Tiêu chuẩn hóa cao khô dành dành, cao khô đỗ trọng và viên nén 2 thành phần dành dành – đỗ trọng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH
-----------------

BỘ Y TẾ

TRẦN THANH TÂM

TIÊU CHUẨN HĨA CAO KHÔ DÀNH DÀNH,
CAO KHÔ ĐỖ TRỌNG VÀ VIÊN NÉN 2 THÀNH PHẦN
DÀNH DÀNH – ĐỖ TRỌNG

LU N V N THẠC S D

CH C

Th nh phố Hồ Ch Minh – 2018

.


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH
-----------------

TRẦN THANH TÂM

TIÊU CHUẨN HĨA CAO KHÔ DÀNH DÀNH,
CAO KHÔ ĐỖ TRỌNG VÀ VIÊN NÉN 2 THÀNH PHẦN
DÀNH DÀNH – ĐỖ TRỌNG

Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc và Độc chất
Mã số: 8720210
LU N V N THẠC S D

CH C

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS TS NGUY N Đ C TU N

Th nh phố Hồ Ch Minh - 2018

.


LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu
trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ cơng
trình nào khác.
Học viên

Tr n Thanh Tâm

.


i

Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2016 - 2018
TIÊU CHUẨN HĨA CAO KHƠ DÀNH DÀNH, CAO KHƠ ĐỖ TRỌNG VÀ VIÊN
NÉN 2 THÀNH PHẦN DÀNH DÀNH – ĐỖ TRỌNG

Tr n Thanh Tâm
Th y hư ng d n: PGS TS Nguy n Đức Tuấn
Từ khóa: Eucommia ulmoides Oliv., Gardenia jasminoides Ellis , viên n n
Dành dành – Đ trọng, geniposid, pinoresinol diglucosid

thành ph n

Mở đầu: Đ trọng Eucommia ulmoides Oliv , và Dành dành Gardenia jasminoides
Ellis , là dược liệu n i tiếng, được s dụng từ bao đ i nay v i tác dụng đi u tr tăng
huyết áp Tuy nhiên, cho đến nay chưa c cơng trình nghiên cứu nào công bố v việc xây
dựng tiêu chuẩn chất lượng cao khô Dành dành và cao khô Đ trọng, một yêu c u bắt buộc
trong công tác kiểm tra chất lượng nguyên liệu đ u vào của quy trình sản xuất các chế
phẩm từ Dành dành và Đ trọng Đ ng th i, chưa c cơng trình nghiên cứu quy trình đ nh
lượng đ ng th i geniposid và pinoresinol diglucosid trong chế phẩm thành ph n Dành
dành – Đ trọng được công bố Xuất phát từ những lý do trên, đ tài “Tiêu chuẩn hóa cao
khơ Dành dành, cao khô Đỗ trọng và viên nén 2 thành phần Dành dành - Đỗ trọng”
được thực hiện
Đối tƣợng v phƣơng pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: cao khô Dành dành, cao khô Đ trọng và viên n n thành ph n
Dành dành – Đ trọng.
Phương pháp nghiên cứu: xây dựng quy trình đ nh lượng geniposid trong cao khơ Dành
dành, xây dựng quy trình đ nh lượng pinoresinol trong cao khơ Đ trọng và xây dựng quy
trình đ nh lượng đ ng th i geniposid và pinoresinol diglucosid trong viên n n thành ph n
Dành dành – Đ trọng b ng phư ng pháp HPLC – D D Tiêu chuẩn h a cao khô Dành
dành, cao khô Đ trọng và viên n n thành ph n Dành dành – Đ trọng
Kết quả: đã xây dựng quy trình đ nh lượng geniposid trong cao Dành dành, quy trình đ nh
lượng pinoresinol trong cao Đ trọng và quy trình đ nh lượng đ ng th i geniposid và
pinoresinol diglucosid trong viên n n thành ph n Dành dành – Đ trọng b ng phư ng
pháp HPLC – D D Cả quy trình trên đ u được thẩm đ nh và đạt yêu c u theo hư ng
d n của ICH Đ tài đã xây dựng dự thảo tiêu chuẩn c s cao khô Dành dành, cao khô Đ

trọng và viên n n thành ph n Dành dành – Đ trọng
Kết luận: v i các kết quả thực hiện được, đ tài g p ph n vào công tác đảm bảo chất
lượng từ khâu nguyên liệu đến sản phẩm đưa ra th trư ng, đảm bảo an toàn và hiệu quả
đi u tr

.


i

Master’s thesis – Academic course: 2016 – 2018
STANDARDIZATION OF EUCOMMIA ULMOIDES DRY EXTRACT,
GARDENIA JASMINOIDES DRY EXTRACT AND TWO COMPONENT
EUCOMMIA ULMOIDES-GARDENIA JASMINOIDES TABLET
Tran Thanh Tam
Supervisor: PhD ssoc Prof Nguyen Đuc Tuan
Keywords: Eucommia ulmoides Oliv., Gardenia jasminoides Ellis., two components
Eucommia ulmoides-Gardenia jasminoides tablet, geniposid, pinoresinol diglucosid.
Introduction: Eucommia ulmoides Oliv., and Gardenia jasminoides Ellis., which are two
famous herbal medicine, have been used for treatment of hypertension for many years ago.
Nervertheless, there has not been any researches about constructing quality standard for
dry extract of Eucommia ulmoides Oliv., and Gardenia jasminoides Ellis., a compulsory
requirement for assessment of materials, used to manufacture tablet. Moreover, there has
been no published guidelines for the simultaneous determination of these two herbals’
markers in two components Eucommia ulmoides-Gardenia jasminoides tablet so far.
Therefore, the study “Standardization of Eucommia ulmoides dry extract, Gardenia
jasminoides dry extract and two components Eucommia ulmoides-Gardenia
jasminoides tablet” was done.
Materials and methods
Materials: Eucommia ulmoides dry extract, Gardenia jasminoides dry extract and two

