Nghiên cứu nhân giống cây sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro (Luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

DƯƠNG THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY SÓI RỪNG
(Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai)
BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SĨ
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên – 2020


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

DƯƠNG THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY SÓI RỪNG
(Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai)
BẰNG KỸ THUẬT NI CẤY IN VITRO
Ngành : Cơng nghệ sinh học
Mã số ngành: 8.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. TRẦN THỊ THU HÀ
2. TS. NGUYỄN XUÂN VŨ

Thái Nguyên - 2020


i
LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu nhân
giống cây Sói rừng (Sarcandra glabra (thunb.) Nakai) bằng kỹ thuật ni cấy in
vitro” là trung thực, được thực hiện tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp Đại học Nông lâm - Đại học Thái Nguyên. Ngoài ra, trong bài báo cáo có sử dụng
một số nguồn tài liệu tham khảo đã được trích dẫn rõ ràng và được phép cơng bố.
Em xin hồn tồn chịu trách nhiệm về tính trung thực của các nội dung trong đề
tài của mình.
Học viên


ii
LỜI CẢM ƠN
Trong q trình học tập và hồn thành luận văn tốt nghiệp, em đã nhận được
sự giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và các cá nhân.
Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến giáo viên hướng dẫn
PGS.TS. Trần Thị Thu Hà và TS. Nguyễn Xuân Vũ đã ln tận tình hướng dẫn,
giúp đỡ em trong suốt q trình thực hiện và hồn thành luận văn này.
Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp
cùng các cán bộ, quý đồng nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề
tài nghiên cứu này.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình,
người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và
thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2020
Học Viên


iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ..........................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. ii
MỤC LỤC .................................................................................................................. iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .............................................................................vi
DANH MỤC BẢNG.................................................................................................. vii
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. viii
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................1
1. Đặt vấn đề .................................................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................................2
Chương 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................3
1.1. Giới thiệu về Chi Sói rừng và lồi cây Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.)
Nakai) ............................................................................................................................3
1.1.1.Phân loại, phân bố ................................................................................................ 3
1.1.2. Đặc điểm thực vật học ........................................................................................3
1.1.3. Giá trị của cây Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) .............................. 4
1.2. Cơ sở việc định danh loài và xác định quan hệ di truyển ......................................5
1.3. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng.....................................................7
1.3.1. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng trên thế giới ............................. 7
1.3.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng ở nước ta .................................8
1.4. Cơ sở phương pháp nhân giống in vitro (vi nhân giống).......................................9
1.4.1. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ..................................10
1.4.2. Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................ 10
1.4.3. Các phương pháp nuôi cấy mô .........................................................................10
1.4.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô thực vật ..............................................11

1.4.5. Các giai đoạn trong nhân giống invitro ............................................................ 15
Chương 2.ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........18
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .......................................................................18
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................18


iv
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu ..........................................................................................18
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................ 18
2.3. Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................18
2.3.1. Điều tra đánh giá thực trạng phân bố và thu thập mẫu nghiên cứu ..................18
2.3.2. Phương pháp nhận dạng mẫu nguồn gen cây Sói rừng bằng đặc điểm
hình thái ......................................................................................................................21
2.3.3. Phương pháp nhận dạng mẫu nguồn gen cây Sói rừng bằng chỉ thị DNA .......22
2.3.4. Phương pháp nhân giống in vitro cây Sói rừng ................................................25
2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................28
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................................................29
3.1. Điều tra, đánh giá thực trạng phân bố, giá trị sử dụng của của lồi
Sói rừng và thu thập mẫu. ........................................................................................... 29
3.2. Kết quả nhận dạng mẫu nguồn gen cây Sói rừng bằng đặc điểm hình thái .........34
3.2.1. Đặc điểm mẫu cây Sói rừng thu thập được tại huyện Xín Mần .......................34
3.2.2. Đặc điểm mẫu cây Sói rừng thu thập được tại huyện Mèo Vạc .......................35
3.2.3. Đặc điểm mẫu cây Sói rừng thu thập được tại huyện Quản Bạ ........................36
3.2.4. Đặc điểm mẫu cây Sói rừng thu thập được tại huyện Hồng Su Phì ...............37
3.2.5. Đặc điểm mẫu cây Sói rừng thu thập được tại huyện Vị Xuyên ......................38
3.3. Kết quả nhận dạng mẫu nguồn gen cây Sói rừng bằng chị thị DNA...................40
3.3.1. kết quả tách chiết DNA tổng số của mẫu Sói rừng nghiên cứu ........................40
3.3.2. Kết quả PCR của mẫu Sói rừng nghiên cứu .....................................................41
3.3.3. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rDNA của mẫu Sói rừng nghiên cứu ..............42
3.3.4. Kết quả phân tích đa dạng di truyền, xác định mối quan hệ di truyền giữa 15

mẫu Sói rừng nghiên cứu ............................................................................................ 43
3.4. Kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro cây Sói rừng .........................................45
3.4.1. Chọn vật liệu khởi đầu ......................................................................................45
3.4.2. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến khả năng
tạo mẫu vô trùng .........................................................................................................45
3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng
nhân nhanh chồi Sói rừng ........................................................................................... 47


v
3.4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh đến
khả năng ra rễ chồi Sói rừng .......................................................................................55
3.4.5. Nghiên cứu đưa cây ra nhà kính .......................................................................58
3.4.6. Chăm sóc cây giai đoạn in vitro..........................................................................6
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................64
1.Kết luận ....................................................................................................................64
2. Kiến nghị .................................................................................................................65
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................66


