Nghiên cứu xác định một số đoạn ADN mã vạch và nhân giống lan phi điệp tím hòa bình (dendrobium anosmun lindley) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP
---------------------------LUẬN VĂN THẠC SỸ KH
OA HỌC LÂM NGHIỆP
ĐỖ QUỲNH LIÊN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐOẠN ADN MÃ VẠCH
VÀ NHÂN GIỐNG LAN PHI ĐIỆP TÍM HỊA BÌNH
(Dendrobium anosmun Lindley) BẰNG KỸ THUẬT
NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

CHUYÊN NGHÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ NGÀNH: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. BÙI THỊ MAI HƯƠNG
2. PGS.TS. NGUYỄN VĂN VIỆT

Hà Nội, 2020


i
LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan, đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu kết
quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất
kỳ cơng trình nghiên cứu nào khác.

Nếu nội dung nghiên cứu của tôi trùng lặp với bất kỳ cơng trình nghiên
cứu nào đã cơng bố, tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm và tuân thủ kết luận
đánh giá luận văn của hội đồng khoa học.

Hà nội, ngày….. tháng….. Năm 2020
Người cam đoan
( Tác giả ký và ghi rõ họ tên)

Đỗ Quỳnh Liên


ii
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, Viện Công nghệ
sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm Nghiệp đã trang bị kiến thức cho
tơi trong suốt q trình học tập.
Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Văn
Việt và TS. Bùi Thị Mai Hương đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tơi trong
suốt q trình làm luận văn Thạc sĩ này.
Tôi xin cảm ơn các cán bộ Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp Trường Đại học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp
đã ln sát cánh hỗ trợ và động viên tôi về cả vật chất và tinh thần trong quá
trình học tập và nghiên cứu.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2020
Học viên

Đỗ Quỳnh Liên

iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii
MỤC LỤC ....................................................................................................... iii
BẢNH DANH MỤC VIẾT TẮT ................................................................... vi
DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................... viii
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................... x
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
Chương 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ................................... 3
1.1. Giới thiệu chung về cây Phi điệp tím Hịa Bình .................................. 3
1.1.1. Nguồn gốc, phân loại .................................................................... 3
1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây Phi điệp tím Hịa Bình ................ 4
1.1.3. Một số điều kiện sinh thái ............................................................. 5
1.1.4. Giá trị sử dụng ............................................................................. 6
1.2. Tổng quan về ADN mã vạch ............................................................... 7
1.2.1. Giới thiệu về ADN mã vạch (DNA barcode) ................................ 7
1.2.2. Một số locus được sử dụng làm chỉ thị mã vạch ADN ở thực vật ... 10
1.2.3.Những nghiên cứu về ứng dụng ADN mã vạch trong giám định loài .. 13
1.3. Tổng quan về nuôi cấy mô - tế bào. ................................................... 16
1.3.1. Cơ sở của khoa học của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật 16
1.3.2. Các bước tiến hành của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật.17
1.3.3. Thành tựu trong nuôi cây mô đối với chi Dendrobium ........................19
Chương 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ............................................................................................... 23
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ......................................................................... 23
2.1.1. Mục tiêu tổng quát ...................................................................... 23
2.1.2. Mục tiêu cụ thể ............................................................................ 23
2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................... 23

iv
2.2.1. Xác định một số trình tự ADN mã vạch ...................................... 23
2.2.2. Nhân giống Phi điệp tím Hịa Bình bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào . 23
2.3. Vật liệu, hóa chất, các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu.................. 23
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu ..................................................................... 23
2.3.2. Hóa chất ...................................................................................... 24
2.4. Phương pháp nghiên cứu xác đinh ADN mã vạch ........................... 26
2.4.1.Tách chiết DNA tổng số ............................................................... 26
2.4.2. Phương pháp nhân bản gen đích của kỹ thuật PCR ................... 28
2.4.3.Tinh sạch sản phẩm PCR ............................................................. 29
2.4.4. Phương pháp đọc trình tự ........................................................... 30
2.4.5. Xử lý số liệu................................................................................. 30
2.5. Phương pháp nhân giống Phi điệp tím Hịa Bình bằng kỹ thuật nuôi
cấy mô tế bào ............................................................................................ 30
2.5.1. Phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch và nuôi cấy khởi động ... 30
2.5.2. Phương pháp nhân nhanh thể chồi ............................................. 31
2.5.3. Phương pháp nhân nhanh chồi ................................................... 32
2.5.4. Phương pháp nghiên cứu ra rễ - tạo cây hoàn chỉnh ................. 34
2.5.5. Phương pháp huấn luyện và ra ngơi........................................... 35
2.5.6. Điều kiện thí nghiệm ................................................................... 36
2.5.7.Chỉ tiêu theo dõi, đánhgiá ............................................................ 36
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 37
3.1. Kết quả xác định một số đoạn ADN mã vạch.................................... 37
3.1.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số .................................................. 37
3.1.2. Kết quả nhân bản vùng gen nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR ...... 37
3.1.3. Phân tích kết quả ........................................................................ 38
3.2. Kết quả nhân giống cây Phi điệp tím Hịa Bình bằng nuôi cấy mô tế bào ...52
3.2.1. Phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch và nuôi cấy khởi động. .. 52
3.2.2. Phương pháp nhân nhanh thể chồi ............................................. 55

v
3.2.3. Phương pháp nhân nhanh chồi. .................................................. 57
3.2.4. Phương pháp nghiên cứu ra rễ - tạo cây hoàn chỉnh ................. 63
3.2.5. Phương pháp huấn luyện và ra ngôi........................................... 65
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 69


vi
BẢNH DANH MỤC VIẾT TẮT
TT

Chữ viết tắt

Giải nghĩa

1

ADN

Deoxyribonucleic Acid

2

IBA

Indol Butyric Acid

3

MS

Murashige và Skoog(1962)

