Nghiên cứu xác định một số trình tự ADN mã vạch và nhân giống cây kim tiền thảo (desmodium styracifolium (osb ) merr ) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

NGUYỄN THỊ HIÊN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TRÌNH TỰ ADN
MÃ VẠCH VÀ NHÂN GIỐNG CÂY KIM TIỀN THẢO
(Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.)BẰNG KỸ THUẬT
NUÔI CẤY IN VITRO

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ NGÀNH:8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. HÀ BÍCH HỒNG

Hà Nội, 2020


i
LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi, dưới sự hướng
dẫn khoa học của TS. Hà Bích Hồng. Các kết quả trình bày trong luận văn là
trung thực, một phần đã được công bố trên Tạp chí khoa học - cơng nghệ,
phần cịn lại chưa được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Luận văn cũng sử dụng thông tin, số liệu từ các bài báo và nguồn tài

liệu của các tác giả khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc đầy đủ.
Nếu có bất kỳ sự gian lận nào tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm về nội
dung luận văn.
Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2020
Ngƣời cam đoan

Nguyễn Thị Hiên


ii
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, Viện Công nghệ
sinh học Lâm nghiệp,Trường Đại học Lâm Nghiệp đã trang bị kiến thức cho
tôi trong suốt q trình học tập.
Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS. Hà Bích Hồng và
PGS. TS Nguyễn Văn Việt đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tơi trong suốt
q trình nghiên cứu đề tài và hoàn chỉnh bản Luận văn Thạc sĩ này.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Viện Công nghệ Sinh học Lâm
nghiệp – Trường Đại học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện cho tơi hồn thành
luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp
đã ln sát cánh hỗ trợ và động viên tôi về cả vật chất và tinh thần trong suốt
quá trình học tập và nghiên cứu.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2020
Học viên

Nguyễn Thị Hiên

iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................... ii
MỤC LỤC ................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................ v
DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................... vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................... 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 3
1.1. Giới thiệu chung về cây Kim tiền thảo ................................................. 3
1.1.1. Nguồn gốc và hệ thống phân loại........................................................... 3
1.1.2. Đặc điểm thực vật của cây Kim tiền thảo............................................... 4
1.1.3. Đặc điểm sinh thái và phân bố ............................................................... 5
1.1.4. Giá trị dược liệu ..................................................................................... 5
1.1.5. Các nghi n cứu về h a sinh h c dược h c của cây Kim tiền thảo ........ 6
1.1.6. Một số bài thuốc dân gian về cây Kim tiền thảo .................................... 9
1.2. Tình hình nhân giống một số lồi thuộc chi Desmodium .................... 10
1.3. Kỹ thuật nuôi cấy in vitro thực vật ..................................................... 12
1.3.1. Cơ sở của khoa h c của phương pháp nuôi cấy mô -tế bào thực vật ... 12
1.3.2. Các giai đoạn ch nh của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật . 13
1.4. Tổng quan về ADN mã vạch .............................................................. 14
1.4.1. Giới thiệu về ADN mã vạch (DNA barcoding)..................................... 14
1.4.2. Một số locus được sử dụng làm chỉ thị mã vạch ADN ở thực vật......... 16
1.4.3.

nh h nh nghi n cứu ADN mã vạch ở thực vật ................................... 21

1.4.3. Ứng dụng của ADN mã vạch ............................................................... 27
Chƣơng 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..... 30
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................... 30

2.1.1. Mục ti u tổng quát ............................................................................... 30
2.1.2. Mục ti u cụ thể ..................................................................................... 30
2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................... 30
2.3. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................ 30


iv
2.3.1. Đối tượng nghi n cứu .......................................................................... 30
2.3.2. hiết bị dụng cụ................................................................................... 31
2.3.3. H a chất............................................................................................... 31
2.4. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 32
2.4.1. Xác định một số ADN mã vạch để xác định loài cây Kim tiền thảo ..... 32
2.4.2. Nghi n cứu nhân giống in vitro loài Kim tiền thảo .............................. 35
2.5. Phương pháp thu thập và xử lí số liệu ................................................. 39
2.5.1. Phương pháp thu thập số liệu .............................................................. 39
2.5.2. Phương pháp xử lý số liệu.................................................................... 40
2.5.3. Địa điểm và thời gian bố tr th nghiệm ............................................... 40
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................... 41
3.1. Xác định một số trình tự ADN mã vạch cho loài Kim tiền thảo .......... 41
3.1.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số ........................................................... 41
3.1.2. Kết quả nhân bản tr nh tự ADN mã vạch cho loài Kim tiền thảo......... 42
3.1.3. Kết quả giải tr nh tự và so sánh tr nh tự các đoạn ADN mã vạch ........ 45
3.1.4. o sánh hiệu quả giám định loài Kim tiền thảo của một số tr nh tự ADN
mã vạch .......................................................................................................... 54
3.2. Kết quả nhân giống in vitro loài Kim tiền thảo ................................... 55
3.2.1. Kết quả nghi n cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng
tạo mẫu sạch và tái sinh chồi in vitro............................................................. 55
3.2.2. Kết quả nghi n cứu ảnh hưởng của nồng độ chất ĐH

đến nhân

nhanh chồi Kim tiền thảo ............................................................................... 57
3.2.3. Kết quả nghi n cứu ảnh hưởng của hàm lượng chất hữu cơ đến khả
năng nhân nhanh chồi.................................................................................... 60
3.2.4. Kết quả nghi n cứuảnh hưởng của chất ĐH

đến khả năng ra rễ cây

Kim tiến thảo.................................................................................................. 62
3.2.5. Kết quả ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến khả năng sống, sinh
trưởng của cây Kim tiền thảo......................................................................... 64
KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ..................................................... 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 69
PHỤ BIỂU


v
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi sử dụng trong đề tài .................................... 31
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR........................................................... 34
Bảng 2.3: Chu trình nhiệt độ cho phản ứng PCR .......................................... 34
Bảng 2.4: Bố trí thí nghiệm khử trùng vật liệu hạt Kim tiền thảo ................. 36
Bảng 2.5: Bố trí các thí nghiệm nhân nhanh chồi Kim tiền thảo ................... 36
Bảng 2.6: Ảnh hưởng của hàm lượng chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh
chồi Kim tiền thảo ........................................................................................ 37
Bảng 2.7: Thiết kế các thí nghiệm ra rễ Kim tiền thảo .................................. 37
Bảng 2.8: Ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến khả năng sống và sinh
trưởng của cây .............................................................................................. 38
Bảng 3.1: Các trình tự đoạn gen matK tương ứng với tên lồi tương đồng với
đoạn trình tự matK của mẫu Kim tiền thảo ................................................... 48