vi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ, thuật

Nghĩa đầy đủ của từ, thuật ngữ

ngữ viết tắt (Cả tiếng anh và tiếng việt)
DNA

Deoxyribonucleic acid

PCR

Plolemerase Chain reaction

SR

Sói rừng

Cs

Cộng sự

IAA

Indole - 3- acetic acid

NAA

Naphthylacetic acid

BAP

Benzylaminopurine

IBA

Indo – 3 – butyric acid

MS

Murashige Skoog

CT

Công thức

LSD

Least Singnificant Difference Test – Sai khác nhỏ nhất có ý nghĩa

CV

Coeficient of Variation – Hệ số biến động


vii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Đặc điểm phân bố Sói rừng theo tuyến điều tra .........................................31
Bảng 3.2. Đặc điểm mẫu thu thập ...............................................................................33
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái các mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Xín Mần ...........34
Bảng 3.4. Đặc điểm hình thái các mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Mèo Vạc ...........35
Bảng 3.5. Đặc điểm hình thái các mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Quản Bạ ...........36
Bảng 3.6. Đặc điểm hình thái các mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Hồng Su Phì ...37
Bảng 3.7. Đặc điểm hình thái các mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Vị Xuyên ..........38
Bảng 3.8. Danh sách 15 mẫu lá Sói rừng trong nghiên cứu .......................................40
Bảng 3.9. Độ dài trình tự của 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu .......................................42
Bảng 3.10: Hệ số tương đồng di truyền giữa 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu và 2 mẫu
tham chiếu ...................................................................................................................44

Bảng 3.11. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1%
đến khả năng tạo mẫu vô trùng (sau 4 tuần nuôi cấy) ................................................46
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi
Sói rừng (sau 4 tuần ni cấy) ....................................................................................48
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kinetin đến hệ số nhân chồi
sau 4 tuần nuôi cấy (sau 4 tuần nuôi cấy) ...................................................................50
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kinetin với NAA đến
hệ số nhận chồi (sau 4 tuần nuôi cấy) .........................................................................52
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP, Kinetin với IBA đến hệ số nhận chồi
sau 4 tuần nuôi cấy ......................................................................................................54
Bảng 3.16. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của
chồi Sói rừng ...............................................................................................................56
Bảng 3.17. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ của chồi
Sói rừng .......................................................................................................................57
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây Sói rừng
in vitro sau 8 tuần theo dõi ..........................................................................................59


viii
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây Sói rừng .................................................................................................3
Hình 3.1. Mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Xín Mần .................................................35
Hình 3.2. Mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Mèo Vạc .................................................36
Hình 3.3. Mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Quản Bạ .................................................37
Hình 3.4. Mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Hồng Su Phì .........................................38
Hình 3.5. Mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Vị Xuyên ................................................39
Hình 3.6. kết quả tách chiết DNA tổng số của 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu .............41
Hình 3.7. Kết quả PCR của 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu với cặp mồi
ITS4/ITS5; M: Marker generuler 1kb plus DNA .......................................................42
Hình 3.8. Cây phát sinh chủng loại của 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu với mẫu tham

chiếu MH270480.1 Chloranthus erectus và KP317601.1 Sarcandra glabra ..............44
Hình 3.9. Kết quả khử trùng mẫu đoạn thân Sói rừng bằng HgCl2 0,1% .................47
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi cây Sói rừng.............49
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với Kinetin đến hệ số nhân chồi
cây Sói rừng ................................................................................................................51
Hình 3.12. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kinetin với NAA đến đến hệ số nhận chồi
cây chồi Sói rừng ........................................................................................................53
Hình 3.13. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kinetin với IBA đến khả năng nhân
nhanh chồi Sói rừng ....................................................................................................55
Hình 3.14. Ảnh hưởng của NAA đến kết quả ra rễ chồi Sói rừng.............................. 57
Hình 3.15. Ảnh hưởng của IBA đến kết quả ra rễ chồi Sói rừng ............................... 58
Hình 3.16. Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây Sói rừng ........59
Hình 3.17. Sói rừng giai đoạn sau in vitro ....................................................................8


1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cây Sói Rừng cịn gọi là cây sói nhẵn, cây cửu tiết trà, cây thảo san hô, cây
quan âm trà, cây tiếp cốt mộc, cây cửu tiết phong, cây cửu tiết lan, cây sơn hồ tiêu,
cây cốt thuộc họ Hoa sói (Chloranthaceae). Sói Rừng là loại cây giàu dược tính nên
được khai thác để sử dụng làm thuốc chữa trị nhiều bệnh. Đông y cho rằng, cây sói
rừng có vị đắng, cay, tính hơi ấm. Có tác dụng kháng khuẩn tiêu viêm, khu phong trừ
thấp, hoạt huyết chỉ thống. Chủ trị viêm phổi, viêm phế quản, viêm ruột thừa cấp
tính, viêm dạ dày ruột cấp tính, nhiễm khuẩn, phong thấp đau nhức, đòn ngã tổn
thương, gãy xương...Trong dân gian, thường dùng rễ cây này ngâm rượu uống để
chữa tức ngực, đau nhức xương khớp; còn dùng tồn cây sắc uống trị cảm mạo, kinh
nguyệt khơng đều và viêm phổi. Lá sắc uống trị ho, giã đắp chữa rắn cắn.
Cây Sói rừng phân bố ở nhiều nước như Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản,
Ấn Độ, Việt Nam và Malaysia. Ở Việt Nam, cây Sói rừng mọc hoang ở khắp nơi,

những khu vực đất ẩm ướt, mát, hốc đất trên núi đá. Sói rừng phân bố ở các tỉnh như
Hà Giang, Yên Bái, Phú Thọ, Bắc Kạn, ...
Điển hình ở Hà Giang có trên 1.100 lồi cây dược liệu trong tổng số hơn 5000
loài cây dược liệu của cả nước; được đánh giá là vùng trọng điểm về đa dạng cây
dược liệu quý, có giá trị kinh tế cao và là vùng trọng điểm của nước ta để phát triển
cây dược liệu gắn với phát triển du lịch sinh thái vùng cao. Hà Giang có điều kiện tự
nhiên, sinh thái rất thuận lợi cho sinh trưởng và phát triển nhiều loại cây dược liệu
trong đó có cây Sói rừng, đặc biệt trong sản xuất giống, bảo tồn và sản xuất các loài
dược liệu quý hiếm.
Tuy nhiên, hiện nay các loài cây thuốc quý đang bị khai thác cạn kiệt và nhiều
lồi đứng trước nguy cơ tuyệt chủng. Vì vậy, việc nghiên cứu, bảo tồn và phát triển
các loài cây dược liệu, đặc biệt là các loài dược liệu quý, có giá trị kinh tế cao đã và
đang được tỉnh Hà Giang xem là nhiệm vụ trọng tâm và cấp bách theo Kết luận số
71-KL/TW ngày 24/9/2014 của Ban Bí thư Trung ương và triển khai mục tiêu phát
triển bền vững nguồn tài nguyên dược liệu của tỉnh và vùng Tây Bắc. Ở nước ta công
tác bảo tồn các loài cây dược liệu chưa thực sự gắn với phát triển. Để phát triển, công


