cADN
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (163.92 KB, 29 trang )
<span class='text_page_counter'>(1)</span><div class='page_container' data-page=1>
Bài tiểu luận: Lập thư
viện cADN
Nhóm sinh viên thưc hiên:
1. Trần Thị Vân Anh 6. Trần Trung Hiếu
2. Trần Xuân Bách 7. Nguyễn Quang Huy
3. Trương Thị Hải 8. Cấn Thị Khánh
Huyền
4. Hà Minh Hiền 9. Hoàng Thị Thu
Hường
</div>
<span class='text_page_counter'>(2)</span><div class='page_container' data-page=2>
Khái quát chung
Ngày nay trái đất đối mặt với biến đổi khí hậu. Thay
đổi khí hậu sẽ làm thay đổi mức độ thiệt hại của khô
hạn, ngập úng, ngập mặn, nhiệt độ cao, tác hại của sâu
bệnh. Chiến lược phát triển chung của ngành nông
nghiệp thế giới là sẽ tập trung vào những nội dung sau:
làm cho cây trồng thích ứng với biến đổi khi hậu; cải
tiến năng suất vượt trội; tạo nền tảng đa dạng di
</div>
<span class='text_page_counter'>(3)</span><div class='page_container' data-page=3>
Để làm được những điều ấy người ta phải thực hiện
nghiên cứu trình tự genom, cải tiến phương pháp đánh
giá kiểu hình, áp dụng các kĩ thuật di truyền và đặc
biệt là xây dựng thư viện cDNA
Trong nội dung của Hội nghị quốc tế lần thứ 6 ở
</div>
<span class='text_page_counter'>(4)</span><div class='page_container' data-page=4>
Thư viện cDNA giúp chúng ta có được các
dịng cDNA mã hóa liên tục của một gen, tìm ra
chúng một cách dễ dàng.
Nhận thấy tầm quan trọng của đề tài chúng tôi
</div>
<span class='text_page_counter'>(5)</span><div class='page_container' data-page=5>
Tổng quan đề tài
I, Thư viện cDNA là gì?
1, Khái niệm
2, Các bước tổng hợp cDNA
3, Các bước lập thư viện cDNA
4, Ưu điểm của việc lập thư viện cDNA
</div>
<span class='text_page_counter'>(6)</span><div class='page_container' data-page=6>
I. Thư viện cDNA (c-DNA
library) là gì?
1. Khái niệm
cDNA (complementary DNA) có nghĩa là ADN bổ trợ.
ADN bổ trợ chính là ADN đựơc tổng hợp từ ARN
thông tin( messenger RNA hay m- RNA) duới sự xúc
tác của enzim phiên mã nguợc (reverse
transcriptase).
Thư viện cADN chính là tập hợp lưu trữ các ADN bổ
</div>
<span class='text_page_counter'>(7)</span><div class='page_container' data-page=7>
Là tập hợp các bản sao cDNA từ tất cả các mARN
của một tế bào. Không giống với thư viện bộ gen thư
viện cDNA được thiết lập từ một tế bào xác định.
Trong đó gen cần nghiên cứu phải biểu hiện thành
mARN
Thường nguời ta thiết lập thư viện cADN trên vectơ
thực khuẩn thể lambda( vectơ chèn) trong truờng hợp
cần lập thư viện cADN tổng thể, hay vectơ plasmid
trong truờng hợp cần lập thư viện cADN hạn chế.
</div>
<span class='text_page_counter'>(8)</span><div class='page_container' data-page=8>
1.Các buớc chính để tổng hợp
cDNA
1. Tổng hợp sợi thứ nhất bằng enzyme reverse
transcriptase ( enzim phiên mã nguợc).
2. Biến tính và cắt RNA trong thể lai mRNA-cDNA
tuần tự bằng nhiệt và enzyme RNase H của
<i>E. </i>
<i>coli. Thay thế khuôn mẫu là chuỗi RNA </i>
bằng chuỗi
cDNA thứ nhất và tổng hợp sợi cDNA thứ hai nhờ
DNA polymerase I của
<i>E. coli.</i>
</div>
<span class='text_page_counter'>(9)</span><div class='page_container' data-page=9>
<i>(1). Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất</i>
ARN thơng tin của sinh vật bậc cao thuờng có
đuôi (3’ end) là một chuỗi các gốc A (poly-A).