components Eucommia ulmoides-Gardenia jasminoides tablet.
Methods: Develop method for determination geniposid in Gardenia jasminoides dry
extract, method for determination pinoresinol diglucosid in Eucommia ulmoides dry
extract, method for simultaneous determination geniposid and pinoresinol diglucosid in
two components Eucommia ulmoides-Gardenia jasminoides tablet by HPLC-DAD.
Standardization of Eucommia ulmoides dry extract, Gardenia jasminoides dry extract and
two components Eucommia ulmoides-Gardenia jasminoides tablet.
Results: Qualification method of geniposid in Gardenia jasminoides dry extract,
qualification method of pinoresinol diglucosid in Eucommia ulmoides dry extract,
simultaneous qualification method of geniposid and pinoresinol diglucosid in two
components Eucommia ulmoides-Gardenia jasminoides tablet by HPLC-DAD were
developed. These methods were validated according to ICH guidelines. Quality procedures
of Eucommia ulmoides dry extract, Gardenia jasminoides dry extract and two components
Eucommia ulmoides-Gardenia jasminoides tablet were also established.
Conclusion: These established standards will be applied for quality procedure of both raw
materials and product, ensuring safety and effective treatment.

.


MỤC ỤC
Trang
ỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i
MỤC ỤC ................................................................................................................ iv
DANH MỤC C C K HI U, C C CH

VI T TẮT....................................... vii

DANH MỤC C C BẢNG ...................................................................................... ix
DANH MỤC C C HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ....................................................... xii

MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN .................................................................................3
11 D

C LIỆU DÀNH DÀNH .............................................................................3

1.1.1. Mô tả và phân loại .........................................................................................3
1.1.2. Phân bố, sinh thái...........................................................................................4

1.1.3. Bộ phận dùng .................................................................................................4
1.1.4. Thành ph n hóa học .......................................................................................4
1.1.5. Tác dụng dược lý ...........................................................................................4
1.1.6. Cơng dụng ......................................................................................................6
1.2. GENIPOSID .......................................................................................................6
1.2.1. Tính chất lý hóa .............................................................................................6
1.2.2. Tác dụng dược lý ...........................................................................................7

1.2.3. Một số phư ng pháp đ nh lượng geniposid (GP) trong quả Dành dành .......7
1.3. D

C LIỆU ĐỖ TR NG ...............................................................................11

1.3.1. Mô tả và phân loại .......................................................................................11
1.3.2. Phân bố, sinh thái.........................................................................................11
1.3.3. Bộ phận dùng ...............................................................................................12
1.3.4. Thành ph n hóa học .....................................................................................12
1.3.5. Tác dụng dược lý .........................................................................................13

1.3.6. Công dụng ....................................................................................................13
1.4. PINORESINOL DIGLUCOSID ......................................................................14

1.4.1. Tính chất lý hóa ...........................................................................................14

.


1.4.2. Tác dụng dược lý .........................................................................................14
1.4.3. Một số phư ng pháp đ nh lượng pinoresinol diglucosid (PDG) trong vỏ
thân Đ trọng .........................................................................................................15
1.4.4. Một số phư ng pháp đ nh lượng đ ng th i GP và PDG trong vỏ thân Đ
trọng .......................................................................................................................19
CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU ...............22
2.1.

ĐỐI T

NG NGHIÊN C U .....................................................................22

2.2.

NGUYÊN V T LIỆU .................................................................................23

2.2.1.

Chất đối chiếu...........................................................................................23

2.2.2.

Dung mơi, hóa chất ..................................................................................23

2.2.3.

Dụng cụ và trang thiết b ..........................................................................23

2.3.

NƠI NGHIÊN C U ....................................................................................24

2.4.

PH ƠNG PHÁP NGHIÊN C U ...............................................................24

2.4.1.

Xây dựng quy trình đ nh lượng GP trong cao khơ Dành dành ................24

2.4.2.

Xây dựng quy trình đ nh lượng PDG trong cao khô Đ trọng ................28

2.4.3.

Xây dựng quy trình đ nh lượng GP và PDG trong viên nén 2 thành ph n

Dành dành – Đ trọng ...........................................................................................30
2.4.4.

Tiêu chuẩn hóa cao khơ Dành dành .........................................................34

2.4.5.

Tiêu chuẩn h a cao khơ Đ trọng ............................................................36

2.4.6.

Tiêu chuẩn hóa viên nén 2 thành ph n cao khô Dành dành và cao khô Đ

trọng

..................................................................................................................38

CHƢƠNG 3 - K T QUẢ NGHIÊN CỨU ..........................................................41
1 Xây dựng quy trình đ nh lượng GP trong cao khô Dành dành ........................41
3.1.1. Khảo sát đi u kiện sắc ký ............................................................................41
3.1.2. Khảo sát đi u kiện x lý m u cao khô Dành dành để đ nh lượng GP.........42
3.1.3. Thẩm đ nh quy trình đ nh lượng GP trong cao khô Dành dành (Phụ lục 1)
...............................................................................................................................45
3.2. Xây dựng quy trình đ nh lượng PDG trong cao khơ Đ trọng .........................49
3.2.1. Khảo sát đi u kiện sắc ký ............................................................................49

.


i

3.2.2. Khảo sát đi u kiện x lý m u cao khô Đ trọng để đ nh lượng PDG .........52
3.2.3. Thẩm đ nh quy trình đ nh lượng PDG trong cao khơ Đ trọng Phụ lục
3.3. Xây dựng quy trình đ nh lượng GP và PDG trong viên n n

55

thành ph n Dành

dành – Đ trọng .......................................................................................................61
3.3.1. Khảo sát đi u kiện sắc ký ............................................................................61

3.3.2. Khảo sát đi u kiện x lý m u đ nh lượng đ ng th i GP và PDG ...............62
3.3.3. Thẩm đ nh quy trình đ nh lượng đ ng th i GP và PDG trong viên n n
thành ph n Dành dành - Đ trọng Phụ lục

