5 vịng. Nhiều triterpenoid
chuyển hóa từ nhóm này sang nhóm khác. Sự chuyển hóa bao gồm việc thay đổi nhóm
– COOH thành nhóm – CH3 tương ứng thành nhóm – CH2OH.
Triterpenoid khơng vịng
Squalen được phát hiện lần đầu từ gan cá mập Squalus, ngồi ra cịn được tìm thấy
trong một số loại nấm, dầu olive [23]. Hình 1.3 thể hiện cơng thức cấu tạo của squalen.

Hình 1.3: Cơng thức cấu tạo của squalen

Triterpenoid 4 vòng
Thuộc loại squalenoxit (mọi vòng 6C đều ở cấu hình trans với nhau): Lanosterol,
protosterol, agnosterol và cycloaudinol.
Nhóm sapogenin triterpenoid 4 vịng chiếm số lượng khơng nhiều trong tự nhiên,
nhưng điều là những sapogenin quan trọng. Đáng chú ý nhất là các chất Panaxozid trong
họ Nhân Sâm Panax gingseng C.A. Meyer, các Cururbitacin trong họ bầu bí
(Cururbitaceae) [24].
Triterpenoid 5 vịng được chia làm 3 nhóm dựa trên quan hệ đã được xác định với
một trong 3 chất tiêu chuẩn là α myrin, β myrin và lupeol [25].
Nhóm α amyrin: α amyrin, axit ursolic, axit asiatic, axit xentoic và axit quinovic. Hình
1.4 thể hiện cấu trúc của các triterpenoid nhóm α amyrin.

5


Hình 1.4: Các triterpenoid thuộc nhóm α amyrin
Nhóm β amyrin: β myrin, axit oleanolic, axit albigenic, axit cincholic, erythrodiol,
soya sapogenol A, B, C,… Nhóm này chiếm đa số trong sapogenin triterpen, phổ biến
nhất là saponin của axit Oleanolic. Hình 1.5 thể hiện cấu trúc của các triterpenoid nhóm
β amyrin [26].

Hình 1.5: Các triterpenoid thuộc nhóm β amyrin
Nhóm Lupeol: Lupeol, betulin, taraxasterol và thuberogenin [27]. Hình 1.6 thể hiện
cấu trúc của các triterpenoid nhóm lupeol.

Hình 1.6: Các triterpenoid thuộc nhóm lupeol

6

Trong phần không phân cực của quả thể nấm linh chi có các triterpenoid tự do với
hàm lượng từ 3 – 5 %. Thành phần chính là các axit ganoderic A, B, C, D, F, H, I và J.
Chính các triterpenoid này làm cho nấm linh chi có vị đắng, khác với các loại nấm khác.
Hàm lượng triterpenoid là khác nhau ở các bộ phận khác nhau và giai đoạn phát triển
khác nhau của nấm [28].
Trong các thành phần hóa học trên, nhóm triterpenoid là một trong số những dược
chất quý được phát hiện đầu tiên với nhiều tác dụng. Ở hầu hết các nước phát triển,
triterpenoid là chất chính được dùng làm tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng của các loài
nấm linh chi khác nhau [29]. Triterpenoid chiếm hàm lượng cao trong nấm linh chi và
có những tác dụng nổi bật nên trong luận văn này đối tượng được lựa chọn trích ly là
triterpenoid và thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích.
1.2. Hoạt tính sinh học của triterpenoid
Triterpenoid phân bố rộng rãi khắp thế giới thực vật và góp phần tạo nên các hoạt
tính sinh học của nấm linh chi. Triterpenoid, đặc biệt là các axit ganoderic trong nấm
linh chi giúp nấm linh chi có khả năng chống viêm, chống khối u, HIV [30], ngăn ngừa
tiểu đường, kháng khuẩn, kháng oxy hoá và giảm mỡ máu.
1.2.1. Kháng oxy hoá
Các gốc tự do và các phản ứng oxy hoá được tạo ra dưới dạng các sản phẩm phụ của
quá trình trao đổi chất, tác động nghiêm trọng đến tế bào thơng qua q trình oxy hóa.
Các gốc tự do làm tăng tốc độ lão hóa và gây ra nhiều bệnh liên quan đến tuổi tác. Các
hoạt chất trong nấm linh chi được được trích ly bằng nước đã thu được cao giàu terpene
và polysaccharide đều được phân tích về khả năng kháng oxy hóa [31]. Trong đó,
terpene có khả năng kháng oxy hóa cao nhất. Trong phần đó, axit ganoderic A, B, C, D
và axit lucidenic B là thành phần chính trong terpene giúp nâng cao hoạt tính sinh học
[32].
Gốc tự do là các nguyên tử hoặc phân tử có lớp ngồi cùng chứa một điện tử đơn lẻ.
Do đó, khơng cân bằng về điện tử, dễ tạo ra phản ứng chiếm đoạt điện tử bị thiếu từ các
nguyên tử hay phân tử khác để trở về trạng thái ổn định. Đồng thời, các phân tử bị tấn
công và mất electron sẽ trở thành gốc tự do mới, bắt đầu một phản ứng dây chuyền và
gây rối loạn hoạt động bình thường của tế bào. Bản chất gốc tự do là nhóm nguyên tử

