Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập từ thực phẩm lên men

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG

TẠ THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN LACTIC
PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đà Nẵng - Năm 2017


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH MÔI TRƯỜNG

TẠ THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN LACTIC
PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn: TS. PHẠM THỊ MỸ

Đà Nẵng – Năm 2017

LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai
cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Sinh viên thực hiện

Tạ Thị Hương


LỜI CẢM ƠN
Trong q trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, tôi đã nhận được nhiều sự
giúp đỡ, hướng dẫn, hỗ trợ từ phía thầy cơ, gia đình và bạn bè. Nhờ đó mà tơi đã
hồn thành được khóa luận như mong muốn, nay cho phép tôi được gửi lời cảm ơn
sâu sắc đến:
Đầu tiên là TS. Phạm Thị Mỹ - giảng viên trực tiếp hướng dẫn đề tài. Trong
suốt thời gian thực hiện, cơ đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ cũng như động viên tơi
lúc tơi gặp khó khăn.
Đồng thời, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh –
Môi Trường, Trường Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng và các thầy cô trong Bộ
môn Công nghệ sinh học đã tạo môi trường thuận lợi, cung cấp đầy đủ trang thiết
bị, dụng cụ cho tôi thực hiện đề tài một cách thuận tiện nhất.
Sau cùng, tôi xin cảm ơn sự ủng hộ, giúp đỡ từ phía gia đình và bạn bè trong
suốt quá trình thực hiện đề tài.
Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Chúc tất cả
mọi người sức khỏe và thành đạt.
Đà Nẵng, tháng 5 năm 2017
Sinh viên thực hiện

Tạ Thị Hương

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG BIỂU
DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
MỞ ĐẦU ..............................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài .............................................................................................1
2. Mục tiêu của đề tài ......................................................................................................2
3. Ý nghĩa của đề tài .......................................................................................................2
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................3
1.1. VI KHUẨN LACTIC..............................................................................................3
1.1.1. Đặc điểm chung................................................................................................3
1.1.2. Phân lo ại LAB ..................................................................................................4
1.1.3. Quá trình lên men.............................................................................................5
1.2. BACTERIOCIN....................................................................................................6
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu...........................................................................................6
1.2.2. Phân loại ............................................................................................................7
1.2.3. Sinh tổng hợp, phổ tác dụng và cơ chế tác dụng của bacteriocin ........... 11
1.2.4. Đánh giá hoạt tính bacteriocin..................................................................... 12
1.2.5. Chiết xuất và tinh chế bacteriocin............................................................... 12
1.2.6. Ứng dụng của bacteriocin ............................................................................ 14
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BACTERIOCIN TỪ LAB ..................... 16
1.3.1. Nghiên cứu ngoài nước ................................................................................ 16
1.3.2. Nghiên cứu trong nước ................................................................................. 17
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 19
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................................ 19
2.1.1. Đối tượng ....................................................................................................... 19

2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................... 19
2.2.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ................................................................................ 19
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................... 20
2.2.1. Phương pháp phân lập .................................................................................. 20
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh bacteriocin của LAB ............... 22
2.2.3. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp
bacteriocin................................................................................................................. 23
2.2.4. Phương pháp khảo sát khả năng chiết bacteriocin bằng(NH4)2SO4 ....... 24
2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................... 24
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................................... 25
3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP LAB TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN ..................... 25
3.1.1 Nhuộm Gram ................................................................................................. 25
3.1.2. Thử nghiệm catalase ..................................................................................... 27
3.1.3. Kiểm tra khả năng sinh acid lactic .............................................................. 29
3.1.4. Xác định kiểu lên men của 9 chủng vi khuẩn được tuyển chọn.............. 32
3.2. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN....................................... 33
3.3. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN
CỦA 3 CHỦNG LAB ĐƯỢC TUYỂN CHỌN ....................................................... 35
3.3.1. Ảnh hưởng của pH ........................................................................................ 35
3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ ............................................................................... 36
3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian .............................................................................. 37
3.4. ẢNH HƯỞNG CỦA TÁC NHÂN TỦA (NH4 )2SO4 ĐẾN CHẤT LƯỢNG
BACTERIOCIN THU ĐƯỢC.................................................................................... 39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................ 41
KẾT LUẬN ................................................................................................................... 41
KIẾN NGHỊ .................................................................................................................. 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 42
PHỤ LỤC .......................................................................................................................... 47

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
FDA

Food and Drug Administration (Cục quản lý Thực
phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ)

LAB

Lactic Acid Bacteria (LAB)

VK

Vi khuẩn

MRS

De Man Rogosa Sharp

PTN

Phịng Thí Nghiệm

EMP

Embden-Meyerhof-Parnas

SP

Sản phẩm

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Số hiệu bảng

Tên bảng

Trang

Bảng 1.1.

Sự khác biệt giữa bacteriocin và kháng sinh

6

Bảng 1.2.

Bacteriocin lớp IIc theo phân loại của Klaenhammer

10

Bảng 2.1.

Thành phần môi trường MRS

20

Bảng 3.1.

Bảng 3.2.

Bảng 3.3.

Bảng 3.4.

Bảng 3.5.

