Nghiên cứu công thức bào chế hỗn dịch nystatin riêng rẽ hoặc phối hợp dược liệu để phòng và điều trị candida

.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÙI NGUYỄN NHƯ QUỲNH

NGHIÊN CỨU CÔNG THỨC BÀO CHẾ
HỖN DỊCH NYSTATIN RIÊNG RẼ HOẶC PHỐI HỢP DƯỢC LIỆU
ĐỂ PHỊNG VÀ ĐIỀU TRỊ CANDIDA

Ngành: Cơng nghệ dược phẩm và bào chế thuốc
Mã số: 872.02.02

Luận văn Thạc sĩ Dược học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Nguyễn Đinh Nga
PGS. TS. Trần Anh Vũ

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2019

.


.

LỜI CAM ĐOAN

Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố
trong bất kì cơng trình nào khác.
Bùi Nguyễn Như Quỳnh

.


.

i

LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô khoa Dược – Đại học Y
Dược TPHCM đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt 2 năm qua.
Em xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến cô PGS. TS. Nguyễn Đinh Nga và cô PGS. TS.
Trần Anh Vũ đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành tốt
luận văn. Đồng thời, em xin cảm ơn quý thầy cô trong Hội đồng Bào chế - Cơng
nghiệp dược đã nhận xét và góp ý để em hoàn thiện đề tài.
Luận văn này được hoàn thành với sự đồng thuận và hỗ trợ rất lớn từ các đơn vị phịng
thí nghiệm Bộ mơn Bào chế, Bộ mơn Vi sinh - kí sinh tại khoa Dược Đại học Y Dược
Thành phố Hồ Chí Minh, phịng thí nghiệm khoa Dược – Đại học Cơng nghệ Thành
phố Hồ Chí Minh. Cuối cùng, sự giúp đỡ về mặt chuyên môn và về mặt tinh thần của
các anh chị và các bạn đồng nghiệp, các bạn sinh viên cũng là một phần không thể
thiếu của đề tài.
Xin dành những lời cảm ơn đặc biệt đến ThS. DS Hà Đức Cường, Phó tổng giám đốc
Công Ty cổ phần Dược phẩm OPC cung cấp nguyên liệu cho đề tài, TS. Trương Quốc
Kỳ, BS. CKI. Lê Thị Diễm Phương, ThS. Nguyễn Ngọc Vân Thanh, ThS. Nguyễn
Hữu Phúc đã giúp em hoàn thành đề tài.
Bùi Nguyễn Như Quỳnh

.


.

Luận văn Thạc sĩ Dược học. Khóa 2017 – 2019
NGHIÊN CỨU CÔNG THỨC BÀO CHẾ HỖN DỊCH NYSTATIN
RIÊNG RẼ HOẶC PHỐI HỢP DƯỢC LIỆU ĐỂ PHÒNG VÀ ĐIỀU TRỊ CANDIDA

Bùi Nguyễn Như Quỳnh
Thầy hướng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Đinh Nga, PGS.TS. Trần Anh Vũ
Mở đầu
Nystatin là một trong những thuốc điều trị đầu tay trong bệnh Candida. Tuy nhiên,
chế phẩm dạng hỗn dịch vẫn chưa phổ biến trên thị trường Việt Nam đặt ra nhu cầu
về nghiên cứu và phát triển để phục vụ điều trị. Mục tiêu của đề tài này nhằm xây
dựng quy trình bào chế hỗn dịch nystatin riêng rẽ hoặc phối hợp dược liệu có hiệu
quả để phòng và điều trị Candida.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng: nystatin, các tinh dầu có tính kháng vi sinh vật, các chủng vi sinh vật phân
lập từ bệnh nhân ung thư.
Phương pháp nghiên cứu: Các chủng nấm Candida miệng được phân lập từ bệnh
nhân ung thư vùng đầu cổ sau xạ trị được đánh giá mức độ nhạy cảm với nystatin đơn
lẻ và phối hợp tinh dầu. Sau đó, nhóm nghiên cứu tiến hành xây dựng cơng thức, quy
trình bào chế, quy trình định lượng và tiêu chuẩn cơ sở của hỗn dịch nystatin. Hỗn
dịch hoàn thiện được thử sơ bộ trên bệnh nhân ung thư tại bệnh viện Ung bướu Thành
phố Hồ Chí Minh.
Kết quả
Phân lập được 46 chủng vi nấm (Candida albicans và Candida non-albicans ) từ bệnh
phẩm, tất cả các chủng này đều nhạy với nystatin. Các phối hợp của nystatin với tinh

dầu cho tác động cộng hợp hoặc riêng rẽ trên các chủng Candida, nhưng hàm lượng
khơng thích hợp phối hợp trong bào chế. Đã xây dựng được cơng thức và quy trình
bào chế hỗn dịch nystatin đơn đạt tiêu chuẩn cơ sở. Quy trình định lượng nystatin
trong chế phẩm bằng phương pháp HPLC được xây dựng và thẩm định đạt yêu cầu
ICH.
Hỗn dịch nystatin cho tác dụng sinh học in vitro ở chủng phân lập tương đương chủng
đối chiếu, khả năng diệt nấm tốt trong thời gian tiếp xúc ngắn. Thử nghiệm sơ bộ trên
người tình nguyện cho thấy tiềm năng trong việc điều trị nấm Candida miệng, hiệu
quả điều trị nấm tốt và khơng gây khó chịu trong q trình sử dụng.
Kết luận
Đã nghiên cứu bào chế và xây dựng quy trình bào chế được hỗn dịch nystatin bước
đầu cho thấy tiềm năng trong việc điều trị nấm Candida ở bệnh nhân ung thư vùng
đầu cổ sau xạ trị.

.


.

STUDY ON NYSTATIN ORAL SUSPENSION AND NYSTATINMEDICINAL HERBS COMBINATION FORMULATION IN PREVENTION
AND TREATMENT OF ORAL CANDIDIASIS
Bui Nguyen Nhu Quynh
Graduate thesis - Master degree in pharmacy. Academic year 2017-2019
Supervivor: Assoc. Prof. Nguyen Dinh Nga, PhD - Assoc. Prof. Tran Anh Vu, PhD
Introduction
Nystatin is one of the first choices in treatment of oral candidiasis. However, nystatin
oral suspension is not available on Vietnam’s market. Thus, the need for research and
development of this pharmaceutical form is urgent. This study is conducted to
establish the preparation protocol for nystatin oral suspension and nystatin
combination suspension in prevention and treatment of oral candidiasis.

