Xây dựng quy trình định lượng (s) amlodipin bằng phương pháp hplc pha đảo sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (4.29 MB, 164 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH
-----------------
TRẦN MỸ THIÊN THANH
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG (S)-AMLODIPIN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC PHA ĐẢO SỬ DỤNG PHA
ĐỘNG CÓ CHỨA TÁC NHÂN ĐỐI QUANG
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH
-----------------
TRẦN MỸ THIÊN THANH
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG (S)-AMLODIPIN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC PHA ĐẢO SỬ DỤNG
PHA ĐỘNG CÓ CHỨA TÁC NHÂN ĐỐI QUANG
Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất
Mã số: 8720210
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ THỊ THU CÚC
TS. PHAN VĂN HỒ NAM
Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018
.
LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan dây là cơng trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong
luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác
Người cam đoan
Trần Mỹ Thiên Thanh
.
Luận văn Thạc sĩ – Khóa 2016 – 2018
Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất – Mã số: 8720210
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG (S)-AMLODIPIN BẰNG PHƯƠNG
PHÁP HPLC PHA ĐẢO SỬ DỤNG PHA ĐỘNG
CÓ CHỨA TÁC NHÂN ĐỐI QUANG
Trần Mỹ Thiên Thanh
Hướng dẫn khoa học: TS. Lê Thị Thu Cúc, TS. Phan Văn Hồ Nam
Từ khóa: HPLC, amlodipin, phân tách đồng phên, đồng phân quang học
Mở đầu
Amlodipin là thế hệ thứ ba của thuốc ức chế kênh cacli thuộc nhóm dihydropyridin có
khả năng chặn kênh cacli được sử dụng trong điều trị bệnh cao huyết áp và chứng đau
thắt ngực. Amlodipin có hai đồng phân đối quang là (S)-amlodipin và (R)-amlodipin.
Tuy nhiên, chỉ có dạng (S) là có hoạt tính sinh học, cịn dạng (R) có nhiều tác dụng phụ.
Phần lớn các chế phẩm trên thị trường ở dạng racemic amlodipin. Tuy nhiên, để cải thiện
tính an tồn và hiệu quả, amlodipin được sản xuất dưới dạng đồng phân (S)-amlodipin
và được đưa ra thị trường vài năm trước. Trong nghiên cứu này, chúng tơi giới thiệu kết
quả phân tích đồng phân quang học (S)-amlodipin bằng phương pháp HPLC pha đảo sử
dụng pha động có chứa tác nhân đối quang.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: hoạt chất amlodipin và (S)-amlodipin
Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát một số điều kiện quan trọng ảnh hưởng trong quá
trình tách (thành phần và tỉ lệ pha động) nhằm chọn được điều kiện phân tích đáp ứng
các thơng số: hai pic đồng phân phải tách nhau hoàn toàn với độ phân giải Rs >1,5; hệ số
bất đối As nằm trong khoảng 0,8-1,5. Sau khi tìm được điều kiện thích hợp, tiến hành
thẩm định quy trình phân tích bao gồm: khảo sát tính phù hợp của hệ thống, tính đặc
hiệu, tính tuyến tính, giới hạn phát hiện, độ chính xác và độ đúng. Quy trình phân tích
sau khi được thẩm định đã được áp dụng để định lượng hoạt chất (S)-amlodipin và xác
định tạp (R)-amlodipin trong một số chế phẩm chứa (S)-amlodipin trên thị trường.
Kết quả
Để xác định được điều kiện sắc ký thích hợp để phân tích đồng phân quang học của
amlodipine như sau: sử dụng cột C18 của Germini NX. Pha động là hỗn hợp methanol –
dung dịch đệm NaH2PO4 5 mM có chứa 17,5 mM SBE-β-CD và 0,3 mM PEG, pH 2,5
(25: 75, tt/tt). Tốc độ dòng 1 ml/ phút, nhiệt độ 30 oC, thể tích tiêm mẫu 10 µl, bước sóng
phát hiện 237 nm. Độ phân giải của các đồng phân lớn hơn 1,5. Giới hạn định lượng là
250 - 750 µg.mL-1. Độ lệch chuẩn tương đối dưới 2% (n = 6), độ phục hồi là 98 -102%,
phương pháp này phù hợp trong kiểm tra chất lượng.
Kết luận
Đã xây dựng được quy trình phân tách đồng phân quang học amlodipin bằng phương
HPLC sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang. Quy trình này có tính chọn lọc,
giới hạn phát hiện thấp, cho kết quả chính xác và độ lặp cao. Quy trình này đã được áp
dụng để định lượng (S)-amlodipin, xác định tạp đồng phân (S)-amlodipin trong một số
chế phẩm chứa (S)-amlodipin.
.
Master’s Thesis – Academic course: 2016 – 2018
Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210
CHIRAL SEPARATION OF (S)-AMLODIPINE ENANTIONMER BY RP-HPLC
USING CHIRAL MOBILE PHASE ADDITIVE
Tran My Thien Thanh
Supervisor: Assoc. Dr. Le Thi Thu Cuc; Dr. Phan Van Ho Nam
Keywords: HPLC, amlodipine, chiral separation, enantiomers.
