Nghiên cứu ứng dụng thử nghiệm chế phẩm sinh học từ nấm trichoderma và xạ khuẩn streptomyces đối kháng với một số vi nấm gây bệnh trên cây đậu xanh (vigna radiate l ) tại xã điện hồng – điện bàn quảng nam

i

ỌC
N N
ỌC SƢ P
M
KHOA SINH

K ÓA LUẬN TỐT N

ỆP

ỌC

Nghiên cứu ứng dụng thử nghiệm chế phẩm sinh học từ
nấm Trichoderma và xạ khuẩn Streptomyces đối kháng
với một số vi nấm gây bệnh trên cây đậu xanh (Vigna
radiate L.) tại xã iện Hồng – iện Bàn - Quảng Nam

Sinh viên thực hiện : Bùi Thị Minh Hiệp
Chuyên ngành : Cử nhân Sinh Môi Trƣờng
Ngƣời hƣớng dẫn : TS. ỗ Thu Hà

à Nẵng, tháng 5/ 2013


ii

LỜI CẢM ƠN
Em xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô giáo hướng dẫn TS. Đỗ
Thu Hà đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm quý báu

trong quá trình thực hiện khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn thầy cơ khoa Sinh – Môi trường – Đại học Sư
Phạm – Đại học Đà Nẵng đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho em trong
4 năm học.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ, động
viên em trong suốt thời gian làm khóa luận.

Xin chân thành cảm ơn!
Bùi Thị Minh Hiệp


iii

DAN

MỤC CÁC C Ữ V ẾT TẮT

CKS

:

Chất kháng sinh

HSCC

:

Hệ sợi cơ chất.

HSKS

:

Hệ sợi khí sinh

KS

:

Kháng sinh

MT

:

Mơi trường

XK

:

Xạ khuẩn

XKTS

:

Xạ khuẩn tổng số

TP

:

Thành phố

VSV

:

Vi sinh vật

VSVKĐ

:

Vi sinh vật kiểm định


iv

DAN

Số hiệu

MỤC CÁC BẢN

Tên bảng

bảng

Trang

3.1

Thành phần nấm bệnh hại trên cây đậu xanh

24

3.2

Đặc điểm hình thái của các chủng nấm bệnh gây hại

24

3.3

Lây

nhiễm

các

chủng

nấm

Fusarium

NB2

và

Collectotrichum NB3 lên cây đậu xanh

26

3.4

Hoạt tính kháng VSVKĐ của 14 chủng XK chi Streptomyces

28

3.5

Đặc điểm nuôi cấy và hình thái của chủng XK 2 và XK 15

30

3.6

3.7

3.8

3.9

3.10

3.11

3.12
3.13
3.14

3.15

Khả năng sinh enzym ngoại bào của 2 chủngxạ khuẩn XK 2,
XK 15
Hoạt tính KS của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn trên 2 môi
trường lên men
Sự phát triển của các chủng nấm Trichoderma sau 3 ngày
nuôi cấy trên môi trường giá đỗ
Kết quả mức đối kháng của nấm Trichoderma đối với nấm
bệnh Fusarium
Mức đối kháng của nấm Trichoderma với nấm bệnh
Collectotrichum
Thời gian nuôi cấy hai chủng xạ khuẩn XK 2 và XK 15 trên
môi trường dịch thể
So sánh khả năng phát triển của nấm Trichoderma qua các
công thức
So sánh khả năng phát triển của xạ khuẩn qua các công thức
Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh Collectotrichum sau khi rắc
chế phẩm nấm Trichoderma
Số lượng cây con mắc bệnh và chết trên 4 công thức sau khi
lây nhiễm nấm bệnh

31

32

34

35

36

38

40
41
42

44


v

DAN

Số hiệu
hình
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
3.1
3.2
3.3
3.4

3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
3.10
3.11
3.12
3.13
3.14
3.15

MỤC CÁC

ÌN

Tên hình

Trang

Cách cấy nấm Trichoderma và nấm bệnh trên đĩa petri
Sơ đồ quy trình lên men xốp tạo chế phẩm nấm xạ khuẩn
Streptomyces
Sơ đồ quy trình lên men xốp tạo chế phẩm nấm
Trichoderma
Mơ hình bố trí thí nghiệm ở giai đoạn 1

19

Mơ hình bố trí thí nghiệm ở giai đoạn 2

Hình ảnh phân lập nấm bệnh trên mơi trường WA
Hình ảnh khuẩn lạc của các chủng nấm bệnh hại đậu xanh
Cuống sinh bào tử và bào tử của các vi nấm bệnh gây hại
cây đậu xanh
Nhân sinh khối nấm trên MT PDA để lây bệnh nhân tạo
sau 3 ngày
Dịch bào tử của các chủng nấm NB 02; NB 03; NB 04
Các triệu chứng bệnh khi lây nhiễm nấm Collectotrichum
và Fusarium ở cây đậu xanh con
Hình ảnh ống giống của một số chủng xạ khuẩn có hoạt
tính KS
Vịng vơ khuẩn của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn XK 02
và XK 15 với nấm gây bệnh trên cây đậu xanh trên mơi
trường Gauze I
Hình ảnh khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn XK 02
Hình ảnh ống giống của chủng xạ khuẩn XK 02
Hình ảnh khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn XK15
Hình ảnh ống giống của chủng xạ khuẩn XK 15
Khả năng sinh enzym amylaza và xenlulaza của XK 02,
XK 15
Phân lập các chủng Trichoderma trên mơi trường PDA
Hình ảnh khuẩn lạc các chủng nấm Trichoderma sau 3

20
20
22
23
25
25
25

26
27
27
29
29
31
31
31
31
32
33
34


vi

Số hiệu
hình

3.16
3.17
3.18
3.19
3.20
3.21
3.22
3.23
3.24
3.25
3.26

3.27
3.28

Tên hình
ngày ni cấy trên mơi trường giá đỗ
Khả năng đối kháng của một số chủng nấm Trichoderma
đối với nấm bệnh Fusarium sau 10 ngày nuôi cấy
Khả năng đối kháng của một số chủng nấm Trichoderma
đối với nấm Collectotrichum sau 10 ngày nuôi cấy
Cuống sinh bào tử, bào tử và ống giống của chủng Tri. 03
Cuống sinh bào tử, bào tử và ống giống của chủng Tri. 07
Nhân giống xạ khuẩn trên môi trường A4-H tạo dịch cấp 1
và dịch cấp 2
Chế phẩm xạ khuẩn Streptomyces sản xuất bằng phương
pháp lên men xốp trên môi trường trấu cám
Chế phẩm nấm Trichoderma sản xuất bằng phương pháp
lên men xốp sau 3 ngày và 5 ngày nuôi cấy
Khả năng đối kháng của chế phẩm đối với nấm bệnh gây
hại trên cây đậu xanh
Khả năng đối kháng của chế phẩm nấm Trichoderma
đốivới nấm bệnh Collectotrichum qua 3 và 4 ngày
Cây đậu xanh 15 ngày tuổi ở 4 cơng thức thí nghiệm
Nấm Collectotrichum xuất hiện ở xung quanh gốc cây đậu
xanh ở CT 2 sau 10 ngày lây nhiễm nấm bệnh
Biễu hiện bệnh trên cây đậu xanh ở CT2 sau 10 ngày lây
nhiễm nấm bệnh
Cây đậu xanh ở CT 3, CT 4 sau 15 ngày lây nhiễm nấm
bệnh