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ sống và tái sinh chồi ...... 56
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi ..... 58
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của hàm lượng chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi 60
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nồng độ α-NAAvà than hoạt tính đến khả năng ... 62
ra rễ. ............................................................................................................. 62
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến khả năng sống, sinh trưởng
của cây Kim tiền thảo ................................................................................... 64


vi
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Cây Kim tiền thảo (Desmodium styracifolium (Osb.) Merr) ........... 3
Hình 1.2: Hình thái cây Kim tiền thảo ............................................................ 4
Hình 3.1: Kết quả tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá Kim tiền thảo ............. 41
Hình 3.2: Kết quả điện di sản ph m PCR các đoạn trình tự ADN mã vạch ... 42
Hình 3.3: Trình tự nucleotide đoạn gen MatK của các mẫu Kim tiền thảo .... 46
Hình 3.4: Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn gen matK của mẫu Kim
tiền thảo (query với lồi Desmodium styracifolium trên NCBI (sbjct) ......... 47
Hình 3.5: Cây quan hệ di truyền giữa mẫu Kim tiền thảo với các trình tự
tương đồng trên ngân hàng gen quốc tế NCBI .............................................. 49
Hình 3.6: Trình tự nucleotide đoạn gen rbcL của các mẫu Kim tiền thảo ..... 50
Hình 3.7: Cây quan hệ di truyền của mẫu Kim tiền thảo với các trình tự tương
đồng trên NCBI dựa trên trình tự đoạn gen rbcL .......................................... 51
Hình 3.8: Trình tự nucleotide đoạn gen ITS của các mẫu Kim tiền thảo ....... 52
Hình 3.9: Cây quan hệ di truyền giữa mẫu Kim tiền thảo với các trình tự
tương đồng trên ngân hàng gen đối với trình tự ITS...................................... 52
Hình 3.10: Trình tự nucleotide đoạn gen ycf1b của các mẫu Kim tiền thảo .. 53
Hình 3.11: Cây quan hệ di truyền giữa mẫu Kim tiền thảo với các trình tự
tương đồng trên ngân hàng gen dựa trên trình tự đoạn gen ycf1b .................. 54
Hình 3.12: Hạt Kim tiền thảo được khử trùng bằng công thức 2 sau 4 tuần

ni cấy ........................................................................................................ 57
Hình 3.13: Cụm chồi Kim tiền thảo trên môi trường nhân nhanh NN1 (A và
MN2 (B) ....................................................................................................... 59
Hình 3.14: Cụm chồi Kim tiền thảo trong môi trường NC1 sau 7 tuần nuôi cấy....... 61
Hình 3.15: Cây Kim tiền thảo được nuối cấy với cơng thức R5 .................... 64
Hình 3.16: Cây Kim tiền thảo được nuôi cấy ở công thức B3 ....................... 66


vii
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỉ lệ mẫu sạch và tỉ lệ
nảy mầm ở các công thức khử trùng ............................................................. 56
Biểu đồ 3.2: Hệ số nhân chồi và tỉ lệ chồi hữu hiệu ở các môi trường. ......... 59
Biểu đồ 3.3: Hệ số nhân chồi và tỉ lệ chồi hữu hiệu ở các cơng thức mơi
trường có bổ sung chất hữu cơ khác nhau ..................................................... 61
Biểu đồ 3.4: Ảnh hưởng của Chất ĐHST đến tỉ lệ chồi ra rễ (A và số rễ
trung bình, chiều dài rễ ở các cơng thức thí nghiệm (B . .............................. 63
Biểu đồ 3.5: Tỉ lệ cây sống và chiều cao TB của cây Kim tiền thảo được nuối
cấy trong các cơng thức thí nghiệm. ............................................................. 65


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay các hợp chất tự nhiên được phân lập từ cây dược liệu đã được
sử dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, chúng được
sử dụng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu
cho ngành công nghiệp thực ph m và mĩ ph m…
Trong hệ thống các loài thực vật ở Việt Nam, có nhiều lồi cây thuộc
họ Đậu (Fabaceae) có giá trị sử dụng cao, được dùng để bào chế làm thuốc
chữa bệnh, trong đó có cây Kim tiền thảo. Đối với cây Kim tiền thảo thì mọi

bộ phận của cây như: rễ, thân, lá đều có thể sử dụng được. Các nghiên cứu
dược lý hiện đại cho thấy Kim tiền thảo có tác dụng lợi tiểu, lợi mật, kháng
sinh, kháng viêm, dãn mạch, hạ huyết áp, tăng bài tiết mật, giảm đau ống mật,
tăng lưu lượng máu ở thận, tăng tuần hoàn máu não và các động mạch đùi…
Song công dụng chủ yếu là lợi mật, thông tiểu tiện, thường dùng chữa sỏi
thận, sỏi mật, sỏi bàng quang, sỏi đường tiết niệu, viêm gan vàng da, viêm
thận phù thũng, chữa bệnh trĩ, chữa viêm mật (Đỗ Tất Lợi, 1999). Tuy nhiên,
hiện nay hầu hết nguồn dược liệu đều được nhập từ nước ngồi và chưa có
nghiên cứu đầy đủ về nhân giống, gieo trồng, chế biến Kim tiền thảo nên
năng suất và chất lượng còn hạn chế.
Để có nguồn dược liệu Kim tiền thảo chất lượng tốt, bền vững đáp ứng
nhu cầu chăm sóc sức khỏe con người đồng thời đảm bảo được hàm lượng và
hoạt tính dược liệu trong sản ph m sau thu hoạch, cần phải có biện pháp hữu
hiệu trong bảo tồn và phát triển lồi dược liệu đa tác dụng này. Vì vậy, nhân
giống lồi Kim tiền thảo bằng phương pháp ni cấy in vitro sẽ giúp tạo ra số
lượng lớn cây con trong thời gian ngắn, có thể đáp ứng nguồn giống cho các
vùng sản xuất dược liệu, nhằm nâng cao thu nhập cho người dân và phục vụ
công tác bảo tồn nguồn gen cây thuốc.
Mặt khác, để giám định hay định danh chính xác lồi Kim tiền thảo phục
vụ cho lựa chọn lồi đưa vào nhân giống in vitro thì phương pháp ADN mã