Introduction
Amlodipine, a third generation dihydropyridine calcium antagonist that is in a group of
drugs called calcium channel blockers. It is used to lower blood pressure - to treat high
blood pressure (hypertension) - or to prevent chest pain (angina). Amlodipine has two
enantiomers called (S)-amlodipine and (R)-amlodipine. Only (S)-amlodipine is
biologically active, while the R) -amlodipine has many side effects. Most of the products
on the market are racemic amlodipine. However, to improve safety and effectiveness,
amlodipine is produced in the form of isomer (S)-amlodipine and was marketed several
years ago. In this study, we present the results of optical (S)-amlodipine analysis by
reverse-phase HPLC using a mobile phase containing the chiral separation agent.
Material and methods
This subject of this study was amlodipine and (S)-amlodipine. The aim of the study was
to investigate some important conditions affecting the separation process in order to
select analytical conditions that suitable in some chromatographic the parameters. Two
isomers must be completely separated. With the resolution of the enantiomers were more
than 1.5; the asymmetry factor is between 0.8 and 1.5. After finding out the appropriate
chromatographic conditions for separatation of amlodipine enantiomers, the method was
validated is system suitability, selectivity, linearity and range, limit of detection,
precision and accuracy. Then, the validated method was applied for quantification of (S)amlodipin and determination of (S)-amlodipin’s enantionmeric impurity in some
available (S)-amlodipin finhised products.
Results
The appropriate chromatographic conditions for a HPLC method was developped for the
chiral separation of amlodipine. The two enantiomers were separated on a Germini NX
C18 column. The mobile phase was methanol - phosphate buffer (5 mmol.mL-1
NaH2PO4, pH 2.5; containing 17.5 mM sulfobutylether-β-cyclodextrin (SBE-β-CD) and
0.3 mM polyethylene glycol-20000 (PEG) (25: 75, v/v) and UV detection at 237 nm. The
resolution of the enantiomers were more than 1,5. The effective range of quantification
for both enantiomers was 250 – 750 µg.mL-1. Relative standard deviation was below 2%
(n=6), the recovery range was 98 -102%. The method is suitable in quality control.
Conclusion
The HPLC approach for quality control of (S)-amlodipine and its enantiomeric impurity
was successfully developed using Germini NX C18 column. The validated method was
applied for quantification of (S)-amlodipine and determination of (S)-amlodipine’s
enantiomeric impurity in some available S)-amlodipine drugs
.
MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ………………
iv
DANH MỤC CÁC BẢNG………………………………………………. vi
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ………………………
ix
MỞ ĐẦU…………………………………………………………………. 1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………. 3
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ AMLODIPIN…………………………………….. 3
1.1.1. Tính chất vật lý................................................................................... 3
1.1.2. Tính chất hóa học…………………………………………………
4
1.1.3. Tác dụng dược lý................................................................................ 4
1.1.4. Chỉ định.............................................................................................. 4
1.1.5. Tương tác thuốc.................................................................................. 4
1.1.6. Định tính và định lượng…………………………………………….. 5
1.2. ĐẠI CƯƠNG VỀ ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG…………………….
6
1.2.1. Khái niệm về đồng phân đối quang………………………………… 6
1.2.2. Các phương pháp phân tích đồng phân đối quang…………………. 7
1.2.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích đồng phân đối quang………… 9
1.2.4. Điện di mao quản phân tích đồng phân đối quang…………………. 10
1.2.5. Một số phương pháp phân tích đồng phân đối quang khác………… 10
1.3. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)………………………
11
1.3.1. Khái niệm về phương pháp HPLC…………………………………. 11
1.3.2. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo ……………………………………… 11
1.3.3. Pha động trong sắc ký pha đảo……………………………… …….. 12
1.4. PHA ĐỘNG ĐỐI QUANG (CHIRAL MOBILE PHASE) …….......... 14
1.4.1. Khái niệm…………………………………………………………
14
1.4.2. Các tác nhân quang hoạt …………………………………………… 15
1.5. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG (S)-AML………………. 16
1.5.1. Một số đề tài nghiên cứu trong nước……………………………….. 17
.
i
1.5.2. Một số đề tài nghiên cứu ngoài nước………………………………. 16
CHƯƠNG 2- ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU….. 19
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU……………………………………….. 19
2.1.1. Đối tượng…………………………………………………………
19
2.1.2. Hóa chất…………………………………………………………….. 18
2.1.3. Trang thiết bị, dụng cụ……………………………………………… 19
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………………………………. 21
2.2.1. Xây dựng quy trình định lượng (S)-amlodipin ………………………
21
2.2.2. Thẩm định quy trình phân tích ……………………………………
23
2.3. ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG MỘT VÀI CHẾ
PHẨM (S)-AML TRÊN THỊ TRƯỜNG…………………………………
25
2.3.1. Định lượng (S)- amlodipin…………………………………………
25
2.3.2. Xác định tạp đồng phân (R)-amlodipin ................................................... 26
CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU..............................................