Trang

36
37
37
37
39
39
40
40
43
44
45
46
46


1

MỞ ẦU
1. LÝ DO C ỌN Ề T
Khi xã hội ngày càng phát triển thì nhu cầu của con người về lương thực, thực
phẩm đảm bảo chất lượng càng được nâng cao và trở nên rất cấp thiết. Sự tăng
trưởng của hóa học nơng nghiệp và thâm canh sản xuất đang thay đổi rất nhiều đến
điều kiện môi trường sinh thái chúng ta đang sống. Trước tình hình đó, biện pháp
phòng trừ sâu bệnh hại bằng phương pháp sinh học đã được các nhà khoa học quan
tâm và nghiên cứu nhiều hơn. Đáng chú ý là các nghiên cứu về một số loại vi sinh
vật (VSV) có khả năng đối kháng với nấm bệnh trên cây trồng. Vi sinh vật đối
kháng không những ngăn chặn được một số bệnh hại trên cây mà cịn khơng gây
ảnh hưởng đến những lồi thiên địch bản xứ trong tự nhiên và không gây ô nhiễm
môi trường. Sự bảo tồn các loài thiên địch tự nhiên này là “chìa khóa” vững chắc

để phịng trừ sâu bệnh hại trên cây trồng an toàn và hiệu quả.Trong đó tác nhân
được chú ý là một số loại xạ khuẩn Streptomyces và nấm Trichoderma có khả năng
đối kháng với vi nấm gây bệnh trên cây trồng.
Ở Việt Nam cũng đã sử dụng nhiều chế phẩm sinh học trong bảo vệ thực vật
nhập từ Trung Quốc hay Nhật Bản và đã phân lập được một số chủng xạ khuẩn và
nấm Trichoderma có khả năng chống nấm gây bệnh ở thực vật. Tuy nhiên việc sử
dụng chế phẩm trong lĩnh vực bảo vệ thực vật ở nước ta còn ở mức độ thấp bởi tập
quán canh tác chỉ quen dùng một số hóa chất bảo vệ thực vật nhất định.
Cây đậu xanh (Vigna radiate L.) là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao, đứng
hàng thứ ba sau đậu tương và lạc. Cây đậu xanh có thời gian sinh trưởng ngắn, mỗi
chu kỳ sinh trưởng kéo dài từ 60-90 ngày. Mặt khác, yêu cầu kỹ thuật canh tác đơn
giản, vốn đầu tư ít, thu hồi nhanh, có thể trồng nhiều vụ trong một năm nên được
người dân lựa chọn để canh tác trên diện tích rộng. Trồng cây đậu xanh cịn có tác
dụng trong cải tạo và bồi đưỡng đất, cung cấp nguồn đạm sinh học quan trọng.
Quảng Nam có khí hậu nóng, mưa nhiều là điều kiện thích hợp cho việc trồng
đậu xanh. Tuy nhiên, sự phát triển mạnh của nấm gây bệnh đã làm ảnh hưởng đến


2
năng suất và chất lượng thu hoạch. Do đó để khắc phục tình trạng trên, cần có
những biện pháp sinh học phịng trừ bệnh để kiểm sốt sự gây hại của chúng.
Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng
thử nghiệm chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma và xạ khuẩn Streptomyces
đối kháng với một số vi nấm gây bệnh trên cây đậu xanh (Vigna radiate L.) tại xã
Điện Hồng – Điện Bàn - Quảng Nam”
2. MỤC T ÊU N

ÊN CỨU

Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng nấm Trichoderma và xạ khuẩn

Streptomyces để tạo chế phẩm sinh học có khả năng đối kháng với vi nấm gây bệnh
trên cây đậu xanh, làm cơ sở cho việc ứng dụng chế phẩm sinh học vào thực tiễn tại
địa phương.
3. NỘ DUN

N

ÊN CỨU

Phân lập các chủng vi nấm gây bệnh trên cây đậu xanh tại xã Điện Hồng -

-

Điện Bàn - Quảng Nam.
-

Phân lập, tuyển chon các chủng xạ khuẩn Streptomyces và nấm Trichoderma
có khả năng đối kháng với vi nấm gây bệnh trên cây đậu xanh tại xã Điện
Hồng - Điện Bàn - Quảng Nam.
Lựa chọn mơi trường thích hợp để tạo chế phẩm thô từ các chủng nấm

-

Trichoderma và xạ khuẩn Streptomyces đã tuyển chọn.
Ứng dụng thử nghiệm chế phẩm thô đối kháng với các chủng vi nấm gây

-

bệnh trên cây đậu xanh.
4. Ý N

ĨA K OA

ỌC V T ỰC T ỄN CỦA Ề T

- Tuyển chọn và lưu giữ các chủng xạ khuẩn Streptomyces và nấm
Trichoderma có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên cây trồng phân lập tại xã
Điện Hồng - Đại Lộc- Quảng Nam.
- Xác định một số môi trường thích hợp có hiệu quả cao để lên men tạo ra chế
phẩm. Góp phần tạo sản phẩm cải tạo đất, chống bệnh cho cây trồng ứng
dụng tại địa phương.


3

C ƢƠN

TỔN QUAN T

1

L ỆU

1.1. SƠ LƢỢC VỀ X K UẨN.
1.1.1. Cấu tạo của xạ khuẩn
Xạ khuẩn là vi khuẩn Gram dương. Trên môi trường đặc, xạ khuẩn phát triển
thành những khuẩn lạc. Khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng da, dạng
nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có 3 lớp: lớp ngồi có các sợi
bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu tạo tổ ong. Khuẩn ty trong mỗi
lớp có hoạt tính sinh học khác nhau. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau như:

đỏ, da cam, vàng, nâu, tím, xanh … tùy thuộc vào lồi và điều kiện môi trường. Cấu
trúc khuẩn lạc xạ khuẩn được phân biệt ở hướng sinh trưởng trong và ngồi mặt mơi
trường thạch tạo thành hệ sợi khí sinh (HSKS) và hệ sợi cơ chất (HSCC). Phần cuối
của HSKS thường biến thành cuống sinh bào tử có nhiều loại hình dạng khác nhau:
thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc đơn…
Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử với phương pháp phân đoạn
hay cắt khúc, thường có hình trụ, ovan, hình cầu, hình que. Hình dạng và kích thước
cuống sinh bào tử, hình dạng, kích thước và bề mặt bào tử là một tiêu chuẩn quan
trọng trong phân loại xạ khuẩn [21].
Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng là
đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác. Nguồn nitơ hữu cơ là protein,
pepton, cao ngô, cao nấm men. Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối amôn… khả năng
đồng hóa các chất ở các lồi hay chủng xạ khuẩn khác nhau là khác nhau.
1.1.2. Tình hình nghiên cứu CKS trên thế giới và ở Việt Nam
1.1.2.1. Tình hình nghiên cứu CKS trên thế giới
Năm 2007 từ các mẫu đất tại phía đơng nam Serbia đã phân lập được lồi XK
Streptomyces hygroscopicus sinh CKS nhóm polyen có khả năng chống lại nấm
Botrytis cinerea gây bệnh thối xám hại nho và kháng virus Herpes simplex. Tại Hàn
Quốc phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces sp. C684 sinh CKS laidlomycin,