2
vạch được cho là có độ tin cậy cao. Phương pháp ADN mã vạch đã trở thành
công cụ hữu hiệu cho các nhà khoa học trong việc phân loại, đánh giá đa dạng
di truyền và quan hệ di truyền các loài cả động vật và thực vật.
Với mục tiêubước đầu xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch cho lồi
nhằm đảm bảo độ tin cậy và chính xác trong nhân giống Cây Kim tiền thảo tôi
thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xác định một số trình tự ADN mã vạch và
nhân giống Cây Kim Tiền Thảo (Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.)

bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro”


3

Chƣơng 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây Kim tiền thảo
1.1.1. Nguồn gốc và hệ thống phân loại
Tên khoa học: Desmodium styracifolium (Osb.) Merr
Tên khác: Đồng tiền lông, Mắt trâu, Vảy rồng, Dây sâm lông, Bươm
bướm,Cỏ Đồng tiền vàng (Gold Money Herb , Cat’s foot, maiden-hair,
ground ivy(Anh); Herbe de St-Jean, couronne de terre, lierre terrestre,
rondette (Pháp).
Chi: Thóc lép (Desmodium)
Họ: Đậu (Fabaceae
Bộ: Đậu (Fabales
Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida
Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta

( />Hình 1.1: Cây Kim tiền thảo (Desmodium styracifolium (Osb.) Merr)
Desmodium là một chi lớn thuộc họ Đậu với khoảng 350 loài thực vật
đa số được sử dụng làm ngũ cốc và thảo dược. Hiện nay chỉ có khoảng 30 lồi


4
được nghiên cứu về đặc điểm thực vật, tính chất hóa học và tác dụng sinh học
(Nguyễn Minh Ngọc, 2013).
1.1.2. Đặc điểm thực vật của cây Kim tiền thảo
Kim tiền thảo là loại cây thân cỏ, mọc bị. Thân hình trụ, màu xanh hơi

vàng, phủ đầy lông mịn màu vàng hoe. Lá mọc so le, đơn hay kép lông chim
lẻ gồm 1-3 lá chét, lá chét ở giữa to hơn 2 lá bên. Cuống lá dài 2-4 cm, hình
trụ phù ở đáy, phủ đầy lơng trắng. Hai lá kèm hình mũi mác, dài 6-9 mm,
ngang 2-3 mm, nhiều gân dọc, đầy lơng trắng mịn. Lá kèm con nhỏ, hình tam
giác. Lá chét có phiến trịn hoặc hơi xoăn, đường kính 2-4 cm, ít khi đến 5
cm, mép ngun, đỉnh trịn hay tù hoặc chia 2 thùy cạn, đáy hình tim; mặt trên
nhẵn, màu hơi vàng hoặc lục xám, mặt dưới mốc do phủ đầy lông mịn màu
trắng, gân lá kiểu lông chim nổi rõ ở mặt dưới, gân phụ 8-10 đôi, cuống lá dài
1-2 mm, phủ đầy lông trắng mịn. Hai lá chét bên có phần phiến hai bên gân
giữa không đều nhau ở gốc,một bên to, một bên hơi nhỏ hơn.

( />Hình1.2: Hình thái cây Kim tiền thảo
Cụm hoa: Chùm dài đến 5 cm, thường ở ngọn cành ít khi ở nách những
lá phía ngọn, mỗi mấu của chùm là một xim co gồm 2 hoa có chung một lá bắc,
giữa 2 gốc cuống hoa có một u lồi nhỏ. Cụm hoa phủ đầy lông trắng mịn.


5
Hoa nhỏ, khơng đều, lưỡng tính, mẫu 5. Hai cuống hoa của xim hướng
ra hai bên sau đó xụ xuống trên quả. Quả loại đậu xụ xuống, mang đài tồn tại
ở gốc, dẹp, dài 1,5 - 2 cm, ngang 3-4 mm, nhiều lông trắng mịn, chia thành 2 6 đốt. Cây thường được thu hái vào mùa hè thu, có thể dùng tươi hay phơi
khô (Đỗ Tất Lợi, 1999); (Lưu Trường Sinh, Hoàng Văn Lương, 2000); (Võ
Văn Chi, 1997).
1.1.3. Đặc điểm sinh thái và phân bố
Kim tiền thảo thích hợp với điều kiện nhiệt độ nóng m hoặc m mát,
đất ít chua, có thành phần cơ giới trung bình, m và thoát nước nhưng cũng
chịu được đất chua, nghèo xấu và khơ hạn. Ưa sáng nhưng cũng chịu được
bóng râm, sống lưu niên, tái sinh hạt, chồi gốc, chồi thân, chồi cành đều khỏe
(Võ Văn Chi, 1997; Đỗ Tất Lợi, 1999).
Phân bố địa lý: Cây Kim tiền thảo là một loại dược liệu mọc nhiều ở

Đông Nam Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Việt Nam và
Nhật Bản… Tại Việt Nam, cây phân bố rộng rãi ở vùng đồi núi. Thường gặp
ở những chỗ sáng, trên đất cát pha, vùng trung du Hà Tây, Lạng Sơn, Ninh
Bình và Hải Phòng (Võ Văn Chi, 1997; Đỗ Tất Lợi, 1999).
1.1.4. Giá trị dược liệu
Theo Đông y đây là một loại cây có vị ngọt, tính hàn. Trong dân gian
cây Kim tiền thảo được dùng thanh nhiệt, lợi thủy, tiêu sạn, giải độc, tiêu
viêm. Các nghiên cứu dược lý hiện đại cho thấy Kim tiền thảo có tác dụng lợi
tiểu, lợi mật, kháng sinh, kháng viêm, dãn mạch, hạ huyết áp. Nhưng công
dụng chủ yếu là lợi mật, thông tiểu tiện, thường dùng chữa sỏi thận, sỏi mật,
sỏi bàng quang, sỏi đường tiết niệu, viêm gan vàng da, viêm thận phù thũng…
Đối với hệ tim mạch, Kim tiền thảo làm tăng lưu lượng mạch vành,hạ huyết
áp, làm tim đập chậm, đồng thời làm giảm mức tiêu thụ oxy của cơ tim. Tác
dụng hạ huyết áp do sự kích thích các thụ thể cholinergic vàsự phóng bế các
thụ thể adrenergic. Các nhà khoa học đã nghiên cứu và chứng minh được rằng