Tổng hợp các đặc tính sinh hóa của 18 chủng VK
được phân lập
Đường kính vịng kháng vi khuẩn chỉ thị của 9 chủng
LAB
Kích thước vịng ức chế VK chỉ thị của 3 chủng LAB
(N1, D3, D5) tại các giá trị pH khác nhau
Bảng 3.4. Kích thước vịng ức chế VK chỉ thị của 3
chủng LAB (N1, D3, D5) tại các mức nhiệt độ
Kích thước vịng ức chế VK chỉ thị của 3 chủng LAB
(N1, D3, D5) tại các thời điểm khác nhau

30

34

35

37

38

Kích thước đường kính khảng VK chỉ thị của
Bảng 3.6.

bacteriocin từ 3 chủng LAB khi tủa ở nồng độ muối
khác nhau

40


DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
Số hiệu hình vẽ

Tên hình vẽ

Trang

Hình 1.1.

Cấu trúc của nisin

7

Hình 1.2.

Cấu trúc Leucocin A

9

Hình 3.1.
Hình 3.2.
Hình 3.3.
Hình 3.4.

Hình 3.5.
Hình 3.6.
Hình 3.7.

Hình ảnh ống giống 18 chủng VK phân lập được
từ các sản phẩm lên men
Quan sát tế bào của 18 chủng VK phân lập được
dưới kính hiển vi quang học vật kính 100X
. Kết quả thử nghiệm catalase 18 chủng VK phân
lập từ sp lên men
. Kết quả kiểm tra khả năng sinh acid lactic của 18
chủng vi khuẩn phân lập từ sản phẩm lên men
Kết quả xác định kiểu lên men của 9 chủng LAB
được tuyển chọn
. Hoạt tính kháng vi khuẩn chỉ thị của bacteriocin
thu được từ 9 chủng LAB
Hoạt tính bacteriocin của 3 chủng N1, D3, D5 với
chủng chỉ thị E coli và Pseudomonas sp.

25

27

28

30

32

33

39



1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngày nay, ngộ độc thực phẩm đã trở thành một trong những vấn đề nóng bỏng
cần được giải quyết để bảo vệ sức khỏe con người. Tình trạng thực phẩm bị nhiễm
khuẩn ngày càng phổ biến và gây thiệt hại lớn cho công ty thực phẩm cũng như sức
khỏe người tiêu dùng. Theo thống kê của Cục An toàn thực phẩm (Bộ Y tế) trong
giai đoạn 2011-2014, Việt Nam ghi nhận 677 vụ ngộ độc thực phẩm với hơn 17
nghìn trường hợp phải nhập viện và 132 người tử vong [2].
Vai trò của các chất phụ gia, chất hoá học dùng trong bảo quản thực phẩm từ
trước đến nay là không thể phủ nhận. Tuy nhiên, việc sử dụng các hóa chất, phụ gia
để bảo quản đang bị lạm dụng quá mức, với mục đích khơng chính đáng để trục lợi
mà khơng màng đến sức khỏe của người tiêu thụ. Vì vậy việc nghiên cứu, tìm kiếm
phương pháp bảo quản nguyên liệu an toàn với người sử dụng là yêu cầu cấp thiết.
Bacteriocin là những peptide hay protein có tác dụng diệt khuẩn do vi khuẩn
sinh ra [38], đã được phát hiện từ đầu thế kỉ XX nhưng mới được nghiên cứu rộng
rãi trong vài thập niên trở lại đây khi nhu cầu về những hợp chất kháng khuẩn nhằm
thay thế kháng sinh và các chất bảo quản hóa học trở nên cấp thiết [31]. Với đặc
tính an tồn đã được FDA (Food and Drug Administration ) xác nhận, vi khuẩn
lactic là một nhóm vi khuẩn sinh bacteriocin thu hút sự quan tâm đặc biệt của các
nhà khoa học trên thế giới [52]. Nhiều cơng trình nghiên cứu đã chứng minh tác
dụng ức chế vi khuẩn có hại của các bacteriocin sinh ra bởi vi khuẩn lactic [30].
Tại Việt Nam, hệ vi khuẩn lactic xuất hiện chủ yếu trong sản phẩm lên men
truyền thống như dưa cải muối chua, sữa chua, cơm mẻ, nem chua… Các nghiên

cứu về khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic ở nước ta mới bắt đầu được
quan tâm trong những năm gần đây, tuy nhiên với số lượng chưa nhiều. Với mong
muốn góp phần nhỏ vào nghiên cứu bacteriocin của vi khuẩn lactic ở Việt Nam,
chúng tôi quyết định thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp
bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập từ thực phẩm lên men” nhằm mục đích
ứng dụng trong bảo quản thực phẩm.


2

2. Mục tiêu của đề tài
Đề tài được thực hiện với mục tiêu là tuyển chọn được các chủng vi khuẩn
lactic có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin cao. Đồng thời, tìm được điều kiện tối
ưu để thu chế phẩm bacteriocin với hiệu suất cao nhất.
3. Ý nghĩa của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
Tuyển chọn và lưu giữ được các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng
hợp bacteriocin cao. Đây là nguồn gen cung cấp cho các hướng nghiên cứu sâu hơn
trong tương lai
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin cao tuyển
chọn được sẽ làm tiền đề cho việc nghiên cứu sản xuất các chế phẩm sinh học ứng
dụng trong bảo quản thực phẩm.