4

NAA

a- Naphthalen acetic acid

5

CTTN

Cơng thức thí nghiệm

6

ĐHST

Điều hịa sinh trưởng

7

BAP

6 -benzynlaminopurin

8

Knops

9

ĐC

Đối chứng

10

TB

Trung Bình

11

TG

Thời gian

12

CTAB

13

PCR

14

EDTA

15

IAA

16

WPM

17

GA3

18

NCBI

19

bp

Cặp base

20

ITS

Vùng AND nằm giữa các gen

Knops Medium

Cetyl trimethylammonium bromide
Phản ứng chuỗi polymerase
axit ethylenediamine tetraacetic
Indol- acetic acid
Woody plant medium
Gibberellin A3
Trung tâm quốc gia về thông tin công nghệ
sinh học


vii

TT

Chữ viết tắt

Giải nghĩa

21

IAE

Tris-Acetate-EAIA

22

EBA

Đệm tách A

23

EBB

Đệm tách B

24

SOS

Sodium Đoecyl Sulphate

25

UV

Tia cực tím

26

ddNTP

Dideoxy nucleotide


viii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Vị trí phân loại của chi Dendrobium ................................................ 3
Bảng 2.1. Thành phần đệm tách A (100ml) .................................................... 24
Bảng 2.2. Thành phần đệm tách B (100ml) .................................................... 24
Bảng 2.3. Thành phần đệm TE (100ml).......................................................... 25
Bảng 2.4. Trình tự và thơng tin của các cặp mồi được sử dụng ..................... 28
Bảng 2.5. Thành phần của một phản ứng PCR ............................................... 28
Bảng 2.6. Ảnh hưởng của hóa chất và thời gian khử trùng đến tạo mẫu sạch
và khả năng nảy mầm ...................................................................................... 31
Bảng 2.7. Ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh
thể chồi ............................................................................................................ 32
Bảng 2.8. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến nhân nhanh chồi....... 32
Bảng 2.9. Ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA đến nhân nhanh chồi ........ 33
Bảng 2.10. Ảnh hưởng của nồng độ BAP, Kinetin và NAA đến nhân nhanh
chồi .................................................................................................................. 34
Bảng 2.11. Ảnh hưởng của nồng độ IBA và NAA tới khả năng ra rễ ............ 35
Bảng 2.12. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chất lượng
cây khi ra ngôi ................................................................................................. 36
Bảng 3.1. Bảng so sánh khoảng cách di truyền của cây Phi điệp tím Hịa Bình
với các lồi Lan khác trên ngân hàng gen quốc tế NCBI của đoạn trình tự
trnH-psbA ........................................................................................................ 40
Bảng 3.2. Bảng so sánh khoảng cách di truyền của cây Phi điệp tím Hịa Bình
với các lồi Lan khác của đoạn trình tự rbcL.................................................. 45
Bảng 3.3. Bảng so sánh khoảng cách di truyền của cây Phi điệp tím Hịa Bình
với các lồi Lan khác của đoạn trình tự ycf .................................................... 49
Bảng 3.4. Bảng so sánh khả năng phân biệt của Các đoạn trình tự ycf, trnHpsbA và rbcL ................................................................................................... 52
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hóa chất và thời gian khử trùng đến tạo mẫu sạch


ix

và nảy mầm ..................................................................................................... 53
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh
thể chồi (sau 6 tuần nuôi cấy) ......................................................................... 55
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng nhân nhanh
chồi (sau 6 tuần nuôi cấy) ............................................................................... 57
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh
chồi (sau 6 tuần nuôi cấy) ............................................................................... 59
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ BAP, Kinetin và NAA đến nhân nhanh
chồi (sau 6 tuần nuôi cấy................................................................................. 61
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ IBA và NAA tới khả năng ra rễ (sau 5
tuần nuôi cấy) .................................................................................................. 63
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chất lượng
cây khi ra ngôi (sau 6 tuần ra ngôi) ................................................................. 65


x
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Ảnh lan Phi điệp tím Hịa Bình ......................................................... 4
Hình 3.1. Ảnh điện di ADN tổng số của 3 mẫu Phi điệp tím ......................... 37
Hình 3.2. Kết quả PCR các đoạn gen rbcL, ITS2, trnH-psbA, ycf của 3 mẫu
Phi điệp tím Hịa Bình ..................................................................................... 38
Hình 3.3. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn trnH-psbA ..................... 40
Hình 3.4.Sự sai khác nucleotide của trình tự đoạn gen trnH-psbA giữa lồi Phi
điệp tím Hịa Bình với lồi Dendrobium tosaense (các vị trí sai khác được bơi
đỏ) ............................................................................................................................ 43
Hình 3.5. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn rbcL tạo bởi phần mềm
mega 10 của cây Phi điệp tím Hịa Bình. ........................................................ 44
Hình 3.6. Sự sai khác trình tự đoạn gen rbcL của lồi Phi điệp tím Hịa Bình
với trình tự của lồi Dendrobium tosaense (các vị trí sai khác được bơi đỏ) . 47