27
3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÁCH ĐỒNG PHÂN QUANG
HỌC (S)-AMLODIPN BẰNG HPLC SỬ DỤNG PHA ĐỘNG CÓ CHỨA
TÁC NHÂN ĐỐI QUANG.............................................................
27
3.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký................................................................... 27
3.1.2. Thẩm định quy trình phân tích (S)-amlodipin bằng HPLC sử dụng 40
pha động có chứa tác nhân đối quang ..........................................................
3.1.3. Dự thảo quy trình phân tích đồng phần quang học (S)-amlodipin
bằng phương pháp HPLC sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang... 50
3.1.4. Úng dụng quy trình để định lượng một vài chế phẩm (S)-amlodipin 52
trên trên thị trường…………………………………………………………
3.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÁCH ĐỒNG PHÂN QUANG
HỌC AMLODIPN BẰNG HPLC SỬ DỤNG CỘT CELLULOSE- 4.......
53
3.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký................................................................... 53
3.1.2. Thẩm định quy trình phân tích (S)-amlodipin bằng HPLC sử dụng
cột cellulose-4.............................................................................................. 57
.
i
3.2.3. Dự thảo quy trình phân tích đồng phân quang học (S) amlodipin
bằng phương pháp HPLC sử dụng cột cellulose-4.………………………
68
3.2.4. Úng dụng quy trình để định lượng một vài chế phẩm (S)-amlodipin 70
trên trên thị trường…………………………………………………………
CHƯƠNG 4 – BÀN LUẬN………………………………………… 72
CHƯƠNG 5 –KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ..........................................
76
5.1. Kết luận................................................................................................
76
5.2. Kiên nghị..............................................................................................
76
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................
77
PHỤ LỤC...................................................................................................
82
.
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên tiếng Anh
Tên Tiếng Việt
(R )-AML
(R)-amlodipin
(R)-amlodipin
(S)-AML
(S)-amlodipin
(S)-amlodipin
ACN
Acetonitril
AML
Amlodippin
BDS
Base deactivated Silanol
CE
Capillary electrophoresis
CM-β-CD
Carboxymethyl- beta-cyclodextrin
CSPs
Chiral stationary phases
Từ viết tắt
Amlodippin
Điện di mao quản
Pha tĩnh bất đối
Đối chiếu
ĐC
DE
Dextrose
DHP
Dihydropyridin
EMEA
European Medicines Evaluation Agency
FDA
Food and Drug Administration
HPLC
High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng
Dihydropyridin
cao
HP-β-CD
Hydroxyl propyl - beta- cyclodextrin
HS-α-CD
Highly sulfated-alpha-cyclodextin
IR
Infrared
Hồng ngoại
LOD
Limit of detection
Giới hạn phát hiện
LOQ
Limit of quantification
Giới hạn định lượng
MeOH
Methanol
MIP-
Molecularly Imprinted Polymer- column
colum
MS
Mass spectrometry
.
Khối phổ
NSAID
Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs
PEG
Polyethylene glycol
RP-HPLC
Revesed phase -high performance liquid
Sắc kí lỏng hiệu năng
chromatography
cao pha đảo
SBE-β-CD
Sulfobutylether- beta- cyclodextrin
Sắc ký đồ
SKĐ
TEA
Triethylamin
TLTK
Tài liệu tham khảo
TT
Thuốc thử
UV
Ultra violet
α-CD
Alpha-cyclodextrin
β-CD
Beta-cyclodextrin
.
Tử ngoại
i
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Danh mục các chất đối chiếu……………………………………
19
Bảng 2.2. Danh mục hóa chất thuốc thử……………………………………
19
Bảng 2.3. Danh mục trang thiết bị, dụng cụ………………………………..
20
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát các cột sắc ký khác nhau………………………. 27
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát các tác nhân đối quang khác nhau……………..
29
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát các nồng độ tác nhân đối quang khác nhau……
29
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát các nồng độ pH dung dịch khác nhau ………… 32
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát các nồng độ PEG khác nhau………………......
34
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát các nồng độ NaH2PO4 khác nhau.......................
34
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát các tỷ lệ pha động khác nhau…………………
38
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống trên mẫu chuẩn
Amlodipin (n=6)…………………………………………………………….
40
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống trên mẫu chuẩn (S)amlodipin (n=6)…………………………………………………………….
41
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát tính tuyến tính của mẫu chuẩn amlodipin……
44
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát tính tuyến tính của mẫu chuẩn (S)- amlodipine 45
Bảng 3.12. Phương trình hồi quy, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện đồng
phân amlodipin trong mẫu chuẩn amlodipin và mẫu chuẩn (S)-amlodipin…
46
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ lập lại của viên nén amlodipine (đồng phân
(S)-amlodipin)……………………………………………………………….