6
thành phần flavonoid trong Kim tiền thảo có tác dụng rất tốt trong việc làm hạ
huyết áp ở những người huyết áp cao. Bên cạnh đó,Kim tiền thảo cũng có tác
dụng đối kháng với các triệu chứng do pituitrin gây giảm lưu lượng mạch
vành, đồng thời làm giảm mức tiêu thụ ơxy của cơ tim (Đồn Thị Nhu, 2013).
Đặc biệt hoạt chất soyasaponin I chứa trong Kim tiền thảo đã được chứng
minh có tác dụng ức chế sự hình thành sỏi calci axalat ở thận. Cao Kim tiền
thảo thí nghiệm trên động vật có tác dụng ức chế sự hình thành sỏi can xi
axalat ở thận do thành phần polysacchorid chứa trong cao có tác dụng này và
đồng thời làm tăng lượng bài tiết nước tiểu, ngồi ra cịn có tác dụng tăng
cường sự tiết mật (Đoàn Thị Nhu, 2013).
1.1.5. Các nghiên cứu về hóa sinh học, dược học của cây Kim tiền thảo
Zhou C và cộng sự (2012) tiến hành nghiên cứu phương pháp đánh giá

chất lượng của Desmodium styracifolium bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao với phát hiện mảng photodiode và phương pháp quang phổ khối ion
hóa song song. Desmodium styracifolium, với C-flavone glycosides là hợp
chất hiệu quả dược lý chính, là một loại thảo dược phổ biến của Trung Quốc
và đã được sử dụng để điều trị rối loạn tiểu tiện, sỏi tiết niệu, phù và vàng da.
Xuehai Wang và cộng sự (2013 đã công bố liên quan đến lĩnh vực y học
cổ truyền Trung Quốc, đặc biệt là viên nang chứa flavonoid tổng số của
Desmodium styracifolium, một phương pháp điều chế viên nang và sử dụng viên
nang chứa flavonoid tổng số của Desmodium styracifolium trong chế ph m thuốc
điều trị sỏi tiết niệu. Điều chế viên nang chứa flavonoid tổng số của Desmodium
styracifolium với tỷ lệ hòa tan cao, tác dụng lâm sàng đáng chú ý, tác dụng phụ
nhẹ và hiệu quả điều trị tốt cho bệnh sỏi tiết niệu, đặc biệt đối với sỏi vùng chậu
thận và sỏi niệu quản( />Nghiên cứu của Zhou J. và cộng sự (2018) cho thấy flavonoid tổng số
của D. styracifolium làm suy yếu sự hình thành của sỏi niệu canxi oxalat do
hydroxy-L-proline gây ra ở chuột. D. styracifolium được coi là một loại thuốc


7
thảo dược Trung Quốc, đã được báo cáo để điều trị các bệnh sỏi thận. Tuy
nhiên, các thành phần hoạt động hóa học tiềm năng và các cơ chế cơ bản liên
quan đến hiệu quả của nó trong việc nhắm mục tiêu sỏi tiết niệu vẫn còn tiếp
tục được làm sáng tỏ. Nghiên cứu này nhằm mục đích điều tra tác dụng chống
tiết niệu của flavonoid tổng số của D. styracifolium (TFDS trên sỏi thận
canxi oxalat (CaOx)trên chuột Sprague-Dawley. Kết quả chứng minh rằng
TFDS có tác dụng có lợi trong việc ức chế sự hình thành CaOx ở thận chuột
có thể thông qua sự kết hợp của các hoạt động chống oxy hóa, chống viêm,
kiềm hóa nước tiểu và làm giảm nồng độ các thành phần tạo sỏi trong nước
tiểu. Do đó, TFDS có thể có ý nghĩa lâm sàng trong việc ngăn ngừa tổn
thương tế bào thận oxy hóa và cuối cùng là hình thành sỏi thận. Dữ liệu cung
cấp một lý do cho việc sử dụng TFDS trong điều trị bệnh sỏi thận và xác định

tác nhân này là một nguồn tiềm năng của thuốc chống lợi tiểu mới(Zhou J.và
cộng sự, 2018).
Xie H. và cộng sự (2018 cũng tiến hành nghiên cứu tổng flavone của
D. styracifolium làm giảm bớt apoptosisvà autophagy của các tế bào HK-2
gây ra bởi COM bằng cách điều chỉnh KIM-1 thông qua con đường
p38/MAPK. Mục đích của nghiên cứu là điều tra cơ chế tổng flavone của D.
styracifolium (TFDS trong việc điều chỉnh sự hình thành của nước tiểu. Hàm
lượng protein của KIM-1, LC3-II, p-p38 được đo bằng phương pháp Western
blot. Ảnh hưởng của nồng độ COM khác nhau, nồng độ TFDS khác nhau,
SB203580 (chất ức chế đặc hiệu của p38/MAPK và sự biểu hiện quá mức
của KIM-1 đối với khả năng sống của tế bào đã được phát hiện bằng xét
nghiệm WST-1. Các tế bào apoptotic và tế bào dương tính FITC được phát
hiện bằng phương pháp dòng tế bào học. Khả năng sống của tế bào HK-2
giảm khi tăng nồng độ COM và nồng độ protein của KIM-1, LC3-II và p-p38
tăng theo thời gian. Chặn con đường p38/MAPK hoặc đồng nuôi cấy với
TFDS đã ức chế tác động của COM đối với quá trình tự hủy và tự động của


8
các tế bào HK-2. Ngoài ra, việc chặn đường dẫn p38/MAPK đã ức chế biểu
hiện của KIM-1. Trong các tế bào gây ra bởi COM, sau khi được xử lý bằng
SB203580, sự biểu hiện quá mức của KIM-1 có thể đảo ngược tác dụng bảo
vệ của SB203580 đối với tổn thương tế bào do COM gây ra và ức chế
SB203580 đối với quá trình tự trị quá mức do COM gây ra, cho thấy
p38/MAPK được điều chỉnh điều chỉnh quá trình apoptosis tế bào gây ra
COM và autophagy. Cuối cùng, chúng tôi đã chứng minh rằng TFDS ức chế
con đường p38/MAPK. Và hiệu quả bảo vệ của tổn thương tế bào do COM
gây ra tăng lên khi tăng nồng độ TFDS, và độ bám dính giữa COM và tế bào
giảm khi tăng nồng độ TFDS. Với sự gia tăng nồng độ của TFDS, con đường
p38/MAPK dần bị ức chế, và các protein liên quan đến KIM-1 và autophagy