Hình 3.7. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn ycf tạo bởi phần mềm
mega 10 của cây Phi điệp tím Hịa Bình. ........................................................ 49
Hình 3.8. Sự sai khác trình tự đoạn gen ycf của lồi Phi điệp tím Hịa Bình
với trình tự của lồi Dendrobium tosaense (các vị trí sai khác được bơi đỏ) . 51
Hình 3.9. Ảnh hưởng của hóa chất và thời gian khử trùng đến tạo mẫu sạch và
nảy mầm .......................................................................................................... 53
Hình 3.10. Hình ảnh Lan Phi điệp tím Hịa Bình ở giai đoạn tạo mẫu sạch và
tái sinh thể chồi ............................................................................................... 54
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHST đến khả năng nhân
nhanh chồi ................................................................................................ 56
Hình 3.12. Hình ảnh Lan Phi điệp tím Hịa Bình ở giai đoạn nhân nhanh thể chồi.57
Hình 3.13. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng nhân
nhanh chồi ................................................................................................ 58
Hình 3.14. Ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA đến khả năng nhân
nhanh chồi ....................................................................................................... 60


xi
Hình 3.15. Ảnh hưởng của nồng độ BAP, Kinetin và NAA đến nhân nhanh
chồi……………………………………………………………………..……66
Hình 3.16. Hình ảnh cây lan Phi điệp tím Hịa Bình qua các giai đoạn ni cấy ....62
Hình 3.17. Ảnh hưởng của nồng độ IBA và NAA tới khả năng ra rễ ............ 64
Hình 3.18. Hình ảnh cây lan Phi điệp tím Hịa Bình qua các giai đoạn ni
cấy ................................................................................................................... 65
Hình 3.19. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chất lượng
cây khi ra ngơi ................................................................................................. 66
Hình 3.20. Hình ảnh cây lan Phi điệp tím Hịa Bình ở giai đoạn cây lan đã
huấn luyện ....................................................................................................... 66

1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, hoa cây cảnh khơng những đóng vai trò quan trọng trong đời
sống tinh thần mà còn ảnh hưởng đến tâm hồn con người và làm đẹp cho cảnh
quan mơi trường. Do đó, quan tâm và phát triển hoa cây cảnh là vấn đề cần
thiết. Hoa lan là một trong những loại hoa được ưa chuộng nhất vì hình dáng,
màu sắc, kích thước phong phú, đa dạng, được coi là nữ hồng của các lồi
hoa.Trong đó Phi điệp tím Hịa Bình có tên gọi khác là Giã Hạc hay Giả Hạc
có tên khoa học là Dendrobium annosmun Lindley, là giống lan quý của rừng
nhiệt đới được nhiều người chơi Lan ưa chuộng không chỉ bởi khuôn bông
đẹp, cây sai hoa mà còn đẹp cả về màu sắc lẫn hình dáng. Cánh hoa tao nhã,
trên cánh có phủ lơng mịn và có ánh kim, trên lưỡi thường có hai mắt tím
đậm, nhất là bộ phận mơi hoa có cấu trúc phức tạp và độc đáo. Phi điệp tím
Hịa Bình có hương thơm đặc biệt, dễ chịu, thoang thoảng mà hầu như khơng
có loại hương liệu nhân tạo nào sánh được. Phi điệp tím Hịa Bình đặc trưng
riêng so với các loại phi điệp có nơi phân bố khác về hình dạng màu sắc hoa.
Hoa Phi điệp tím Hịa Bình sẽ có cánh to hơn, có màu đậm hơn và có hương
thơm đặc biệt hơn hoa Phi điệp ở khu vực phân bố khác. Ngoài giá trị làm
cảnh phi điệp có thể làm thuốc để điều trị nhiều bệnh về da, suy nhược thần
kinh và tăng cường sức đề kháng cho cơ thể. Vì vậy, Phi điệp tím Hịa Bình
mang lại hiệu quả kinh tế cao [7],[11].
Hiện nay người ta tiến hành nhân giống cây Phi điệp tím Hịa Bình
thơng qua hình thức ươm cây con bằng cành phát hoa và gieo hạt, tuy nhiên
các phương pháp nhân giống trên cho hiệu quả không cao.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một phương pháp nhân giống cây trồng
cho hiệu quả cao. Nhiều loại cây đã được nhân giống thành công thông qua
phương pháp nuôi cấy mô tế bào
Trước đây, việc phân loại hay giám định sinh vật chủ yếu dựa trên chỉ
thị về hình thái hoặc các đặc tính sinh lý sinh hóa bên trong nhờ vào bảng