Như vậy mồi để tổng hợp sẽ là một chuỗi các
gốc T ( oligo-dT). Enzim xúc tác quá trình này
là enzim phiên mã nguợc (reverse
</div>
<span class='text_page_counter'>(10)</span><div class='page_container' data-page=10>
. Có thể tóm tắt q trình làm như sau:
Người ta tách riêng mARN nhờ các tổ hợp ologonucleotid chỉ
chứa deoxythimidin (Oligo dT). Người ta gắn các oligo (dT) trong
phiễu chiết. Sau đó chiết xuất tồn bộ ARN của tế bào gồm rARN,
tARN, mARN rồi cho hỗn hợp này chảy qua phễu có gắn
xellulo-oligo (dT)
</div>
<span class='text_page_counter'>(11)</span><div class='page_container' data-page=11></div>
<span class='text_page_counter'>(12)</span><div class='page_container' data-page=12>
Sau khi tổng hợp xong sợi 1 của ADN bổ
trợ, lúc này sợi 1 của ADN bổ trợ vẫn cịn kết
cặp với ARN thơng tin bởi liên kết hydro ( hỗn
hợp 2 sợi ARN và ADN này gọi là
heteroduplex)
Nguời ta gây biến tính (đun sơi) thể lai
mRNA-cDNA để cắt RNA bằng RNase H của
</div>
<span class='text_page_counter'>(13)</span><div class='page_container' data-page=13></div>
<span class='text_page_counter'>(14)</span><div class='page_container' data-page=14>
(2). Tổng hợp sợi cADN thứ 2
Thông thường,
đầu tận cùng 3’ của các cDNA sợi
đơn có khả năng tạo thành các cấu trúc vịng cặp tóc
(hairpin loop) và
vì thế có thể được sử dụng để làm
mồi
(primer) cho quá trình tổng hợp sợi cDNA thứ
hai bằng DNA
polymerase I
<i>của E. coli hoặc </i>
<i>reverse transcriptase .</i>
Đoạn Klenow của
DNA polymerase I thiếu hoạt
</div>
<span class='text_page_counter'>(15)</span><div class='page_container' data-page=15></div>
<span class='text_page_counter'>(16)</span><div class='page_container' data-page=16>
(3). Cắt vịng cặp tóc của cDNA sợi
đơi
Sau khi tổng hợp cDNA hồn tồn, sợi thứ nhất và thứ hai
được liên kết cộng hóa trị bởi vịng cặp tóc và vịng cặp tóc
dễ bị cắt bởi nuclease S1. Sau đó, đoạn cDNA được sửa
chữa bằng enzyme Klenow,kết quả là hai đầu tận cùng là
đầu bằng.
Sợi đơi cDNA sau đó được tách thành các tiểu phần theo
kích thước và các phân tử lớn nhất được gắn vào các
</div>
<span class='text_page_counter'>(17)</span><div class='page_container' data-page=17>
Tuy nhiên, việc đưa các đầu bằng vào vector sẽ gây khó
khăn trong việc lấy chúng ra khỏi vector một cách nguyên
vẹn sau này. Do đó các linker thường được nối vào hai đầu
của các cDNA nhờ DNA ligase. Linker là những đoạn
nucleotide ngắn có chứa vị trí nhận biết của một loại RE (ví
dụ: <i>EcoRI) được tổng hợp nhân tạo tương ứng với vị trí nhận </i>
biết RE (ví dụ: <i>EcoRI) của vector. Sau đó, các cDNA mang </i>
<i>linker và vector sẽ được cắt bởi cùng một </i>enzyme (ví dụ:
</div>
<span class='text_page_counter'>(18)</span><div class='page_container' data-page=18>
3. Các bước lập thư viện cADN trong
bacteriophage l vector
<i>1. Chọn lọc kích thước của cDNA</i>
<i>2. Gắn các cDNA với các nhánh của </i>
<i>bacteriophage l</i>
</div>
<span class='text_page_counter'>(19)</span><div class='page_container' data-page=19>
<i>(1). Chọn lọc kích thước của cDNA</i>
cDNA sau khi cắt hạn chế được phân đoạn
bằng sắc ký cột Sepharose để loại bỏ
những linker thừa và các phân tử cDNA có
kích thước nhỏ hơn 500 bp. Cột sắc ký
</div>
<span class='text_page_counter'>(20)</span><div class='page_container' data-page=20>
<i>(2). Gắn các cDNA với các nhánh của </i>
<i>bacteriophage l</i>
Thông thường cần phải tiến hành thử một loạt các phản
ứng gắn và phản ứng đóng gói. Trong các phản ứng này,
một lượng không đổi của các nhánh bacteriophage l được
gắn với các lượng khác nhau của cDNA, mục đích là để xác
định lượng cDNA tạo ra ít nhất là 5´ 106 bacteriophage tái tổ
hợp.
Phản ứng gắn cần được thiết kế sao cho tối thiểu một
bacteriophage tái tổ hợp đơn sẽ chứa nhiều hơn một phân tử
cDNA bằng cách dùng tỷ lệ của các nhánh được phosphoryl
hóa và cDNA để chỉ 5% bacteriophage được tái tổ hợp. Nếu
sử dụng các nhánh dephosphoryl hóa, thì các bacteriophage
khơng tái tổ hợp bị ức chế hiệu quả, và vì thế khơng thể xác
định lượng cDNA cần thiết để tạo ra một quần thể
</div>
<span class='text_page_counter'>(21)</span><div class='page_container' data-page=21>
<i>(3). Phân tích các đoạn chèn </i>
<i>cDNA</i>
Thu thập khoảng mười hai plaque của bacteriophage tái tổ hợp
và chuẩn bị DNA để cắt bằng RE thích hợp.