3

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. VI KHUẨN LACTIC
1.1.1.Đặc điểm chung

Vi khuẩn lactic (LAB - Lactic Acid Bacteria) phân bố rộng trong thiên nhiên,
trong đất, trong nước, trong khơng khí, ở trên bề mặt lá cỏ, trong các loại rau, quả,
sữa, thịt…, một số chủng được tìm thấy trong các bộ phận của hệ tiêu hóa ở con
người và động vật. Đồng thời, nhóm LAB thường được tìm thấy trong các sản phẩm
lên men truyền thống như dưa cải muối chua, kim chi, sữa chua, nem chua [4],[ 44].
LAB là những vi khuẩn Gram dương, trực khuẩn hoặc cầu khuẩn, đa số không
sinh bào tử, không chuyển động và không chứa cytochrome và enzyme catalase,
chúng khơng có khả năng sinh tổng hợp enzyme peorxydase, phân giải H2O2 để
phát triển, có khả năng lên men đường để tạo acid lactic. Nhóm LAB là vi khuẩn kị
khí tùy nghi hay hiếu khí [47].
LAB thường có dạng hình cầu, hình oval và hình que, đường kính của dạng
cầu khuẩn lactic từ 0,5-1,5μm, các tế bào hình cầu xếp thành từng cặp hoặc chuỗi
có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực khuần lactic từ 1-8μm, trực khuẩn
thường đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi [48].
Các loài LAB (đặc biệt là trực khuẩn đồng hình) rất kén chọn thành phần dinh
dưỡng, chúng chỉ phát triển khi trên mơi trường có tương đối đầy đủ các yếu tố dinh
dưỡng cần thiết như acid amin, peptide, protein, vitamin (B1 , B2 , B6 , PP, các acid
pantonenic và acid folic) [13].
LAB có hoạt tính protease, chúng phân hủy được protein của sữa tới peptide
và acid amin. Hoạt tính này ở các lồi có khác nhau, thường trực khuẩn là cao hơn.
Chúng chịu được trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và cồn ethylic, nhiều lồi
vẫn sống được trong mơi trường có 10-15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn
bền với NaCl tới 7-10%. LAB ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 25-35 0C, các
lồi ưa nhiệt có nhiệt độ tối ưu là 40-45 0C, lồi ưa lạnh có thể phát triển ở nhiệt độ
tương đối thấp (khoảng 5 0 C hoặc thấp hơn). Khi gia nhiệt tới 60-80 0C hầu hết
chúng bị chết sau 10-30 phút [11].


4

Một số loại có khả năng tạo màng nhầy, một số khác có khả năng đối kháng
với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh và làm thối rữa thực phẩm. LAB ngoài
khả năng lên men lactic, chúng cịn có khả năng sản sinh ra các chất kháng khuẩn
gọi là bacteriocin và được ứng dụng nhiều trong y học cũng như trong bảo quản
thực phẩm [21].
Nhóm LAB biến dưỡng theo hai con đường chuyển hóa carbon: con đường lên
men lactic đồng hình với sản phẩm tạo ra chủ yếu là acid lactic và con đường lên
men lactic dị hình với các sản phẩm tạo ra là acid lactic, acid acetic, ethanol,
CO2…[62]. Hoạt lực lên men acid lactic tốt nhất của trực khuẩn lactic ở vùng
pH=5.5-6… Hơn nữa nhiều lồi LAB có khả năng sinh bacteriocin chống lại sự
phát triển của các vi sinh vật gây hại và có tác động hiệu quả trong bảo quản thực
phẩm [13].
1.1.2.Phân loại LAB
Theo khóa phân loại Bergey (2009) [34], LAB được xếp:
Giới (Kingdom)

: Bacteria

Ngành (Division)

: Firmicutes

Lớp (Class)

: Bacilli

Bộ (Order)

: Lactobacillus

Họ I (Family I)

: Lactobacillaceae

Giống I (Genus I)

: Lactobacillus

Giống II (Genus II)

: Pendiococcus

Họ II (Family II)

: Enterococceae

Giống (Genus)

: Enterococcus

Họ III (Family III)
Giống (Genus)
Họ IV (Family IV)

: Leuconoscaceae
: Leuconostoc
: Streptococcaceae

Giống I (Genus I)

: Streptococcus

Giống II (Genus II)

: Lactococcus


5

1.1.3.Q trình lên men
Hoạt động sinh hóa trao đổi chất tiêu biểu nhất của LAB chính là cơ chế q
trình lên men. Lên men lactic là q trình chuyển hóa kỵ khí đường với tích lũy acid
lactic trong mơi trường. Có thể tóm tắt theo phương trình sau:
NADH2