2
tác chọn tạo giống, công nghệ nhân và nuôi trồng giống tốt cung cấp nguyên liệu
chất lượng cần được quan tâm. Chính vì vậy, việc cải tiến áp dụng cơng nghệ trong
bảo tồn, nhân giống là một giải pháp hữu hiệu giải quyết vấn đề về phát triển dược
liệu hiện nay. Theo báo cáo của hầu hết các tỉnh ở vùng núi phía Bắc, việc bảo tồn và
phát triển các lồi cây dược liệu tại địa phương cịn nhiều hạn chế từ giống cho đến
trồng và thu hoạch. Giống sử dụng không rõ nguồn gốc, giống tạp, chất lượng chưa
cao, nhân giống bằng phương pháp truyền thống nên giống không được đảm bảo cả
số lượng và chất lượng. Từ những lý do đó tơi thực hiện nghiên cứu "Nghiên cứu
nhân giống cây Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) bằng kỹ thuật nuôi
cấy in vitro” làm cơ sở khoa học cho cơng tác bảo tồn và phát triển lồi cây Sói rừng
của tỉnh Hà Giang.

2. Mục tiêu nghiên cứu
* Mục tiêu chung
Xây dựng quy trình nhân giống cây Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.)
Nakai) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào.
* Mục tiêu cụ thể
- Điều tra, đánh giá, thu thập mâu nghiên cứu
- Nhận dạng được lồi cây Sói rừng bằng đặc điểm hình thái
- Nhận dạng được đúng lồi cây Sói rừng bằng chỉ thị DNA
- Nghiên cứu được chất khử trùng và thời gian khử trùng cho tỷ lệ mẫu vơ trùng cao
- Nghiên cứu được chất kích thích sinh trưởng phù hợp đến khả năng nhân nhanh
chồi cây Sói rừng
- Nghiên cứu được chất kích thích sinh trưởng (NAA, IBA) cho giai đoạn ra rễ
chồi cây Sói rừng
- Nghiên cứu được loại giá thể phù hợp cho cây Sói rừng giai đoạn sau in vitro
3. Địa điểm nghiên cứu
- Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp –
Đại học Nông lâm Thái Nguyên


3
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về Chi Sói rừng và lồi cây Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.)
Nakai)
1.1.1.Phân loại, phân bố
Sói rừng có tên khoa học là: Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai. Giới: Plantae;
Bộ: Chloranthales; Họ: Chloranthaceae; Chi: Sarcandra; Loài: Glabra (Đỗ Huy
Bích, 2011) [3].
Ngồi ra cịn có tên khác như: Chloranthus brachystachys Blum, Chlorathus

glaber (Thunb.) makino, Sarcandra Chloranthus Gardeno, thuộc họ Hoa sói
Chloranthaceae. Ở Việt Nam cây Sói rừng cịn có một số tên gọi khác như: sói lãng,
sói nhẵn, cửu tiết kim túc lan, cửu tiết trà, cửu tiết phong, trúc tiết trà, tiếp cốt liên,
thảo sách hồ, tiếp cốt mộc (Võ Văn Chi, 2012) [4].
Cây Sói rừng phân bố ở nhiều nước: Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Ấn
Độ, Việt Nam và Malaysia. Ở Việt Nam cây mọc từ Hà Giang (Vị Xuyên), Sơn La
(Mộc Châu), Cao Bằng (Thạch An, Nguyên Bình, Tĩnh Túc), Lạng Sơn (Hữu Lũng,
Bắc Sơn), Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Nội (Hà Tây), Thừa Thiên Huế, Kom Tum
(Đác lây, KonPlong), Lâm Đồng (Đà Lạt, Bảo Lộc) (Võ Văn Chi, 1996) [5].
1.1.2. Đặc điểm thực vật học

Hình 1.1. Cây Sói rừng


4
Cây Sói rừng có chiều cao 1 - 2 mét, thân nhẵn, các mấu hơi phồng. Nhánh
cây trịn, khơng có lơng, các lá mọc đối, phiến dài hình bầu dục hay hình ngọn giáo,
chiều dài 7 - 20 cm và rộng 2 - 8 cm với 5 - 7 cặp gân bên. Mép lá có răng cưa nhọn
và thơ. Cuống lá dài 5 - 8 mm. Bơng kép, ít nhánh, nhánh ngắn với hoa nhỏ màu
trắng khơng có cuống và có một nhị. Bầu nhụy có hình trứng và khơng có vịi. Cây
ra quả mọng nhỏ, hình gần trịn đường kính 3 - 4 mm, khi chín có màu đỏ hay đỏ
gạch. Cây ra hoa vào tháng 6 - 7 và quả chín vào tháng 8 - 9. Sói rừng mọc hoang ở
vùng núi đất, ở rìa rừng và ven đồi ẩm nhiều nơi và lên đến độ cao 1000m. Thu hái
tồn cây vào mùa hạ thu, có thể dùng tươi hoặc phơi khô (Võ Văn Chi, 1997) [5].
1.1.3. Giá trị của cây Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai)
1.1.3.1. Giá trị kinh tế
Sói rừng là cây dược liệu có hiệu quả kinh tế cao đang thu hái ở nhiều tỉnh
miền núi nước ta.
1.1.3.2. Giá trị dược liệu
Theo Đông y, cây Sói rừng có vị đắng, tính hơi ấm, có tác dụng hoạt huyết