Phân tích kích thước của các đoạn chèn cDNA bằng điện di
trên agarose gel 1%, dùng DNA marker có các đoạn từ 500 bp
tới 5 kb.
Nếu các bacteriophage tái tổ hợp chứa các đoạn chèn có kích
thước khác nhau và nếu kích thước trung bình của chúng xấp xỉ
1 kb hoặc lớn hơn, thì có thể tiến hành các bước tiếp theo (ví dụ:
tạo ra thư viện cDNA hoàn chỉnh).
</div>
<span class='text_page_counter'>(22)</span><div class='page_container' data-page=22>
<i>(4). Tạo thư viện cDNA hoàn chỉnh</i>
Nếu sử dụng các nhánh dephosphoryl hóa để xây dựng thư viện cDNA, thì
tính tốn lượng cDNA cho kết quả tăng gấp 10 lần số lượng của các plaque
không tái tổ hợp. Nếu sử dụng các nhánh phosphoryl hóa, thì tính tốn
lượng cDNA cho kết quả quần thể bacteriophage chứa xấp xỉ 5% các thể tái
tổ hợp.
Thiết kế một phản ứng gắn quy mô lớn, tăng số lượng của tất cả các thành
phần ở một tỷ lệ thích hợp.
Chắc chắn rằng thiết kế phản ứng gắn đối chứng chỉ chứa các nhánh của
</div>
<span class='text_page_counter'>(23)</span><div class='page_container' data-page=23>
<i>(5). Khuếch đại thư viện cDNA</i>
Vector lgt10.
Để thiết lập một sự cung cấp lâu dài của thư viện, thì
nó cần phải được khuếch đại
bằng sự sinh trưởng trên
chủng
<i>E. coli thích hợp (chẳng hạn chủng BNN102) </i>
<i>trên đĩa agar. Nếu thư viện</i>
chỉ được sàng lọc một lần,
bước khuếch đại này có thể bỏ qua và các
bacteriophage có thể được dàn
mỏng trực tiếp trên
</div>
<span class='text_page_counter'>(24)</span><div class='page_container' data-page=24>
<i>Vector lgt11 và các dẫn xuất của nó và lZAP, lZAPII. Các thư </i>
</div>
<span class='text_page_counter'>(25)</span><div class='page_container' data-page=25>
4. Ưu điểm
Các dịng cDNA chứa trình tự mã hóa liên tục của một gen.
Nhiều gen ở eukaryote là gián đoạn, có chứa nhiều đoạn
intron. Sau khi cắt tiền thân mRNA (pre-mRNA) và nối lại, các
đoạn intron đã bị loại và mRNA hồn thiện (mature mRNA) có
trình tự mã hóa liên tục được tạo thành. Do cDNA được phiên
mã ngược từ khn mẫu mRNA hồn thiện nên các dịng cDNA
có thể tổng hợp protein cần thiết với số lượng lớn như mong
muốn.
Nhiều protein được tổng hợp với số lượng lớn bởi những tế bào
</div>
<span class='text_page_counter'>(26)</span><div class='page_container' data-page=26>
II.Những thành tựu đã đạt đựơc
Các nhà khoa học thuộc CIAT, Colombia và Nhật
Bản đã hòan thành việc xây dựng thư viện cDNA có
chiều dài phân tử đầy đủ, dưới điều kiện bình thường,
nóng, khơ hạn, độ độc nhơm, và những điều kiện sau
thu họach làm tổn hại đến sinh lý cây trồng
Bản chất di truyền của genome khoai mì khá phức
tạp với chu kỳ sinh trưởng dài, do đó việc cải tiến
</div>
<span class='text_page_counter'>(27)</span><div class='page_container' data-page=27>
Áp dụng công nghệ sinh học để cải tiến giống khoai mì là một
chiến lược năng động. Kiến thức cơ bản về các gen điều khiển
chống chịu stress sẽ vô cùng cần thiết khi tiếp cận với cơng nghệ
sinh học, thí dụ như chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) và
chuyển nạp gen.
Thư viện cDNA của khoai mì là tiềm năng phục vụ cho các nhà
</div>
<span class='text_page_counter'>(28)</span><div class='page_container' data-page=28>
Thành tựu ở nuớc ta
Viện di truyền nông nghiệp Việt Nam:
</div>
<span class='text_page_counter'>(29)</span><div class='page_container' data-page=29>
Tách dòng tổng cộng được 184 dòng gen hoạt động mạnh trong
điều kiện cực đoan; giải mã trình tự ADN và xác định trình tự axit
amin của 41 dịng gen hoạt động mạnh. Ngồi ra kết quả đối chiếu
với Ngân hàng gen cho thấy tất cả 41 dịng gen trên đều có vị trí
xác định trên các clone genomic, BAC và PAC, trong đó có nhiều
dịng gen có độ đồng nhất cao (trên 90%) với các clone cDNA của
Ngân hàng Gen đã biết rõ chức năng.
Đã xác định được 4 dịng gen “kháng đạo ơn”, 2 dòng gen
</div>
<!--links-->