2
hướng dẫn định danh có sẵn. Phương pháp phân loại truyền thống này trong
nhiều trường hợp cịn gặp nhiều khó khăn và hạn chế, như: nhiều sinh vật có
hình thái rất giống nhau nhưng thực tế lại rất khác nhau trong hệ thống phân
loại (hệ gen rất khác nhau), ngược lại nhiều sinh vật có hình thái rất khác
nhau nhưng lại rất gần nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất giống nhau).
Mặt khác, phương pháp phân loại này dựa trên các đặc điểm hình thái rất khó
phân biệt được sự khác biệt giữa các biến dị dưới loài. Đặc biệt, đối với
những mẫu vật có nguồn gốc sinh vật đã bị biến đổi về hình thái, như: những
mẫu sinh vật đã chết, bị chôn vùi dưới đất, ở các cơng trình xây dựng, đã qua
chế biến thì khơng thể xác định được bằng chỉ thị hình thái. Do đó, địi hỏi
cần có phương pháp định danh và phân loại hiện đại hơn khắc phục được
những hạn chế này.Việc ứng dụng các gen mã vạch, xác định các đoạn ADN
mã vạch là một phương pháp định danh, sử dụng một đoạn ADN chuẩn ngắn
nằm trong bộ genome của sinh vật đang nghiên cứu để phục vụ giám định
loài, mang lại hiệu quả cao trong thời gian ngắn, góp phần khơng nhỏ vào sự
định danh và bảo tồn các lồi thực vật trên thế giới. Phương pháp xác định các
đoạn ADN mã vạch cũng được áp dụng phổ biến cho các lồi thực vật có giá
trị kinh tế cao. Do đó, việc xác định lồi bằng ADN mã vạch có độ chính xác
rất cao. Phương pháp này trở thành cơng cụ hữu hiệu cho các nhà khoa học
trong việc phân loại, đánh giá đa dạng di truyền và quan hệ di truyền các
lồi,…
Từ những lý do trên, tơi thực hiện đề tài “Nghiên cứu xác định một số
đoạn ADN mã vạch và nhân giống lan Phi điệp tím Hịa Bình
(Dendrobium anosmun Lindley) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào” sẽ là
căn cứ để phân loại, lựa chọn, nuôi cấy và xây dựng dữ liệu gen quý góp phần
quản lý tài nguyên thiên nhiên, bảo tồn nguồn gen quý của quốc gia.

3
Chương 1
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Giới thiệu chung về cây Phi điệp tím Hịa Bình

1.1.1. Nguồn gốc, phân loại
Cây Phi điệp tím Hịa Bình hay cịn gọi là Giã Hạc hay Giả Hạc, với
danh pháp khoa học là Dendrobium anosmun Lindley, Phi điệp tím Hịa Bình
là một lồi Phong lan thuộc dịng Lan, Phi điệp tím Hịa Bình có đầy đủ các
đặc tính của một phong Lan hồng thảo như thân gồm nhiều giả hành mọc
thành bụi, các giả hành phân thành các đốt như đốt tre nứa. Giá thể bám cho
dòng lan này đều là các thân cây, xơ dừa hay rêu nếu như trong chậu. Lan Giả
Hạc ưu thích khí hậu nhiệt đới vì vậy dịng Lan này được phân bố chủ yếu ở
các nước Đông Nam Á như: Thái Lan, Lào, Việt Nam, Campuchia… Tại Việt
Nam có ở các tỉnh như Cao Bằng, Hịa Bình, Phú Thọ, Thanh Hóa, Tây
Ninh… Tuy nhiên, tùy vào xuất xứ mà Phi điệp tím mang đặc trưng riêng.
Đặc biệt, Phi điệp tím Hịa Bình có hình dạng, màu sắc, hương thơm và vẻ
đẹp độc đáo riêng biệt so với Phi điệp tím khác bởi cánh hoa to hơn, màu sắc
và hương thơm đặc biệt [7].
Hệ thống phân loại:
Bảng 1.1. Vị trí phân loại của chi Dendrobium
Giới

Plantae

Ngành

Magnoliophyta

Lớp

Moncotyledoneae

Phân Lớp

Liliidae

Bộ

Orchidales

Họ

Orchidaceae

Chi

Dendrobium

Lồi

Dendrobium annosmun Lindley


4

Hình 1.1. Ảnh lan Phi điệp tím Hịa Bình
Nguồn: hoalanhuyanh.com

1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây Phi điệp tím Hịa Bình

- Thân: Phi điệp tím Hịa Bình thuộc dạng thân thong, thân có thể dài
tới 2m bng rũ xuống. Phi điệp tím Hịa Bình mọc thành từng cụm, thuộc
nhóm đa thân và thân có giả hành. Gỉa hành chứa diệp lục, dự trữ nước và
chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của giả hành mới và duy trì sự
sống. Thân chia thành nhiều đốt, mỗi đốt chứa một mắt ngủ. Độ dài đốt phụ
thuộc vào độ tuổi của cây, mơi trường… Màu sắc thân Phi điệp tím Hịa Bình
rất đa dạng từ màu xanh, chấm tím và tím tùy từng giai đoạn, đường kính thân
có thể tới 1,5cm khi vào mùa nghỉ. Thân già các đời trước thì thường khơ teo,
màu nâu tím hoặc vàng như rơm [7],[11].
- Lá: Lá đơn mọc cách, xếp so le, mọng nước, dài 10-15cm, rộng từ 3-4
cm. Mép lá nguyên, hệ gân song song, đầu lá nhọn [11].
- Rễ: Phi điệp tím Hịa Bình thuộc loại rễ bì sinh, đường kính nhỏ
khoảng 1,5-2mm, có hình trụ. Rễ rất dài, chóp rễ có màu xanh [11].
- Hoa: Phi điệp tím khơng những mọc trên những giả hành mới mà còn
mọc trên các giả hành cũ. Hoa Phi điệp tím Hịa Bình nở vào cuối xuân - đầu
hè (tháng 4 - 6 dương lịch), hoa to tới 10cm, mọc từ 1-3 chiếc ở các đốt đã


5
rụng lá. Trên cánh có phủ lơng mịn và có ánh kim, trên lưỡi thường có hai
mắt tím đậm. Hoa có hương thơm ngào ngạt và lâu tàn (2-3 tuần lễ). Nhiều
hoa trên phát hoa, một cây nếu mạnh khỏe có thể ra tới 50-70 hoa [29],[32].
- Quả: Quả của Phi điệp tím Hịa Bình thuộc loại quả nang, nở ra theo
3-6 đường nứt dọc. Khi chín quả nở ra, các mảnh vỏ cịn dính lại với nhau ở
phía đỉnh và phía gốc. Bên trong chứa rất nhiều hạt, khi chín hạt có màu vàng.
Hạt cấu tạo bởi một phơi chưa phân hóa, chứa đầy khơng khí. Hạt rất nhiều và
nhỏ, toàn bộ hạt trong một quả nặng chỉ bằng một phần mười mg, rất nhẹ nên
dễ phát tán nhờ gió [11].