47
Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ lập lại của viên nén amlodipin (đồng phân 47
(R)-amlodipin)……………………………………………………………….
Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ lặp lại của viên nén (S)-amlodipin………… 48
Bảng 3.16. Kết quả khảo sát độ đúng của viên nén amlodipin (n=9) (đồng
phân (S)-amlodipin)…………………………………………………………. 48
.
i
Bảng 3.17. Kết quả khảo sát độ đúng của viên nén amlodipin (đồng phân
49
(R-amlodipin)……………………………………………………………….
Bảng 3.18. Kết quả khảo sát độ đúng của viên nén (S)-amlodipin…………... 49
Bảng 3.19. Kết quả khảo sát LOD (µg/ml) và LOQ (µg/ml) của viên nén (S)
amlodipin…………………………………………………………………..
50
Bảng 3.20. Kết quả định lượng (S)-amlodipin trong các chế phẩm………
52
Bảng 3.21. Kết quả khảo sát tạp đồng phân (R)-amlodipin trong các chế
phẩm ………………………………………………………………………... 52
Bảng 3.22. Kết quả khảo sát các cột sắc ký cellulose khác nhau…………… 54
Bảng 3.23. Kết quả khảo sát các tỷ lệ pha động khác nhau………………..
55
Bảng 3.24. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống trên mẫu chuẩn
amlodipin (n=6)……………………………………………………………..
57
Bảng 3.25. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống trên mẫu chuẩn (S)amlodipin (n=6)……………………………………………………………..
58
Bảng 3.26. Kết quả khảo sát tính tuyến tính của mẫu chuẩn amlodipine…..
61
Bảng 3.27. Kết quả khảo sát tính tuyến tính của mẫu chuẩn (S)- amlodipin
61
Bảng 3.28. Phương trình hồi quy, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện đồng 64
phân amlodipin trong mẫu chuẩn amlodipin và mẫu chuẩn (S)-amlodipin….
Bảng 3.29. Kết quả khảo sát độ lập lại của viên nén amlodipine (đồng phân
(R)-amlodipin)………………………………………………………………. 64
Bảng 3.30. Kết quả khảo sát độ lập lại của viên nén amlodipin (đồng phân 65
(S)-amlodipin)………………………………………………………………
Bảng 3.31. Kết quả khảo sát độ lặp lại của viên nén (S)-amlodipin………..
65
Bảng 3.32. Kết quả khảo sát độ đúng của viên nén amlodipin (n=9) (đồng
phân (R-amlodipin)………………………………………………………….
66
Bảng 3.33. Kết quả khảo sát độ đúng của viên nén amlodipin (đồng phân
(S)-amlodipin)……………………………………………………………….
.
66
ii
Bảng 3.34. Kết quả khảo sát độ đúng của viên nén (S)-amlodipin ………… 67
Bảng 3.35. Kết quả khảo sát LOD (µg/ml) và LOQ (µg/ml) của viên nén (S) 67
amlodipin…………………………………………………………………..
Bảng 3.36. Kết quả định lượng (S)-amlodipin trong các chế phẩm…………. 70
Bảng 3.37. Kết quả khảo sát tạp đồng phân (R)-amlodipin trong các chế 70
phẩm…………………………………………………………………………
Bảng 4.1. So sánh các thông số sắc ký khi sử dụng cột sắc ký có chức tác
nhân đối quang SBE-β-CD và cột cellulose-4 để phân tích (S)-AML……..
.
73
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của amlodipin………………………………… 3
Hình 1.2. Độ nhớt của hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ ở 25oC………...
13
Hình 3.1. SKĐ của dung dịch chuẩn amlodipin tại các cột sắc ký khảo sát .
27
Hình 3.2 Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của cột sắc ký PHLC lên độ phân giải
và thời gian phân tách đồng phân amlodipine………………………
28
Hình 3.3. SKĐ khảo sát trên các tác nhân đối quang khác nhau …………..
29
Hình 3.4. SKĐ khảo sát sự tách đồng phân (thay đổi nồng độ tác nhân đối
quang)…………………………...................................................................... 31
Hình 3.5. Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của các nồng độ tác nhân đối quang
Sulfobutyl ether- β-cyclodextrin (SBE-β-CD) khác nhau lên độ phân giải và
thời gian phân tách đồng phân amlodipin………………………………
31
Hình 3.6. SKĐ khảo sát sự tách đồng phân (thay đổi pH của pha động) …… 33
Hình 3.7. Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của các nồng độ pH dung dich khác 34
nhau lên độ phân giải và thời gian phân tách đồng phân amlodipine………
Hình 3.8. SKĐ khảo sát sự tách đồng phân (khác PEG)……………………. 35
Hình 3.9. Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của các nồng độ PEG khác nhau lên
độ phân giải và thời gian phân tách đồng phân amlodipine………………..
35
Hình 3.10. SKĐ khảo sát sự tách đồng phân (khác nồng độ đệm NaH2PO4)
37
Hình 3.11. Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của các nồng độ NaH2PO khác nhau 37
lên độ phân giải và thời gian phân tách đồng phân amlodipin …………….