4
chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng methicillin và các cầu khuẩn
kháng vancomycin, kháng được nấm gây bệnh trên thực vật.
Năm 2008 từ 7 mẫu đất nông nghiệp ở Sarawak, Kuala Lumpur đã phân lập
được 62 XK thuộc chi Streptomyces trong đó có 37 chủng sinh CKS đối kháng với
nhiều VSVKĐ: Fusarium palnivora, Bacillus subtilis, Ralstonia solanacerarum.
Làm cơ sở để tạo ra các CKS kháng nấm với vi khuẩn, hướng tới một nền nông
nghiệp sinh thái bền vững [25].
Năm 2011, tại Thái Lan đã phân lập được chủng XK Streptomyces cavurensis

từ đất ở vùng rễ cây trồng ức chế chống lại nấm Collectotrichum spp, tác nhân gây
bệnh thán thư. Đã thu được 304 chủng XK trong đó có 202 chủng có hoạt tính KS
chiếm 73% kháng được ít nhất một loại nấm mốc hoặc nấm men; 17,8% chống lại
3 loại nấm gây bệnh thán thư [43].
Mới đây nhất, tháng 01 năm 2012 tại Ấn Độ đã phân lập và xác định đến loài
XK Pseudonocardia azurea sp. từ vùng đất trầm tích của các hệ sinh thái rừng
ngập mặn Ninzampatnam tại vùng ven biển phía nam của Andhra Pradesh. Đây là
chủng xạ khuẩn hiếm tiết ra CKS azureomycin A và B có hiệu quả chống nấm gây
bệnh trên phạm vi rộng [42].
1.1.2.2. Tình hình nghiên cứu CKS ở Việt Nam
Trường Đại học Tổng Hợp Hà Nội (nay thuộc Đại học Quốc Gia Hà Nội), Đại
học Sư Phạm Hà Nội đã nghiên cứu sự phân bố, sự lên men các chủng XK sinh
CKS có hoạt tính mạnh, hoạt phổ rộng từ đất Việt Nam. Viện Khoa học Việt Nam
đã nghiên cứu sản xuất và khả năng ứng dụng của chế phẩm Biovit, Teravit,
Baxitraxin vào chăn nuôi và bảo vệ cây trồng trong nông nghiệp. Trong nhiều năm
qua Trường Đại học Dược và các Xí nghiệp Dược đã thực hiện hàng trăm các thí
nghiệm lên men các CKS: Clotetraxillin, oxytetraxillin, erythromyxin, neomyxxin,
dekamixin, fumajilin… đã thu được những kinh nghiệm nhất định về công nghệ
sinh học và công nghệ kháng sinh [11].
Năm 2004, Kiều Hữu Ảnh đã xác định đến lồi chủng xạ khuẩn Streptomyces
hygroscopius có khả năng sinh CKS chống các nấm gây bệnh trên thực vật:


5
F.oxysporum, Scierotifum tolfsii và bước đầu thử nghiệm chế phẩm trên đồng ruộng
[7].
Năm 2006, Bùi Thị Việt Hà đã phân lập được 508 chủng XK từ 71 mẫu đất
khác nhau ở Việt Nam và xây dựng được cây phát sinh chủng loại của 3 chủng XK
T – 41, D – 42, TC – 54, xác định được cấu trúc hóa học của CKS TC – 54. Đây là
lần đầu tiên một chủng XK được nghiên cứu từ khâu đầu phân lập đến tìm ra cấu

trúc phân tử [8].
1.1.3. Ứng dụng của CKS trong bảo vệ thực vật
Để khắc phục các nhược điểm trên do thuốc hóa học gây ra thì ngoài các biện
pháp như thay đổi mùa vụ, thay đổi cơ cấu cây trồng, tuyển chọn các giống cây
trồng có khả năng kháng lại sâu bệnh v.v… thì biện pháp sử dụng CKS đã và đang
được nghiên cứu. CKS có nhiều ưu điểm hơn so với thuốc hóa học như: có tác dụng
nhanh, dễ phân hủy, có tính đặc hiệu cao chỉ tiêu diệt một hoặc một số loài sâu nhất
định nên khơng ảnh hưởng đến những VSV có ích khác. Đồng thời, CKS có độ độc
thấp, khơng gây ơ nhiễm mơi trường và đặc biệt là nó cịn có khả năng ức chế cả
những VSV đã kháng lại thuốc hóa học.
Trong vịng vài chục năm trở lại đây, Nhật Bản đã sản xuất ở quy mô công
nghiệp 10 loại CKS chống bệnh ở thực vật như blastisidin từ xạ khuẩn S.
griseochromogenes,

kasugamixin

từ

S.

kusugaensis,

validamixin

từ

S.

hygroscopicus... Các CKS này có khả năng chống bệnh đạo ơn, khơ vằn hại lúa rất
có hiệu quả, độ độc thấp. Ở Anh và các nước Châu Âu khác đã sử dụng KS

griseofulvin, Ấn Độ sử dụng aureofunvin chống bệnh thối cổ rễ...[25].
Tháng 1 năm 2003 khoa Bệnh học Thực vật Trường Đại học Quốc Gia Chung
Hsing ở Taichung Đài Loan đã phân lập được chủng xạ khuẩn Streptomyces
padanus PMS-702 có khả năng sinh kháng sinh fungichromin. Chất KS
fungichromin có khả năng kháng khuẩn mạnh tiêu diệt được Rhizotonia solani AG 4, một tác nhân làm chết cây cải bắp khi bị ngập nước. Nếu xử lý hạt cải bắp với
dịch lọc của chủng xạ khuẩn Streptomyces padanus PMS - 702 có tác dụng làm
giảm khả năng bị chết do ngập nước của cây cải bắp. Nồng độ để kiềm chế tối thiểu
của CKS này là 72 mg/ml, kiềm chế được hơn 90% [40].