1.1.3. Một số điều kiện sinh thái

1.1.3.1. Ánh sáng
Phi điệp là cây ưa sáng nên có thể trồng nơi có nhiều ánh sáng nhưng
khơng nên phơi dưới thời tiết nắng nóng cả ngày, rễ có thể bị cháy lá non.
Tốt nhất nên có một lớp lưới che bảo vệ cây, giúp cây hấp thụ đủ lượng
ánh sáng cần thiết mỗi ngày. Cây trồng không nên ở chỗ râm quá, cây sẽ
quặt quẹo, lá xanh sẫm, thân lá còi cọc nhất là vào mùa đơng, nếu thiếu
nắng cây sẽ khó ra hoa.
1.1.3.2. Nhiệt độ
Lan Phi điệp tím chịu nóng và chịu lạnh rất tốt. vào mùa nóng cây có
thể chịu được nhiệt độ lên đến 38 độ C, còn vào mùa lạnh cây có thể chịu
được nhiệt độ xuống thấp tới mứa 3,3,độ C. Tuy nhiên, vào mùa đông nếu
nhiệt độ không lạnh dưới 15-16 độ C kéo dài trong khoảng 4 đến 6 tuần lễ thì
giả hạc khó ra nụ
1.1.3.3. Độ ẩm và độ thơng thống
Phi điệp tím cũng cần nhiều độ ẩm vào thời điểm các thân non phát
triển. Độ ẩm thơng thường khoảng 60 - 70%. Lồi này cũng thích sống trong
điều kiện thống gió.


6
1.1.3.4. Lượng nước
Nước là điều kiện cần thiết cho sự phát triển của lan, việc tưới nước
đúng cách sẽ giúp cây sinh trưởng ổn định và ra hoa đều. Vào mùa hè khi
lan ra mầm non và mọc mạnh cần tưới 2 đến 3 lần một tuần. Vào mùa thu,
khi cây đã ngừng tăng trưởng, nên tưới nước thưa đi, mỗi tuần chỉ cần tưới
một lần cho thân cây khỏi bị teo lại. Vào mùa đông, đây là thời gian lan
chuẩn bị để ra hoa, ngừng hẳn việc tưới nước. Nếu độ ẩm quá thấp nên phun
sương mỗi tháng 1-2 lần.
1.1.3.5. Dinh dưỡng
Phi điệp tím cũng yêu cầu một lượng dinh dưỡng nhất định để sinh

trưởng và phát triển. Các thành phần dinh dưỡng như: N - P - K và các
nguyên tố trung và vi lượng. Sử dụng phân NPK tỷ lệ: 10 - 20 - 30 nồng độ
3g/L định kỳ 1 tuần 1 lần. Khoảng 2 tháng trước khi Phi điệp tím ra hoa,
phun NPK 15 - 20 - 25 nồng độ 2 g/L một tuần một lần, đến khi hoa tàn thì
dừng bón phân.

1.1.4. Giá trị sử dụng
1.1.4.1. Giá trị thẩm mỹ
Lan Phi điệp tím Hịa Bình được mệnh danh là món trang sức đẹp nhất
mà thiên nhiên ưu đãi ban tặng cho loài người. Màu sắc hoa quyến rũ, trên
cánh có phủ lơng mịn và ánh kim, trên lưỡi thường có 2 mặt tím đậm với
hương thơm ngào ngạt và lâu tàn. Thân cao khỏe và rất siêng hoa , một giả
hành một lúc có thể cho rất nhiều hoa. Chính vì lẽ đó, Phi điệp tím Hịa Bình
được con người dùng để thưởng lãm vẻ đẹp hay làm cảnh, trang trí, làm đẹp
khơng gian sống [7], [11].
1.1.4.2. Giá trị kinh tế
Khác với các dòng lan Phi điệp khác, Phi điệp tím Hịa Bình mang lại
giá trị kinh tế cao bởi sự đẹp lạ và độc đáo của nó. Phi điệp tím Hịa Bình đã
chiếm một vị trí quan trọng điểm tơ trong các hội nghị, đám cưới, bàn tiệc
hay trang trí cơ dâu.


7
Phi điệp tím Hịa Bình được khai thác và bán với giá rất cao. Năm 2019
giá lan Phi điệp tím tính theo kg vào khoảng 6 - 7 triệu/kg.
Ngồi ra Phi điệp tím Hịa Bình được dùng để chiết xuất tinh dầu thơm
trong công nghệ mỹ phẩm mang lại giá trị cho con người.
1.1.4.3. Giá trị y học
Ngoài giá trị làm cảnh, Lan Phi điệp tím Hịa Bình cịn có giá trị làm
thuốc mà ít ai biết được trong nhiều bệnh về da, suy nhược cơ thể, suy nhược

thần kinh, đau họng, tăng cường sức đề kháng cho cơ thể…
1.2. Tổng quan về ADN mã vạch