Subject and method
Subject: nystatin, essential oils, microorganism isolated from cancer patients.
Method: Candida species were isolated from patients with head and neck cancer after
radiotherapy, then were tested for susceptibility against nystatin and nystatin
combined with essential oils. Next, we developed nystatin suspension formulation,
preparation protocol, quantification and standards for the suspension. The final
product was preliminarily tested on voluntary cancer patients at Oncology Hospital
Ho Chi Minh city to obtain the effectiveness and medication adherence.
Results
All 46 Candida species including Candida albicans and non-albicans from clinical
samples were susceptible to nystatin. Nystatin-essential oils combinations showed
additive or indifferent effects on isolates, but the concentration was infeasible to
combine in products. Nystatin oral suspension formulation and the protocol for the
suspension were developed meeting the standard. The quantification protocol using
HPLC method was established and validated based on ICH guidline.
Nystatin oral suspension has the same in vitro activity on the isolated species and
control species. This suspension also shows fungicidal effect after a short time of
exposure. The preliminary trial on voluntary patients has potential effectiveness and
tolerance in treatment of oral candidiasis.
Conclusion
Nystatin oral suspension and its preparation protocol were developed with potential
effects in treatment of oral candidiasis in patients with head and neck cancer after
radiotherapy.

.


i.

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... ii
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... iii
MỤC LỤC ................................................................................................................. iv
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .........................................................................x
DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................ xi
DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... xiv
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................3
1.1. Tổng quan về bệnh nấm Candida miệng ở bệnh nhân ung thư .......................3
1.2. Nguyên liệu ......................................................................................................3
1.2.1. Nystatin .....................................................................................................3
1.2.2. Một số tinh dầu có tác động kháng nấm ...................................................6
1.3. Tổng quan về dạng bào chế hỗn dịch ...............................................................8
1.3.1. Tổng quan về dạng bào chế.......................................................................8
1.3.2. Một số tá dược dùng trong nghiên cứu .....................................................9
1.4. Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn và xác định
tỉ lệ phối hợp hoạt chất ..........................................................................................11
1.4.1. Phương pháp pha loãng ...........................................................................11
1.4.2. Phương pháp khuếch tán .........................................................................12
1.4.3. Xác định tỉ lệ phối hợp thuốc bằng phương pháp bàn cờ .......................12
1.5. Phương pháp định danh Candida spp. ...........................................................13
1.5.1. Phương pháp truyền thống ......................................................................13

.


.

i

1.5.2. Phương pháp sinh học phân tử ................................................................15
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................16
2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ...................................................................16
2.1.1. Các nguyên liệu, hoá chất .......................................................................16
2.1.2. Thiết bị ....................................................................................................17
2.1.3. Chủng vi sinh vật thử nghiệm .................................................................18
2.2. Phương pháp nghiên cứu................................................................................19
2.2.1. Thăm dò mức độ nhạy cảm và hoạt tính của một số chất kháng nấm dạng
đơn lẻ hay phối hợp ...........................................................................................19
2.2.2. Xây dựng công thức, quy trình bào chế và tiêu chuẩn cơ sở cho chế phẩm
hỗn dịch nystatin ...............................................................................................24
2.2.3. Đánh giá tác dụng sinh học của chế phẩm ..............................................36
Chương 3. KẾT QUẢ nghiên cứu ............................................................................39
3.1. Thăm dị mức độ nhạy cảm và hoạt tính của một số chất kháng nấm dạng đơn
lẻ hay phối hợp ......................................................................................................39
3.1.1. Phân lập, đánh giá mức độ nhạy cảm vi nấm Candida miệng trên bệnh
nhân ung thư vùng đầu cổ sau xạ trị với nystatin và một số thuốc kháng nấm.
...........................................................................................................................39
3.1.2. Khảo sát hoạt tính và hiệu quả phối hợp giữa nystatin và tinh dầu ........42
3.2. Xây dựng công thức, quy trình bào chế và tiêu chuẩn cơ sở cho chế phẩm hỗn
dịch nystatin ..........................................................................................................44
3.2.1. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng nystatin ...........................44
3.2.2. Xây dựng cơng thức và quy trình bào chế hỗn dịch nystatin ..................58
3.2.3. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho chế phẩm ..............................................66
3.2.4. Theo dõi độ ổn định chế phẩm ................................................................67

.

.
ii

3.3. Đánh giá tác dụng sinh học của chế phẩm .....................................................71
3.3.1. Đánh giá tác dụng sinh học in vitro ........................................................71
3.3.2. Sơ bộ đánh giá tác dụng của chế phẩm trên bệnh nhân nhiễm nấm Candida
miệng .................................................................................................................74
Chương 4. Bàn luận...................................................................................................76
4.1. Thăm dị mức độ nhạy cảm và hoạt tính của một số chất kháng nấm dạng đơn
lẻ hay phối hợp ......................................................................................................76
4.1.1. Phân lập, đánh giá mức độ nhạy cảm vi nấm Candida miệng trên bệnh
nhân ung thư vùng đầu cổ sau xạ trị với nystatin và một số thuốc kháng nấm 76
4.1.2. Khảo sát hoạt tính và hiệu quả phối hợp giữa nystatin và tinh dầu ........76
4.2. Xây dựng công thức, quy trình bào chế và tiêu chuẩn cơ sở cho chế phẩm hỗn
dịch nystatin ..........................................................................................................77
4.2.1. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng nystatin ...........................77
4.2.2. Xây dựng cơng thức và quy trình bào chế hỗn dịch nystatin ..................78
4.2.3. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho chế phẩm ..............................................79
4.2.4. Theo dõi độ ổn định của chế phẩm .........................................................80
4.3. Đánh giá tác dụng sinh học của chế phẩm .....................................................80
4.3.1. Đánh giá tác dụng sinh học in vitro ........................................................80
4.3.2. Sơ bộ đánh giá tác dụng lâm sàng của chế phẩm trên bệnh nhân nhiễm
nấm Candida miệng ..........................................................................................81
Kết luận và kiến nghị ................................................................................................82
1. Thăm dị mức độ nhạy cảm và hoạt tính của một số chất kháng nấm dạng đơn
lẻ hay phối hợp ..................................................................................................82
2. Xây dựng công thức và phương pháp bào chế hỗn dịch nystatin .................82
3. Đánh giá tác dụng sinh học của chế phẩm ....................................................83

.

.

DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ .........................................................1
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................1
PHỤ LỤC ..............................................................................................................PL-1
PHỤ LỤC 1: Công thức môi trường .................................................................PL-1
PHỤ LỤC 2: Hình ảnh phân lập mẫu Candida từ bệnh nhân...........................PL-3
PHỤ LỤC 3: Đường kính vùng kháng nấm của các chủng phân lập ...............PL-5
PHỤ LỤC 4: Số liệu thẩm định nystatin bằng phương pháp sinh học .............PL-7
PHỤ LỤC 5: Số liệu thẩm định nystatin bằng HPLC.....................................PL-14
PHỤ LỤC 6: Phân bố kích thước hạt ..............................................................PL-23
PHỤ LỤC 7: Phiếu kiểm nghiệm nguyên liệu nystatin ..................................PL-26
PHỤ LỤC 8: Chứng chỉ phân tích chất đối chiếu nystatin .............................PL-27
PHỤ LỤC 9: Chấp thuận của hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học Đại
học Y Dược TP Hồ Chí Minh .........................................................................PL-28
PHỤ LỤC 10: Chấp thuận của bệnh viện Ung Bướu TPHCM thực hiện đề tài
nghiên cứu tại bệnh viện .................................................................................PL-29

.


.

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ACN

Acetonitril

AMB

Amphotericin B

bs

bổ sung

C. albicans

Candida albicans

CFU

Colony forming unit - Đơn vị hình thành khóm

CLSI

Viện tiêu chuẩn phịng thí nghiệm và lâm sàng

CLZ

Clotrimazol

DĐVN

Dược điển Việt Nam

DMSO

Dimethyl sulfoxid

FIC

Fractional Inhibitory Concentration

FLC

Fluconazol

HNT

Hương nhu trắng

HPLC

High Performance Liquid Chromatography – Sắc ký lỏng hiệu
năng cao

MeOH

Methanol

MHA

Mueller Hinton Agar

MIC

Minimum Inhibitory Concentration – Nồng độ tối thiểu ức chế

MIZ

Miconazol

MSSA

Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus

MRSA

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

NYS

Nystatin

PDA

Photodiode Array – Dãy diod quang

SDA

Sabouraud Dextrose Agar

SMIC

Sessile Minimum Inhibitory Concentration - Nồng độ tối thiểu ức
chế dạng biofilm

TTO

Tràm trà Úc

VKN

Viện Kiểm Nghiệm

.


i.

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số chế phẩm chứa nystatin trên thị trường ..........................................5
Bảng 2.1. Danh sách hoá chất dùng trong thử hoạt tính kháng nấm và bào chế ......16
Bảng 2.2. Danh sách các hoá chất dùng trong kiểm nghiệm ....................................17
Bảng 2.3. Danh sách thiết bị dùng trong nghiên cứu ................................................17
Bảng 2.4. Hình thái khác nhau của các khóm nấm ...................................................20
Bảng 2.5. Đánh giá đường kính vịng kháng nấm theo nhà sản xuất (Bioanalyse) ..21
Bảng 2.6. Tiêu chuẩn đánh giá đường kính vịng kháng nấm trên chủng đối chiếu
Candida albicans ATCC 10231 ................................................................................21
Bảng 2.7. Các thử nghiệm thăm dò pha động ...........................................................28
Bảng 2.8. Thành phần trong công thức cơ bản .........................................................31
Bảng 2.9. Thành phần công thức khảo sát pH của hỗn dịch .....................................31
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái trên mơi trường cấy và ở kính hiển vi .......................39
Bảng 3.2. Kết quả thử nhạy cảm trên chủng Candida albicans ATCC 10231 .........41
Bảng 3.3. Tỉ lệ đáp ứng với thuốc kháng nấm của Candida albicans. .....................41
Bảng 3.4. Tỉ lệ đáp ứng với thuốc kháng nấm của Candida non-albicans ...............42
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát nồng độ tối thiểu ức chế sự phát triển của Candida của

tinh dầu ......................................................................................................................42
Bảng 3.6. Tỉ lệ phối hợp giữa nystatin và tinh dầu Quế ...........................................43
Bảng 3.7. Tỉ lệ phối hợp giữa nystatin và tinh dầu Hương nhu trắng.......................43
Bảng 3.8. Tỉ lệ phối hợp giữa nystatin và tinh dầu Tràm trà Úc ..............................43
Bảng 3.9. Hoạt tính kháng khuẩn in vitro của tinh dầu Quế. ....................................44
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp định lượng.................46
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát đường tuyến tính của phương pháp định lượng ..........47
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp định lượng .................49
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng ........................50
Bảng 3.14. Kết quả khảo sát pha động ......................................................................51
Bảng 3.15. Kết quả tính tương thích hệ thống của phương pháp định lượng ...........53

.


.

i

Bảng 3.16. Kết quả khảo sát đường tuyến tính của phương pháp định lượng ..........54
Bảng 3.17. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp định lượng .................56
Bảng 3.18. Kết quả xác định độ đúng của phương pháp định lượng ........................57
Bảng 3.19. Kết quả định lượng nystatin trong hỗn dịch bằng 2 phương pháp .........58
Bảng 3.20. Kết quả pH của các công thức ................................................................58
Bảng 3.21. Các công thức khảo sát tỉ lệ chất gây treo và chất diện hoạt ..................59
Bảng 3.22. Kết quả khảo tỉ lệ chất gây treo và chất diện hoạt ..................................59
Bảng 3.23. Công thức khảo sát hàm lượng tá dược điều vị ......................................61
Bảng 3.24. Kết quả khảo sát hàm lượng tá dược điều vị ..........................................61
Bảng 3.25. Kết quả phân bố kích thước tiểu phân các mẫu sau khi đồng nhất hố..62
Bảng 3.26. Cơng thức hỗn dịch nystatin 100000 IU/ml ...........................................64

Bảng 3.27. Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu lý hoá các mẫu L1-L3 ..............................66
Bảng 3.28. Kết quả theo dõi độ ổn định mẫu L1 ở điều kiện dài hạn.......................68
Bảng 3.29. Kết quả theo dõi độ ổn định mẫu L2 ở điều kiện dài hạn.......................69
Bảng 3.30. Kết quả theo dõi độ ổn định mẫu L3 ở điều kiện dài hạn.......................70
Bảng 3.31. Kết quả đánh giá tác động sinh học trên các chủng Candida albicans ..71
Bảng 3.32. Kết quả đánh giá tác động sinh học trên các chủng Candida non-albicans
...................................................................................................................................72
Bảng 3.33. Số đơn vị hình thành khóm sau khi vi nấm tiếp xúc với thuốc ..............73
Bảng 3.34. Kết quả đánh giá sơ bộ tác dụng của chế phẩm trên bệnh nhân nhiễm nấm
Candida miệng ..........................................................................................................75
Bảng PL-1. Đường kính vùng kháng nấm của các chủng Candida albicans phân lập
...............................................................................................................................PL-5
Bảng PL-2. Đường kính vùng kháng nấm của các chủng Candida non-albicans phân
lập ..........................................................................................................................PL-6
Bảng PL-3. Kết quả tính tuyến tính ......................................................................PL-7
Bảng PL-4. Kết quả tính chính xác ngày 1 ...........................................................PL-7
Bảng PL-5. Kết quả tính chính xác ngày 2 ...........................................................PL-8
Bảng PL-6. Kết quả độ chính xác ngày 3 .............................................................PL-8

.