6
Năm 2008, chế phẩm Antiforhis được Viện Công Nghệ Sinh Học- Bộ Nông
Nghiệp – Phát triển nông thôn đã nghiên cứu và sản xuất bằng phương pháp lên
men xốp thanh trùng trên nền giá thể dinh dưỡng. Chế phẩm này có nguồn gốc từ 5
chủng vi sinh vật chọn lọc đối kháng nấm gây bệnh Pseudomonas fluorescens
chống bệnh héo vàng trên cây cà chua và lở cổ rễ cây bắp cải.
1.2. K Á QUÁT VỀ NẤM TRICHODERMA
1.2.1. ặc điểm hình thái, sinh trƣởng của nấm Trichoderma
1.2.1.1. Đặc điểm hình thái
Trichoderma là một lồi nấm bất tồn, sinh sản vơ tính bằng đính bào tử.
Khuẩn ty của vi nấm khơng màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhánh
phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần liên kết với nhau thành chùm
nhỏ ở đầu cành. Bào tử hình cầu, hình elip hoặc hình thn, trong suốt hoặc có màu
lục. Khuẩn lạc nấm có màu trắng hoặc từ lục trắng đến lục, vàng xanh, lục xỉn đến
lục đậm [22].
Bào tử của hầu hết nấm Trichoderma có hình bầu dục, kích thước khoảng (3 –
5μm) x (2 – 4μm), rất hiếm khi bào tử của nấm này có hình cầu. Vách bào tử trơn
láng, tuy nhiên ở một vài lồi Trichoderma (như T. viride) bào tử có vách xù xì như
có nhiều mụn cơm (Mecray, 2002). Tất cả các lồi Trichoderma đều có khả năng
sinh bào tử áo (Chlamydospore). Bào tử áo có hình cầu méo và ở dạng đơn bào, tuy

nhiên cũng có một số lồi có khả năng hình thành nên các bào tử áo đa bào [38].
Kubicek và Harman đã mô tả chi tiết 33 lồi Trichoderma, ơng cho rằng: tùy
từng lồi nấm mà chúng có hình dạng và kích thước khác nhau. Trong đó, một số
lồi Trichoderma đã được ứng dụng trong phịng trừ sinh học [30].
1.2.1.2. Sự sinh trưởng của nấm Trichoderma
Trichoderma có khả năng sử dụng nguồn hỗn hợp cacbon và nitơ. Nguồn
cacbon và năng lượng Trichoderma sử dụng được là monosaccharit và disaccharit,
cùng với hỗn hợp polysaccgarit, purin, pyrinidin, axít amin, tanmin, andehit và axít
hữu cơ. Đặc biệt là axít béo, methanol methylamin và NH3 là nguồn đạm bắt buộc
phải có trong môi trường nuôi cấy Trichoderma [26].
1.2.2. Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma


7
Cơ chế đối kháng giữa Trichoderma và các loại nấm khác được phân loại như
sau: kí sinh lên cơ thể của nấm bệnh (mycoparasitism), tiết ra các chất kháng nấm
bệnh (antibiosis), cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống với nấm bệnh
(competition for nutrient). Những cơ chế này không tách biệt nhau, và cơ chế đối
kháng thực tế có thể là một trong những loại cơ chế này. Ví dụ, sự kiểm soát nấm
Botrytis cinerea (gây bệnh mốc xám) trên nho bởi Trichoderma bao gồm cả sự cạnh
tranh dinh dưỡng và sự kí sinh lên hạch nấm, cả hai cơ chế đã ngăn chặn tác nhân
gây bệnh [27], [28], [31], [36].
* Cơ chế ký sinh lên nấm bệnh
Theo Chet (1990) cơ chế đối kháng kí sinh gồm 4 giai đoạn. Giai đoạn 1, sự
tăng trưởng có tính chất hướng hóa, trong giai đoạn này tác nhân kích thích hóa học
từ nấm gây bệnh hấp dẫn nấm đối kháng. Giai đoạn 2, sự nhận dạng đặc hiệu, có lẽ
trung gian bởi lectin trên bề mặt tế bào của cả tác nhân gây bệnh và nấm đối kháng.
Giai đoạn 3, sự tấn cơng và xoắn vịng của sợi nấm Trichoderma xung quanh vật
chủ. Giai đoạn 4, sự bài tiết các enzim phân giải vách tế bào chất. Hệ enzim phân
giải vách tế bào bao gồm chitinaza, glucanaza, proteaza [24].

* Cơ chế tiết chất kháng sinh
Các chủng Trichoderma sản xuất đa dạng các chất chuyển hóa thứ cấp dễ bay
hơi và khơng bay hơi, một vài chất loại này ức chế VSV khác mà khơng có sự
tương tác vật lí. Chất ức chế được coi là chất kháng sinh. Các chủng Trichoderma
sản xuất nhiều loại kháng sinh khác nhau, môi trường cũng tác động vào sự sản xuất
cả về chất lượng và số lượng. Hơn nữa các kháng sinh đặc hiệu tác động vào các tác
nhân gây bệnh khác nhau thì khác nhau [31].
Bên cạnh sự tác động qua lại trong quần thể giữa nấm đối kháng và nấm bệnh,
trong hoạt động sống nấm Trichoderma sản sinh ra các men phân hủy glucoza,
xenluloza làm chất hữu cơ có trong đất được phân hủy nhanh hơn tạo điều kiện cho
cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt [15].
* Cơ chế cạnh tranh dinh dƣỡng và không gian sống
Sự cạnh tranh dinh dưỡng cũng được xem như cơ chế hữu hiệu khi sử dụng
nấm Trichoderma trong kiểm soát nấm bệnh.


8
Lockwood (1981, 1982) và Wicklow (1992) đã đưa ra khái niệm cạnh tranh
khai thác và cạnh tranh cản trở vào tương tác giữa quần thể nấm. Sự cạnh tranh cản
trở liên quan đến cơ chế hóa học và tập tính bởi VSV này giới hạn VSV khác tiếp
xúc cơ chất và xảy ra do sự tương tác giữa hệ sợi nấm trong cùng loài hoặc khác
loài Sự cạnh tranh dinh dưỡng bao gồm: cạnh tranh cho mô hoại sinh, cho chất dịch
rỉ từ hạt và trên vị trí vết thương [31].
1.2.3. Tình hình nghiên cứu về nấm Trichoderma trên thế giới và ở Việt
Nam
1.2.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Năm 1984, Hardar và ctv công bố nấm Trichoderma spp. được sử dụng rộng
rãi trong phòng trừ sinh học để quản lý bệnh hại do R. solani gây ra. Nấm
Trichoderma spp. tấn công trực tiếp bằng cách cuộn quanh và tiết ra enzim phân
hủy chitin của nấm gây hại thành những phân tử nhỏ dễ hấp thu, đồng thời giúp cây

trồng kháng lại bệnh. Và cho rằng nấm Trichoderma spp. sống ở rễ cây giúp biến
đổi vật chất vô cơ, giúp tăng cường khả năng sản xuất hóc mơn ở cây trồng, làm
tăng khả năng kháng bệnh của cây trồng. Khi dùng dịch huyền phù nấm
Trichoderma hazianum vào trong đất làm tăng sự nẩy mầm, tăng khả năng ra hoa,
tăng sinh khối và chiều cao cây bắp, ớt, hoa cúc, cà chua, thuốc lá. Nòi T1290 của
nấm Trichoderma hazianum còn làm tăng số chồi và rễ cây bắp ngọt trong nhà lưới
66% so với đối chứng [32], [35].
Năm 2000, Okigbo và Ikediugw cho biết những lồi Trichoderma spp. có hệ
sợi nấm nhỏ, mảnh là một nhân tố có triển vọng trong phòng trừ sinh học chống
bệnh thối hạt, thối rễ và quản lý bệnh hại sau thu hoạch.
1.2.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Ở Việt Nam những nghiên cứu về sự phân bố của nấm Trichoderma chưa
nhiều, chủ yếu ở khu vực phía Nam.
Năm 2005, Đinh Minh Hiệp nghiên cứu về enzym chitinaza và β-glucanaza từ
Trichoderma spp. và khả năng kiểm soát sinh học đối với một số nấm gây bệnh
thực vật ở Viện Sinh học Nhiệt đới. PGS.TS Phạm Thị Ánh Hồng và ThS. Đinh
Minh Hiệp ở khoa sinh, ĐH KHTN ĐHQG-HCM đã tiến hành đề tài “Điều tra khảo