......................................................65

3.3.4. Tiêu chuẩn hóa cao khơ Dành dành (Phụ lục 7) ..........................................72
3.3.5. Tiêu chuẩn h a cao khô Đ trọng Phụ lục 8 .............................................76
3.3.6. Tiêu chuẩn hóa viên nén 2 thành ph n Dành dành – Đ trọng Phụ lục 9 80
CHƢƠNG 4 - BÀN UẬN ...................................................................................86
4 1 Xây dựng quy trình đ nh lượng GP trong cao khô Dành dành ........................86
4.1.1. Khảo sát đi u kiện sắc ký ............................................................................86
4.1.2. Khảo sát đi u kiện x lý m u cao khô Dành dành để đ nh lượng GP.........86
4.2. Xây dựng quy trình đ nh lượng PDG trong cao khô Đ trọng .........................87
4.2.1. Khảo sát đi u kiện sắc ký ............................................................................87
4.2.2. Khảo sát đi u kiện x lý m u cao khô Đ trọng để đ nh lượng PDG .........88
4.3. Xây dựng quy trình đ nh lượng GP và PDG trong viên n n

thành ph n Dành

dành – Đ trọng .......................................................................................................89
4.3.1. Khảo sát đi u kiện sắc ký ............................................................................89
4.3.2. Khảo sát đi u kiện x lý m u đ nh lượng đ ng th i GP và PDG ...............89
4.4. Tiêu chuẩn hóa cao khơ Dành dành, cao khơ Đ trọng và viên n n

thành

ph n Dành dành – Đ trọng ....................................................................................90
K T UẬN ..............................................................................................................92
KI N NGHỊ .............................................................................................................92
TÀI I U THAM KHẢO
PHỤ ỤC

.


i

DANH MỤC CÁC KÝ HI U, C C CH

VI T TẮT

Ký hiệu, ch
viết tắt

Từ ngu ên

Ngh a tiếng Việt

ACN

Acetonitrile

As

Asymmetric factor

Hệ số bất đối

CP

Chinese pharmacopoeia

Dược điển Trung Quốc

DAD

Diode array detector

Đ u d dãy diod quang

DĐVN

Dược điển Việt Nam

ICH

International conference on
harmonisation

Hội ngh quốc tế v sự đ ng
thuận

IR

Infrared

H ng ngoại

GP

Geniposid

H

Height

Chi u cao pic

HPLC

High performmance liquid
chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LOD

Limit of detection

Gi i hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantification

Gi i hạn đ nh lượng

M

Molar concentration

N ng độ mol

MeOH

Methanol

MS

Mass spectroscopy

Khối ph
Số đĩa lý thuyết biểu kiến

Nbk
PDG

Pinoresinol diglucosid

ppm

Part per million

Ph n triệu

RS

Resolution

Độ phân giải

RSD

Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tư ng đối
Diện t ch pic/đỉnh

S

.


ii

Ký hiệu, ch
viết tắt

Từ ngu ên

Ngh a tiếng Việt

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn
Sắc ký l p mỏng

SKLM
S/N

Signal/noise

Trung bình

TB
tR

T n hiệu/nhi u

Retention time

Th i gian lưu
Thể t ch

tt
UPLC

Ultra Performmance Liquid
Chromatography

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

UV – Vis

Ultra Violet – Visible

T ngoại – Khả kiến

.


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1 1 Chư ng trình r a giải geniposid theo Bergonzi M C và cộng sự ............10
Bảng 1 2 Chư ng trình r a giải PDG theo DĐVN V ..............................................16
Bảng 1 3 Chư ng trình r a giải PDG theo BP

17 ...............................................17

Bảng 1 4 Th i gian lưu các pic theo Hilderbert Wagner .........................................18
Bảng 1.5. Chư ng trình r a giải đ ng th i GP và PDG theo Bing Tian Zhao và
cộng sự ......................................................................................................................19
Bảng 1 6 Chư ng trình r a giải đ ng th i GP và PDG theo Xin Chai và cộng sự .20
Bảng 2 1 Chất đối chiếu s dụng trong nghiên cứu ................................................23
Bảng 2 2 Danh mục dung mơi, hóa chất dùng trong nghiên cứu ............................23
Bảng 2 3 Dụng cụ, trang thiết b s dụng trong nghiên cứu....................................24
Bảng 3 1 Thông số sắc ký của GP tư ng ứng v i cột sắc ký khảo sát (n=3) ..........42
Bảng 3 2 Thông số sắc ký của GP tư ng ứng v i dung môi chiết khảo sát (n=3) ..43
Bảng 3 3 Thông số sắc ký của GP tư ng ứng v i tỷ lệ cao và dung môi chiết khác
nhau (n=3) .................................................................................................................43
Bảng 3 4 Thông số sắc ký của GP tư ng ứng v i th i gian chiết khác nhau (n=3) 44
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát t nh ph hợp hệ thống trên m u đối chiếu GP và m u

th (n=6) ....................................................................................................................45
Bảng 3 6 Kết quả khảo sát t nh tuyến t nh GP.........................................................46
Bảng 3 7 Kết quả thẩm đ nh độ l p lại và độ ch nh xác trung gian của quy trình
đ nh lượng GP trong cao khô Dành dành n=9 ........................................................47
Bảng 3 8 Kết quả thẩm đ nh độ đ ng của quy trình đ nh lượng GP trong cao khô
Dành dành (n=9) .......................................................................................................48
Bảng 3 9 Thông số sắc ký của GP trong thẩm đ nh độ b n n= ...........................49
Bảng 3 1

Các thông số sắc ký tư ng ứng v i các chư ng trình pha động đ nh

lượng PDG được khảo sát .........................................................................................50
Bảng 3 11 Thông số sắc ký của PDG tư ng ứng v i dung môi chiết khảo sát (n=3)
...................................................................................................................................52

.