Hình 3.12. SKĐ khảo sát sự tách đồng phân (khác tỷ lệ pha động)……….
39
Hình 3.13. Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của các tỷ lệ pha động khác nhau
39
lên độ phân giải và thời gian phân tách đồng phân amlodipin ……………..
Hình 3.14. Sắc ký đồ mẫu chuẩn amlodipin ………………………………
41
Hình 3.15. Sắc ký đồ mẫu chuẩn (S)-amlodipin ……………………….....
41
Hình 3.16. Sắc ký đồ của chuẩn amlodipin +chuẩn (S)-amlodipin……….
42
Hình 3.17. Sắc ký đồ mẫu thử amlodipin.....................................................
42
Hình 3.18. Sắc ký đồ của mẫu trắng ……………………………………….
42
.
Hình 3.19. Sắc ký đồ của mẫu trắng thêm chuẩn…………………………
42
Hình 3.20. Sắc ký đồ mẫu thử (S)-amlodipin………………………………
42
Hình 3.21. Độ tinh khiết của pic (S)-amlodipin trong mẫu thử……………
42
Hình 3.22. Phổ UV tại thời gian lưu của pic (S)-amlodipin trong mẫu
chuẩn………………………………………………………………………..
43
Hình 3.23. Phổ UV tại thời gian lưu của pic (R)-amlodipin trong mẫu chuẩn 43
Hình 3.24. Phổ UV tại thời gian lưu của pic (S)-amlodipin trong mẫu thử..
43
Hình 3.25. Phổ UV tại thời gian lưu của pic (R)-amlodipin trong mẫu thử…
43
Hình 3.26. Mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích đỉnh (S)-amlodipin……. 44
Hình 3.27. Mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích đỉnh (R)-amlodipin……
44
Hình 3.28. Mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích đỉnh (S)-amlodipin
45
Hình 3.29. Sắc ký đồ mẫu chuẩn amlodipin nồng độ 0,3 µg/ml……………
46
Hình 3.30. Sắc ký đồ mẫu chuẩn amlodipin nồng độ 0,2 µg/ml……………. 46
Hình 3.31. Sắc ký đồ mẫu chuẩn amlodipin nồng độ 0,1 µg/ml……………. 46
Hình 3.32. Sắc ký đồ của mẫu Viên nén Safeesem 2,5 ((S)-amlodipin 2,5mg)
53
Hình 3.33. Sắc ký đồ của mẫu Viên nén Safeesem 5 ((S)-amlodipin 5mg)......
53
Hình 3.34. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn (S)-amlodipin………………………………
53
Hình 3.35 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn (R)-amlodipin………………………………
53
Hình 3.36. SKĐ kết quả khảo sát các cột cellulose khác nhau.....................
54
Hình 3.37. SKĐ khảo sát trên các tỷ lệ pha động…………………………..
56
Hình 3.38. Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của các tỷ lệ pha động khác nhau lên
độ phân giải và thời gian phân tách đồng phân amlodipine…………….
56
Hình 3.39. Sắc ký đồ mẫu chuẩn amlodipine……………………………..
58
Hình 3.40. Sắc ký đồ mẫu chuẩn (S)-amlodipin……………………………. 58
Hình 3.41. Sắc ký đồ của chuẩn amlodipin +chuẩn (S)-amlodipin………… 59
Hình 3.42. Sắc ký đồ mẫu thử amlodipin…………………………………… 59
Hình 3.43. Sắc ký đồ của mẫu trắng …………………………...................... 59
Hình 3.44. Sắc ký đồ của mẫu trắng thêm chuẩn…………………………
59
Hình 3.45. Sắc ký đồ mẫu thử (S)-amlodipin………………………………
59
.
i
Hình 3.46. Độ tinh khiết của pic (S)-amlodipin trong mẫu thử……………
60
Hình 3.47. Phổ UV tại thời gian lưu của pic (S)-amlodipin trong mẫu
60
chuẩn…………………………………………………………………………
Hình 3.48. Phổ UV tại thời gian lưu của pic (R)-amlodipin trong mẫu
chuẩn………………………………………………………………………..
60
Hình 3.49. Phổ UV tại thời gian lưu của pic (S)-amlodipin trong mẫu thử… 60
Hình 3.50. Phổ UV tại thời gian lưu của pic (R)-amlodipin trong mẫu thử…. 60
Hình 3.51. Mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích đỉnh (R)-amlodipin……
61
Hình 3.52. Mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích đỉnh (S)-amlodipin……. 62
Hình 3.53. Mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích đỉnh (S)-amlodipin……. 60
Hình 3.54. Sắc ký đồ mẫu chuẩn amlodipine nồng độ 0,3 µg/ml………….
63
Hình 3.55. Sắc ký đồ mẫu chuẩn amlodipine nồng độ 0,2 µg/ml………….