giảm đau, khử phong trừ thấp, tiêu viêm giải độc. Trong dân gian, rễ cây được ngâm
rượu, uống chữa đau tức ngực. Lá được sắc uống hỗ trợ trị bệnh lao, hoặc giã đắp hỗ
trợ trị rắn cắn, ngâm rượu xoa bóp hỗ trợ trị vết thương, mụn nhọt, phong thấp, đau
nhức xương. Theo Perrot và Hurrier (1906), tồn bộ cây sói rừng cũng được dùng để
hỗ trợ điều trị bệnh động kinh.
Kết quả nghiên cứu hiện đại cho thấy, sói rừng có tác dụng ức chế đối với tụ
cầu khuẩn vàng staphylococcus aureus, trực khuẩn lỵ, trực khuẩn bacillus coli, trực
khuẩn mủ xanh bacillus pyocyaneus; trực khuẩhn thương hàns… Lá có tác dụng
kháng khuẩn mạnh nhất; rễ và cành tươi có tác dụng mạnh hơn rễ và cành khô.
Hỗ trợ điều trị ho, suy nhược, viêm khớp, đau nhức xương, nắn bó gẫy xương
làm giảm u bướu, giảm ứ đọng máu, cải thiện chức năng tuyến tụy, hỗ trợ trị đau dạ
dầy. Tồn cây Hoa sói rừng có cả tác dụng chống ung thư, lẫn tác dụng kháng khuẩn,
nên dùng để hỗ trợ trị ung thư có biến chứng nhiễm khuẩn rất tốt. Đã thấy có hiệu
quả tốt hơn đối với các loại ung thư dạ dầy, ung thư gan, ung thư tuyến tụy, ung thư
thực quản, bệnh bạch cầu và sarcom lưới dòng lympho (Mai Hải Yến, 2010) [15].
Cây Sói rừng cũng có tác dụng mạnh chống lại ơxi hóa, giúp giải nhiệt, tiêu
độc, làm tăng sự sản xuất các tiểu cầu trong máu (từ đó giúp tiêu trừ các huyết khối),


5
tăng tuần hồn máu và chống viêm. Cũng có các tài liệu cho rằng S. glabra giúp
giảm mệt mỏi trong điều trị ung thư và được đề xuất sử dụng như một giải pháp thay
thế trong điều trị, nhưng chưa có thử nghiệm nào chứng thực điều này.
Sói rừng được sử dụng như một tác nhân dự phịng hóa học, trên bệnh nhân
điều trị bằng tác nhân hóa trị liệu, do có cả 2 tác dụng tăng cường miễn dịch và ức
chế phát triển của tế bào ung thư. Nước sắc tồn cây sói rừng có tác dụng thực bào,
một dạng của tác dụng chống ung thư, nhưng tinh dầu của sói rừng, lại có tác dụng
ức chế thực bào, giống như tác dụng khơng mong muốn của cyclophosphamid, vì
vậy trước khi sử dụng sói rừng, nên đun sơi thật kỹ, để loại bỏ tinh dầu. isoilaxidin
chiết xuất từ cây sói rừng, có tác dụng ức chế manh bệnh bạch cầu dịng lympho.

Một số cách sử dụng cây Sói rừng:
Hỗ trợ phịng cảm mạo: Dùng sói rừng 10 – 15g, mùa đơng thêm tía tơ 6g, mùa
hè thêm kim ngân hoa 6g, sắc nước uống thay trà trong ngày.
Hỗ trợ điều trị các chứng viêm nhiễm (có tác dụng chống viêm rất tốt): Mỗi
ngày dùng 30 - 40g cành lá sói rừng tươi, sắc lấy nước, chia 3 lần uống, liên tục 2 - 3
ngày hoặc có thể kéo dài ngày hơn.
Hỗ trợ điều trị đau lưng: Dùng cành lá sói rừng 10 - 15g, sắc với nửa rượu nửa
nước, chia ra uống trong ngày.
Hỗ trợ điều trị đòn ngã tổn thương, gãy xương, viêm khớp xương do phong
thấp: Dùng cây tươi, giã nát, sao rượu, đắp; hoặc dùng 15-30g rễ sắc với nước hoặc
ngâm rượu uống.
Hỗ trợ điều trị ngoại thương xuất huyết: Dùng cây tươi, giã nát, đắp; hoặc dùng
15 - 30g rễ, ngâm rượu uống.
Hỗ trợ điều trị vết thương loét, không liền miệng: Dùng cành lá, lượng thích
hợp, nấu nước rửa, ngày 1- 2 lần.
Hỗ trợ điều trị bỏng: Dùng lá sói rừng, phơi khơ, tán mịn, trộn thêm 2 phần dầu hạt
sở hoặc dầu vừng; hàng ngày bôi vào chỗ bị bỏng.
1.2. Cơ sở việc định danh lồi và xác định quan hệ di truyển
Có nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau trong phân loại và xác định loài
ở động, thực vật và hầu hết các phương pháp này đều dựa trên nguyên tắc như những
lồi có chung nguồn gốc, có những tính chất giống nhau, càng gần nhau thì tính chất


6
giống nhau càng nhiều. Sự giống nhau có thể về đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh
lý sinh hố, phơi sinh học. Đối với thực vật, đặc điểm hình thái học của các lồi thực
vật qua nhận biết hình thái lá, hoa, quả, cách thức phân cành…có ưu điểm dễ quan
sát trực tiếp bằng trực quan nhưng chỉ dựa vào thống kê phân tích một hoặc nhiều
tính trạng được thể hiện ra bên ngoài nên hiệu quả thấp. Điều này thật sự gặp nhiều
khó khăn khi các mẫu vật cần giám định khơng cịn ngun vẹn, mất hình thái bên