đã giảm. TFDS đã ức chế apoptosis tế bào HK-2 và autophagy bằng cách điều
chỉnh KIM-1 thông qua con đường p38/MAPK (Xie H, Li J và Gao H.,2018).
Sun X. và cộng sự (2018 tiến hành nghiên cứu phương pháp vân tay
định lượng hiệu quả để đánh giá tính nhất quán chất lượng của Desmodium
styracifolium. Phương pháp vân tay định lượng HPLC này có thể được coi là
một phương pháp phù hợp để đánh giá chất lượng của các loại thuốc và chế
ph m thảo dược truyền thống của Trung Quốc. Để tiến hành phương pháp
định lượng HPLC cần có sự kết hợp cùng năm thành phần chính (vicenin-1,
schaftoside, isoschaftoside, vicenin-3 và isovitexin của D. styracifolium đã
được phát triển để đánh giá tính nhất quán chất lượng của loại thảo dược này.
Việc phân tách sắc ký được thực hiện trên cột Agilent 5 TC-C18 (4,6 × 250
mm, 5 m bằng cách rửa giải gradient bằng acetonitril và axit formic 0,1% (v/
v . Nhiệt độ cột là 30°C và bước sóng phát hiện là 272 nm. Dữ liệu sắc ký
được phân tích bằng phương pháp vân tay định lượng có hệ thống mới
(SQFM . Phương pháp vân tay định lượng được thiết lập đã được áp dụng
thành công để xác định đồng thời mức độ của các thành phần chính và 39
đỉnh chung đã được tìm thấy. Các mẫu được thu thập ở tỉnh Quảng Đơng có


9
tính nhất quán chất lượng tốt, theo quan điểm truyền thống rằng tỉnh Quảng
Đông là khu vực tốt nhất để trồng D. styracifolium. Mối quan hệ hiệu quả
chống oxy hóa dấu vân tay của các mẫu khác nhau đã được nghiên cứu bằng
cách kiểm tra mối tương quan giữa các đỉnh chung và tác dụng chống oxy hóa.
Hai mươi hai đỉnh chung có tương quan dương với tác dụng chống oxy hóa,
trong khi các đỉnh khác cho thấy mối tương quan nghịch. SQFM là đáng tin
cậy và hiệu quả để phân tích dữ liệu sắc ký (Vasantha M.M. và cộng sự,2005).
Hiện nay, hầu hết các cơng trình đã cơng bố đều chủ yếu nghiên cứu về
hóa sinh học và thành phần dược học của cây Kim tiền thảo. Ở Việt Nam
cũng như trên thế giới hiện chưa có cơng trình nghiên cứu nào về nhân giống

cây Kim tiền thảo bằng phương pháp nuôi cấy in vitro.
1.1.6. Một số bài thuốc dân gian về cây Kim tiền thảo
Chữa mụn nhọt, ghẻ lở: Kim tiền thảo + xa tiền thảo tươi, giã nát, cho
rượu vào, vắt lấy nước cốt, lấy lông ngỗng chấm thuốc bôi vào vết thương.
Chữa sạn mật: Chỉ xác (sao) 10-15g, xuyên luyện tử 10g, hoàng tinh
10g, Kim tiền thảo 30g, sinh địa 6-10g (cho vào sau), sắc uống. Hoặc Kim
tiền thảo 30g, xuyên phá thạch 15g, trần bì 30g, uất kim 12g, xuyên quân (cho
vào sau) 10g, sắc uống.
Chữa sạn đường tiểu: Kim tiền thảo 30-60g, hải kim sa (gói vào túi vải
15g, đơng quỳ tử 15g, xun phá thạch 15g, hoài ngưu tất 12g, hoạt thạch
15g, sắc uống. Hoặc kim tiền thảo 30g, xa tiền tử (bọc vào túi vải 15g, xun
sơn giáp (chích 10g, thanh bì 10g, đào nhân 10g, ô dược 19g, xuyên ngưu tất
12g, sắc uống.
Chữa sỏi đường tiểu do thận hư thấp nhiệt: hoàng kỳ 30g, hoàng tinh
15g, hoài ngưu tất 15g, Kim tiền thảo 20g, hải kim sa (gói vào túi vải , xuyên
phá thạch 15g, vương bất lưu hành 15g, sắc uống.
Chữa bệnh trĩ: mỗi ngày dùng toàn cây Kim tiền thảo tươi 100g (nếu khô
50g sắc uống. Đối với trĩ nội và ngoại đều có kết quả như nhau.Chữa viêm


10
đường mật không do vi khu n: Dùng Kim tiền thảo sắc uống sáng 1 lần hoặc
nhiều lần trong ngày. Mỗi ngày dùng 30g, có khi 20g hoặc 10g/ ngày, 30 ngày
là 1 liệu trình. Thơng thường uống trong 2-3 tháng có kết quả với tỉ lệ 76,9%.
Chữa sỏi niệu gây chảy máu, sung huyết: Dùng 40g kim tiền thảo, 20g
mã đề, 12g ngưu tất, 12g ý dĩ, 8g các loại uất kim, đào nhân, đại phúc kì, kê
nội kim. Sắc uống, mỗi ngày 1 thang.
Chữa phù, viêm túi mật, viêm gan, viêm thận: 40g Kim tiền thảo, 10g chút
chít, 10g dành dành, 20g mộc thông, 20g ngưu tất. Mỗi ngày sắc 1 thang uống.
Chữa viêm vàng da: Mỗi ngày dùng 60g kim tiền thảo sắc uống cho đến