.
ii

Bảng PL-7. Kết quả độ đúng 80% lần 1 ...............................................................PL-9
Bảng PL-8. Kết quả độ đúng 80% lần 2 ...............................................................PL-9
Bảng PL-9. Kết quả độ đúng 80% lần 3 .............................................................PL-10
Bảng PL-10. Kết quả độ đúng 100% lần 1 .........................................................PL-10
Bảng PL-11. Kết quả độ đúng 100% lần 2 .........................................................PL-11

Bảng PL-12. Kết quả độ đúng 100% lần 3 .........................................................PL-11
Bảng PL-13. Kết quả độ đúng 120% lần 1 .........................................................PL-12
Bảng PL-14. Kết quả độ đúng 120% lần 2 .........................................................PL-12
Bảng PL-15. Kết quả độ đúng 120% lần 3 .........................................................PL-13
Bảng PL-0.16. Phân bố kích thước tiểu phân sau khi đồng nhất hoá 5 phút ......PL-23
Bảng PL-0.17. Phân bố kích thước tiểu phân sau khi đồng nhất hố 10 phút ....PL-24
Bảng PL-0.18. Phân bố kích thước tiểu phân sau khi đồng nhất hoá 15 phút ....PL-25

.


.

v

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của nystatin ...................................................................4
Hình 1.2. Các khuẩn lạc trên mơi trường CHORMagar Candida. ...........................13
Hình 1.3. Cấu trúc ADN của vi nấm Candida ..........................................................15
Hình 2.1. Phương pháp khuếch tán bằng đĩa giấy ....................................................21
Hình 2.2. Phương pháp pha lỗng theo hình bàn cờ. ................................................23
Hình 2.3. Cách bố trí các giếng trên đĩa petri ...........................................................26
Hình 2.4. Lưu đồ bào chế hỗn dịch nystatin 100000 IU/ml......................................35
Hình 3.1. Đặc điểm khóm nấm phân lập trên mơi trường CHROMagar ..................40
Hình 3.2. Đặc điểm quan sát bằng kính hiển vi của vi nấm nuôi cấy trên môi trường
thạch bột ngơ .............................................................................................................40
Hình 3.3. Kết quả đánh giá tính đặc hiệu phương pháp ............................................47
Hình 3.4. Đường biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa logarit nồng độ và đường
kính vịng kháng nấm ................................................................................................48
Hình 3.5. Kết quả thử tính tuyến tính ở 5 nồng độ ...................................................49

Hình 3.6. Sắc ký đồ ở các điều kiện pha động khác nhau.........................................51
Hình 3.7. Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu placebo, mẫu chuẩn và mẫu thử .....................53
Hình 3.8. Phổ UV của mẫu chuẩn (4) và mẫu thử (5) ..............................................54
Hình 3.9. Phổ độ tinh khiết pic của mẫu chuẩn (6) và mẫu thử (7) ..........................54
Hình 3.10. Đường biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic
...................................................................................................................................55
Hình 3.11. Đồ thị phân bố kích thước tiểu phân khi đồng nhất hố trong 5 phút ....62
Hình 3.12. Đồ thị phân bố kích thước tiểu phân khi đồng nhất hố trong 10 phút ..62
Hình 3.13. Đồ thị phân bố kích thước tiểu phân khi đồng nhất hố trong 15 phút ..63
Hình 3.14. Lưu đồ pha chế 1000 ml hỗn dịch nystatin 100000 IU/ml .....................65
Hình 3.15. (a). Candida albicans, (b). Candida tropicalis .......................................73
Hình 3.16. Hình ảnh lâm sàng nhiễm nấm Candida miệng trước và sau khi điều trị
bằng hỗn dịch nystatin. .............................................................................................74

.


.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Candida miệng là bệnh nhiễm nấm phổ biến nhất ở người, đặc trưng bởi sự phát triển
quá mức các lồi Candida trong biểu mơ niêm mạc miệng. Bệnh phổ biến ở 90% các
đối tượng hệ miễn dịch suy yếu và 15-60% bệnh nhân ung thư [33], [42], [44], [68].
Ở bệnh nhân ung thư vùng đầu cổ sau xạ trị, tình trạng ức chế miễn dịch, tổn thương
niêm mạc và giảm tiết nước bọt là điều kiện để phát triển Candida miệng [12], [65].
Số lượng vi nấm tăng đáng kể trong khoang miệng sau khoảng 2 tuần xạ trị và có thể
kéo dài đến 6 tháng sau xạ trị với các biểu hiện như viêm niêm mạc miệng, nóng rát
và thay đổi vị giác ở nhiều bệnh nhân [15], [23].
Các hướng dẫn mới nhất về điều trị nhiễm nấm Candida miệng của Việt Nam [2] và
Hoa Kỳ [53] đều khuyến cáo thuốc kháng nấm tại chỗ là lựa chọn đầu tay. Hiện nay