1.2.1. Giới thiệu về ADN mã vạch (DNA barcode)
Phương pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời và đã xây
dựng được một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói riêng
tương đối đầy đủ và tồn diện. Phương pháp phân loại này chủ yếu dựa vào
sự khác biệt hình thái của các cơ quan trong cơ thể thực vật, đặc biệt là cơ
quan sinh sản (hoa). Tuy nhiên, phương pháp này cũng gặp rất nhiều khó
khăn khi cần xác định những mẫu vật đang trong giai đoạn phát triển (chưa ra
hoa), những mẫu có đặc điểm giống nhau do cùng thích nghi với điều kiện
mơi trường hoặc khó nhận biết do có nhiều điểm tương đồng ở bậc phân loại
thấp như loài và dưới loài. Ngoài ra, phương pháp phân loại hình thái thường
chỉ được thực hiện bởi các chuyên gia hình thái học, việc phân loại đôi khi tốn
nhiều thời gian và công sức.
Từ giữa những năm 1990, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân
tử, một phương pháp nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân loại học đã hình
thành và được gọi là phương pháp phân loại học phân tử. Phương pháp này dựa
trên các dữ liệu thông tin về hệ gen (ADN) trong và ngoài nhân hoặc các sản
phẩm của chúng (protein). Tùy mục đích hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta
có thể lựa chọn các gen (đoạn ADN) khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau
của hệ gen. Trong phương pháp phân loại phân tử, các kỹ thuật thường được


8
ứng dụng để nghiên cứu tính đa dạng sinh học, mối quan hệ tiến hóa giữa các
lồi, xây dựng cây phát sinh chủng loại cũng như giúp nhận dạng đến cấp phân
loại loài hoặc chi.
Ở thực vật, một số phương pháp chỉ thị phân tử được sử dụng để
nhận dạng loài cũng như sử dụng enzyme giới hạn kết hợp với lai ADN

(RFLP), dấu vân tay ADN (DNA fingerprinting), phản ứng chuỗi trùng
hợp PCR và đặc biệt việc sử dụng các kỹ thuật mã vạch ADN (DNA
barcode) ngày càng trở nên phổ biến. Các phương pháp này đều dựa trên
thực tế rằng cấu trúc hóa học của ADN từ mọi loài là giống nhau và sự
khác biệt duy nhất giữa chúng là trình tự các cặp base.
Năm 2003, nhà nghiên cứu tại đại học Guelph, Canada - Paul Hebert đã đề xuất một phương pháp xác định loài dựa trên ADN mã vạch (DNA
barcode). Mã vạch ADN là trình tự nucleotide của một chuỗi ADN ngắn, có
cùng nguồn gốc tổ tiên, trong đó có vùng ít bị thay đổi (vùng bảo thủ) và
vùng thay đổi theo q trình tiến hóa [36]. Ngồi ra việc lựa chọn một vùng
trình tự làm ADN mã vạch còn cần phải mang những đặc điểm sau: Có độ dài
thích hợp (khơng q ngắn để có độ đa hình về trình tự giữa các taxon, khơng
q dài để có thể giải trình tự theo cách thơng thường, thậm chí cả khi trong
điều kiện chưa được tối ưu); khơng phải vùng dị hợp để có thể nhân bản trực
tiếp trình tự mà khơng cần tách dịng; thuận lợi trong việc so sánh trình tự dựa
trên vị trí khác biệt các base và khơng có đoạn trình tự chưa chắc chắn như
một vài đoạn lặp microsatellite làm giảm chất lượng trình tự [25].
Dựa vào mức độ thay đổi trong trình tự ADN này để đánh giá sự sai
khác di truyền giữa các sinh vật. Hai mẫu vật của hai lồi có thể có hình thái
bên ngồi rất giống nhau, song chúng có thể được phân biệt bằng cách sử
dụng ADN mã vạch. Với ưu thế đó, ADN mã vạch có thể được sử dụng cho
hai mục đích chính: nhận dạng về mặt phân tử cho các loài đã được mơ tả và
tìm ra các lồi mới chưa được mô tả [24].


9
ADN mã vạch là một công cụ mới, rất hiệu quả cho các nghiên cứu về
phân loại, giám định sinh vật, gồm cả động vật, thực vật, nấm, vi sinh vật và
virus [33], [37]. Việc xác định loài bằng mã vạch ADN có hiệu quả cao trong
việc phân biệt các lồi sinh vật khi những quan sát hình thái, sinh trưởng và
phát triển chưa đủ cơ sở để định danh hoặc phân biệt loài [17].

Việc sử dụng ADN mã vạch để nhận dạng các lồi trên quy mơ tồn
cầu có ý nghĩa ngày càng lớn. Cho đến nay, sau hơn 10 năm nghiên cứu đã
có trên 6000 cơng trình khoa học được cơng bố với khoảng 5 triệu trình tự
AND mã vạch ở các loài sinh vật theo số liệu của BOLD. Để chuẩn hóa ở
mức độ quốc tế về việc sử dụng ADN mã vạch, cộng đồng khoa học đã nỗ
lực trong việc tìm kiếm các vùng trình tự ADN làm mã vạch có thể phân
biệt đồng thời nhiều lồi [26, 28, 34].
Một ADN mã vạch điển hình phải đáp ứng được các u cầu sau:
- Có tính phổ biến cao (dễ dàng nhân bản và giải trình tự).
- Trình tự có tính đặc hiệu cao.
- Có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài [26]
Mỗi đoạn mã vạch có những đặc trưng riêng và có khả năng phân biệt
sinh vật ở các mức độ khác nhau: chi, họ, lồi hay dưới lồi. Các đoạn ADN
mã vạch có thể là những đoạn nằm trong hệ gen nhân (18S, 5.8S, 26S,
ITS…)[16, 19, 20, 31], hệ gen ty thể (Cytb, CO1…)[20, 32], hệ gen lục lạp
(matK, rbcL, trnH – psbA...) [25,27].Tuy nhiên, chưa có đoạn ADN nào được
sử dụng làm mã vạch chung cho tất cả các loài sinh vật, thay vào đó cần lựa
chọn những đoạn ADN đặc trưng và việc phối hợp các đoạn ADN mã vạch sẽ
đem lại hiệu quả cao hơn [29,31]. Tùy vào đối tượng giám định mà các đoạn
ADN mã vạch sẽ được sử dụng một cách hợp lý [18, 26].