NAD

CH3COCOOH

CH3CH(OH)COOH
Lactate dehydrogenase

Các lồi LAB khác nhau về cơ chế lên men glucose. Trong đó một số lồi lên
men đường tạo acid lactic, nhóm này gọi là lên men đồng hình, một số nhóm khác
ngồi acid lactic cịn tạo rượu và CO2 , nhóm này gọi là lên men dị hình [3],[ 5],[
69],[ 71].
 Lên men lactic đồng hình
LAB lên men đồng hình phân giải đường theo con đường EMP (EmbdenMeyerhof-Parnas) và cho ra sản phẩm chủ yếu là acid lactic (90-98%). Chỉ một
phần nhỏ pyruvate được decacboxyl hóa và chuyển hóa thành acid acetic, etanol và
CO2. Mức độ tạo thành các sản phẩm phụ thuộc sự có mặt của oxi. Một số vi khuẩn

lên men đồng hình thường gặp là Lactococus lactis, Lactobacilius acidophilus, L.
casei, L. cremoris, L. helveticus, L. delbrueckii, Streptococcus lactis, s.
thermophilus [69],[ 71].
 Lên men lactic dị hình
LAB lên men dị hình do thiếu 2 enzyme chủ yếu của con đường EMP là
aldolase và triozophosphat-merisoase nên giai đoạn đầu của quá trình phân giải
glucose xảy ra theo con đường PP (pentose -phosphat). Q trình chuyển hóa
triozophosphat thành acid lactic giống như lên men đồng hình. Sản phẩm của quá
trình lên men lactic dị hình ngồi acid lactic (40%), cịn có các sản phẩm khác như
rượu etylic (20%), acid acetic (10%), các chất khí cịn lại (20%) [69],[ 71].


6

1.2. BACTERIOCIN
1.2.1.Lịch sử nghiên cứu
Những báo cáo đầu tiên liên quan tới bacteriocin xuất hiện từ cuối thế kỷ XIX
khi các nhà khoa học nghiên cứu về tính đối kháng giữa các vi khuẩn (bacterial
antagonism) [31]. Năm 1925, bacteriocin chính thức được Gratia tìm ra trên một
chủng Escherichia coli [35], về sau chất này được biết đến với tên gọi colicin V
[33]. Năm 1953, thuật ngữ “bacteriocin” lần đầu được đề xuất và định nghĩa bởi
Jacob và cộng sự, chủ yếu dựa trên các đặc tính của colicin [38]. Năm 1976, Tagg
và cộng sự chỉ ra sự khác biệt giữa colicin và các bacteriocin sinh ra bởi vi khuẩn
Gram (+) [65], từ đó định nghĩa về bacteriocin được mở rộng và đến ngày nay, các
peptid và protein do vi khuẩn (VK) sinh ra có tác dụng diệt khuẩn đều được gọi là
bacteriocin [38].
Vì có hoạt tính kháng khuẩn nên trước đây, bacteriocin bị nhầm lẫn như là
“chất kháng sinh”. Năm 1965, Reeves và cộng sự đã tìm ra sự khác biệt của
bacteriocin với các chất kháng sinh bởi đặc điểm đặc trưng: Bacteriocin có bản chất
protein [58].

Bảng 1.1. Sự khác biệt giữa bacteriocin và kháng sinh [58]
Đặc điểm

Bacteriocin

Kháng sinh

Ứng dụng

Thực phẩm

Y học

Sản phẩm chuyển hóa

Sản phẩm chuyển hóa

bậc 1

bậc 2

Hoạt tính

Phổ hẹp

Phổ rộng

Miễn dịch tế bào chủ

Có

Khơng

Có mặt

Vắng mặt

Tổng hợp

Sự có mặt của các tế bào
miễn dịch trong tế bào chủ

Đa số qua sự hình thành
Dạng hoạt động

lỗ nhưng đơi khi cũng
tác động lên sự tổng hợp

Màng tế bào hay các
đích nội bào

sinh học thành tế bào
Ảnh hưởng độc lên tế bào
nhân chuẩn

Khơng

Có

7

Bacteriocin là sản phẩm phổ biến của giới VK [38], được tìm thấy ở nhiều
nhóm VK thật (Eubacteria) và cả trên VK cổ (Archaebacteria). Theo Klaenhammer,
99% các lồi VK có thể sinh ra ít nhất một bacteriocin [46].
1.2.2.Phân loại
Cho đến nay có khoảng 200 loại bacteriocin được xác định, tuy nhiên việc
phân loại các bacteriocin vẫn chưa được xác định rõ ràng và nó vẫn đang là vấn đề
tranh cãi. Các bacteriocin thường được phân loại dựa trên các tiêu chí khác nhau.
Những tiêu chí chính là họ VK sản xuất, trọng lượng phân tử của chúng và cuối
cùng là trình tự chuỗi amino acid [43]. Trong đó, phương pháp phân loại được chấp
nhận và sử dụng phổ biến là bacteriocin được chia thành 4 lớp: lớp I, lớp II lớp III
và lớp IV. Hai nhóm bacteriocin lớp I và lớp II là đối tượng được tìm hiểu và
nghiên cứu nhiều hơn hơn hai nhóm cịn lại.
a) Lớp I
Bacteriocin lớp I hay còn gọi là Lanbiotic là những peptide nhỏ (<5 kDa), bền
nhiệt và tác động lên cấu trúc màng. Một bacteriocin của nhóm này là nisin. Các
lantibiotic chia thành 2 phân lớp là Ia và Ib dựa trên sự tương đồng cấu trúc.
 Phân lớp Ia
Phân lớp Ia gồm các peptide dạng thn dài, linh hoạt và tích điện dương,
chúng hoạt động bằng cách kết hợp với các lipid mang điện tích âm hình thành các
lỗ trong màng tế bào chất của các loài vi khuẩn nhạy cảm [68]. Nisin cũng thuộc
nhóm này. Đây là một peptide được hình thành bởi 34 aminoacid, các loại acidamin
phổ biến có trong nisin là lanthionine (Lan), methyllanthionine (MeLan),
didehydroalanine (DHA) và acid didehydroaminobutyric (Dhb). Nisin có 2 biến thể
của nisin được ghi nhận là nisin A và nisin Z.