khi hết vàng da.
1.2. Tình hình nhân giống một số lồi thuộc chi Desmodium
Năm 2005, Vasantha Kumari tiến hành nghiên cứu tái sinh cây
Desmodium oojeinense Roxb. bằng phương pháp tạo mô sẹo. Trong nghiên
cứu, mô sẹo được tạo ra bằng cách nuôi cấy lá, cuống lá, chồi nách, trụ dưới
lá mầm và lá mầm của D. oojeinense trên môi trường MS, B5 hoặc WP được
bổ sung 2,4-D hoặc BAP. Trong số các môi trường được sử dụng, tất cả các
nhà nghiên cứu đều cho rằng môi trường MS và WP được bổ sung 2,4-D hoặc
BAP được tìm thấy là mơi trường lý tưởng cho việc tạo ra mơ sẹo. Trong đó,
B5 là môi trường kém hiệu quả nhất. Các nhà nghiên cứu đã quan sát thấy
phiến lá mỏng được nuôi trong môi trường MS được bổ sung 2,4-D hoặc BAP
ở mức 1,0 mg/l và môi trường WP được bổ sung một trong hai hormone này ở
mức 0,25 mg/l thì tạo mơ sẹo tốt nhất. Tái sinh cây chỉ đạt được từ mô sẹo khi
cho lá, lá mầm và trụ dưới lá mầm phát triển trên môi trường MS được bổ
sung với sự kết hợp 4 mg/l BAP và Kinetin (Ki . Chồi tái sinh được tạo thành
cây hồn chỉnh trong mơi trường MS bổ sung 3 mg/l IAA. 50% số cây tái sinh
sống sót khi trồng ngồi tự nhiên. Đây là báo cáo đầu tiên về việc tạo ra mô
sẹo và tái sinh cây con D. oojeinense của các nhà nghiên cứu (Preeti S. và
cộng sự, 2013).


11
Srivastava Preeti và cộng sự (2013 tiến hành nhân giống in vitro tần số
cao cây Thóc lép (Desmodium gangeticum L.L. (DDCC) – cây thuốc có nguy
cơ tuyệt chủng. Các nhà nghiên cứu sử dụng cây giống vô trùng 10 ngày tuổi,
cắt bỏ đỉnh sinh trưởng và lấy mắt ngủ nuôi cấy trên mơi trường Murashige
ADN Skoog (MS , ½ MS và Gamborg (B5 chứa các cytokinin 6-benzyl
aminopurine (BA , kinetin (Ki và thiadiazuran (TDZ . BA đã được tìm thấy
là hiệu quả nhất cho sự phát sinh chồi chiếm tỉ lệ 98% và số lượng chồi tối đa
là 12,4 được tạo ra trên môi trường MS được bổ sung 4,44 µM BA. Tỉ lệ ra rễ

cao nhất (98% và số rễ tối đa là 8 rễ/chồi khi chồi được nhúng vào dung dịch
axit indol-3-butyric (IBA (492,12 µM trong 30 phút và sau đó ni cấy trên
mơi trường ½ MS. Các cây con đã được trồng thành công trong Soilrite (hỗn
hợp gồm 75% rêu than bùn Ailen và 25% đá trân châu có pH trong khoảng từ
5,0 đến 6,5 với tỷ lệ sống 96%. Cây tái sinh phát triển bình thường và khơng
có bất kỳ biến đổi hình thái nào (Preeti S. và cộng sự, 2013).
San Thandar và cộng sự (2015 đã nghiên cứu thành cơng quy trình
nhân giống in vitro cây Mũi mác (Desmodium triquetrum D.C.). Trong nghiên
cứu này, sự phát triển chồi trực tiếp và sự hình thành mơ sẹo đã đạt được từ
các chồi nách và mô lá khác nhau của cây giống in vitroD.triquetrum D.C.
Môi trường Murashige và Skoog từ (MS được bổ sung với nồng độ khác
nhau của cytokinin và kết hợp với chất phụ gia đã được sử dụng để nhân chồi,
cảm ứng mô sẹo và hình thành rễ. Sự tiết ra polyphenolic từ vật liệu ni cấy
được kiểm sốt bằng cách bổ sung axit citric vào môi trường. Những cây con
đã bén rễ được cấy vào một túi nhựa chứa hỗn hợp đất và được trồng trong
điều kiện nhà xanh để thích nghi với môi trường tự nhiên. Nồng độ khác nhau
của auxin và cytokinin ảnh hưởng đến quá trình nhân nhanh chồi, cảm ứng
mơ sẹo và sự hình thành rễ. Kết quả của nghiên cứu cho thấy, môi trường bổ
sung 4 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA là tối ưu để nhân chồi, 2 mg/l BAP + 0,5
mg/l NAA là tốt nhất cho sự tăng sinh mô sẹo. Môi trường ⅟₂MS chứa ở


12
NAA 0,75 hoặc 1 mg/l cho thấy chồi ra rễ tối đa. Quy trình nhân giống in
vitro có thể được tiêu chu n hóa rất hữu ích trong việc nâng cao chất lượng
cây trồng Desmodium triquetrum DC cho các chương trình trồng thương mại
và bảo tồn tế bào mầm (Thandar S và Tun O. M.,2015).
1.3. Kỹ thuật nuôi cấy in vitro thực vật
Nhân giống bằng nuôi cấy mô (propagation by tisue culture , hoặc vi
nhân giống (micropropagation là tên gọi chung cho các phương pháp nuôi

cấy in vitro cho các bộ phận nhỏ được tách khỏi cây (Nguyễn Văn
Uyển,1993) đang được dùng phổ biến để nhân giống thực vật.
1.3.1. Cơ sở của khoa học của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là lĩnh vực nuôi cấy các nguyên liệu thực
vật hồn tồn sạch các vi sinh vật trên mơi trường nhân tạo, trong điều kiện
vô trùng (Nguyễn Quang Thạch và Lý Thị Anh , 2000).
Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa trên
học thuyết về tính tồn năng của tế bào của nhà sinh lý thực vật người Đức
Haberlandt vào cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20: “Mọi tế bào bất kỳ của cơ thể
sinh vật cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền (ADN cần thiết và
đủ của sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát
triển thành một cá thể hồn chỉnh”. Ngày nay, các nhà khoa học đã chứng
minh được khả năng tái sinh cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ.
Trong nuôi cấy in vitro, quá trình phát sinh hình thái thực chất là kết
quả của q trình phân hố và phản phân hố tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế
bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào
thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng một cách
định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính
tồn năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô
nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào mơi trường ni cấy hai nhóm chất
điều tiết sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin. Tỷ lệ hàm lượng hai


13
nhóm chất này trong mơi trường khác nhau sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái
khác nhau. Khi trong mơi trường ni cấy có tỷ lệ nồng độ auxin (đại diện là
IAA)/cytokinin là kinetin thấp thì sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy
theo hướng tạo chồi, khi tỷ lệ này cao mơ ni cấy sẽ phát sinh hình thái theo
hướng tạo rễ còn ở tỷ lệ cân đối sẽ phát sinh theo hướng tạo mô sẹo (callus)
(Nguyễn Quang Thạch, 2000).