Bảng 3 12 Thông số sắc ký của PDG tư ng ứng v i tỷ lệ cao và dung môi chiết
khác nhau (n=3).........................................................................................................54
Bảng 3 13 Thông số sắc ký của PDG tư ng ứng v i th i gian chiết khác nhau
(n=3) ..........................................................................................................................55
Bảng 3 14 Kết quả khảo sát t nh ph hợp hệ thống trên m u đối chiếu PDG và m u
th (n=6) ....................................................................................................................55
Bảng 3 15 Kết quả khảo sát t nh tuyến t nh PDG ....................................................57
Bảng 3 16 Kết quả thẩm đ nh độ l p lại và độ ch nh xác trung gian của quy trình
đ nh lượng PDG trong cao khô Đ trọng n=9 ........................................................58
Bảng 3 17 Kết quả thẩm đ nh độ đ ng của quy trình đ nh lượng PDG trong cao khơ
Đ trọng n=9 ...........................................................................................................59
Bảng 3 18 Chư ng trình pha động khảo sát độ b n quy trình đ nh lượng PDG .....60

Bảng 3 19 Thông số sắc ký của PDG trong thẩm đ nh độ b n n=3) ......................60
Bảng 3 2

Các chư ng trình pha động đ nh lượng đ ng th i GP và PDG .............61

Bảng 3 21 Thông số sắc ký của GP và PDG tư ng ứng v i tỷ lệ bột thuốc và dung
môi chiết khác nhau (n=3).........................................................................................63
Bảng 3 22 Thông số sắc ký của GP và PDG tư ng ứng v i th i gian chiết khác
nhau (n=3) .................................................................................................................64
Bảng 3 23 Kết quả khảo sát t nh ph hợp hệ thống trên m u đối chiếu và m u th
(n=6) ..........................................................................................................................65
Bảng 3 24 Kết quả khảo sát t nh tuyến t nh GP và PDG .........................................67
Bảng 3 25 Kết quả độ l p lại và độ ch nh xác trung gian quy trình đ nh lượng ......68
Bảng 3 26 Kết quả thẩm đ nh độ đ ng của quy trình đ nh lượng GP và PDG .......69
Bảng 3 27 Kết quả khảo sát LOD và LOQ của GP và PDG n=6 .........................70
Bảng 3 28 Chư ng trình pha động khảo sát độ b n quy trình đ nh lượng đ ng th i
GP và PDG trong chế phẩm ......................................................................................70
Bảng 3 29 Thông số sắc ký của GP và GDP trong thẩm đ nh độ b n n=3) ...........71
Bảng 3 3

Kết quả mất khối lượng do làm khô cao Dành dành n=6 ....................72

Bảng 3 31 Kết quả tro không tan trong acid hydrocloric cao Dành dành n=6 .....72

.


i

Bảng 3 32 Kết quả tro toàn ph n cao Dành dành n=6 ..........................................72

Bảng 3 33 Kết quả th gi i hạn nhi m khuẩn cao Dành dành n=6 ......................73
Bảng 3 34 Kết quả th gi i hạn kim loại n ng cao Dành dành n=6 .....................74
Bảng 3 35 Kết quả đ nh t nh GP trong cao Dành dành b ng HPLC n=6 .............75
Bảng 3 36 Kết quả đ nh lượng GP trong cao Dành dành n=6 ..............................75
Bảng 3 37 T m tắt tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao khô Dành dành ............................75
Bảng 3 38 Kết quả xác đ nh mất khối lượng do làm khô cao Đ trọng n=6 ........76
Bảng 3 39 Kết quả tro không tan trong acid hydrocloric cao Đ trọng n=6 ........76
Bảng 3 4

Kết quả tro toàn ph n cao Đ trọng n=6 .............................................77

Bảng 3 41 Kết quả th gi i hạn nhi m khuẩn của

lô cao Đ trọng n=6 ...........77

Bảng 3 42 Kết quả th gi i hạn kim loại n ng cao Đ trọng n=6 ........................78
Bảng 3 43 Kết quả đ nh t nh PDG trong cao Đ trọng b ng HPLC n=6 .............79
Bảng 3 44 Kết quả đ nh lượng PDG trong cao Đ trọng n=6 ..............................80
Bảng 3 45 T m tắt tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao khô Đ trọng ...............................80
Bảng 3.46. Kết quả th độ rã viên thành phẩm ........................................................81
Bảng 3 47 Kết quả th gi i hạn nhi m khuẩn viên thành phẩm n=6 ...................82
Bảng 3 48 Kết quả đ nh t nh GP và PDG trong viên thành phẩm b ng HPLC n=6
...................................................................................................................................83
Bảng 3 49 Kết quả th độ đ ng đ u hàm lượng GP và PDG trong viên thành phẩm
...................................................................................................................................83
Bảng 3 5

T m tắt tiêu chuẩn kiểm nghiệm viên n n

thành ph n Dành dành – Đ

trọng ..........................................................................................................................84

.


i

DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ
Trang
H nh 1 1 Dành dành Gardenia jasminoides Ellis) ...................................................3
H nh 1 2 Công thức cấu tạo geniposid ......................................................................6
H nh 1.3. Sắc ký đ dung d ch chuẩn GP và dung d ch th bột quả Dành dành .......8
H nh 1 4 Sắc ký đ dung d ch chuẩn GP và dung d ch th bột quả Dành dành .......9
H nh 1 5 Sắc ký đ dung d ch th bột quả Dành dành theo Bergonzi M.C. ...........10
H nh 1 6 Đ trọng (Eucommia ulmoides Oliv) .......................................................11
H nh 1 7 Công thức cấu tạo pinoresinol diglucosid ................................................14
H nh 1 8 Sắc ký đ dung d ch th bột vỏ thân Đ trọng theo Hilderbert Wagner..18
H nh 1 9 Sắc ký đ dung d ch chuẩn và dung d ch th bột vỏ thân Đ trọng theo
Tian Zhao ..................................................................................................................19
H nh 1 1

Sắc ký đ UPLC dung d ch chuẩn và dung d ch th bột vỏ thân Đ

trọng theo Xin Chai ...................................................................................................21
H nh 3 1 Sắc ký đ m u đối chiếu, m u th và ph UV tại th i gian lưu của GP. 41
H nh 3 2 Sắc ký đ m u th khảo sát cột sắc ký .....................................................42
H nh 3 3 Hàm lượng GP chiết được v i các dung môi chiết khác nhau .................42
H nh 3 4 Hàm lượng GP chiết được v i tỷ lệ cao và dung môi chiết khác nhau ....43
H nh 3 5 Hàm lượng GP chiết được v i th i gian chiết khác nhau ........................44