9
sát sự phân bố của các chủng nấm Trichoderma tại TP. Hồ Chí Minh và các tỉnh
Đơng Nam Bộ” [10].
Gần đây nhất vào năm 2010, tại ĐBSCL đã sản xuất được hai dạng chế phẩm
phân hủy rơm (dạng chế phẩm hồ tan trong nước và dạng chế phẩm khơng hồ tan
trong nước), mật số tồn tại của nấm Trichoderma của chế phẩm dạng bột hoà tan
trong nước mật số dao động từ 0,01 x 1012 đến 0,09 x 1012 và đối với chế phẩm
dạng bột khơng hồ tan trong nước dao động từ 0,09 x 109 đến 420 x 1012. Xác định
thời gian sử dụng chế phẩm tốt nhất trong vòng 3 tháng [4].
Năm 2011, Đào Thị Hồng Xuyến, Trương Trọng Ngôn, Dương Minh báo cáo
đề tài “Khảo sát sự đa dạng di truyền và khả năng tiết enzyme β-1,3-glucanase của

các chủng nấm Trichoderma có triển vọng trên đất trồng cam quít và dứa” ở Hội
thảo Quốc gia về Bệnh Hại Thực vật Việt Nam lần 10, Hà Nội, 20 - 22/7/11 [4].
1.2.4. Ứng dụng của nấm Trichoderma trong lĩnh vực bảo vệ thực vật
Một trong những nghiên cứu ứng dụng của Trichoderma spp. được quan tâm
nhiều nhất, đó là khả năng kiểm soát sinh học cũng như khả năng đối kháng một số
nấm gây bệnh ở thực vật. Các nhà nghiên cứu đã sử dụng nhiều loại Trichoderma
spp. khác nhau để kiểm soát nhiều loại nấm gây bệnh khác nhau. Kết quả là
Trichoderma spp. kiểm sốt có hiệu quả các nấm gây bệnh sau: Rhizoctonia spp.:
gây mục rễ, thân và hạt. Pythium spp.: gây úng thối ở đậu, thuốc lá, cây con;
Armillaria mellea: mục rễ ở cây rừng, cao su, thông; Botrytis cinerea: mốc xám gây
hỏng dâu và nho. Phytophthora spp.:mục rễ, hỏng trái ở ca cao [19].
Hiện nay, các chủng nấm Trichoderma spp. đã được sử dụng rộng rãi trong
các chế phẩm sinh học thương mại, với thành phần chính là Trichoderma spp. kiểm
sốt có hiệu quả các nấm gây bệnh trên cây trồng. Ở New Zealand, nhiều chủng
Trichoderma khác nhau được trộn chung để kiểm soát bệnh trên cây nho và các cây
dạng quả hạch. Ở Mỹ, người ta rắc bột bào tử hay phủ gel bào tử lên các hạt giống
để tăng tính kháng bệnh của cây trồng hay phun bào tử lên khắp cánh đồng trước
khi trồng trọt [28].
Trong nước, đã có nhiều cơng trình nghiên cứu sử dụng các chủng nấm
Trichoderma xử lí đất trước khi gieo trồng bắp hay trộn nấm mốc với phân chuồng


10
hoại mục trước khi bón ruộng 5 - 10 ngày, rồi rải trên ruộng trước khi gieo hạt có
tác dụng hạn chế bệnh khô vằn hại bắp [15].
1.3.

K Á

QUÁT

VỀ

NẤM

BỆN

RHIZOCTONIA, COLLECTOTRICHUM

ASPERGILLUS,
ÂY

FUSARIUM,

TRÊN RAU, MÀU

1.3.1. Khái quát về nấm bệnh Aspergillus
Giống Aspergillus có khoảng 200 lồi trong tự nhiên, trong đó có các lồi
Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae… có giá trị sử dụng trong
sản xuất enzim, rượu, axit hữu cơ… Giống Aspergillus do Michelli mô tả lần đầu
vào năm 1729. Năm 1901 Wehmer đã cho ra đời chuyên luận phân loại giống nấm
bất tồn này.
Vị trí phân loại: Thuộc lớp Deuteromyces, bộ Moniliales, họ Moniliaceace.
Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, bào tử đính khơng nằm trong bọc bào tử,
cuống sinh bào tử thể bình phình lên rõ rệt ở đầu tạo thành bọng lớn hình cầu, màu
nâu đen. Thể bình gồm hai lớp, lớp thứ nhất hình tam giác cân ngược, lớp thứ hai
hình chai; bào tử đính xịe, hình cầu xù xì, có gai nhọn, có màu nâu đen đến đen
than.
Nấm Aspergillus là nguyên nhân gây ra hư hại trái cây tươi sau thu hoạch như
táo, lê, đào, chanh, nho, dâu, xồi, lựu… Ngồi ra nó cịn làm hư hại trái sake, hạt

điều, các loại đâu đỗ, ngoài ra chúng còn sống bám trên đồ da, đồ gỗ.
1.3.2. Khái quát về nấm bệnh Fusarium
Nấm Fusarium là chi lớn nhất trong họ Tuberculariaceae, thuộc lớp
Hyphomycetes, nấm bất toàn Fungi imperfecti. Loài nấm này gây hại nhiều loại cây
trồng trên tất cả các bộ phận đặc biệt bộ phận gốc, rễ của cây [9], [23].
Đặc điểm hình thái của nấm Fusarium là: hệ sợi nấm phân nhánh, có vách
ngăn, sợi nấm thường không màu, chuyển màu nâu khi già.
Fusarium sinh sản vô tính bằng bào tử, có kiểu bào tử vơ tính là bào tử đính
lớn, bào tử đính nhỏ và bào tử vách dày (hậu bào tử). Bào tử đính lớn dài, nhiều
nhân, hình liềm hoặc thân cong sinh ra từ cuống bào tử, phân nhiều nhánh xếp thành
tầng. Đầu và cuối bào tử đính lớn thn nhọn. Một vài lồi bào tử lớn tách rời và
không gắn trên cuống bào tử, những tế bào sinh bào tử lớn gọi là thể bình. Bào tử


11
đính nhỏ thường đơn nhân đơi khi 2 ngăn, hình cầu hoặc hình trứng được sinh ra từ
một thể bình hay những cuống bào tử phân nhánh hoặc không phân nhánh và
thường được giữ trong một nhóm nhỏ. Bào tử đính nhỏ của Fusarium rất giống bào
tử của Cephalosporium vì thế giai đoạn này thường được quy vào nấm
Cephalosporium. Bào tử vách dày, hình trịn hoặc hình trứng, vách dày, nằm tận
cùng hoặc chen giữa các sợi nấm giả, chúng có thể phát triển đơn hoặc thành chuỗi.
Hậu bào tử hay bào tử vách dầy rất bền và tồn tại độc lập trong thời gian dài.
1.3.3. Khái quát về nấm bệnh Rhizoctonia
Thuộc lớp Nấm Trơ (Mycelia Steliria); ở giai đoạn hữu tính là Thanatephorus
cucumeris thuộc lớp nấm Đảm, là lồi nấm đa thực có phổ ký chủ rất rộng, ký sinh
trên các cây: lúa, ngô, khoai tây, thuốc lá, lạc, cà chua, cải bắp, đậu đỗ, bèo tây.
Đặc điểm về hình thái: Nấm Rhizoctonia khi cịn non có sợi nấm khơng màu,
khi trưởng thành có màu nâu vàng nhạt, có vách ngăn không liên tục (Ou, 1983).
Trên mô ký chủ hoặc vách ống nghiệm nuôi cấy, sợi nấm đôi khi mọc ra
những tế bào ngắn, phình to và phân nhiều nhánh.