mang electron độc thân như superoxide (O2•), hydroxyl (HO•), hydroperoxyl (HOO•),
peroxyl (ROO•), alkoxyl (RO•). Các ion kim loại chuyển tiếp (Cu2+, Fe2+…) có thể xúc
7


tác cho phản ứng tạo gốc hydroxyl từ superoxide và hydro peroxide. Phản ứng này gọi
là phản ứng Fenton (1.1).
Fe2+

H2 O2 →

●

(1.1)

OH + OH−

Các gốc tự do này kém bền, hoạt động hóa học cực mạnh theo phản ứng dây chuyền,
khi phân tử nào bị chiếm electron phân tử đó sẽ trở thành gốc tự do mới [33]. Việc vô
hiệu hóa gốc tự do và phục hồi tế bào bị tổn thương bằng các chất kháng oxy hóa sẽ tăng
cường hệ thống miễn dịch, ngăn ngừa bệnh tật, và làm chậm q trình lão hóa. Các chất
kháng oxy hóa có khả năng giải phóng ra những điện tử hoặc proton H+ cho các gốc tự
do, vơ hiệu hóa khả năng oxy hóa và ngăn chặn sự tấn cơng các tế bào khỏe mạnh. Cơ
chế kháng oxy hóa bằng cách cho điện tử được thể hiện ở hình 1.7.
Phân tử bình thường

Gốc tự do
Hạt nhân

Electron

bị mất

Electron

Hình 1.7: Cơ chế kháng oxy hóa bằng cách cho điện tử
1.2.2. Kháng ung thư
Ung thư là một nhóm các bệnh liên quan đến việc tăng sinh tế bào một cách mất kiểm
soát và những tế bào đó có khả năng xâm lấn những mơ khác bằng cách phát triển trực
tiếp vào mô lân cận hoặc di chuyển đến những bộ phận khác trong cơ thể. Các nghiên
cứu về khả năng kháng ung thư của triterpenoid cho thấy khả năng chống viêm và kháng
lại các khối u. Ngồi ra, triterpenoid có thể điều chỉnh và kích hoạt hệ thống miễn dịch
giúp tăng cường chức năng miễn dịch cơ thể và tăng khả năng tự vệ chống lại ung thư
8


[34]. Axit ursolic và các axit ganoderic gây ra quá trình chết theo chu kì của các tế bào
(apoptosis). Quá trình này xảy ra khi các gốc oxy hố tự do (Reactive oxgen species –
ROS) được sản sinh quá mức và điện thế màng ty thể giảm (Mitochondrial membrane
potential – MMP). Thêm vào đó, ROS tăng sẽ kích hoạt tín hiệu chết theo chương trình
của tế bào (Apoptosis Signalregulated Kinase – ASK) kích hoạt các caspase – 9, caspase
– 8 và caspase – 3 tham gia vào quá trình chết theo chu kì của tế bào như thể hiện ở hình
1.8 [35].

Ty thể

Hình 1.8: Ảnh hưởng của triterpenoid đến quá trình tế bào chết theo chu kì
1.2.3. Kháng khuẩn
Tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn ngày càng gia tăng và nhiều loại kháng
sinh thường dùng đã khơng cịn hiệu quả với các chủng vi khuẩn. Vì vậy, việc nghiên
cứu các hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật như triterpenoid đang được quan

tâm (axit oleanolic, axit ursolic và các dẫn xuất). Các triterpenoid ức chế vi khuẩn sinh
trưởng, phá huỷ tế bào và peptidoglycan. Ngoài ra, khi các triterpenoid tiếp xúc với
thành tế bào làm tăng tính thấm của màng dẫn đến các thành phần tế bào thẩm thấu ra
bên ngồi, các triterpenoid khơng phân ly sẽ phân ly, giải phóng H+ và anion, pH bên
trong của vi khuẩn giảm. Các vi khuẩn nhạy cảm với pH không thể chịu được sự chênh
lệch pH bên trong và bên ngoài. Việc hạ thấp độ pH trong tế bào làm giảm hoạt động
9