Hình 1.1. Cấu trúc của nisin (Nguồn: Wei Liu và cộng sự, 2011)

8

Loại bacteriocin này được sản xuất bởi một vài chủng Lactococcus lactic,
được sử dụng như một chất phụ gia trong thực phẩm. Nó có phổ kháng khuẩn Gram
(+) rộng, E. coli và các VK Gram (-) khác chỉ bị ảnh hưởng bởi nisin khi màng
ngoài của chúng bị phá hỏng. Nisin được cho là có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả
đối với Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, các tế bào sinh dưỡng của
Bacillus spp. và Clostridium spp. [68]. Chúng được sử dụng chủ yếu trong các thực
phẩm đóng hộp và các sản phẩm từ sữa, đặc biệt trong sản xuất phô mai, nhằm
chống lại các vi sinh vật chịu nhiệt như Bacillus và Clostridium. Nisin cũng được
ghi nhận có hiệu quả chống lại các bệnh viêm vú do VK Gram (+) gây ra [24].
 Phân lớp Ib
Phân lớp Ib gồm các peptide có dạng hình cầu, cấu trúc khơng linh động, tích
điện âm hoặc khơng tích điện. Chúng thể hiện hoạt động bằng cách gây ức chế sinh
tổng hợp peptidoglycan [25], gây nhiễu với các phân tử enzyme thiết yếu của VK
nhạy cảm. Chúng thường hoạt động trong các phản ứng lên men quan trọng của
VK. Nhóm này bao gồm các chất kháng khuẩn như mersacidine, mutacin A,
actagardin, cinnamycin [43].
b) Lớp II
Còn được gọi là lớp Non-Lanbiotic, bao gồm các bacteriocin có trọng lượng
phân tử nhỏ hơn 10 kDa, bền nhiệt và khơng chứa lanthionine. Các bacteriocin
nhóm II có thể chia thành 3 phân lớp, bao gồm IIa, IIb và IIc.
 Lớp IIa
Lớp IIa là lớp lớn nhất, gồm các peptide hoạt động chống Listeria, đại diện
đặc trưng cho nhóm này là Leucocin A, pediocin PA-1. Các sakacin A, sakacin P
cũng là đại diện đặc trưng cho nhóm này. Các bacteriocin nhóm này hoạt động bằng
cách phá vỡ tính tồn năng của màng tế bào, làm mất cân bằng và thất thốt ion
phosphate hữu cơ do đó mà tiêu diệt VK [43].
Sakacin A là bacteriocin được sản xuất bởi Lactobacillus sakei LB 706, được
cấu tạo bởi 41 acid amin (tiền thân là 90 acid amin). Bacteriocin này là một

polypeptide ổn định nhiệt, mang đặc tính di truyền.


9

Sakacin P là một polypeptide nhỏ, ổn định nhiệt, được tổng hợp bởi ribosome,
mang đặc tính di truyền [39], được sản xuất bởi Lactobacillus sakei LB 673.

Hình 1.2. Cấu trúc Leucocin A (nguồn Christopher T Lohans, 2012)
Các bacteriocin này hứa hẹn cho nhiều ứng dụng cộng nghiệp nhờ vào hoạt
động kháng Listeria mạnh của chúng. Thậm chí chúng cịn là các tác nhân kháng
Listeria được chú ý nhiều hơn là bacteriocin lớp I (nisin). Sakacin được ứng dụng
trong sản xuất xúc xích, xử lý ở các sản phẩm thịt để giữ được lâu (như sản phẩm
thịt nguội [42] và thịt đông lạnh ), pho mát, các sản phẩm lên men acid lactic khác.
Ngồi ra, cịn được sử dụng để ức chế sự phát triển của VK khơng mong muốn, có
thể là nguyên nhân gây nhớt và gây mùi ở các sản phẩm.
 Lớp IIb
Lớp IIb hình thành bởi một phức hợp của 2 peptide riêng biệt, những peptide
này ít hoặc khơng có hoạt động nào và nó khơng có sự giống nhau giữa các peptide
bổ sung. Các bacteriocin nhóm này có thể hoạt động riêng lẻ, cũng có thể liên hiệp
khi hoạt động cùng nhau (enterocin L50A, L50B) tạo lỗ trên màng tế bào, hoặc
chúng có thể cùng cần thiết cho hoạt động kháng khuẩn (lactococcins Gα/Gβ,
Lactococcins M/N và plantaricins EF, JK). Các bacteriocin đặc trưng cho nhóm này
là lactococcin G, plantaricin EF và plantaricin JK [43].
Lactococcin G là một bacteriocin có hoạt động phụ thuộc vào hoạt động bổ
sung của 2 peptide, là lactococcins Gα và Gβ. Lactococcin Gα gồm có 39 acid
amin, cịn Lactococcin Gβ gồm có 35 acid amin. Bactericoin này được sử dụng như
một chất bảo quản thực phẩm, có khả năng kháng tế bào VK Lactococcus lactis.
Hoạt động diệt khuẩn chỉ xảy ra khi có sự hiện diện của cả 2 peptide, mặc dù 2
peptide này có khả năng diệt khuẩn độc lập [43].