H nh 3 6 Kết quả khảo sát t nh chọn lọc của phư ng pháp đ nh lượng GP ............46
H nh 3 7 Sắc ký đ m u th cao Dành dành trong thẩm đ nh độ b n.....................49
H nh 3 8 Ph UV tại th i gian lưu PDG của m u đối chiếu ...................................49
H nh 3 9 Sắc ký đ m u th v i các pha động đ nh lượng PDG được khảo sát .....52
H nh 3 1

Hàm lượng PDG chiết được v i các dung môi khác nhau .....................52

H nh 3 11 Hàm lượng PDG chiết được v i các tỷ lệ cao và dung môi khác nhau .53
H nh 3 12 Sắc ký đ d ch chiết cao Đ trọng ..........................................................53
H nh 3 13 Hàm lượng PDG chiết được v i th i gian siêu âm khác nhau ...............54
H nh 3 14 Sắc ký đ khảo sát t nh chọn lọc phư ng pháp đ nh lượng PDG ..........56
H nh 3 15 Sắc ký đ m u th cao Đ trọng trong khảo sát độ b n .........................60

.


ii

H nh 3 16 Sắc ký đ m u th v i các pha động đ nh lượng đ ng th i GP và PDG
được khảo sát.............................................................................................................62
H nh 3 17 Hàm lượng GP và PDG chiết được v i tỷ lệ bột thuốc và dung môi chiết
khác nhau...................................................................................................................63
H nh 3 18 Hàm lượng GP và PDG chiết được v i th i gian chiết khác nhau ........64
H nh 3 19 Sắc ký đ khảo sát t nh chọn lọc phư ng pháp đ nh lượng đ ng th i GP
và PDG trong chế phẩm ............................................................................................66
H nh 3 2

Sắc ký đ khảo sát LOD và LOQ của GP và PDG ................................69

H nh 3 21 Sắc ký đ m u th chế phẩm trong khảo sát độ b n ..............................71
H nh 3 22 Kết quả th gi i hạn nhi m khuẩn cao Dành dành ................................73
H nh 3 23 Kết quả th gi i hạn kim loại n ng cao Dành dành ...............................74
H nh 3 24 Sắc ký đ SKLM đ nh t nh GP trong cao Dành dành ............................74
H nh 3 25 Kết quả th gi i hạn nhi m khuẩn cao Đ trọng ...................................78
H nh 3 26 Gi i hạn kim loại n ng cao Đ trọng .....................................................78
H nh 3 27 Sắc ký đ đ nh t nh PDG trong cao Đ trọng b ng SKLM....................79
H nh 3 28 Kết quả th gi i hạn nhi m khuẩn viên thành phẩm..............................81
H nh 3 29 Sắc ký đ SKLM đ nh t nh GP và PDG trong viên thành phẩm.............82

.


MỞ ĐẦU
Từ bao đ i nay, dược liệu rất g n gũi và gắn b v i đ i sống con ngư i: từ nguyên
liệu, gia v của những m n ăn h ng ngày, cho đến thành ph n không thể thiếu của
các loại nư c hoa, m phẩm làm đ p và đ c biệt dược liệu như một ngư i bạn đ ng
hành, trợ thủ đắc lực cho các th y thuốc trong việc đi u tr bệnh và chăm s c sức
khỏe. Ngày nay, trư c những tác dụng phụ cũng như hậu quả c khi rất nghiêm
trọng của thuốc h a dược, vai tr của các loại thuốc c ngu n gốc tự nhiên rất được
quan tâm và ch ý b i vì t nh hiệu quả cũng như độ an toàn từ kinh nghiệm s dụng
qua hàng trăm năm H n thế nữa, dư i sự phát triển của khoa học k thuật và y học
hiện đại, các tác dụng và c chế đi u tr của dược liệu đang ngày càng sáng tỏ h n
nữa, và xu hư ng – “quay tr v v i thiên nhiên” ngày càng mạnh mẽ h n
Dành dành (Gardenia jasminoides Ellis., Rubiaceae), một loài cây được tr ng và
phát triển rất tốt

các tỉnh mi n Bắc nư c ta, n i bật b i màu lá xanh b ng và hoa

th m trắng ng n Đ c biệt, quả Dành dành v i thành ph n h a học đ c trưng là các

iridoid glycosid (trong đ

hoạt chất c hàm lượng cao là geniposid và gardenosid

đã được s dụng từ lâu đ i như một phư ng thuốc quý trong việc đi u tr các bệnh
như viêm gan, hạ huyết áp, đái tháo đư ng, lợi tiểu…
Đ trọng (Eucommia ulmoides Oliv., Eucommiaceae) là một v thuốc c truy n
được biết đến v i tác dụng đi u tr tăng huyết áp và là thành ph n của nhi u bài
thuốc dân gian chữa đau nhức lưng, đau nhức kh p gối, động thai,… Các nghiên
cứu v h a học, dược lý cho thấy lignan chủ yếu là pinoresinol diglucosid và
iridoid là hai nh m hoạt chất chính cho các tác dụng của dược liệu Đ trọng
Ở ngư i bệnh tăng huyết áp, lượng muối và nư c dư thừa trong c thể khiến thành
động mạch ch u thêm nhi u áp lực Dành dành v i tác dụng lợi tiểu sẽ tác động đến
thận nh m tăng lượng muối và nư c thải ra khỏi c thể qua đư ng tiểu g p ph n
vào hiệu quả đi u tr tăng huyết áp của dược liệu Đ trọng Vì vậy, việc nghiên cứu
cơng thức bào chế và tiêu chuẩn h a viên n n phối hợp hai thành ph n cao khô Đ
trọng và cao khô Dành dành là c n thiết

.