ngồi. Do vậy, việc định danh dựa trên quan sát hình thái và kinh nghiệm dân gian sẽ
được hỗ trợ chính xác hơn nếu sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại.
Các phương pháp phân loại học phân tử và xác định loài là hướng nghiên cứu
được phát triển mạnh trên thế giới hiện nay, được xây dựng dựa trên việc nhận biết
thành phần và cấu trúc của các gen đặc hữu của các taxon sinh vật. Hiện nay, các kỹ
thuật dựa trên phân tích DNA là phương pháp có hiệu quả cao trong việc định loại và
giám định lồi.
Phân loại học phân tử có thể dựa trên sự nghiên cứu các gen trong hệ gen
nhân, hệ gen của các bào quan như ti thể, lục lạp hoặc các sản phẩm của gen như
protein, enzyme. Mỗi loại gen, sản phẩm của gen lại phù hợp với từng đối tượng và
mục đích nghiên cứu khác nhau. Do đó, việc lựa chọn gen nào, loại protein nào có ý
nghĩa lớn đối với sự thành công của mỗi hướng nghiên cứu. Các kỹ thuật thường
được sử dụng bao gồm: kỹ thuật isozym (đồng enzyme), các kỹ thuật phân tích so
sánh trình tự nucleotide các đoạn DNA như phương pháp đa hình chiều dài các đoạn
cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP), các kỹ thuật trên
cơ sở phản ứng PCR như SSR (Simple Sequence Repeats), đa hình các đoạn DNA
nhân bản ngẫu nhiên - RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA) (Harvey và
cộng sự, 1996; Roman và cộng sự, 2003), đa hình chiều dài các đoạn DNA nhân bản
- AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), phân tích trình tự DNA …
(Phạm Hồng Sơn, 2006; Lê Duy Thành và cộng sự, 2005) đã giúp giải quyết các mối
nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, quan hệ
chủng loại và tiến hố của nhiều lồi động, thực vật và vi sinh vật. Thêm vào đó
các kỹ thuật này cũng được sử dụng như những chỉ thị phân tử để xác định những
gen kiểm soát hoặc có liên quan đến tính trạng nào đó của các cá thể, lồi hay các
nhóm lồi [12], [13], [25].


7
Gần đây, việc sử dụng các DNA mã vạch (DNA barcode) để định danh loài
đang được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu và có những đóng góp

đáng kể trong việc phân loại lồi. Để nhận dạng gen hay đánh giá mức độ tiến hố
lồi thì các nhóm gen chính thường được sử dụng là gen ribosome rRNA, gen ty thể,
và gen lục lạp (thực vật) trong đó gen rRNA 18S, 5S và 16S hay được dùng để đánh
giá mối quan hệ tiến hoá giữa các sinh vật. So với chỉ thị hình thái và chỉ thị hố học,
chỉ thị DNA cho độ chính xác cao hơn mà không lệ thuộc vào bất cứ yếu tố khách
quan nào.
Quá trình tìm kiếm một chỉ thị DNA chung cho các lồi thực vật gặp nhiều
khó khăn. Ở thực vật hệ gen lục lạp mang nhiều đặc điểm thích hợp đối với chỉ thị
DNA và hệ gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi ITS (Internal
Transcribed Spacer) thường được sử dụng làm DNA chỉ thị trong một số nghiên cứu
(Borsch và cộng sự, 2003; Shaw và cộng sự, 2007; Van và cộng sự, 2000) [16].
Trong nhiều năm gần đây, nhiều vùng gen đã được nghiên cứu và đề xuất là chỉ
thị DNA cho thực vật. Tuy nhiên chưa có chỉ thị DNA nào được đa phần các nhà
phân loại học thực vật hoàn toàn chấp nhận. Mặc dù vậy, các nhà nghiên cứu cũng
đã đi tới một quan điểm thống nhất là sẽ cần không chỉ một mà nhiều vùng DNA
chỉ thị để định danh loài đối với thực vật (Chase và cộng sự, 2005; Kress và cộng
sự, 2008) [17].
1.3. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng
1.3.1. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng trên thế giới
Sói rừng có thể được nhân giống hữu tính bằng hạt, hoặc vơ tính bằng giâm
hom, nuôi cấy mô tế bào. Ở Trung Quốc, S. glabra được nhân giống bằng giâm
hom. Cây 2 năm tuổi cho tỷ lệ hom ra rễ đạt 88,7% sử dụng hom nhúng vào dung
dịch 200mg/L ABT-1 trong 30 phút (Qiu, 2012; Zhu et al., 2010); 82% khi xử lý
với dung dịch 200mg/L IBA (Liu et al., 2008) [24].
Ở Trung Quốc, cây được dùng để chữa một số bệnh ung thư: ung thư tụy, dạ
dày, trực tràng, gan, lỵ, gãy xương, thấp khớp, đau lưng, cảm mạo, kinh nguyệt
không đều, hoa được dùng để ướp trà. Các nhà khoa học Trung Quốc, Mỹ, Nhật
Bản kết luận rằng thành phần hóa học chủ yếu của cây Sói rừng là: sesquiterpen