1.3.2. Các giai đoạn ch nh của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật
1.3.2.1.Giai đoạn chuẩn bị
Là bước đầu tiên của quy trình nhân giống. Giai đoạn này gồm các
khâu như: chọn lọc cây mẹ để lấy mẫu, chọn cơ quan để lấy mẫu. Mô chọn để
ni cấy thường là các mơ có khả năng tái sinh cao trong ống nghiệm, sạch
bệnh, giữ được các đặc tính q của cây mẹ. Sau đó chọn chế độ khử trùng
thích hợp làm sao để mẫu cấy bị nhiễm là thấp nhất, đồng thời khả năng sinh
trưởng và phát triển vẫn tốt. Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay
là dùng các tác nhân hố học có tính sát trùng mạnh như cồn 70%, HgCl2,
NaOCl, Ca(ClO3)2, H2O2,... để khử trùng mẫu.
1.3.2.2. Giai đoạn nuôi cấy khởi động
Là giai đoạn ta đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro trên mơi trường dinh
dưỡng nhân tạo thích hợp để tái sinh mô cấy. Môi trường này được xác lập
cho từng loại cây, loại mô nuôi cấy. Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm
khu n, nấm hoặc virus sẽ được lưu giữ ở phịng ni cấy với điều kiện nhiệt
độ, ánh sáng phù hợp. Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy ban đầu
sẽ xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ hoặc các phơi
vơ tính có đặc tính gần như phơi hữu tính. Đây sẽ là những vật liệu khởi đầu
để cho q trình nhân nhanh tiếp sau đó.
1.3.2.3. Giai đoạn nhân nhanh
Một khi mẫu cấy sạch đã được tạo ra và từ đó nhận được các cụm chồi,
các phơi vơ tính sinh trưởng tốt, q trình ni cấy sẽ bước vào giai đoạn


14
nhân nhanh. Người ta cần thu được tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều
kiện nuôi cấy và thành phần mơi trường đã được tối ưu hóa nhằm đạt được
mục tiêu này. Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi thường kéo dài trong
khoảng 1-2 tháng tùy mỗi loại cây và nhìn chung cho cả giai đoạn nhân nhanh
là vào khoảng 10-36 tháng.

1.3.2.4. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
Các chồi hình thành trong q trình ni cấy có thể phát rễ tự sinh,
nhưng thông thường các chồi này phải được cấy sang một mơi trường khác để
kích thích tạo rễ, ở giai đoạn này phải tạo cây trong ống nghiệm phát triển cân
đối về thân, lá, rễ để đạt tiêu chu n của một cây giống.
1.3.2.5. Giai đoạn vườn ươm
Đây là giai đoạn đánh giá tính hiện thực của quá trình nhân giống in
vitro khi chuyển cây từ điều kiện vơ trùng của phịng thí nghiệm ra ngồi tự
nhiên. Khi đưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm, nhằm giảm đi hiện
tượng “sốc” do thay đổi về điều kiện mơi trường cần có giai đoạn thích nghi.
Q trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây yêu cầu sự chăm sóc đặc
biệt, do đó ở giai đoạn này cần chủ động để điều khiển được quá trình chiếu
sáng, dinh dưỡng và giữ nước cũng như lựa chọn các giá thể thích hợp và
trong điều kiện cách ly bệnh để các cây con đạt tỷ lệ sống cao.
1.4.Tổng quan về ADN mã vạch
1.4.1. Giới thiệu về ADN mã vạch (DNAbarcoding)
Thuật ngữ “ADN mã vạch” lần đầu tiên được sử dụng vào năm 1993 là
một khái niệm sử dụng trình tự ADN như một ký tự nhận dạng để xác định
nhanh chóng và chính xác lồi, dưới lồi. Về cơ bản, kỹ thuật này dựa vào
việc sử dụng một đoạn ADN có kích thước khoảng từ 400 - 800 bp như là
một tiêu chu n để nhận dạng các loài một cách nhanh chóng và chính xác. Kỹ
thuật ADN mã vạch giúp các nhà phân loại học trong công tác phân loại và
xác định loài, nâng cao năng lực kiểm soát, hiểu biết và tận dụng sự đa dạng


15
sinh học. Ngồi ra, kỹ thuật này có triển vọng nghiên cứu và ứng dụng trong
khoa học sự sống, trong khoa học pháp y, y tế, nghiên cứu y dược, sản xuất và
kiểm soát chất lượng thực ph m, truy xuất nguồn gốc, bảo hộ sản ph m...
Phương pháp này vơ cùng có ý nghĩa trong các trường hợp các mẫu vật sinh

học cần giám định đã được qua xử lý, chế biến như các dạng chế ph m thuốc
hay thực ph m đã qua chế biến... (Yao H. và cộng sự, 2010).
Năm 2003, nhà nghiên cứu tại đại học Guelph, Canada – Paul Hebert đã đề xuất một phương pháp xác định loài dựa trên ADN mã vạch (DNA
barcoding). ADN mã vạch là trình tự nucleotide của một chuỗi ADN ngắn, có
cùng nguồn gốc tổ tiên, trong đó có vùng ít bị thay đổi (vùng bảo thủ và vùng
thay đổi theo q trình tiến hóa (Hebert, 2003).
Dựa vào mức độ thay đổi trong trình tự ADN này để đánh giá sự sai
khác di truyền giữa các sinh vật, tương tự như máy quét mã vạch trong siêu
thị. Hai mẫu vật của hai lồi có thể có hình thái bên ngồi rất giống nhau,
song chúng có thể được phân biệt bằng cách sử dụng ADN mã vạch. Với ưu
thế đó, ADN mã vạch có thể được sử dụng cho hai mục đích chính: nhận dạng
về mặt phân tử cho các lồi đã được mơ tả và tìm ra các lồi mới chưa được
mơ tả (Hebert và cộng sự, 2004 .
Ngồi ra việc lựa chọn một vùng trình tự làm ADN mã vạch cịn cần
phải mang những đặc điểm sau: có độ dài thích hợp (khơng q ngắn để có độ
đa hình về trình tự giữa các taxon, khơng q dài để có thể giải trình tự theo
cách thơng thường, thậm chí cả khi trong điều kiện chưa được tối ưu ; khơng
phải vùng dị hợp để có thể nhân bản trực tiếp trình tự mà khơng cần tách
dịng; thuận lợi trong việc so sánh trình tự dựa trên vị trí khác biệt các base và
khơng có đoạn trình tự chưa chắc chắn như một vài đoạn lặp microsatellite
làm giảm chất lượng trình tự (Hollingsworth, 2009).
ADN mã vạch là một cơng cụ mới, rất hiệu quả cho các nghiên cứu về
phân loại, giám định sinh vật, gồm cả động vật, thực vật, nấm, vi sinh vật và
virus (Hebert và cộng sự, 2003 ; (Group và cộng sự, 2009 . Việc xác định loài