tại Việt Nam, các bệnh nhân ung thư nhiễm nấm Candida chủ yếu được chỉ định dùng
povidone-iodine, một số ít dùng hỗn dịch amphotericin B nhập từ nước ngoài với giá
thành cao và khan hiếm. Trong khi đó, nystatin được đánh giá là thuốc mang lại hiệu
quả cao, chi phí thấp và ít tác dụng phụ [64]. Vì vậy, với mong muốn có thêm lựa
chọn thuốc trong điều trị, khoa Răng Hàm Mặt – Đại học Y Dược TP. HCM đã kết
hợp với khoa Dược thực hiện đề tài nghiên cứu đánh giá hiệu quả điều trị nấm
Candida vùng miệng ở bệnh nhân sau xạ trị bằng nystatin dạng lỏng tại bệnh viện
Ung Bướu TP. HCM. Tuy nhiên, trong nước vẫn chưa có sản phẩm chứa nystatin
dạng lỏng trên thị trường. Hơn nữa, đầu năm 2019, Cục quản lý Dược phẩm và Thực
phẩm Hoa Kỳ (FDA) đưa thơng báo về tình trạng thiếu hụt thuốc nystatin dạng hỗn
dịch do một số hãng dược phẩm ngừng sản xuất [24]. Do đó, việc nghiên cứu và phát
triển chế phẩm hỗn dịch nystatin là nhu cầu cấp thiết để tiến hành tối ưu hóa hiệu quả
điều trị nấm Candida miệng.
Bên cạnh đó, các dẫn chất tự nhiên nguồn gốc từ dược liệu với khả năng kháng nấm,
kháng khuẩn có nhiều tiềm năng để hỗ trợ các thuốc hiện tại trong tình hình gia tăng
tỉ lệ đề kháng với nystatin trên thế giới [7], [46]. Đề tài “Nghiên cứu công thức hỗn
dịch phòng và điều trị Candida từ nystatin riêng rẽ hoặc phối hợp dược liệu”
được thực hiện nhằm tìm ra công thức bào chế tối ưu chứa đơn chất nystatin hoặc

.


.

phối hợp giữa nystatin và dược liệu để tăng tác động dùng phòng và điều trị cho bệnh
nhân nhiễm nấm Candida miệng, đặc biệt là bệnh nhân ung thư vùng đầu cổ sau khi
xạ trị.
Mục tiêu tổng quát
Xây dựng công thức bào chế hỗn dịch nystatin riêng rẽ hoặc phối hợp dược liệu có
hiệu quả để phịng và điều trị Candida.

Mục tiêu cụ thể
- Thăm dò mức độ nhạy cảm và hoạt tính của một số chất kháng nấm dạng đơn lẻ hay
phối hợp.
- Xây dựng cơng thức, quy trình bào chế đồng thời xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho
chế phẩm hỗn dịch nystatin và theo dõi độ ổn định.
- Đánh giá tác dụng sinh học của chế phẩm.

.


.

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về bệnh nấm Candida miệng ở bệnh nhân ung thư
Một số loài nấm, đặc biệt là Candida, là hệ sinh vật thường trú trong khoang miệng
phần lớn dân số. Ở điều kiện thường, các vi nấm tồn tại đồng thời với các vi sinh vật
khác và không gây hại. Tuy nhiên, những thay đổi trong hệ vi sinh vật ở khoang
miệng hoặc tồn thân có thể kích thích phát triển nhanh chóng của vi nấm và dẫn đến
nhiễm nấm miệng. Ở bệnh nhân ung thư được hóa trị hoặc xạ trị, các tổn thương mô
mềm ở khoang miệng là yếu tố nguy cơ dẫn đến nấm miệng [12], [28], [56], [65]. Tỉ
lệ nhiễm nấm Candida miệng ở bệnh nhân ung thư trong các nghiên cứu trước đây là
15-60% [8]. Một bài tổng quan hệ thống bao gồm 39 nghiên cứu riêng lẻ được tiến
hành bởi Lalla RV và cộng sự [42] cho thấy tỉ lệ nhiễm nấm ở khoang miệng tăng
đáng kể trong và sau hóa trị hoặc xạ trị ở bệnh nhân ung thư (48,2% trước điều trị,
72,2% trong quá trình điều trị và 70,1% sau điều trị).
Các hướng dẫn điều trị nhiễm nấm Candida miệng hiện nay đều ưu tiên các tác nhân
điều trị tại chỗ hơn so với đường tồn thân do có hiệu quả cao, giảm các tác dụng phụ
tồn thân và ít nguy cơ tương tác thuốc. Hướng dẫn mới nhất của Bộ Y Tế Việt Nam
năm 2015 [2] và Hiệp hội Nhiễm trùng Hoa Kỳ (IDSA) năm 2016 [53] khuyến cáo
các lựa chọn đầu tay cho các trường hợp nấm miệng nhẹ bao gồm viên ngậm

clotrimazol và hỗn dịch nystatin với liều 100000 IU/ml x 4-6 ml x 4 lần/ngày.

1.2. Nguyên liệu
1.2.1. Nystatin
1.2.1.1. Tổng quan về nystatin
Nystatin A1 (hoặc được gọi là nystatin) được sinh tổng hợp bởi một chủng vi khuẩn
Streptomyces noursei. Ngoài ra, thành phần dịch nuôi cấy bao gồm các thành phần
khác là nystatin B, nystatin C, nystatin E, nystatin I, nystatin J, nystatin K [29]. Cấu
trúc của nystatin là một macrolid polyen liên kết với đường deoxy D-mycosamin.

.


.

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của nystatin

Nystatin là chất bột màu vàng hoặc hơi nâu, mùi giống ngũ cốc và dễ hút ẩm. Nystatin
thực tế không tan trong nước và cồn, tan tốt trong dimethylformamid và
dimethylsulphoxid [1]. Nystatin bền ở pH 6-8, dễ dàng bị phân huỷ ở pH dưới 2 và
pH trên 9. Nhiệt độ, ánh sáng và oxy làm tăng tốc độ phân huỷ nystatin [36], [51] .
Theo Dược điển Việt Nam V [4], nystatin được định lượng bằng phương pháp sinh
học thơng qua hoạt tính kháng nấm.
Nystatin liên kết với sterol của màng tế bào nấm nhạy cảm nên làm thay đổi tính thấm
của màng nấm, dẫn đến rị rỉ các thành phần nội bào. Vì vậy, nystatin có tác dụng kìm
hãm hoặc diệt nấm tùy thuộc vào nồng độ và độ nhạy cảm của vi nấm. Nystatin tác
động trên nấm men, đặc biệt tốt trên Candida albicans, dung nạp tốt ngay cả khi điều
trị lâu dài và không gây kháng thuốc [1].
Nystatin không hấp thu được qua đường tiêu hố khi dùng đường uống, khơng hấp
thu được qua da hay niêm mạc khi dùng tại chỗ, thải trừ chủ yếu qua phân dưới dạng

chưa chuyển hoá [1].