8
lactose, curmarin, flavonoid (Collons, 1992). Hiện các tài liệu tìm thấy về cây Sói
rừng chỉ tập trung nghiên cứu về các hoạt chất hóa học của lồi trong hỗ trợ điều trị
bệnh. Kang et al., (2008) đã nghiên cứu tác dụng ức chế khối u của dịch chiết S.
glabra và gây chết tế bào gây ung thư biểu mô mũi - họng ở người. Kết quả cho thấy
dịch chiết Sói rừng ngăn cản sự phát triển khối u in vivo [22].
Zhu et al., (2010) đã nghiên cứu tạo rễ in vitro trên mơi trường MS, kết quả
NAA khơng có tác dụng cải thiện ra rễ. Môi trường tốt nhất cho ra rễ là 1/2MS+IBA
0.2 mg/L+sucrose30 g/L hoặc 1/4 MS+IBA 0.2 mg/L+sucrose 30 g/L[29].
Li et al., (2008) đã nhân giống in vitro cây Sói rừng trên mơi trường MS, 80
% chồi phát sinh trên môi trường MS+BA 1.0 mg/L. Môi trường cấy chuyển là MS +
BA 2.0 mg/L +NAA0 3 mg/L cho hệ số nhân chồi là 6.2. Môi trường tốt nhất cho ra
rễ là 1/2 MS+NAA 1.0 mg/L với tỷ lệ 100 %.
Zhu et al., (2007) đã thu được mẫu cấy vô trùng bằng cách nhúng mẫu trong
cồn 75% trong 30 giây, sau đó bằng HgCl2 0.1% trong 10 phút. Tiếp đó rửa bằng
nước vơ trùng và nhúng vào dung dịch 120 mg/l rifampicin trong 4 ngày; Cuối cùng
mẫu được nhúng vào HgCl2 0.1% và rửa bằng nước vô trùng và cấy vào mơi trường
tái sinh chồi [31].
1.3.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng ở nước ta
Mai Hồng Oanh (2016) đã nghiên cứu mẫu Sói rừng thu nhận từ Lạng Sơn,
tách chiết và tinh sạch được DNA tổng số. Nhân bản thành công hai vùng gen ITS và
rpoC1 bằng phương pháp PCR và tạo dịng thành cơng hai gen nhân bản được, đã
xác định được trình tự nucleotide của 2 đoạn gen rpoC1 và ITS [9].
Bùi Văn Trọng và cs (2014) đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều
hịa sinh trưởng tới sự hình thành rễ của hom cây Sói rừng (Sarcandra glaba
(Thunb.) Nakai.) tại Lâm Đồng. Nhóm tác giả đã sử dụng NAA ở nồng độ 1% cho
kết quả giâm hom Sói rừng tốt nhất đạt 86.67%, hom sống và ra rễ, số lượng rễ trung
bình là 5.08 rễ/hom, chiều dài rễ trung bình là 3,68 cm so với đối chứng (66,67%;
3,9; 3,65 cm, tương ứng) [10].

9
Le Hong En et al., (2016) đã nghiên cứu nhân giống Sói rừng bằng giâm hom.
Tác giả đã sử dụng IBA, IAA, NAA để nghiên cứu tác dụng của chất kích thích ra rễ.
Nồng độ IBA 1-1,5% cho ra rễ tốt nhất. Hom bánh tẻ cho ra rễ tốt hơn các loại hom khác.
Nguyễn Quỳnh Anh (2013), đã Nghiên cứu ứng dụng cây Sói rừng ở Cao Bằng
để hỗ trợ điều trị một số bệnh ung thư. Tác giả đã nghiên cứu quy trình bào chế và
dạng bào chế thành phẩm từ cây Sói rừng. Sau 3 năm nghiên cứu đề tài đã đạt được mục
tiêu đề ra, kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học, một số hoạt tính sinh học, độc tính
và tác dụng điều trị ung thư trên động vật thực nghiệm của bột và lá cây Sói rừng
Sarcandra glabra (Thunb) Nakai, thu hái ở vùng rừng núi xã Bạch Đằng, huyện Hòa An
tỉnh Cao Bằng. Kết quả nghiên cứu đã đưa ra được quy trình Nghiên cứu làm viên tế;
Nghiên cứu làm dạng thuốc bột (thuốc tán); Nghiên cứu làm dạng cao thuốc (cao
nước) [1].
1.4. Cơ sở phương pháp nhân giống in vitro (vi nhân giống)
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các q trình ni cấy
từ ngun liệu thực vật trên môi trường nhân tạo trong điều kiện vơ trùng.
Nhân giống in vitro hay cịn gọi là vi nhân giống thường sử dụng cho việc ứng dụng
các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, sử dụng các bộ phận khác nhau của
thực vật với kích thước nhỏ (Nguyễn Quang Thạch, 2009) [11].
Trong thực tế, các nhà vi nhân giống thường dùng thuật ngữ nuôi cấy mô và
nhân giống in vitro hay nuôi cấy in vitro thay thế cho nhau để chỉ các phương thức
nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng với các mục đích khác nhau. Ngun lý
cơ bản của ni cấy mơ là tính tồn năng của tế bào (Totipotency). Gottlieb
Haberlandt (1902) nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng đầu tiên cho ni cấy
mơ - tế bào thực vật. Ơng đưa ra giả thuyết về tính tồn năng của tế bào trong cuốn
sách “Thực nghiệm về nuôi cấy tế bào tách rời”. Theo ông, mỗi tế bào bất kỳ của cơ
thể sinh vật nào đều mang toàn bộ lượng thơng tin di truyền của cơ thể đó và có khả
năng phát triển thành cơ thể hồn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi (Nguyễn Quang
Thạch, 2009).

10
1.4.1. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Q trình ni cấy mơ tế bào thực vật có những ưu điểm sau (Dương Cơng
Kiên, 2006):
- Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp từ 1
cây sau khi được nuôi cấy từ 1 – 2 năm có thể tạo ra hàng triệu cây.
- Sản phẩm cây đồng nhất: Tạo ra quần thể có độ đều cao dù xuất phát từ cây
mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp.
- Tiết kiệm khơng gian: Khơng phụ thuộc vào thời tiết bên ngồi và các vật
liệu khởi đầu có kích thước nhỏ. Mật độ cây tạo trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất
nhiều so với sản xuất truyền thống trên đồng ruộng.
- Lợi thế về vận chuyển: Cây con có kích thước nhỏ, vì vậy có thể vận chuyển
đi xa dễ dàng và thuận lợi.
- Sản xuất được quanh năm: Qúa trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kỳ
thời gian nào, không phụ thuộc mùa vụ.
1.4.2. Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
- Chi phí sản xuất cao: chi phí hóa chất, trang thiết bị hiện đại, tiêu tốn nhiều
năng lượng,….nên giá thành sản xuất con giống cao so với các phương pháp truyền
thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt.
- Chất lượng cây giống có thể bị biến dị: cây con ni cấy có thể sai khác với
cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma.
1.4.3. Một số phương pháp nuôi cấy mô
Các phương pháp thường được áp dụng phổ biến như sau (Nguyễn Như
Khanh, 2011, Vũ Văn vụ, 2009) [14]:
- Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Trong nuôi cấy mô, một phương thức đơn giản và thường hay được sử dụng
để tái sinh chồi invitro là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
Trên thực tế người ta thường nuôi cấy đỉnh chồi non với kích thước khoảng

vài mm. Đó có thể đỉnh chồi ngọn hoặc đỉnh chồi nách, mỗi đỉnh sinh trưởng ni
cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo ra một hay nhiều chồi và mỗi chồi sẽ phát triển
thành cây hoàn chỉnh.