16
bằng ADN mã vạch có hiệu quả cao trong việc phân biệt các lồi sinh vật khi
những quan sát hình thái, sinh trưởng và phát triển chưa đủ cơ sở để định
danh hoặc phân biệt loài (Casiraghi và cộng sự, 2010).

Việc sử dụng ADN mã vạch để nhận dạng các lồi trên quy mơ tồn
cầu có ý nghĩa ngày càng lớn. Cho đến nay, sau hơn 10 năm nghiên cứu đã có
trên 6000 cơng trình khoa học được cơng bố với khoảng 5 triệu trình tự ADN
mã vạch ở các loài sinh vật theo số liệu của BOLD (98 . Để chu n hóa ở mức
độ quốc tế về việc sử dụng ADNmã vạch, cộng đồng khoa học đã nỗ lực trong
việc tìm kiếm các vùng trình tự ADN làm mã vạch có thể phân biệt đồng thời
nhiều lồi (Hollingsworth và cộng sự, 2011; Ford, C.S và Ayres K.L., 2009;
Yu và cộng sự, 2011).
Một ADN mã vạch điển hình phải đáp ứng được các u cầu sau:
- Có tính phổ biến cao (dễ dàng nhân bản và giải trình tự .
- Trình tự có tính đặc hiệu cao.
- Có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài (Hollingsworth và
cộng sự, 2011).
1.4.2. Một số locus được sử dụng làm chỉ thị mã vạch ADN ở thực vật
Khác với động vật, ngồi bộ gen nhân và ty thể, thực vật cịn có một bộ
gen bổ sung là bộ gen lục lạp (cpADN). ADN nhân, ty thể và lục lạp đều
được sử dụng trong phân tích lồi. Tùy vào mức độ phân tích mà mỗi vùng
gen và mỗi phương pháp được áp dụng thích hợp. Do tính phức tạp và lặp đi
lặp lại, chỉ có một số gen thuộc ADN hệ gen nhân như 18S, 26S, vùng
ITS…được sử dụng. Vùng 18S và 5,8S thường được sử dụng để xác định ở
mức bộ hoặc họ, vùng 26S thường được sử dụng để xác định ở mức dưới họ
đến cho đến loài, vùng ITS và vùng 5S spacer thường được dùng để phân tích
ở mức loài cho tới mức dưới loài.
Nếu như các gen ty thể như COI và Cytb được dùng rộng rãi cho động
vật và tảo (Balaraju K. và cộng sự, 2008; Baskaran K. và cộng sự, 1990) thì


17
khi chúng được áp dụng cho các loài thực vật trên cạn lại biểu hiện tính bảo
thủ cao nên khơng phù hợp làm ADN mã vạch. Thay vào đó, các vùng rời rạc

trong hệ gen lạp thể đã được dùng trong các nghiên cứu phát sinh loài (như
các vùng exon của các gen rbcL, atpB, ndhF, matK và vùng intron của các
gen trnL, trnL-F).
Những vùng ADN này giống như mã vạch bởi tính bảo thủ cao trong
phạm vi mỗi lồi nhưng đa hình giữa các lồi. Một vùng trình tự thơng
thường khác trong nghiên cứu phát sinh lồi thực vật trên cạn là ribosome ITS
nhân (vùng đệm của tiểu đơn vị lớn ARN ribosome , tuy nhiên vùng này
không đạt hiệu quả cao ở một số nhóm thực vật do các yếu tố khác liên quan
đến các diễn biến tiến hóa phức tạp của các vùng lặp lại cao trong hệ gen
nhân(Mark Y. S. H. P. D. N., 2008).
Dựa trên sự khác nhau của các vùng mã hóa và khơng mã hóa, 4 đề
xuất chính đã được đưa ra với sự kết hợp khác nhau của 7 gen lục lạp đó là:
rpoC1 + rpoB+ matB hoặc rpoC1 + mtaK + trnH - psbA, rbcL + trnH psbA và atpF-H + pbsK-I + matK. Sự kết hợp khác nhau của các gen đã được
thảo luận tại hội nghị quốc tế Barcode of life lần thứ 2 tại Đài Bắc.
Năm 2010, La Haye và cộng sự đề xuất riêng gen matK cấu thành nên
mã vạch cây trồng, đây là một trong những khu vực có mức độ tiến hóa nhanh
nhất trong lục lạp và cho thấy khả năng phân biệt cao các lồi thực vật hạt kín
(Hilu K.W.L.H., 1997). Nhóm nghiên cứu thực vật COBL đề nghị một mã
vạch bao gồm hai khu vực mã hóa gen của lục lạp rbcL + matK (Yu J. và
cộng sự, 2011). Theo Barcode of life năm 2011 đã lưu trữ được hơn
1.100.000 ADN barcode của thực vật được lưu trữ trong ngân hàng gen quốc
tế và liên kết với hơn 2.000 bài báo khác nhau để chu n hóa mức độ quốc tế
về việc sử dụng ADN barcode, cộng đồng khoa học đã nỗ lực trong việc tìm
kiếm các vùng trình tự ADN có thể làm mã vạch phân biệt nhiều loài (CBOL
Plant Working Group, 2009;Chen S. và cộng sự,2010; Gao T.Y.H. và cộng
sự, 2009; Kress J.W., 2005).