1.2.1.2. Các dạng bào chế nystatin
Trên thị trường thế giới, các dạng bào chế của nystatin bao gồm viêm ngậm 500000
IU hay 1000000 IU, hỗn dịch uống 100000 IU/ml điều trị nấm miệng; thuốc mỡ hoặc
kem bôi 100000 IU/g điều trị nấm ngoài da. Ở Việt Nam, chế phẩm điều trị nấm
miệng chỉ có nystatin dạng bột, cốm rơ hoặc cốm pha hỗn dịch. Dạng bào chế này
gây nhiều khó khăn cho đối tượng bệnh nhân ung thư vùng đầu cổ do tuyến nước bọt
bị ức chế dẫn đến tình trạng khơ niêm mạc miệng sẽ đau rát khi sử dụng. Vì vậy, dạng

.


.

hỗn dịch nystatin sẽ giúp bệnh nhân tuân thủ điều trị tốt hơn do ít ảnh hưởng đến các
vùng mơ mềm. Bên cạnh đó, nystatin hầu như khơng tan trong nước nhưng ổn định
ở trạng thái treo trong dịch, thích hợp bào chế dưới dạng hỗn dịch vì bền về mặt hóa
học [43]. Một điểm lợi thế của dạng bào chế này là khơng để lại vị đắng khó chịu
trong miệng sau khi dùng.
Bảng 1.1. Một số chế phẩm chứa nystatin trên thị trường

TT Tên biệt dược

1

Nystatin

Dạng bào

Hàm

chế

lượng

Hỗn dịch

100000

Nhà sản xuất

Cardinal Health, Mỹ

IU/ml
2

Nystatin

Hỗn dịch

100000
IU/ml

3

Nystatin

Hỗn dịch

100000
IU/ml

4

Nystatin Oral

Hỗn dịch

Suspension BP
5

Jamp-nystatin Oral

IU/ml
Hỗn dịch

Suspension USP
6

Mycostatine

100000

100000
IU/ml

Hỗn dịch

100000

A-S Medication
Solutions, Mỹ
Rebel Distributors,
Mỹ
Sandoz Limited,
Anh
Jamp Pharma
Corporation, Canada
Sg Pharma, Pháp

IU/ml
7

Nystan Oral Suspension

Hỗn dịch

(Ready -Mixed)
8

Nystatin

100000
IU/ml

Cốm pha

100000 IU

hỗn dịch
9

Nystatin

Viên nén bao
Bột rơ miệng

Nystafar

Anh
Dược Phúc Vinh –
Việt Nam

500000 IU

phim
10

Vygoris Limited,

Mekophar –
Việt Nam

100000 IU

Pharmedic –
Việt Nam

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

6

1.2.2. Một số tinh dầu có tác động kháng nấm
Trong các nghiên cứu trước đây, tinh dầu đã được chứng minh là một trong những
hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên có tác động kháng nấm tốt nhất [37], [40]. Tinh dầu
có thể làm giảm sự phát triển của vi nấm và biofilm thông qua các cơ chế đặc hiệu
[48]. Đặc biệt, FDA phân loại tinh dầu vào nhóm GRAS (Generally Recognised as
Safe) vì khơng gây hại và có nguồn gốc tự nhiên. Do đó, các sản phẩm có chứa tinh
dầu được người tiêu dùng đón nhận hơn các sản phẩm “tổng hợp”.

1.2.2.1. Tinh dầu Quế
Tinh dầu Quế với thành phần chính là cinnamaldehyd đã được chứng minh có hiệu
quả trong việc ức chế sự tăng trưởng của nhiều loại nấm, bao gồm cả nấm men, nấm
mốc và nấm da [35], [52] . Năm 2013, Pazyar và cộng sự [55] đã chứng minh dịch
chiết của Cinnamomum zeylanicum thể hiện hoạt tính tốt trên in vitro với các chủng
Candida với MIC trong khoảng 0,5-30 mg/ml. Năm 2017, nhóm tác giả Trần Anh
Vũ, Nguyễn Đinh Nga và Bùi Nguyễn Như Quỳnh [6] đã chiết tinh dầu Cinnamomun
obtusifolium và thử nghiệm hoạt tính trên nấm men Candida albicans, C. glabrata và
C. tropicalis và nấm da với MIC lần lượt trong khoảng 0,03-0,08 µl/ml và dạng
biofim của Candida với SMIC khoảng 0,3-0,6 µl/ml.
Về hiệu quả phối hợp, năm 2013, Castro RD và cộng sự [18] đã công bố kết quả thử
phối hợp giữa tinh dầu Quế (Cinnamomum zeylanicum) và nystatin trên Candida
tropicalis và C. krusei. Giá trị MIC riêng rẽ của tinh dầu và nystatin lần lượt là 312,5
µg/ml và 64 µg/ml trên cả 2 lồi. Khi phối hợp 2 chất, giá trị MIC của tinh dầu Quế
giảm xuống còn 39 µg/ml và nystatin cịn 32 µg/ml, hệ số FIC là 0,6024 thể hiện tác
động cộng lực trong ức chế sự sinh trưởng của nấm.

Ngoài ra, dịch chiết từ Quế cũng có tác động trên vi khuẩn như Escherichia coli,
Salmonella spp., Bacillus cereus, và Staphylococcus aureus in vitro [30], [31], [34].
Từ năm 1990, Zhang và cộng sự [70] đã chứng minh khả năng kìm khuẩn của
Cinnamomum cassia tương đương hoặc vượt trội hơn so với nipagin A và acid
benzoic. Nghiên cứu của Chao và cộng sự năm 2000 [20] cho thấy dầu Quế có khả
năng chống lại 4 lồi vi khuẩn Gram dương (Bacillus cereus, Micrococcus luteus,

.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

7

Staphylococcus aures, Enterococcus faecalis) và 4 vi khuẩn Gram âm (Alcaligens
faecalis, Enterobacter cloacae, E. coli, Pseudomonas). Tại Việt Nam, tác động kháng
khuẩn cũng được thực hiện bởi nhóm nghiên cứu Trần Anh Vũ, Nguyễn Đinh Nga
và Bùi Nguyễn Như Quỳnh năm 2017 [6] trên vi khuẩn Gram dương Staphylococcus,
Streptococcus và Gram âm E. coli với MIC khoảng 0,15-0,8 µl/ml. Từ đó cho thấy
tinh dầu Quế và dịch chiết có phổ kháng khuẩn rộng và mức độ kháng khuẩn mạnh.