63
Hình 3.56. Sắc ký đồ mẫu chuẩn amlodipine nồng độ 0,1 µg/ml………….
63
Hình 3.57. Sắc ký đồ của mẫu Viên nén Safeesem 2,5 ((S)-Amlodipin 2,5mg)
70
Hình 3.58. Sắc ký đồ của mẫu Viên nén Safeesem 2,5 ((S)-Amlodipin 5
70
mg)...................................................................................................................
Hình 3.59. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn (S)-amlodipin………………………..
70
Hình 3.60. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn (R)-amlodipin………………………
70
.
MỞ ĐẦU
Các đồng phân quang học có thể khác nhau về tính chất dược động học, dược lý học
hay độc tính. Khơng hiếm các trường hợp chỉ một đối quang có hoạt tính trong khi
đối quang kia lại gây độc cho cơ thể. Trong hướng dẫn của FDA (Mỹ) hay EMEA
(Châu Âu) đều nhấn mạnh việc tách riêng các đối quang và đánh giá sự đóng góp của
mỗi đối quang với tác dụng của thuốc [18]. Hiện nay, các chế phẩm thuốc đang lưu
hành ở dạng đồng phân riêng lẻ ngày càng phổ biến dẫn đến yêu cầu phát triển các
phương pháp phân tích đồng phân quang học nhằm phục vụ cho kiểm nghiệm tạp
đồng phân của nguyên liệu và các chế phẩm thuốc trên thị trường.
Amlodipin (AML) là thế hệ thứ ba của thuốc ức chế kênh calci thuộc nhóm
dihydropyridin (DHP) có khả năng chặn kênh calci được sử dụng trong điều trị bệnh
cao huyết áp và chứng đau thắt ngực. AML được sử dụng trong điều trị chứng đau
thắt ngực ổn định mạn tính và trong điều trị tăng huyết áp từ nhẹ đến trung bình [36].
Giống như hầu hết các chất ức chế kênh calci khác của nhóm dihydropyridin, AML
thường được sử dụng trong điều trị dưới dạng racemic. Tuy nhiên, đồng phân (R) và
(S) khơng có cùng hoạt tính sinh học. Chỉ có (S)-AML có thuộc tính giãn mạch [10],
tác dụng của nó tương đương với dạng racemic nhưng ít tác dụng phụ hơn [35] trong
khi đó phù, đau đầu, chóng mặt, rát mặt và các phản ứng phụ khác đến từ (R)-AML
[17]. (S)-AML lại có tác dụng ức chế kênh calci mạnh, do tác động trên chuột mạnh
hơn hơn so với (R)-AML khoảng 1000 lần. Ngoài thời gian hoạt động dài hơn, (S)AML làm giảm nguy cơ tái nhịp nhanh, và độ thanh thải của bệnh nhân phụ thuộc
vào sự biến đổi nhiều hơn so với (R)-AML [33]. Do sự khác biệt đáng kể về dược
động học giữa hai dạng đồng phân quang học này và để cải thiện tính an tồn và hiệu
quả, AML được sản xuất dưới dạng đồng phân (S) và được đưa ra thị trường vài năm
trước. Vì vậy, đồng phân (R) coi như là tạp chất nên hạn chế sử dụng và cần được
thực hiện bởi các phương pháp phân tích nhanh và hiệu quả.
Có nhiều nghiên cứu phân tích các đồng phân quang học đã được báo cáo như sắc ký
lỏng ghép đầu dò khối phổ [41], điện di mao quản [4], [16],... Phương pháp CE rẻ
tiền do tiết kiệm dung mơi hóa chất nhưng độ ổn định và độ lặp lại của CE không
.
bằng HPLC. Vì vậy đề tài sử dụng HPLC để phân tách, đây là phương pháp vẫn được
áp dụng trong hầu hết các quy trình.
Các đồng phân quang học của AML đã được tách trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng
cao khi sử dụng pha tĩnh cột chiral (chiral stationary phases- CSPs) [27, 30] hoặc pha
động chứa chiral (chiral mobile phase additives- CMPAs) [12, 37, 40]. Do các cột bất
đối thường đắt tiền và không thông dụng. Nên trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu
và ứng dụng phương pháp để định lượng (S)-AML trên HPLC với pha động có chứa
tác nhân đối quang. Đề tài giúp giảm chi phí và góp phần xây dựng tiêu chuẩn chất
lượng cho viên nén chứa (S)-amlodipin để có thể áp dụng trong kiểm tra chất lượng
và tiêu chuẩn hóa. Đề tài “Xây dựng quy trình định lượng (S)-amlodipin bằng phương
pháp HPLC pha đảo sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang” được thực hiện
với các mục tiêu sau:
- Khảo sát các pha động có chứa tác nhân đối quang có thể tách (S)-amlodipin bằng
phương pháp HPLC.
- Thẩm định phương pháp định lượng (S)-amlodipin bằng HPLC sử dụng pha động
có chứa tác nhân đối quang.
- Ứng dụng quy trình để định lượng một vài chế phẩm (S)-amlodipin trên thị trường
.