10

 Lớp IIc
Lớp IIc là những peptide nhỏ, bền nhiệt, gồm những bacteriocin không đồng
nhất nên phương thức hoạt động của chúng cũng khác nhau. Nhóm IIc bao gồm tất
cả các bacteriocin lớp II khơng rơi vào nhóm IIa, IIb. Trong phân lớp này tìm thấy
có 2 dạng [43]:
- Chất kháng khuẩn có 1 hoặc 2 gốc cystein (như thiolbiotics có một và
cystibiotics có 2 gốc cystein).
- Kháng khuẩn khơng có cystein (lactoccin A và acidocin B).
Bảng 1.2. Bacteriocin lớp IIc theo phân loại của Klaenhammer [43]
KLPT

Amino

Gốc

(Da)

acid

cystein

Bacillus cereus Bc7

4893

56

2

Entrococcus faecium T136

5465

53

2

Bacteriocin

Vi sinh vật sản xuất

Cerein 7/8
Enterocin B

EntrococcusfaeciumCECT492
Lactococcin A

Lactococcus lactis LMG2130

5778

54

0

Lactococcin B

Lactococcus cremoris 9B4

5328

47

1

Divergicin Aa

Carnobacterium divergens LV13

4224

46

2

Acidocin Ba

Carnobacteriumacidophilus M46

5754

59

0

c) Lớp III

Lớp này bao gồm những peptide lớn, có trọng lượng phân tử lớn hơn 30 kDa,
khơng bền nhiệt. Nhóm này có thể bao gồm các enzymee ngoại bào kháng lại các
VK có thể bắt chước các hoạt động sinh lý của bacteriocin. Các bacteriocin lớp III
cho đến nay chỉ được phân lập từ các thành viên của giống Lactobacillus [68]. Đại
diện cho nhóm này là halveticin J được sản xuất bởi VK L. halveticus 481 và
helveticin V, acidifilicin A và lactacin A, lactacin B được sản xuất bởi L.
acidophilus.
d) Lớp IV
Hiện nay, có rất ít tài liệu nghiên cứu về nhóm này. Một cách tổng quát các
bacteriocin nhóm IV được định nghĩa là bacteriocin phức tạp có chứa lipid hoặc


11

carbohydrate moities. Bao gồm các glycoprotein (lactocin 27), hoặc lipoprotein
(lacstrepcins) được quy định bởi non-protein [43].
1.2.3.Sinh tổng hợp, phổ tác dụng và cơ chế tác dụng của bacteriocin
 Sinh tổng hợp
Bacteriocin được tổng hợp tại ribosome dưới dạng tiền chất khơng hoạt động,
chúng chỉ trở nên có hoạt tính sau khi được biến đổi nhờ các phản ứng enzyme đặc
hiệu [51]. Theo Tagg và cộng sự, các bacteriocin của VK Gram (+) có thể tồn tại
dưới dạng ngoại bào (extracellular form) hoặc gắn với tế bào (cell-associated form),
tỉ lệ mỗi dạng phụ thuộc vào đặc điểm môi trường [65].
Môi trường sống của VK cịn có ảnh hưởng lớn tới lượng bacteriocin sinh ra,
trong đó các yếu tố chủ yếu là thành phần môi trường, nhiệt độ và pH. Các yếu tố
này có thể ảnh hưởng trực tiếp đến sự sản sinh bacteriocin hoặc gián tiếp thông qua
sự sản xuất sinh khối do bacteriocin được coi là sản phẩm trao đổi chất bậc 1 của
VK [30].
 Phổ tác dụng
Phổ tác dụng của các bacteriocin nhìn chung rất khác nhau. Căn cứ phổ tác

dụng, có thể chia bacteriocin của LAB làm 2 nhóm. Nhóm thứ nhất là các
bacteriocin chỉ có tác dụng trên các lồi gần gũi với lồi sinh ra nó, ví dụ như
lactobin A sinh ra bởi Lactobacillus amylovorus chỉ ức chế một số Lactobacillus sp.
gần gũi. Nhóm thứ 2, ít gặp hơn, có phổ tác dụng rộng, ví dụ như nisin sinh ra bởi
một số dòng Lactococcus lactis subsp. lactis có khả năng ức chế nhiều VK Gram
(+). Nói chung, các bacteriocin của LAB thường ít thể hiện hoạt tính trên VK Gram
(-) [53].
Bacteriocin có thể có tác dụng diệt khuẩn hoặc kìm khuẩn trên các chủng VK
nhạy cảm, mức độ tác dụng khác nhau do ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như nồng độ,
mức độ tinh sạch bacteriocin, các điều kiện thực nghiệm…[27].
 Cơ chế tác dụng
Cơ chế tác dụng của bacteriocin rất đa dạng, một bacteriocin có thể có nhiều
hơn một cơ chế tấn cơng tế bào đích [52]. Một số cơ chế đã được đề xuất: thay đổi
hoạt tính enzyme nội bào, ức chế bào tử nảy mầm, tạo lỗ trên màng tế bào… Nhìn