1.2.2.2. Tinh dầu Hương nhu trắng
Tinh dầu Hương nhu với thành phần chính là eugenol có tác động kháng nấm trên
các chủng Candida, P. notatum, R. stolonifer, M. mucedo, Aspergillus sp. , T. viride,
P. funiculosum [48]. Dịch chiết của Ocimum sanctum có hoạt tính kháng nấm tốt đối
với các chủng Candida, bao gồm cả các chủng đề kháng với các thuốc kháng nấm
azol (MIC 15-50 mg/dL) [41]. Ngoài ra, dịch chiết Ocimum sanctum có tác động
đồng vận khi phối hợp với fluconazol, phối hợp này cho đường kính vùng ức chế vi
nấm lớn hơn và giá trị MIC thấp hơn (8-16 μg/ml) so với khi dùng riêng lẻ từng thành
phần (32-128 μg/ml) trên chủng Candida albicans phân lập được trên lâm sàng [69].

Một nghiên cứu khác được tiến hành bởi Amber K. và cộng sự [10] cho thấy tinh dầu
Hương nhu cũng cho tác động tương tự khi phối hợp với ketoconazol. Tuy nhiên, khi
phối hợp với nystatin, chưa thấy có tác động kháng khuẩn đồng vận hay cộng hợp
trên chủng C. albicans [63].

1.2.2.3. Tinh dầu Tràm trà Úc
Tinh dầu Tràm trà Úc (Melaleuca alternifolia) với thành thần chính là terpinen-4-ol
là một trong những tinh dầu được sử dụng thường xuyên cho mục đích kháng khuẩn
và kháng nấm. Trong nhiều nghiên cứu trước đây, tinh dầu Melaleuca alternifolia ở
nồng độ thấp cho tác động ức chế các chủng C. albicans kháng fluconazol (MIC 0,060,5% với tinh dầu và 0,06-0,25% đối với terpinen-4-ol). Tuy nhiên, tinh dầu Tràm trà
Úc có thể gây kích ứng da, niêm mạc và độc tính trên tai nếu sử dụng ở liều cao [17],
[54]. Khi sử dụng kết hợp với fluconazol, tinh dầu tràm Trà Úc cho tác động đồng
vận trên các chủng C. albicans đề kháng fluconazol và làm giảm MIC của fluconazol
so với sử dụng riêng lẻ [45].

.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

8

1.3. Tổng quan về dạng bào chế hỗn dịch
1.3.1. Tổng quan về dạng bào chế
Hỗn dịch là một hệ phân tán dị thể gồm 2 pha, pha liên tục hay pha ngoại thường ở
thể lỏng hoặc bán rắn, pha phân tán hay pha nội là chất rắn không tan trong pha ngoại
nhưng được phân tán đồng nhất trong pha ngoại. Hỗn dịch thơ có kích thước tiểu
phân lớn hơn 1 µm, giới hạn tối đa thường khoảng 50-75 µm. Hỗn dịch keo có kích
thước của các tiểu phân nhỏ hơn 1 µm. Dựa vào đường dùng, hỗn dịch thuốc được
chia thành các nhóm như hỗn dịch tiêm, hỗn dịch uống và hỗn dịch tác dụng tại chỗ.

Về ưu điểm của hỗn dịch, hỗn dịch là sự lựa chọn phù hợp nhất trong trường hợp
dược chất khó tan hoặc tan kém trong nước ở nồng độ trị liệu hay dược chất không
bền khi điều chế dạng dung dịch nhưng lại khá ổn định khi điều chế dạng hỗn dịch.
Ngoài ra, dạng hỗn dịch hiệu quả trong việc che giấu vị đắng của hoạt chất.
Hỗn dịch lỏng với chất dẫn là nước hoặc các dung môi thân nước có thể được bào
chế bằng phương pháp phân tán cơ học, phương pháp ngưng kết hoặc kết hợp cả 2
phương pháp trên. Trong đó, phương pháp phân tán cơ học là phương pháp chủ yếu
được ứng dụng trong việc điều chế các sản phẩm hỗn dịch thuốc có các dược chất rắn
khơng tan hoặc ít tan trong chất dẫn của thuốc.
Tốc độ sa lắng của hỗn dịch tuân theo định luật Stokes:
𝑉=

𝑑 2 (𝜌1 − 𝜌2 )𝑔
𝜂0

V (cm/s): tốc độ sa lắng; d (cm): đường kính tiểu phân; ρ1, ρ2: tỷ trọng pha phân tán
và môi trường phân tán; g: gia tốc trọng trường; η0: độ nhớt của môi trường phân tán.
Một số yếu tố ảnh hưởng đến độ bền của hỗn dịch [9] như:
- Kích thước tiểu phân
Từ định luật Stokes có thể thấy rằng kích thước tiểu phân trong pha phân tán rất quan
trọng. Trong hỗn dịch tồn tại cân bằng giữa phân bố kích cỡ hạt, độ nhớt của pha liên
tục và sự khác biệt về tỉ trọng giữa pha phân tán và pha liên tục. Thông thường, các
nhà bào chế mong muốn có được một hỗn dịch đóng bánh một phần và kích thước
tiểu phân của pha phân tán nên <10 μm. Với kích thước này hỗn dịch sẽ ổn định hơn.

.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

9

- Độ ổn định điện thế
Hỗn dịch bền nhất khi có sự cân bằng giữa điện tích dương và âm trên các tiểu phân,
lúc đó điện tích bằng 0. Thể tích lắng của pha phân tán là tối đa, đồng thời sự lên
bông cũng xảy ra. Điện tích bề mặt tiểu phân cũng bị ảnh hưởng bởi pH.
- Độ nhớt của pha liên tục
Từ định luật Stokes thấy rằng độ nhớt tăng có thể làm giảm đáng kể sự sa lắng. Do
đó, tăng độ nhớt là một cách đơn giản để có thể ngăn cản quá trình lắng. Tuy nhiên
đối với một hỗn dịch thuốc, một tiêu chí quan trọng hơn là phải đủ lỏng để có thể rót
được. Phương pháp làm tăng độ nhớt có hiệu quả là dùng các tác nhân gây treo thường
được dùng trong bào chế hỗn dịch thuốc.

1.3.2. Một số tá dược dùng trong nghiên cứu
1.3.2.1. Glycerol
Glycerol là chất lỏng trong, không màu, không mùi, độ nhớt cao, hút ẩm, vị ngọt, rất
tan trong nước và ethanol. Glycerol được sử dụng rộng rãi trong nhiều dược phẩm,
mỹ phẩm và thực phẩm. Trong chế phẩm đường uống, glycerol được sử dụng với vai
trị là dung mơi, chất tạo vị ngọt, chất bảo quản kháng vi sinh vật và tạo độ nhớt.
Glycerol còn là một chất phụ gia thực phẩm và cũng được sử dụng trong điều trị.