Hiện nay, DĐVN V đã quy đ nh chỉ tiêu đ nh lượng hoạt chất geniposid trong dược
liệu Dành dành và pinoresinol diglucosid trong dược liệu Đ trọng. Tuy nhiên, cho
đến nay chưa c cơng trình nghiên cứu nào cơng bố v việc xây dựng tiêu chuẩn
chất lượng cho cao khô Dành dành và cao khô Đ trọng, một yêu c u bắt buộc cho
công tác kiểm tra chất lượng nguyên liệu đ u vào của quy trình sản xuất các chế
phẩm từ Dành dành và Đ trọng Đ ng th i, chưa c cơng trình nghiên cứu quy
trình đ nh lượng đ ng th i geniposid và pinoresinol diglucosid trong chế phẩm
thành ph n Dành dành – Đ trọng được công bố Xuất phát từ những lý do trên, đ
tài “Tiêu chuẩn hóa cao khơ Dành dành, cao khơ Đỗ trọng và viên nén 2 thành

phần Dành dành - Đỗ trọng” được thực hiện v i những mục tiêu cụ thể sau:
-

Tiêu chuẩn h a cao khô Dành dành

-

Tiêu chuẩn h a cao khô Đ trọng

-

Tiêu chuẩn h a viên n n

.

thành ph n Dành dành – Đ trọng


CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1. DƢỢC LI U DÀNH DÀNH

H nh 1.1. Dành dành Gardenia jasminoides Ellis)
(A) Hoa và lá Dành dành; (B) Quả Dành dành khô
Tên khoa học:

Gardenia jasminoides Ellis

Tên đ ng nghĩa:

Gardenia florida L.

Tên khác:

Chi t , mác làng cư ng Tày

Tên nư c ngồi:

Cape jasmine (Anh).

1.1.1. Mơ tả và phân loại
Cây cỏ, cao 1 -

m, xanh tốt quanh năm, phân nhánh nhi u Cành màu nâu nhẵn, c

kh a rãnh dọc Lá mọc đối hay mọc v ng , dày, hình thn, trái xoan. Hoa to, màu
trắng ho c trắng ngà, rất th m. Quả hình trứng, c đài t n tại

đỉnh, khi chín c

màu vàng, th t quả màu vàng cam, hạt d t, quả nhi u hạt [3].
Phân loại thực vật Dành Dành [26]:
Gi i Thực vật (Plantae)
Ngành Thực vật c mạch (Tracheophyta)
L p Ngọc Lan (Magnolopsida)
Bộ Long đ m (Gentianales)
Họ cà phê (Rubiaceae)
Chi (Gardenia)
Loài jasminoides)

.

1.1.2. Phân bố, sinh thái
Chi Gardenia c khoảng 7 loài trên thế gi i, phân bố rộng rãi
cận nhiệt đ i châu Á và châu Phi Ở Việt Nam c
đ ng b ng và trung du nhưng tập trung chủ yếu

v ng nhiệt đ i và

1 loài, phân bố

khắp các tỉnh

các tỉnh Hải Dư ng, Hưng Yên,

Thái Bình, Hà Nam, Nam Đ nh, Ninh Bình, Thanh H a, Nghệ n và Hà Tĩnh Dành
dành ưa ẩm, ưa sáng và c thể ch u b ng, thư ng mọc

đất ẩm, g n ngu n nư c

như b ao, b kênh rạch hay b suối thành bụi l n, đôi khi gốc ngập chìm trong
nư c [3].
1.1.3. Bộ phận dùng
Quả: Thu hái quả ch n già vào tháng 8 - 1 ngắt bỏ cuống ph i hay sấy nh đến khơ
Quả hình trứng hay hình thoi, dài

- 4,5 cm, đư ng k nh 1 -

cm M t ngoài màu

vàng cam đến nâu đỏ, c khi xám nâu đến đỏ xám, h i b ng, c 5 - 8 đư ng g
chạy dọc theo quả [3].
Lá: thu hái quanh năm, d ng lá tư i [3].
1.1.4. Thành phần hóa học
Quả Dành dành chứa:
- Các iridoid glycosid: Gardosid, shanzhisid, geniposid, acid geniposidic, genipin,
gentiobiosid, scandosid methyl ester, gardenosid [3] Trong đ , geniposid được xem
là chất đánh dấu của dược liệu Dành dành [17].
- Các acid hữu c : cid picrocrocinic, acid dicafeoyl - 5 - (3 - hydroxy - 3 - methyl
glutaroyl quinic, acid 3 - cafeoyl - 4 - sinapoyl quinic [3].
- Các sắc tố : α - Crocin, α – crocetin [3].
Lá chứa một iridoid duy nhất là cerbinal [3].
Hoa chứa một steroid là acid gardenolic B,

chất cycloartan triterpenoid là acid

gardenic và acid gardenolic B và tinh d u trong đ

c

benzyl acetat,

hydroxycitronelal và eugenol [3].
1.1.5. Tác dụng dƣợc lý
Tác dụng lợi mật: D ch chiết c n từ quả chứa các chất crocin, crocetin và genipin
đ u làm tăng sự tiết mật Thí nghiệm trên thỏ đã thắt ống d n mật chủ cho thấy cao

.

c n, cao nư c của quả Dành dành đ u c tác dụng ức chế sự gia tăng bilirubin trong
máu [3].
Tác dụng ức chế sự tiết dịch vị và hoạt động dạ dày - ruột: Trên chuột cống thắt
môn v , genipin được cho thẳng vào hoành tá tràng v i li u 5 mg/kg làm giảm sự
tiết d ch v Tác dụng này b ng khoảng 1/5 – 1/1 tác dụng của atropin sulfat B ng
đư ng tiêm tĩnh mạch, genipin (li u 5 mg/kg), gardenosid (li u 1