Theo Phạm Hoàng Oanh (1998), thời gian bắt đầu tạo hạch nấm nhanh nhất là
sau khi nuôi cấy và chậm nhất là 240 giờ. Hạch nấm bám sát vào mô nuôi cấy, bề
mặt sần sùi, sợi nấm to, không màu, phân nhánh vng góc.
Khi chúng nhiễm vào cây sẽ gây ra các triệu chứng bệnh như: nấm bệnh tấn
công vào phần gốc, thân gần mặt đất làm cây con héo rũ, phần gốc và rễ cây có vết
bệnh màu nâu hơi đỏ. Những nghiên cứu về sự sinh trưởng trong phịng thí nghiệm
cho thấy, nấm rhizoctonia gây hại cho nhiều loại cây trồng khác nhau bao gồm:
bông vải, củ cải, khoai tây, ngơ, đậu đỗ và lúa mì.
1.3.4. Khái qt về nấm bệnh Collectotrichum
Nấm Collectotrichum thuộc lớp nấm Deuteromycetes, bộ Melanconiales, họ
Melanconiaceae. Collectotrichum được mơ tả có 11 lồi (von Arx,1957; Sutton,
1973). Theo ý kiến gần nhất của Baxter và cộng sự (1985), Collectotrichum được giới
thiệu có 21 lồi: C. coccodes, C. dematium, C. gloeosporioides, C. graminicola, C.
falcatum và C. capsici… là những loài thường gây bệnh thán thư [2].


12
Collectotrichum có hệ sợi nấm nội sinh, sợi nấm mảnh, phân nhánh, khơng
màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào; nhiều hạt dầu được sản xuất
trong mỗi tế bào của hệ sợi nấm, khi chín sợi nấm trở nên sậm màu và bện xoắn lại
thành dạng chất nền nhỏ dưới lớp ngoài cùng [2].
Nấm Collectotrichum chỉ sinh sản vơ tính bằng bào tử đính, bào tử đính phát
triển trên cuống bào tử trong dạng thể quả là cụm cuống bào tử. Cụm cuống bào tử
có dạng đĩa phẳng, mặt sau có cấu trúc phấn mịn, mỗi cụm cuống bào tử gồm lớp
chất nền, bề mặt sản sinh cuống bào tử trong suốt. Cuống bào tử không có vách
ngăn kéo dài đơn bào, dạng liềm, cong, bào tử trong suốt. Cùng với bào tử và cuống
bào tử là các lông cứng trên mỗi cụm cuống bào tử, lông dài cứng, thuôn nhọn,
không phân nhánh [2].
Những bệnh do nấm Aspergillus, Fusarium, Rhizoctonia và Collectotrichum
gây ra rất phổ biến ở nước ta và trên thế giới, gây thiệt hại lớn cho ngành nông

nghiệp và nền kinh tế đất nước. Vì vậy, biện pháp ngăn chặn và hạn chế 4 loại nấm
bệnh này hoạt động gây bệnh trên đồng ruộng là rất cần thiết.
1.4. TỔN

QUAN VỀ CÂY ẬU XAN

Cây đậu xanh có nguồn gốc từ Trung Á, được trồng ở nhiều nơi trên thế giới
như Mỹ, Úc và nhiều nước Châu Á. Ở nước ta cây đậu xanh được xác định là một
trong những cây trồng họ Đậu quan trọng, về giá trị dinh dưỡng cũng như giá trị về
kinh tế của nó. Đậu xanh được trồng tập trung ở các tỉnh phía Nam, một ít ở phía
Bắc và duyên hải Trung Bộ [14].
Đặc điểm nổi bật của cây đậu xanh là về giá trị dinh dưỡng, hàm lượng
protein cao chiếm 20 - 40 % trọng lượng khô của hạt, chứa đầy đủ các axitamin
khơng thay thế. Ngồi ra hạt còn chứa các chất dinh dưỡng khác như lipit 2,4 %,
các chất khoáng (Ca, Fe, P, Na, Mg, K ...) 3,5 %, các vitamin 0,03%.
Về thực phẩm, hạt đậu xanh là nguồn nguyên liệu quan trọng trong ngành
chế biến thực phẩm như sản xuất bột đậu, bột dinh dưỡng, làm giá đỗ, làm nguyên
liệu chế biến bánh kẹo.
Về y học, đậu xanh là vị thuốc giải nhiệt, mát gan bổ thận.


13
Đối với nơng nghiệp, cây đậu xanh có vai trị tích cực trong việc cải tạo đất
sau mỗi vụ trồng cây họ Đậu để lấy hạt, đất được giàu thêm một lượng lớn nitơ dễ
sử dụng nhờ vi khuẩn sống cộng sinh cố định nitơ ở rễ cây.
Như vậy, trong cơ cấu cây trồng nông nghiệp ở nước ta cây đậu xanh có giá
trị về nhiều mặt, trong tương lai sẽ được mở rộng diện tích gieo trồng trên cả nước.
1.5. VỊ TRÍ

ỊA LÝ V

ỀU K ỆN TỰ N

ÊN XÃ

ỆN

ỒN

- B - QN

1.5.1. Vị trí địa lý
Điện Hồng là xã đồng bằng thuộc về phía Tây của huyện Điện Bàn, nằm trên
tuyến ĐT 609 (Vĩnh Điện đi đường Hồ Chí Minh (Nam Giang), cách thị trấn Vĩnh
Điện 12 km, ranh giới hành chính được xác định:
- Phía Đơng giáp

: xã Điện Thọ.

- Phía Tây giáp

: thị trấn Ái Nghĩa, xã Đại Hịa.

- Phía Nam giáp

: xã Điện Quang.