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ AMLODIPIN
Cơng thức cấu tạo:
(S)-AML
(R)-AML
Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của amlodipin
CÔNG THỨC PHÂN TỬ : C20H25CLN2O5
Danh pháp: 3-ethyl 5-methyl (4RS)-2-[(2-aminoethoxy)methyl]-4-(2-clorophenyl)6-methyl-1,4-dihydropyridin-3,5-dicarboxylat.
Khối lượng phân tử : 408,879 g/mol
Tên thường: Amlodipin besylat (Amlodipin tồn tại dưới dạng muối amlodipin besilat,
trong chế phẩm có chứa từ 95,0 đến 102,0 % : C20H25ClN2O5.C6H5SO3H
Khối lượng phân tử: 567,06 g/mol
pKa = 8,6
1.1.1. Tính chất vật lý [1]: Bột kết tinh màu trắng. Dễ tan trong methanol, hơi tan
trong ethanol, khó tan trong nước và 2-propanol.
.
1.1.2. Tính chất hóa học [8]
Nhân thơm
: Hấp thụ UV.
Nhóm chức este
: Các phản ứng thủy phân.
Nhóm NH2
: Tính khử và tính base.
Nhân dihydropyridin
: Tính base và tính khử, bị oxy hóa bởi Ce2+ tạo thành
pyridin, ứng dụng trong định lượng.
1.1.3. Tác dụng dược lý
AML có tác dụng chống tăng huyết áp, làm tăng lưu lượng máu ở thận và cải thiện
chức năng thận. Có thể dùng AML để điều trị tăng huyết áp ở người bệnh đái tháo
đường. AML tác dụng chậm nên ít có nguy cơ hạ huyết áp cấp hoặc nhịp nhanh phản
xạ. AML có tác dụng chống đau thắt ngực, thời gian chống đau kéo dài 24 giờ. Người
bệnh có thể dùng phối hợp với thuốc chẹn beta và nitrat trong điều trị đau thắt ngực.
Amlodipin là dẫn chất của dihydropyridin có tác dụng chẹn calci qua màng tế bào.
Trong phân tử amlodipin có một nguyên tử carbon bất đối nên amlodipin tồn tại dưới
dạng hỗn hợp racemic của 2 đồng phân đối quang. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh
trong hai đồng phân của amlodipin thì đồng phân tả truyền (levamlodipin S(-)amlodipin) đóng vai trị chính để tạo ra tác dụng điều trị tăng huyết áp và đau thắt
ngực. (S)-amlodipin có hoạt lực mạnh hơn (R)-amlodipin 1000 lần [29].
1.1.4. Chỉ định [11]
- Tăng huyết áp (có thể dùng cho bệnh nhân đái tháo đường)
- Dự phòng ở người bệnh đau thắt ngực ổn định
1.1.5. Tương tác thuốc [1]
- Thuốc gây mê: làm giảm huyết áp mạnh
- Lithi: Khi dùng cùng với amlodipin, có thể gây độc thần kinh, buồn nôn, ỉa chảy
- NSAID đặc biệt là indomethacin do ức chế prostaglandin hoặc giữ natri và dịch nên
làm giảm tác dụng chống tăng huyết áp của amlodipin
- Amlodipin liên kết cao với protein huyết tương do đó cần thận trọng với những
thuốc liên kết với protein huyết tương (thay đổi nồng độ thuốc)
.
1.1.6. Định tính và định lượng
1.1.6.1. Các phương pháp định tính
Phổ hồng ngoại [1, 16]
Nguyên tắc: So sánh phổ hồng ngoại của chất thử và chất chuẩn AML.
Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của amlodipin besilat
chuẩn đối chiếu
Phổ tử ngoại [20]
Nguyên tắc: AML có khả năng hấp thu tử ngoại, cực đại hấp thu của AML trong dung
môi acid hydrocloric 0,1N/ methanol (TT) là 360 nm (quét phổ từ 300 - 400 nm).
Sắc kí lớp mỏng [38]
Nguyên tắc: Tiến hành phương pháp sắc ký lớp mỏng đối với chất thử và chất đối
chiếu AML. Kết quả trên sắc ký đồ dung dịch thử phải cho vết chính tương ứng về vị
trí, kích thước và màu sắc với vết chính của dung dịch đối chiếu khi quan sát dưới
đèn tử ngoại 366 nm.
Điểm chảy
AML có điểm chảy từ 178 - 179 oC.
1.1.6.2. Các phương pháp định lượng
- Phương pháp acid- base trong acid acetic khan: dung dịch chuẩn là HClO4 0,1M,
phương pháp đo thế.
- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [11]
Điều kiện sắc ký
Kích thước cột
: l = 0,25 m, Ø = 4,0 mm;
Pha tĩnh
: octadecylsilyl silica gel (5 μm);
Nhiệt độ cột
: 30 °C.
Pha động
: 2,3 g /L dung dịch ammonium acetat, methanol (30:70).