mg/kg) đ u c

tác dụng ức chế co b p do pilocarpin gây nên [3].
Đối với hệ thần kinh trung ương: Th nghiệm trên chuột nhắt trắng tiêm xoang bụng
cao c n quả Dành dành v i li u 5,69 g/kg c tác dụng gây trấn tĩnh, làm giảm hoạt
động tự nhiên của chuột, c tác dụng hợp đ ng v i phenobarbital kéo dài th i gian
ngủ. Khi tiêm xoang bụng chuột nhắt trắng d ch chiết c n quả Dành dành sau một
gi xuất hiện tác dụng hạ thân nhiệt Tác dụng này k o dài trong nhi u gi [3].
Tác dụng giảm đau: Th nghiệm trên chuột nhắt trắng v i phư ng pháp gây qu n
đau b ng cách tiêm acid acetic, các hoạt chất genipin, gardenosid và dạng chiết
nư c quả Dành dành đ u c tác dụng giảm đau một cách rõ rệt, giảm số l n qu n
đau của chuột [3].
Tác dụng hạ huyết áp: Nư c sắc và d ch chiết c n quả Dành dành th nghiệm trên
mèo, thỏ, chuột cống, dùng b ng đư ng uống, tiêm xoang bụng hay tĩnh mạch đ u
c tác dụng làm hạ huyết áp Tác dụng này xuất hiện trong th i gian ngắn [3].
Tác dụng đối với tim: Trên tim ếch cô lập, d ch chiết quả Dành dành làm giảm sức
co b p c tim D ch chiết methanol quả Dành dành tiêm tĩnh mạch cho chuột cống
trắng v i li u 1 g/kg theo dõi trên điện tâm đ cho thấy c dấu hiệu của t n thư ng
c tim và d n truy n nhĩ thất b phong bế [3].
Ảnh hưởng đối với cholesterol máu: Trên mơ hình thỏ được ni b ng thức ăn c
1% cholesterol cịn crocetin cứ

ngày 1 l n tiêm bắp v i li u 5 µg/kg, kết quả cho

thấy hàm lượng cholesterol trong huyết thanh
không d ng thuốc, c n lượng triglycerid
bình thư ng trong khi đ

.

lô d ng thuốc giảm 5 % so v i lơ

lơ d ng thuốc v n duy trì được

lơ không dùng Dành dành tăng

% [3].

mức


Tác dụng kháng khu n chống viêm: B ng phư ng pháp đục l khuyếch tán thuốc
trong môi trư ng nuôi cấy, quả Dành dành c tác dụng ức chế sự phát triển của tụ
c u khuẩn vàng và não mô c u Th nghiệm trên ống k nh, nư c ngâm quả Dành
dành c tác dụng ức chế một số nấm gây bệnh ngoài da D ch chiết b ng ethanol và
methanol từ quả Dành dành c tác dụng chống viêm [3].
Tác dụng gây tiêu chảy: Các chất gardenosid, geniposid đ u c tác dụng gây tiêu
chảy, trên chuột nhắt trắng li u c hiệu lực 5 % - ED50 của gardenosid là

0

mg/kg và ED50 của geniposid > 800 mg/kg [3].
1.1.6. C ng dụng

Dành dành là một v thuốc được d ng từ lâu trong y học c truy n để hạ sốt, b n
ch n kh ngủ, vàng da, huyết nhiệt, tiểu tiện kh khăn, mắt đỏ đau, miệng khát
Quả Dành dành sao đen c tác dụng chỉ huyết, lư ng huyết d ng chữa chảy máu
cam, nôn ra máu, đái ra máu, băng lậu Li u d ng: Ngày d ng 6 - 1 g dư i dạng
nư c sắc ho c hoàn tán D ng ngoài, Dành dành giã nát đắp lên ch sưng đau, chữa
bong gân, vết thư ng [3].
1.2. GENIPOSID
1.2.1. Tính chất lý hóa
-

Cơng thức phân t : C17H24O10 [18].

-

Khối lượng phân t : 88,37 g/ mol [18].

-

Nhiệt động n ng chảy: 163,5 – 164,3 oC [16], 163 – 164 oC [20].

-

Năng suất quay cực: [

-

Ph IR KBr cm-1: 3400 (ν O-H), 1710, 1700 (ν C=O ester), 1640 (ν C–H

20
D

= +7,5o [20].

v ng th m) [20].
-

Ph UV: λmax = 236,5 nm (ethanol) [18], λmax = 239 nm [16].

H nh 1.2. Công thức cấu tạo geniposid

.


1.2.2. Tác dụng dƣợc lý
Nhi u nghiên cứu đã chứng minh r ng geniposid có ti m năng trong tr liệu bệnh
hen suyển vì c khả ức chế cả 5-lipoxygenase và cảm ứng ovalbumin Bên cạnh đ ,
geniposid cũng c

tác dụng chống lại tác nhân gây ung thư là 12-O-

tetradecanoylphorbol-13-acetate sẽ k ch hoạt protein kinase C cũng như tác dụng
kháng angiogenic [10].
Theo Hou Y.C. và cộng sự, quả Dành dành v i thành ph n ch nh geniposid - một
iridoid glucosid, là một thuốc c truy n n i tiếng của Trung Quốc d ng đi u tr các
bệnh v da, các bệnh v gan, viêm màng kết cấp t nh, huyết niệu [9].
1.2.3. Một số phƣơng pháp định lƣợng geniposid (GP) trong quả Dành dành
1.2.3.1. Theo CP 2015 [17]
Chuẩn bị mẫu
Dung dịch thử: Cân chính xác 0,1 g bột quả Dành dành vào bình nón n t mài, thêm
5 ml methanol, cân, siêu âm

ph t, cân lại, b sung lượng methanol, bay h i, lắc,

lọc H t ch nh xác 1 ml d ch lọc vào bình đ nh mức 5 ml, b sung methanol đến
vạch
Dung dịch chu n: Hòa tan lượng ch nh xác chuẩn GP v i methanol để thu được
n ng độ 30 μg/ml.
Điều kiện sắc ký: Cột C18; Pha động: ACN – H2O (15:85, tt/tt); Bư c s ng phát
hiện: 38 nm; Thể t ch tiêm: 1 μl.
Yêu cầu: Số đĩa lý thuyết ≥ 1500; Hàm lượng GP ≥ 1,8 %.
1.2.3.2. Theo DĐVN V [1]
Chuẩn bị mẫu
Dung dịch thử: Cân chính xác 0,2 g bột dược liệu qua rây số 5

vào bình n n n t

mài, thêm ch nh xác 5 ml methanol, đậy n t bình và cân xác đ nh khối lượng Lắc
siêu âm trong 1 gi , để nguội và cân lại, b sung methanol để được khối lượng ban
đ u, lắc đ u và ly tâm D ch ly tâm được lọc qua màng lọc ,45 μm
Dung dịch chu n: Hòa tan geniposid chuẩn trong methanol để được dung d ch c
n ng độ ch nh xác khoảng ,1 mg/ml