10

1.2.2. Một số locus được sử dụng làm chỉ thị mã vạch ADN ở thực vật
1.2.2.1. Trình tự gen nhân
Các trình tự mã vạch được nhân bản từ ADN hệ gen của bố mẹ dự kiến
sẽ cung cấp nhiều hơn thơng tin về các lồi cần xác định. Tuy nhiên, khó khăn
trong việc khuếch đại PCR từ gen nhân vì gen nhân chủ yếu là đơn gen hoặc
có số lượng bản sao gen thấp, đặc biệt từ sự suy thoái và chất lượng ADN hệ

gen khi được tách chiết và khả năng phân biệt dưới loài do bảo toàn gen chức
năng có thể chính là lý do tại sao hạn chế số lượng các gen nhân được thử
nghiệm trong xác định loài bằng chỉ thị ADN mã vạch [38,42].
1.2.2.2. Vùng gen mã hóa ribosome
Gen rDNA là hệ thống đa gen mã hóa phần ARN của ribosome. Các gen
DNA ribosome (rDNA) mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa dạng
thích hợp để phân biệt các lồi gần gũi. Trong tế bào, rDNA được sắp xếp
như các đơn vị được lặp lại ngẫu nhiên bao gồm DNA mã hóa ribosome 18S,
5,8S, 28S và xen giữa các trình tự khơng mã hóa ITS1, ITS2 (internal
transcribed spacers) nằm ở hai bên sườn của vùng 5,8S. Vùng mã hóa của ba
gen rDNA được bảo tồn cao hơn hai vùng ITS. Nhìn chung các đơn vị rDNA
được lặp lại hàng nghìn lần và được sắp xếp tập trung tại vùng lớn trên nhiễm
sắc thể. Một trong những tính năng đáng chú ý nhất của rDNA là từng đơn vị
trong hệ thống đa gen khơng tiến hố độc lập, thay vào đó tất cả các đơn vị
tiến hoá một cách phối hợp nhờ vậy mà rDNA đạt mức ổn định cao hơn trong
loài nhưng khác biệt giữa các loài khác nhau.
Hiện tại, nrITS vùng ITS của gen nhân được xem là một trong những
cơng cụ hữu ích nhất để đánh giá phát sinh lồi ở cả thực vật và động vật vì
nó phổ biến trong tự nhiên, kế thừa từ bố mẹ và biến đổi cao do ít hạn chế
chức năng. Một số nghiên cứu gần đây ở cây sinh sản hữu tính và cây sinh sản
vơ tính cho thấy một số mức độ biến đổi số các bản sao của trình tự ITS1 và
ITS2 do nhiều nguyên nhân như lai gần, phân ly, tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến cao


11
và hình thành gen giả của các gen chức năng dẫn đến những thay đổi đó. Trên
cơ sở này nrDNA có thể được sử dụng để phân định chính xác và hiệu quả
thực vật trong cùng loài với đặc điểm lịch sử đời sống khác nhau (một năm,
lâu năm, trên cạn, dưới nước) và nguồn gốc tiến hóa khác nhau [36],[33],[30].
1.2.2.3. Trình tự gen lục lạp

Hệ gen lục lạp của thực vật gồm phân tử ADN mạch vịng có kích
thước 120 - 160 kb chia làm hai bản sao đơn là bản sao đơn lớn (large singlecopy region) và bản sao đơn nhỏ (small single-copy region). Hai bản sao được
phân cách bởi hai chuỗi lặp lại đảo nhau (IRa và IRb) có độ dài trung bình 20
- 30 kb. Hệ gen lục lạp chứa tất cả các gen rRNA (4 gen ở thực vật bậc cao),
các gen tRNA (35 gen) và các gen khác mã hóa cho các protein tổng hợp
trong lục lạp (khoảng 100 gen) cần thiết cho sự tồn tại của chúng.
Việc sử dụng các kết quả phân tích hệ gen lục lạp vào nghiên cứu phát
sinh lồi và phân loại thực vật được các nhà khoa học rất quan tâm vì hệ gen
lục lạp có tính bảo thủ cao và mang tính đặc thù của từng lồi do. Dựa trên
các nghiên cứu về phát sinh loài gần đây, một số locus là đoạn gen hay các
gen được chọn để nghiên cứu làm chỉ thị barcode tiềm năng cho các lồi thực
vật trên thế giới. Có khoảng 20 gen lục lạp có độ dài phù hợp (khoảng 1 kb)
được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài. Các gen này chứa đựng nhiều
mức độ tiến hố và vì vậy phù hợp cho nhiều mức độ phân loại [37],[38],[41].
2.2.2.4. Trình tự gen matK
Gen matK có kích thước khoảng 1.550 bp và mã hóa cho enzyme
maturase liên quan đến quá trình loại bỏ các intron loại 2 trong quá trình
phiên mã RNA và là 1 trong những gen tiến hóa nhanh nhất trong số các
gen trong hệ gen lục lạp. Do có mặt ở phần lớn thực vật nên matK đã được
sử dụng như một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát
sinh loài ở thực vật. CBOL đã thử nghiệm matK trên gần 550 loài thực vật
và thấy rằng 90% mẫu thực vật hạt kín dễ dàng khuếch đại trình tự bằng