12

chung, lớp vỏ tế bào được coi là đích tác dụng chính của các bacteriocin từ LAB.
Bacteriocin phá vỡ tính toàn vẹn của lớp vỏ tế bào VK nhạy cảm, gây mất các chất
nội bào, cuối cùng gây chết tế bào [53].
Cơ chế tác dụng cụ thể của bacteriocin ở từng lớp là khác nhau. Các
bacteriocin lớp I (lantibiotic) ức chế tổng hợp vách tế bào hoặc tạo lỗ trên màng tế
bào bằng cách gắn vào lipid II [52]. Các bacteriocin lớp II có cấu trúc xoắn ốc và
lưỡng cực nên có thể xen vào màng tế bào đích, từ đó tạo lỗ, khử cực và làm chết tế
bào [28]. Cơ chế tác dụng của các bacteriocin lớp III nói chung chưa rõ [53]; một số
tác giả cho rằng đó là các lysin tiêu khuẩn hay tiêu khuẩn tố (bacteriolysin), tác
động trực tiếp lên vách tế bào đích gây phá hủy tế bào [28].
1.2.4. Đánh giá hoạt tính bacteriocin
Có nhiều phương pháp đánh giá hoạt tính bacteriocin, về cơ bản chúng đều

dựa trên việc đánh giá tác dụng đối kháng của mẫu thử đối với các chủng vi sinh vật
chỉ thị [65]. Một số ví dụ: phương pháp “spot-on-lawn”, phương pháp khuếch tán
qua giếng thạch [56], phương pháp đo độ đục [45]... Ảnh hưởng của các tác nhân ức
chế khác không phải là bacteriocin như pH, H2O2… cần được loại trừ bằng phương
pháp thích hợp [65].
Gần đây một số phương pháp mới để đánh giá hoạt tính bacteriocin đã được
đề xuất. Năm 2001, Mugochi và cộng sự đưa ra phương pháp đánh giá hoạt tính
bacteriocin bằng cách đo nồng độ ion K+ giải phóng từ VK chỉ thị [50]. Phương
pháp này được cho là có hiệu quả sánh ngang với phương pháp khuếch tán qua
giếng thạch [38].
1.2.5.Chiết xuất và tinh chế bacteriocin
Do tính chất của các bacteriocin rất đa dạng nên khơng có phương pháp hay
quy trình chiết tách chung [36]. Vấn đề thường gặp trong quá trình chiết xuất và
tinh chế bacteriocin là sự hao hụt bacteriocin và sự giảm hoạt tính ức chế vi sinh vật
[65]. Một quy trình sản xuất bacteriocin chỉ được coi là lí tưởng khi có thể áp dụng
với quy mơ lớn, cho hiệu suất thu nhận bacteriocin trên 50% và độ tinh sạch khoảng
90% [53].


13

 Chiết xuất
Bacteriocin có thể được chiết xuất bằng nhiều cách, tiêu biểu trong số đó là
các phương pháp: kết tủa bằng amoni sulfat, hấp phụ - giải hấp phụ và chiết bằng
dung môi hữu cơ [56].
- Kết tủa bằng amoni sulfat
Do có bản chất protein, bacteriocin có thể được kết tủa bằng muối do hiện
tượng salting out (tính tan của protein giảm mạnh ở nồng độ muối cao) [56]. Amoni
sulfat thường được sử dụng nhất [56], ngoài ra cũng có tác giả sử dụng diatomite
calcium silicate [29]. Muối được thêm từ từ vào mẫu (dịch nổi đã loại sinh khối tế

bào) cho đến khi đạt nồng độ mong muốn. Nồng độ muối cần thiết để kết tủa các
bacteriocin khác nhau có thể khác nhau, cần khảo sát để tìm ra nồng độ muối thích
hợp với từng trường hợp cụ thể. Tủa bacteriocin được tách riêng bằng cách li tâm,
sau đó hồ trong lượng nhỏ (vừa đủ) trong đệm acetate pH 3.8 (giá trị pH của dung
dịch đệm có thể khác nhau giữa các nghiên cứu) hoặc nước cất vô trùng. Thường
loại muối bằng bằng phương pháp thẩm tích [56].
- Hấp phụ - giải hấp phụ
Phương pháp này được phát triển bởi Yang và cộng sự dựa trên đặc tính của
một số bacteriocin: bacteriocin được hấp phụ lên bề mặt tế bào VK sinh bacteriocin
đó ở pH gần trung tính và được giải phóng trở lại mơi trường sau khi xử lí ở pH
thấp (pH khoảng 1.5 – 2.0) [70]. Ưu điểm của phương pháp này là ít kéo theo các
protein tạp so với phương pháp kết tủa bằng amoni sulfat [56].
- Chiết bằng dung môi hữu cơ
Phương pháp này cũng xuất phát từ bản chất protein của bacteriocin: khi thêm
dung môi hữu cơ vào mẫu, hằng số điện môi giảm xuống, độ tan của protein giảm
và tạo kết tủa [3]. Ethanol và aceton là hai dung môi khá thông dụng được sử dụng
để chiết bacteriocin. Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ đã được ứng dụng
thành công với một số bacteriocin như lactococcin B, pediocin PA-1, lacticin Q…
[56].