.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh

8

Điều kiện sắc ký: Cột C18

5 x 4,6 mm; 5 μm ; Bư c s ng phát hiện: 4 nm;

Pha động: CN – H2O (15:85, tt/tt); Tốc độ d ng: 1, ml/ph t; Thể t ch tiêm: 1 μl.
Yêu cầu: Số đĩa lý thuyết ≥ 8000; RSD % diện t ch pic của 6 l n tiêm:

, %;

Hàm lượng GP ≥ 3,0 %.
1.2.3.3. Theo Xin-Sheng Wang và cộng sự [24]
Chuẩn bị mẫu
Phương pháp chiết siêu âm: Cân khoảng 1, g bột quả, thêm một lượng dung môi
chiết xuất th ch hợp, ngâm 30 phút, sau đ siêu âm

t n số 4 KHz, d ch chiết

được lọc qua màng lọc ,45 μm
Phương pháp chiết hồi lưu: Cân 5, g bột quả, thêm 5 ml nư c, đun h i lưu
o

C trong

9

gi , lọc, chiết lại bã dược liệu 1 l n nữa v i c ng đi u kiện D ch chiết

được lọc qua màng lọc ,45 μm
Phương pháp chiết với sự hỗ trợ của vi sóng: Cân 5, g bột quả, thêm 5 ml nư c,
chiết 1 ph t, d ch chiết được lọc qua màng lọc ,45 μm.
Điều kiện sắc ký: Hệ thống sắc ký Waters alliance 695 – đ u d PD

996; Cột

sắc ký: SunFire 15 x 4,6 mm; 5 μm ; Pha động: CN – H2O 15:85, tt/tt ; Tốc độ
d ng: 1, ml/ph t; Thể t ch tiêm: 5 μl; Nhiệt độ cột:

o

C; Bư c s ng phát hiện:

238 nm.

H nh 1.3. Sắc ký đ dung d ch chuẩn GP và dung d ch th bột quả Dành dành
theo Xin-Sheng Wang
1.2.3.4. Theo Toshiyuki Oshima và cộng sự [21]
Chuẩn bị mẫu
Dung dịch thử: Cân khoảng ,5 g bột quả Dành dành, thêm 15 ml h n hợp methanol
– nư c (1:1, tt/tt , đun h i lưu

85 oC, làm nguội, ly tâm tốc độ 1600 vòng/phút,

gạn lấy d ch chiết, chiết bã dược liệu thêm

.

l n nữa v i c ng đi u kiện Gom d ch


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh

9

chiết lại cho vào bình đ nh mức 5 ml, b sung đến vạch b ng h n hợp methanol –
nư c (1:1, tt/tt).
Dung dịch chu n geniposid: Xây dựng đư ng chuẩn GP (1,0 – 5
gardenosid (0,25 – 1

μg/ml , acid geniposid (0,2 – 1

μg/ml ,

μg/ml , genipin–1–β–

gentiobiosid (1,0 – 500) trong h n hợp methanol – nư c 1:1, tt/tt).
Điều kiện sắc ký: Hệ thống HPLC Shimadzu Model LC-6A; Cột sắc ký: ODS TSK gel LS-410 (150 x 4,6 mm; 5 μm); Pha động: nư c – methanol – acid
phosphoric (870:130:1, tt/tt/tt); Tốc độ d ng: 1,0 ml/phút; Nhiệt độ cột: 5

o

C;

Bư c s ng phát hiện: 238 nm; Thể t ch tiêm: 1 μl.

H nh 1.4. Sắc ký đ dung d ch chuẩn GP và dung d ch th bột quả Dành dành
theo Toshiyuki Oshima
(1) Geniposid , (2) gardenosid, (3) acid geniposid, (4) genipin–1–β–gentiobiosid

1.2.3.5. Theo Bergonzi M.C và cộng sự [4]
Chuẩn bị mẫu
Dung dịch thử: Cân khoảng 1, g bột quả Dành dành, thêm 1 ml methanol 5 %,

siêu âm 4 ph t, lọc, gạn lấy d ch chiết, chiết bã dược liệu thêm

l n nữa v i c ng

đi u kiện Gộp d ch chiết lại, bay h i dung môi đến khô, cân cắn thu được, h a tan
cắn trong methanol
Điều kiện sắc ký: Hệ thống HPLC: HP 1100L; Cột sắc ký: Luna C18 (250 x 4,6
mm; 5 μm ; Tốc độ d ng: 1,0 ml/phút; Nhiệt độ cột: 27 oC; Bư c sóng phát hiện:
240 nm; Thể tích tiêm: 2 μl; Pha động: MeOH
chư ng trình r a giải trong Bảng 1 1.

.

) – H2O (pH 3,2, HCOOH) (B),


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh

10

Bảng 1.1. Chư ng trình r a giải geniposid theo Bergonzi M C và cộng sự
Thời gian (phút)
Pha động A (%)
Pha động B (%)
0–4

10

90

4 – 40

90

10

H nh 1.5. Sắc ký đ dung d ch th bột quả Dành dành theo Bergonzi M.C.
(1) Scandosid methylester, (2) gardenosid, (3) genipin gentobiosid,
(4) geniposid, (5) acetylgeniposid

1.2.3.6. Nhận xét
-

Quy trình x lý m u: Tất cả quy trình chiết xuất GP trong dược liệu đ u đ n
giản, d thực hiện

-

Đi u kiện sắc ký:
 Cột sắc ký được s dụng là cột pha đảo C18.
 Pha động bao g m dung môi hữu c

CN/MeOH và dung d ch nư c

(nư c/nư c acid
 Chế độ r a giải đẳng d ng chỉ đ nh lượng geniposid ho c r a giải
gradient đ nh lượng nhi u hợp chất trong đ c geniposid
 Th i gian phân tích tư ng đối ngắn tối đa
 Bư c s ng phát hiện dao động trong khoảng

.

ph t
8 – 240 nm.