11
- Nuôi cấy mô sẹo
Mô sẹo là một khối tế bào vơ tổ chức, hình thành từ các mơ hoặc cơ quan đã
phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý bằng các chất điều hòa sinh
trưởng thực vật…) Mẫu cấy ban đầu để tạo mô sẹo có thể lấy từ cây con vơ trùng
trong ống nghiệm, rẽ, thân, lá của cây bên ngồi đã được vơ trùng. Mô sẹo là nguyên
liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng như: nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôi soma.
- Nuôi cấy bao phấn và túi phấn
Nuôi cấy bao phấn và túi phấn tạo cây đơn bội là sự cảm ứng phát sinh phôi từ
những lần phân chia lặp lại của các bào tử đơn bội, các tiểu bao tử, các hạt phấn non.
- Nuôi cấy tế bào đơn
Tế bào đơn có thể ghi nhận bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lý bằng
enzyme. Mỗi loại cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy
khác nhau.
Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc tế bào, nghiên cứu
ảnh hưởng của các điều kiện khác nhau lên quá trình sinh trưởng, phát triển và phân
hóa của tế bào.
1.4.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô thực vật [11],[14]
* Vật liệu nuôi cấy
Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào thực
vật. Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quan hay
bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá), các cấu trúc của phôi (lá mầm, trụ lá
mầm…), các cơ quan dự trữ (củ, thân rễ…).
Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mô khác nhau
trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong q trình ni cấy, vì

vậy việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh lý và tuổi của
mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu, mục đích và khả năng
nuôi cấy.
Mẫu nuôi cấy trước khi đưa vào nuôi cấy phải được vô trùng. Phương pháp
phổ biến nhất trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hóa chất có khả năng tiêu
diệt vi sinh vật. Hóa chất được lựa chọn để vô trùng mẫu phải đảm bảo 2 điều kiện:
Có khả năng tiêu diệt vi sinh vật tốt và khơng hoặc ít độc đối với mẫu. Hiệu quả vô


12
trùng tùy thuộc vào thời gian, nồng độ và khả năng xâm nhập để tiêu diệt vi sinh vật
của hóa chất. Một số hóa chất thường được sử dụng hiện nay để vô trùng mẫu là:
Ca(OCl)2-hypoclorit canxi, NaOCl-hypoclorit natri, oxy già, HgCl2-thủy ngân
clorua, chất kháng sinh (gentamicin, ampixilin…).
* Điều kiện nuôi cấy
- Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, các thao tác với mẫu
cấy được tiến hành trong buồng cấy vơ trùng. Buồng cấy có hệ thống màng lọc giúp
lọc vi sinh vật đồng thời có hệ thống đèn tử ngoại giúp tiêu diệt vi sinh vật trong
khơng khí và trên bề mặt các dụng cụ thiết bị nuôi cấy. Để khử trùng dụng cụ và mơi
trường ni cấy có thể sử dụng các phương pháp: Khử trùng khô (bằng nhiệt), khử
trùng ướt (hấp vô trùng), màng lọc.
- Ánh sáng và nhiệt độ: Mẫu nuôi cấy thường được đặt trong phòng ổn định
về ánh sáng và nhiệt độ.
* Môi trường dinh dưỡng
Môi trường dinh dưỡng phải có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết cho sự
phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây.
Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy thực vật,
cho đến nay đã có rất nhiều loại mơi trường khác nhau được sử dụng cho mục đích
này, trong đó có một số mơi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến như MS
(Murashige&Skoog, 1962) , LS (Linsmainer và Skoog, 1965)… Môi trường MS

(Murashige&Skoog, 1962) là môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy
mô của tế bào thực vật, mơi trường MS thích hợp cho cả thực vật 1 lá mầm, 2 lá
mầm. Môi trường Gramborg (1965) còn gọi là B5 dùng thử nghiệm trên đậu tương,
được sử dụng trong tách và nuôi tế bào trần.
Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy mơ đóng vai trị quyết định
đến sự thành cơng hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Mỗi một loại vật
liệu nuôi cấy hay loại cây khác nhau cần những thành phần mơi trường thích hợp để
phù hợp với mục đích việc ni cấy mơ tế bào thực vật.
Nhìn chung, mơi trường ni cấy mơ tế bào thực vật gồm các thành phần cơ
bản sau :


13
+ Các khoáng đa lượng
+ Các khoáng vi lượng.
+ Nguồn cacbon
+ Các vitamin
+ Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác
+ Các chất điều hòa sinh trưởng.
+ Các chất bổ sung khác: nước dừa; dịch chiết nấm men; than hoạt tính; Agar
Khống đa lượng
Các khống đa lượng bao gồm các nguyên tố khoáng được sử dụng ở nồng độ
trên 30 ppm tức là 30mg/l. Những nguyên tố đó là : N, Fe, P, K, Ca, Mo. Riêng Na và
Cl cũng được sử dụng trong một vài loại môi trường, nhưng chưa rõ vai trị của chúng
- Nitrogen: Mơ, tế bào thực vật có thể sử dụng nitrogen khống như
ammonium và nitrate. Tỷ lệ ammonium và nitrat thay đổi tùy theo loại cây và trạng
thái phát triển của mô. Nitrogen được cung cấp dưới NO3-, NH4+ ;
- Phospho ( P): Phospho là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực vật. Nó
tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nucleic và
tham gia vào cấu trúc màng. Ngoài ra khi phosphor ở dạng H2PO4 - và HPO42- cịn có