14

 Tinh chế
Bacteriocin sau khi được chiết xuất thường còn lẫn nhiều tạp. Để thu được
bacteriocin tinh khiết cần trải qua các bước tinh chế [53]. Các kĩ thuật tinh chế
bacteriocin rất đa dạng [14], có thể dựa trên kích thước (ví dụ: sắc kí lọc gel, siêu
lọc…) hoặc điện tích riêng của bacteriocin (ví dụ: sắc kí trao đổi ion, điện di…)
[65]. Quá trình tinh chế thường trải qua nhiều bước, kết hợp nhiều kĩ thuật khác
nhau [53]. Tuy nhiên, một số quy trình đơn giản nhằm tinh chế bacteriocin ở qui mô

công nghiệp đã được phát triển thành công. Năm 1997, Suárez và cộng sự đã đề
xuất quy trình tinh chế nisin A bằng phương pháp sắc kí ái lực miễn dịch nhờ kháng
thể đơn dòng kháng nisin A, cho kết quả tốt [63]. Năm 2004, Cheigh và cộng sự đã
tinh chế được nisin Z từ môi trường ni cấy Lactococcus lactis subsp.lactis A164
bằng phương pháp sắc kí trao đổi ion nền mở rộng, thu được nisin Z có độ tinh
khiết gấp 31 lần với hiệu suất 90% [26].

1.2.6. Ứng dụng của bacteriocin
Với tác dụng kháng khuẩn, bacteriocin được ứng dụng trong 2 lĩnh vực lớn:
công nghệ dược phẩm và công nghệ thực phẩm [59].
 Trong công nghệ dược phẩm
Bacteriocin được nghiên cứu ứng dụng trong công nghệ dược phẩm theo 2
hướng chính: probiotic [32] và chất thay thế kháng sinh [41]. Probiotic được định
nghĩa là các vi sinh vật sống khi được sử dụng với lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động
có lợi cho sức khỏe của vật chủ [55]. Tác dụng của các chế phẩm probiotic có thể là
trực tiếp hoặc gián tiếp thơng qua sự điều chỉnh khu hệ vi sinh vật đường ruột [20].
Bacteriocin được cho là đóng vai trị quan trọng trong hoạt động của các probiotic,
là một trong các tiêu chí lựa chọn chủng vi sinh vật làm probiotic [32].
Đã có nhiều giả thiết được đưa ra về cơ chế bacteriocin tham gia vào hoạt
động của probiotic. Một là, bacteriocin giúp probiotic xâm nhập và chiếm ưu thế
trong hệ vi sinh vật đường ruột. Hai là, bacteriocin thể hiện tác dụng kháng khuẩn,
trực tiếp ức chế các VK gây bệnh. Ba là, bacteriocin mang tín hiệu kích thích hệ
miễn dịch của vật chủ. Hiện nay, các nhà khoa học vẫn đang tìm kiếm những bằng


15

chứng để khẳng định chính xác vai trị và cơ chế tác dụng của bacteriocin trong hoạt
động của probiotic, nhất là các bằng chứng in vivo [32].
Sự xuất hiện và gia tăng các chủng VK gây bệnh đa kháng thuốc là một vấn đề

lớn của y học hiện nay. Để giải quyết vấn đề này, bên cạnh việc sử dụng hợp lí các
kháng sinh hiện có, một u cầu cấp thiết được đặt ra là nghiên cứu phát triển các
phương pháp điều trị mới thay thế cho sử dụng kháng sinh. Bacteriocin là một trong
những giải pháp đã được đề xuất và nghiên cứu [59].
Về mặt lí thuyết, bacteriocin được sinh ra trong tự nhiên rất đa dạng nên khả
năng tìm ra những chất có tác dụng kháng lại các VK gây bệnh là rất lớn. Mặt khác,
do bacteriocin thường có tác dụng đặc hiệu trên một số lồi VK nhất định, chúng có
thể được sử dụng như những thuốc thiết kế riêng cho từng tác nhân gây bệnh, nhờ
đó giảm tần suất xuất hiện VK kháng thuốc [59].
Các nghiên cứu thực nghiệm đã cho những kết quả bước đầu khả quan. Ở đây
chỉ nêu ra một vài ví dụ: Nisin, mersacidin, mutacin 1140, lacticin 3147 đã được
báo cáo về tác dụng trên các VK gây bệnh kháng thuốc như MRSA, VRE [52].
Nisin F tiêm vào chuột nhiễm Staphylococcus aureus cho thấy có tác dụng kiểm
sốt sự phát triển của S. aureus [22]. Lacticin 3147 thể hiện tác dụng ức chế
Clostridium difficile trên mơ hình ex vivo của ruột kết [57]. Một liều duy nhất
mutacin B-Ny266 tiêm màng bụng vào chuột nhiễm S. aureus nhạy cảm với
methicillin cho tỉ lệ tử vong là 0%, trong khi tỉ lệ tử vong ở nhóm chuột đối chứng
(khơng dùng mutacin B-Ny266) là từ 70 đến 100% [49].
Mặc dù vẫn cần thêm nhiều nghiên cứu để có thể đưa bacteriocin vào ứng
dụng trên thực tiễn lâm sàng nhưng những kết quả trên đã cho thấy tiềm năng to lớn
của bacteriocin trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn [32].Trong tương lai, sử
dụng bacteriocin hứa hẹn sẽ là một liệu pháp an toàn và hiệu quả thay thế các kháng
sinh truyền thống [59].
 Trong công nghệ thực phẩm
Bacteriocin của LAB được nghiên cứu ứng dụng làm chất bảo quản trong cơng
nghệ thực phẩm bởi có nhiều ưu điểm: ức chế hiệu quả nhiều VK gây hỏng và gây
bệnh trong thực phẩm (điển hình là Listeria monocytogenes) [38], thân thiện với