- Phía Bắc giáp : xã Điện Tiến.
1.5.2. iều kiện tự nhiên
- Địa hình, địa mạo

Xã có địa hình tương đối bằng phẳng, ít chia cắt, hướng dốc chính từ Tây sang
Đông theo dịng chảy của sơng Thu Bồn và sơng Bình Phước. Do vậy diện tích đất
sản xuất nơng nghiệp trên địa bàn xã tập trung, nhiều cánh đồng rộng lớn, năng suất
cao và ổn định.
Tổng số giờ nắng trung bình trong năm là 2.371 giờ, tập trung từ tháng 2 đến
tháng 8 hàng năm. Các tháng có giờ nắng nhiều nhất là 4, 5, 6, 7, các tháng có giờ
nắng ít nhất 9, 10, 11, 12.
Nhìn chung, xã nằm trong khu vực có kiểu khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa, có
hai mùa rõ rệt. Với kiểu khí hậu thời tiết này sẽ thuận lợi cho việc phát triển nhiều
loại cây trồng. Tuy nhiên, cũng có nhiều bất lợi cho việc bố trí mùa vụ sản xuất,
dịch bệnh xảy ra nhiều là những hạn chế cần quan tâm để khắc phục.
- Các nguồn tài nguyên đất: Trên địa bàn xã có một số nhóm đất chính sau:
Đất phù sa sơng được bồi: diện tích 543,04 ha, chiếm 35,06 % tổng diện tích
tự nhiên. Đất có thành phần cơ giới thịt nặng, thịt nhẹ, thịt trung bình tầng dày trên


14
100cm, đang sản xuất lúa và cây hoa màu. Phân bố tập trung ở thôn 3 và thôn 5 dọc
theo sơng Thu Bồn và sơng Bình Phước.
Đất phù sa khơng được bồi: diện tích 356 ha, chiếm 22,98 % tổng diện tích,
phân bố tập trung ở các khu vực thơn 6, thôn 7 và thôn 8. Loại đất này ở địa hình
cao hơn, tầng dày trên 100 cm thành phần cơ giới từ thịt nặng đến trung bình và thịt
nhẹ hiện đã được khai thác sử dụng để sản xuất nơng nghiệp, năng suất cây trồng ổn
định và có chiều hướng gia tăng.
Đất phù sa Glây: diện tích 471,35 ha, chiếm 30,43 % tổng diện tích, phân bố ở
khu vực các thôn 1, thôn 2, thôn 4, thôn 9, thôn 11 và dọc theo tỉnh lộ ĐT 609 đoạn
Đồng Tứ đi Vĩnh Điện. Thành phần cơ giới từ thịt nhẹ đến trung bình, thích hợp
cho việc trồng các loại hoa màu, lúa
Cồn cát và bãi cát trắng vàng: diện tích 45,38 ha, chiếm 3,25 % tổng diện
tích, đất cồn cát thường phân bố liền dãi dọc theo bờ sông Thu Bồn

15

C ƢƠN

P ƢƠN
2.1. Ố TƢỢN

N

2

P ÁP N

ÊN CỨU

ÊN CỨU

2.1.1. Xạ khuẩn
Các chủng xạ khuẩn Streptomyces được phân lập các mẫu đất tại xã Điện
Hồng - Điện Bàn - Quảng Nam.
2.1.2. Nấm Trichoderma
Các chủng nấm Trichoderma được phân lập từ các mẫu đất tại xã Điện Hồng Điện Bàn - QN.
2.1.3. Nấm bệnh
Các chủng nấm mốc: Aspergillus gây bệnh mốc hạt; Fusarium gây bệnh héo
vàng. Colletotrichum gây bệnh thán thư; Rhizoctonia gây bệnh mục rễ, phân lập
trên cây đậu xanh bị bệnh tại xã Điện Hồng - Điện Bàn - Quảng Nam.
2.1.3. Cây đậu xanh (Vigna radiate L.).
2.2. ỊA

ỂM, P

MV V T Ờ

AN N

ÊN CỨU

2.2.1. ịa điểm thu mẫu ngoài thực địa
Tiến hành lấy mẫu nghiên cứu tại xã Điện Hồng – Điện Bàn - Quảng Nam.
2.2.2. ịa điểm và phạm vi nghiên cứu thí nghiệm
* Địa điểm nghiên cứu thí nghiệm
Phịng thí nghiệm Vi sinh - Hóa sinh của khoa Sinh - môi trường, trường Đại
học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng.
* Phạm vi nghiên cứu
- Phân lập các chủng vi nấm gây hại chính trên cây đậu xanh.
- Phân lập, tuyển chọn các chủng xạ khuẩn chi Streptomyces có khả năng sinh
CKS chống vi nấm gây bệnh trong đất tại xã Điện Hồng - Điện Bàn - Quảng Nam.
- Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với
nấm gây bệnh ở thực vật trong đất tại xã Điện Hồng - Điện Bàn - Quảng Nam.
- Lên men tạo chế phẩm sinh học từ nấm và xạ khuẩn trên môi trường bán rắn.


16
- Ứng dụng thử nghiệm chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma và xạ khuẩn
Streptomyces đến khả năng đối kháng nấm Collectotrichum gây bệnh thán thư trên
cây đậu xanh.
2.2.3. Thời gian nghiên cứu
Thời gian thực hiện: từ tháng 03/2012 đến tháng 05/2013.

2.3. P ƢƠN

P ÁP N

ÊN CỨU

2.3.1. Phƣơng pháp thu mẫu ngoài thực địa
- Nguyên tắc lấy mẫu đất: mẫu được lấy theo phương pháp lấy điểm theo
đường chéo, ở tầng đất từ 5 – 15cm ở các vị trí khác nhau (4 - 5 vị trí) trong một
vùng 100m2. Sau đó các mẫu đất đem trộn đều, đựng trong túi nilông đã khử trùng.
- Xử lý đất tại chỗ: thực vật, động vật sống trong đất và đất sỏi được loại bỏ
trước khi rây qua rây cỡ lỗ 2mm để tạo thuận lợi cho sự trao đổi khí giữa các hạt
đất. Đất được bóp vụn bằng tay và đảo đều để tránh lớp đất bề mặt bị quá khô (công
việc được thực hiện ở điều kiện nhiệt độ không đổi xung quanh).
- Lưu giữ, vận chuyển và bảo quản mẫu: thắt túi hơi lỏng để tạo điều kiện hiếu
khí. Mẫu đất không để chồng lên nhau. Mẫu đất đem về được phân lập ngay, càng
sớm càng tốt hoặc bảo quản trong tủ lạnh ở 4ºC.
2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu trong phịng thí nghiệm
2.3.2.1. Phương pháp phân lập
* Phân lập xạ khuẩn Streptomyces và nấm Trichoderma
Phân lập các mẫu dựa trên phương pháp phân lập của Egorov: xạ khuẩn được
phân lập trên môi trường Gauze I; Trichoderma trên môi trường PDA.
- Cách tiến hành: Cân 1 gam mẫu đất đem nghiền, cho vào bình tam giác
250ml chứa 99ml nước cất vơ trùng, lắc đều được độ pha lỗng 10-2. Hút ra 1ml cho
vào ống nghiệm chứa sẵn 9 ml nước vơ trùng, lắc đều ta có độ pha lỗng 10-3. Và
tiếp tục cho đến độ pha loãng 10-6. Dùng pipet vơ trùng hút ở mỗi độ pha lỗng
0,1ml dịch mẫu và nhỏ vào hộp petri có chứa mơi trường phân lập vô trùng, dùng
que trang dàn đều trên mặt thạch. Mỗi độ pha lỗng cấy trên 3 đĩa petri, gói cẩn
thận và nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 28 - 300C. Sau 5 – 7 ngày nuôi cấy, chọn