tác dụng như một hệ thống đệm (buffer) làm ổn định pH của mơi trường trong q
trình ni cấy;
- Kali ( K): K+ là một cation chủ yếu trong cây,giúp cho cây cân bằng các
anion vô cơ và hữu cơ. Ion K được chuyển qua màng tế bào dễ dàng và có hai vai trị
chính là điều hịa pH và áp suất môi trường nội bào. Sự thiếu hụt K+ trong môi
trường nuôi cấy mô thực vật sẽ dẫn đến tình trạng thừa nước và làm giảm tốc độ hấp
thu photphate. Người ta cung cấp Kali cho mô nuôi cấy dưới dạng kali nitat (KNO 3),
kali clorua (KCl) và kalihydrophotphat (KH2PO4);
- Canxi (Ca): Ca có mặt rất nhiều trong vách tế bào và màng tế bào. Sự có mặt
của Ca2+ rất quan trong trong khả năng đối kháng với sự nhiễm nấm. Sự ổn định 12
của màng tế bào chịu ảnh hưởng rất lớn bỡi ion Ca2+. Sự thiếu hụt Ca2+ sẽ làm tăng
q trình giải phóng các hợp chất ra khỏi màng tế bào. Canxi được cung cấp dưới
dạng canxi nitrat ( Ca(NO3)2.4H2O) canxi clorua (CaCl2.6H2O);


14
- Magiê (Mg): Là thành phần cấu trúc của diệp lục tố, có tác dụng đến q
trình quang hợp, phụ trợ cho nhiều enzyme liên quan trong biến dưỡng cacbonhydrat
sự tổng hợp acid nucleic… Ion Mg có tính linh động cao, hầu hết ion Mg2+ đều đc sử
dụng cho việc điều hòa pH nội bào và ổn đinh cân bằng anion và cation. Nếu thiếu
hụt Mg sẽ ngăn cản quá trình tổng hợp RNA. Kết quả là cấu trúc và chức năng của
lục lạp sẽ bị ảnh hưởng nhanh chóng khi xảy ra thiếu hụt Mg, là yếu tố không thể
thiếu trong quá trình trao đổi năng lượng của thực vật bởi vì nó có vai trị quan trọng
trong việc tổng hợp ATP. Mg được cung cấp dưới dạng magiê sunphat (
MgSO4.7H2O);
- Sắt (Fe): Nhưng môi trường cổ điển thường dùng sắt dưới dạng FeCl2,
FeCl3.6H2O, FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3, Fe(C4H4O6). Hiện nay hầu hết các phịng thí
nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelat kết hợp với Na2-Ethylene Diamine Tetra Acetate
(EDTA). Ở dạng này sắt khơng bị kết tủa và giải phóng từ từ ra mơi trường theo nhu
cầu mơ thực vật.

Khống vi lượng
Cu, Zn, Mn, Bo, I, Co là các nguyên tố vi lượng thường được dùng trong môi
trường nuôi cấy invitro. Các ngun tố này đóng vai trị quan trọng trong các hoạt
động của enzyme. Chúng được dùng với nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên
tố đa lượng. Các dung dịch vi lượng thường dùng là : Nistch (1951), Heller (1953),
Murashige – skoog ( 1962)
Nguồn cacbon
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, các mẫu ni cấy nói chung không thể
quang hợp hoặc quang hợp ở cường độ rất thấp, vì vậy trong mơi trường ni cấy
cần bổ sung các hợp chất hydratcacbon. Nguồn hydratcacbon được sử dụng phổ biến
là đường 13 saccarozơ với hàm lượng từ 2-6% (W/V). Những loại đường khác như
fructose, glucose, maltose, sorbitol,... rất ít dùng
+ Các chất điều hòa sinh trưởng.
Các chất điều hòa sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường ni
cấy, có vai trị quan trọng trong q trình phát sinh hình thái thực vật. Hiệu quả của
chất điều hịa sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ, hoạt tính của chất điều hòa sinh
trưởng và yếu tố nội sinh của mẫu cấy.


15
Dựa vào hoạt tính sinh lý phân chất điều hịa sinh trưởng thành 2 nhóm: Nhóm chất
kích thích sinh trường và nhóm chất ức chế sinh trưởng. Trong ni cấy mơ, tế bào
thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởng là nhóm thường được sử dụng.
- Ảnh hưởng giá thể trồng tới sinh trưởng phát triển của cây non ngoài vườn ươm
Trước đây giá thể sử dụng chủ yếu là đất, cát và sỏi. Ngày nay giá thể đã được thay
đổi rất nhiều. Như ta đã biết cây cần cả oxy và dinh dưỡng tiếp xúc với cây. Giá thể
lý tưởng là loại có khả năng giữ nước, tương đương với độ thống khí. Khả năng giữ
nước và độ giữ nước của giá thể được quyết định bởi những khoảng trống trong nó.
Giá thể lý tưởng có các đặc điểm:
- Có khả năng giữ ẩm cũng như độ thống khí tốt

- Có pH trung tính và có khả năng ổn định pH
- Thấm nước dễ dàng
- Bền, có khả năng tái sử dụng hoặc phân hủy an tồn cho mơi trường
- Nhẹ, rẻ và thơng dụng
Giá thể có nhiều loại như xơ dừa, trấu hun, mùn cưa, cát, sỏi vụn, rong biển, đất
nung xốp, …
1.4.5. Các giai đoạn trong nhân giống invitro
1.4.5.1. Khử trùng mô nuôi cấy
Là giai đoạn quan trọng, quyết định đến kết quả của q trình ni cấy. Mục
đích của giai đoạn này là tạo nguồn nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy. Kết
quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, nồng độ và thời gian khử trùng.
1.4.5.2. Tái sinh mẫu
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh có định hướng sự phát triển của mơ
ni cấy. Q trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ các hợp chất điều hịa
sinh trưởng như auxin/cytokinin đưa vào mơi trường nuôi cấy cũng như tuổi sinh lý
của mẫu.
1.4.5.3. Nhân nhanh
Là giai đoạn bao gồm nhiều lần cấy chuyển mô trên các mơi trường nhân
nhanh nhằm kích thích tạo các cơ quan phụ hoặc các cấu trúc khác mà từ đó cây con
hồn chỉnh có thể tái sinh. Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số nhân cao nhất. Để
đạt được mục đích nhân nhanh, người ta thường đưa vào môi trường nuôi cấy các