1.3.2.2. Hệ đệm dinatri hydrophosphat dodecahydrat (Na2HPO4.12H2O) và natri
dihydrophosphat dihydrat (NaH2PO4.2H2O)
Na2HPO4.12H2O và NaH2PO4.2H2O thường được sử dụng trong cơng thức thuốc với
vai trị là hệ đệm. Bằng cách thay đổi tỉ lệ 2 chất trong hệ đệm, hỗn hợp đệm có pH
trong khoảng 5,8 – 8,0. Vì vậy, hệ đệm này được sử dụng khá rộng rãi trong ngành
sinh học và dược phẩm.

1.3.2.3. Aspartam [57]
Aspartam tồn tại dưới tinh thể không màu hoặc màu trắng, vị ngọt. Ở nhiệt độ 20 oC,

độ tan trong nước là 1% (kl/tt). Độ tan của aspartam tăng khi tăng nhiệt độ hoặc trong
môi trường acid. Aspartam ổn định ở dạng rắn, khơ. Khi bị ẩm hoặc đun nóng,
aspartam bị phân hủy và mất vị ngọt. Vì vậy, chỉ nên đun nóng trong thời gian ngắn,

.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

10

sau đó làm lạnh nhanh. Aspartam được sử dụng rộng rãi trong các dược phẩm dùng
đường uống và thực phẩm với vai trò là chất tạo vị ngọt. Độ ngọt của aspartam gấp
180-200 lần đường saccharose. Lượng nhỏ aspartam trong dược phẩm hay thực phẩm
có chứa rất ít giá trị dinh dưỡng nên được sử dụng làm chất tạo ngọt cho người ăn
kiêng hoặc có chế độ dinh dưỡng đặc biệt.

1.3.2.4. Natri carboxymethylcellulose (NaCMC) [57]
NaCMC là chất bột màu trắng, không mùi, hầu như không tan trong ethanol 95%, dễ
dàng phân tán trong nước tạo thành dung dịch keo trong suốt. NaCMC hút ẩm mạnh
(>50% lượng nước), dung dịch nước ổn định ở pH 2-10. Dạng bột rắn có thể tiệt trùng
ở 160 oC trong vịng 1 giờ. NaCMC được ứng dụng rộng rãi trong các dược phẩm
dùng đường uống và đường tại chỗ với vai trị là tá dược gây treo, tá dược dính và tá
dược rã.

1.3.2.5. Polysorbat 20 (Tween 20) [57]
Polysorbat 20 có một mùi đặc trưng và vị ấm, hơi đắng, ở 25 oC là chất lỏng không
màu đến màu vàng, tan trong ethanol và nước, khơng tan trong dầu khống và dầu
thực vật. Polysorbat là chất diện hoạt khơng ion hóa được sử dụng rộng rãi trong bào
chế vi nhũ tương dầu/nước. Ngồi ra, nó cịn được sử dụng làm chất gây thấm, giúp

làm tăng độ tan các chất khó tan trong nước hoặc làm tăng khả năng phân tán của các
tiểu phân rắn trong hỗn dịch.

1.3.2.6. Sepinov (Polymer của hydroxyethylacrylat và natri acryloyldimethyl
taurat) [61]
Sepinov là polyme dạng bột màu trắng, không mùi, hút ẩm mạnh, trương nở trong
nước tạo thành gel trong suốt. Sepinov tương hợp nhiều dung môi như cồn, propylen
glycol và nhiều hoạt chất khác. Sepinov ổn định trong khoảng pH rộng từ 3-10 và
không bị ảnh hưởng bởi các chất điện giải. Sepinov là tá dược sử dụng rộng rãi trong
dược phẩm và mỹ phẩm với vai trò là chất nhũ hóa, chất làm tăng độ nhớt hoặc chất
ổn định.

.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

11

1.4. Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn và
xác định tỉ lệ phối hợp hoạt chất
1.4.1. Phương pháp pha loãng
Phương pháp pha lỗng địi hỏi sự phân tán đồng nhất của chất thử trong môi trường
nuôi cấy. Phương pháp này chủ yếu được sử dụng để xác định các giá trị nồng độ tối
thiểu ức chế vi sinh vật (MIC) của một chiết xuất, tinh dầu hoặc chất tinh khiết đồng
thời đánh giá sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn. Trị số MIC càng thấp, chất thử có tác dụng
càng mạnh [58], [67]. Kết quả của phương pháp này cũng mang ý nghĩa định lượng.
Phương pháp pha lỗng có thể được tiến hành thơng qua 2 cách:

1.4.1.1. Pha lỗng trong mơi trường lỏng

Chất thử sau khi hồ tan trong dung mơi thích hợp phụ thuộc vào độ tan (nước tiệt
trùng, DMSO, methanol hay hỗn hợp nước/methanol…) sẽ được phân tán đồng nhất
trong môi trường thích hợp cho từng loại vi sinh vật. Dịch treo vi sinh vật được cho
vào môi trường thử nghiệm. Sau khoảng thời gian ủ thích hợp. Kết quả được xác định
bằng mắt thường hoặc bằng quang phổ kế thông qua độ đục của dịch. Ở những nồng
độ chất thử có tác dụng ức chế vi sinh vật, các ống thử trong suốt; khi chất thử khơng
có tác dụng, vi sinh vật phát triển làm môi trường trở nên đục [58], [67].
MIC được xác định là nồng độ thấp nhất ức chế sự phát triển của vi sinh vật.
Dựa vào thể tích thử nghiệm, có 2 thuật ngữ được sử dụng là “pha loãng”
(macrodilution) và “vi pha loãng” (microdilution). Trong đó, pha lỗng được định
nghĩa khi thể tích thử nghiệm từ 2ml trở lên và vi pha loãng khi tiến hành trong các
giếng với thể tích mỗi giếng ≤ 500 µL.
Hiện nay, Viện tiêu chuẩn phịng thí nghiệm và lâm sàng (Clinical and Laboratory
Standard Institute – CLSI) đã đưa ra các phương pháp chuẩn cho từng loài vi sinh vật
như phương pháp CLSI M27-A2 (2002) dùng thử nấm men, CLSI M38-A2 (2008)
dùng thử nấm sợi hay CLSI M07-A9 (2012) dùng thử vi khuẩn.

.