12
cách sử dụng một cặp mồi đơn và đề nghị sử dụng matK là một trong
những locus barcode chuẩn cho thực vật [38],[30].
1.2.2.5. Trình tự gen rpoB và rpoC1
Gen rpoB, rpoC1, rpoC2 mã hóa ba trong 4 tiểu đơn vị của RNA
polymerase lục lạp. Khi nghiên cứu họ Dipterocarpaceae và Tsumura (1996)

đã nhận thấy gen rpoB là thích hợp để nghiên cứu phát sinh loài. Hiện nay
rpoB là gen được sử dụng nhiều trong nghiên cứu phát sinh loài và xác định
các loài vi khuẩn, đặc biệt là khi nghiên cứu các chủng có quan hệ gần gũi.
Cùng với gen 16S rRNA, rpoB được sử dụng trong nhiều nghiên cứu để xác
định loài vi khuẩn mới, do vậy các gen này được đề xuất là chỉ thị barcode
độc lập hoặc kết hợp với một số gen khác. Trong các nghiên cứu gần đây,
CBOL đã thử nghiệm 7 locus và thấy rằng khả năng phân biệt loài của đoạn
gen rpoC1 là thấp nhất (43%). Do vậy cần có các nghiên cứu tiếp theo để
chứng minh sự phù hợp khi sử dụng rpoB và rpoC1 làm chỉ thị barcode trong
các nghiên cứu giám định lồi [38],[41].
1.2.2.6. Trình tự gen ycf5
ycf5 mã hóa cho một protein có chứa 330 amino acids. Gen này được
bảo tồn trên tất cả các vùng thực vật và đã được kiểm nghiệm cho phù hợp
với DNA barcode của một vài nhóm. Tuy nhiên, gen này chưa được cơng
nhận và sử dụng nhiều trong vai trò của một DNA barcode [37],[38].
1.2.2.7. Trình tự hai gen trnH-psbA
Gen trnH-psbA có kích thước trung bình khoảng 450 bp, nhưng thay đổi
từ 296 đến 1120 bp. Nó được chứng minh là có khả năng xác định loài cao.
Locus trnH-psbA đã được khuếch đại thành cơng ở nhiều thực vật hạt kín và
hạt trần. Trong nhiều nghiên cứu gần đây đã đề xuất việc sử dụng trnH-psbA
như chỉ thị mã vạch độc lập cho thực vật hay kết hợp với matK. CBOL thấy
rằng khả năng phân biệt loài của trnH-psbA là cao nhất (69%) trong số 7


13
locus được thử nghiệm và do đó đề nghị nó như là chỉ thị mã vạch bổ sung
[36],[38].
1.2.2.8. Trình tự hai gen trnL(UAA)-trnF(GAA)
Locus trnL (UAA) - trnF (FAA) chứa gen trnL (UAA), vùng intron và
vùng nằm giữa hai gen trnL (UAA) và trnF (GAA). Vùng khơng mã hố

trnL(UAA) và trnF (GAA) khơng phải là vùng có sự biến đổi lớn nhất của
DNA lục lạp nhưng có ưu thế như cấu trúc bậc 2 với vùng biến đổi và vùng
bảo thủ xen kẽ nhau. Điều này tạo thuận lợi cho các nghiên cứu tìm kiếm
trình tự nucleotide ở các vùng bảo thủ để thiết kế mồi và sử dụng kỹ thuật
PCR để khuếch đại các đoạn gen ở vùng biến đổi. Trong nghiên cứu để xác
định trnL (UAA) intron có nên được sử dụng làm vùng DNA barcode,
Taberlet (2007) đã sử dụng 100 loài thực vật và kết luận rằng trnL intron có
thể sử dụng như là một barcode của thực vật [38],[42].

1.2.3.Những nghiên cứu về ứng dụng ADN mã vạch trong giám định loài
1.2.3.1. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam, đến nay đã có một số cơng trình nghiên cứu về mã vạch
ADN được triển khai ở một số cơ sở nghiên cứu. Tuy nhiên, các nghiên cứu
này vẫn còn rất nhỏ lẻ, trên một vài đối tượng sinh vật, chưa có tính hệ thống,
đồng bộ nên chưa thể xây dựng được cơ sở dữ liệu về mã vạch ADN, một số
đề tài đã và đang được triển khai tại các viện nghiên cứu và trường đại học
trong cả nước, như:
Năm 2018, Nguyễn Tiến Dũng và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu đề
tài: “Đặc điểm hình thái và mã vạch ADN của loài cây bày lá một hoa Pari
vietnamensis (Takht.) H.Li”. Phân tích trình tự gen vùng ITS và psbA - trnH
riêng lẻ và kết hợp của 3 mẫu bảy lá một hoa Việt Nam cho thấy vùng gen
ITS có thể sử dụng để phân biệt bảy lá một hoa Việt Nam với các loại còn lại
trong chi Paris với độ tin cậy cao. Ngoài ra, việc sử dụng kết hợp hai vùng
gen ITS + psbA-trnH củng cố kết quả định loại phân tử của vùng gen ITS và