17
những khuẩn lạc riêng rẽ, mọc tốt, cấy truyền sang thạch nghiêng chứa cùng môi
trường phân lập đến khi thuần chủng [6].
* Phân lập mẫu bệnh cây [3], [12], [18]
- Phân lập từ lá, thân, rễ
Rửa mẫu lá, thân, rễ trong nước, khử trùng bề mặt mô lá hoặc thân, rễ bằng
cách nhúng nhanh lá vào cồn 70% trong 5 giây, rửa lại trong nước cất vô trùng và
để khô trên giấy thấm vơ trùng. Sau đó dùng kéo cắt thành từng đoạn nhỏ 2 x 2mm
từ phần ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh, tiến hành cấy mẫu trên môi trường
WA. Đặt các đĩa petri đã cấy mẫu bệnh trong tủ ấm ở nhiệt độ 280C trong 2 - 3 ngày
để cho sợi nấm phát triển trên môi trường. Khi nấm bệnh đã mọc, cấy chuyền sang
môi trường PDA.
- Phân lập nấm bệnh cây từ đất:
Tương tự như phân lập xạ khuẩn và nấm Trichoderma.
2.3.2.2. Phương pháp giữ giống
Để bảo quản giống cho những nghiên cứu tiếp theo, tiến hành cấy truyền định
kỳ 2 tháng 1 lần trên môi trường thạch nghiêng. Nuôi cấy ở tủ ấm 28 - 300C trong 2
- 7 ngày, sau đó để vào tủ lạnh bảo quản ở 40C. Trước khi mang ra sử dụng cần cấy
truyền qua ống nghiệm mới đã có sẵn môi trường [6].
2.3.2.3. Các phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh
* Phương pháp khối thạch
Cấy xạ khuẩn trên môi trường Gauze I; Gauze II, ISP – 4 trong hộp petri sau 5
– 7 ngày, khi xạ khuẩn mọc tốt, dùng khoan nút chai khoan các khối thạch đặt vào
hộp petri đã cấy VSV kiểm định. Để vào tủ lạnh từ 5 – 7 giờ cho KS kịp khuếch tán
rồi nuôi cấy ở nhiệt độ 28 – 30◦C . Đọc kết quả sau 3 ngày. Hoạt tính kháng nấm
được xác định theo kích thước vịng vơ khuẩn (D-d; mm).
* Phương pháp đục lỗ
Dùng để thử hoạt tính kháng sinh trong dung dịch. Dùng khoan nút chai khoan
các lỗ trên bề mặt môi trường đã trộn VSVKĐ ở hộp petri. Nhỏ vào các lỗ khoan

dung dịch cần thử kháng sinh. Các bước tiến hành theo giống phương pháp khối
thạch[6].


18
2.3.2.4. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học
* Đặc điểm nuôi cấy
Cấy xạ khuẩn trên 6 môi trường MT Gauze I, MT Gauze II, Czapek tinh bột,
Czapek nguyên gốc, Saccaroza và ISP-4, nuôi cấy ở nhiệt độ 28 - 30ºC. Sau 7, 14,
21 ngày đem ra quan sát khả năng sinh trưởng, màu sắc khuẩn lạc, sắc tố tiết ra môi
trường theo phương pháp Shirling và Gottlieb [39], so với bảng màu của
Bondarsev, Tresner và Backus [41].
* Đặc điểm hình thái
- Quan sát màu sắc của hệ sợi khí sinh:
Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gauze I, Gauze II, Czapek tinh bột,
Czapek nguyên gốc, Saccaroza, ISP-4, nhiệt độ nuôi cấy 28 - 30°C, sau thời gian 7,
14, 21 ngày quan sát màu sắc của HSKS và HSCC. Dựa theo tài liệu Gauze và cộng
sự [29], Krasilnikov [34], xác định màu sắc dựa theo bảng màu của Bondarsev,
Tresner và Backus [41].
- Quan sát màu sắc của hệ sợi cơ chất
Màu sắc của HSCC được xác định qua quan sát trực tiếp trên môi trường thạch
đĩa hoặc thạch nghiêng và mô tả theo thang màu chuẩn của Tresner và Backus
(1961) [41], của Bondarsev.
- Phương pháp xác định khả năng sinh amylaza và xenlulaza
Sử dụng phương pháp khối thạch bằng cách đục lỗ, nhỏ dịch lên men rồi đo
vòng phân giải (D - d, mm), D là đường kính vịng phân giải, d là đường kính lỗ
khoan. Đối với CMC và tinh bột hiện bằng thuốc thử lugol.
2.3.2.5. Lựa chọn môi trường lên men sinh tổng hợp chất KS
Nhằm lựa chọn mơi trường lên men thích hợp để xạ khuẩn có khả năng sinh
tổng hợp các CKS cao nhất. Sử dụng 4 môi trường lên men Gauze I, Gauze II, ISP4, A- 4H. Các chủng xạ khuẩn tuyển chọn được lên men trong các môi trường dịch

thể trên. Nuôi cấy trên máy lắc với tốc độ 220 vòng/phút ở nhiệt độ 28 - 30°C. Lấy
mẫu định kỳ sau 2, 3, 4, 5 ngày, xác định hoạt tính chất kháng sinh và các thông số
lên men nhằm lựa chọn chủng và mơi trường lên men thích hợp [6].


19
2.3.2.6. Phương pháp thử tính đối kháng của nấm Trichoderma đối với các
chủng nấm gây bệnh [16]
- Môi trường thử tính đối kháng (mơi trường giá đỗ)
- Cách tiến hành: rót mơi trường nước giá đỗ vào đĩa petri, để nguội và kiểm
tra nhiễm tạp sau 24 giờ. Kẻ 1 đường ở giữa đĩa petri. Cấy nấm Trichoderma và 1
trong 2 chủng nấm bệnh đã chọn trên 2 điểm đối xứng nhau trên đường vừa kẻ như
hình 2.1

TR

N
B

TR: Trichoderma
NB: nấm bệnh

3 cm
Hình 2.1. Cách cấy nấm Trichoderma và nấm bệnh trên đĩa petri
Thí nghiệm được thực hiện với 2 cơng thức:
CT1: TR và NB cấy đồng thời; CT2: NB cấy cấy độc lập (đối chứng)
Mỗi công thức được thực hiện với 3 lần lặp lại, mỗi đĩa petri là một công thức,
ủ ở nhiệt độ 25oC. Theo dõi tốc độ sinh trưởng và phát triển của Trichoderma và
chủng nấm gây bệnh.
- Chỉ tiêu theo dõi: bán kính khuẩn lạc nấm bệnh theo thời gian.

- Quy ước về khả năng đối kháng của Trichoderma đối với các chủng nấm
bệnh [20]: sau khi tiến hành thử đối kháng, theo dõi các đĩa đã cấy cho đến khi hai
khuẩn lạc của Trichoderma và nấm bệnh tiếp xúc nhau.
2.3.2.7. Phương pháp tạo chế phẩm [16]
* Chế phẩm xạ khuẩn
Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy được ni cấy lắc 200 vịng/ phút ở nhiệt
độ 30°C trong môi trường A4-H, sau 4 ngày được giống cấp 1, nhân tiếp trên môi
trường A4-H trên với 1 % giống cấp 1, sau 4 ngày được giống cấp 2. Tiếp tục lên
men rắn trên môi trường trấu : cám : nước với tỉ lệ 1 : 1 : 2 với 10% giống cấp 2.
Sau 3 ngày đem sấy khô, nghiền bột.