Tốc độ dịng
: 1,5 ml / phút.
Bước sóng phát hiện : 237 nm.
Thời gian chạy phân tích: tương đương hai lần thời gian lưu của amlodipin.
.
Dung dịch thử: Hòa tan 50,0 mg chế phẩm trong pha động, pha lỗng thành 50,0 ml
với cùng dung mơi. Hút chính xác 5,0 ml dung dịch thu được pha lỗng thành 100,0
ml bằng pha động.
Dung dịch đối chiếu: Hịa tan 50,0 mg amlodipin besylat chuẩn (ĐC) trong pha động,
pha lỗng thành 50,0 ml với cùng dung mơi pha động. Hút chính xác 5,0 ml dung
dịch thu được pha lỗng thành 100,0 ml bằng pha động.
Tiến hành sắc ký với dung dịch thử, dung dịch đối chiếu.
Tính hàm lượng của C20H25ClN2O5.C6H6O3S dựa vào diện tích pic đáp ứng của dung
dịch thử và dung dịch chuẩn và hàm lượng được công bố của C20H25ClN2O5.C6H6O3S
trong amlodipin besylat chuẩn.
1.1.6.3. Các chế phẩm hiện có trên thị trường:
Các chế phẩm hiện có trên thị trường chủ yếu tồn tại ở dạng racemic, một số ít tồn tại
ở dạng (S)-amlodipin:
- Dạng racemic: Amlodipin 5mg, Amlor 5 mg (Thái Lan), Norvasc,...
- Dạng (S)-amlodipin: Asomex 2,5mg và Asomex 5mg, S-amcad 2,5mg (Cipla - Ấn
Độ)
Các chế phẩm thường ở hai dạng bào chế là viên nén và viên nang.
1.2. ĐẠI CƯƠNG VỀ ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG [6]
1.2.1. Khái niệm về đồng phân đối quang
Đồng phân đối quang (enantiomers) là hai đồng phân không gian dạng ảnh và vật qua
gương. Chúng có cơng thức hóa học hồn tồn giống nhau, chỉ khác về cách bố trí
khơng gian của các nhóm thế quanh cacbon bất đối. Đồng phân quang học là hiện
tượng đồng phân có liên quan đến sự khác nhau về góc quay của mặt phẳng ánh sáng
phân cực. Điều kiện cho tính quang hoạt chính là: cấu trúc hình học của phân tử phải
như thế nào đó để phân tử khơng chồng khít với hình ảnh trong gương của nó tương
tự như quan hệ giữa bàn tay phải và bàn tay tráí (chirality). Ngồi ra sự khác biệt
trong cấu trúc phân tử theo kiểu như sự khác biệt của bàn tay phải và bàn tay trái, khả
năng quay mặt phẳng ánh sáng phân cực theo những góc bằng nhau nhưng ngược
chiều nhau, cịn lại tất cả các tính chất lí hóa thơng thường của các đồng phần đó là
.
giống nhau. Chất mà có khả năng làm quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực một
góc α nào đó gọi là chất quang hoạt.
Cấu hình R và S (cấu hình tuyệt đối): khi nguyên tử cacbon liên kết với 4 nguyên tử
hoặc nhóm nguyên tử khác nhau C*abcd. Thiết lập trình tự ưu tiên của cacbon bất đối:
a>b>c>d . Người ta quan sát phân tử theo trục C-d từ phía ngược chiều với d nếu từ
a->b ->c theo chiều kim đồng hồ thì cấu hình là R (rectus = phải), theo chiều ngược
kim đồng hồ thì là cấu hình S (sinister = trái) trong đấy thứ tự ưu tiên a-b-c theo CahnIngold- Prelog như sau
–I> Br> Cl> S> F> O> N> C> H
-COOH> -C=O> -CHO> -CH2OH> -CH=R> -CH3 ( R ở đây chỉ các CH3).
Chính sự khác nhau về cấu trúc khơng gian này đã làm cho chúng có tương tác khác
nhau với các thụ thể sinh học, cũng như chất mang, receptor, enzym. Vì thế, đặc tính
dược động học, cũng như đặc tính dược lý của hai đồng phân đối quang của một số
thuốc rất khác nhau. Có tới một nửa các dược chất đang sử dụng hiện nay có đồng
phân đối quang, mà 1/3 trong số đó có các đồng phân đối quang mang đặc tính dược
lý hoặc dược động học khác nhau.
1.2.2. Các phương pháp phân tích đồng phân đối quang
Phân tích đồng phân đối quang là một trong những chủ đề khó trong hóa phân tích do
bản chất lí hóa q gần nhau của hai đồng phân đối quang trong mỗi cặp đồng phân
đối quang. Các đồng phân đối quang có thể được tách bằng hai cách: trực tiếp hoặc
gián tiếp.
Theo cách gián tiếp: hai đồng phân này được tạo dẫn chất với một hợp chất đối quang
khác để tạo ra hai sản phẩm là đồng phân quang học, nhưng không phải là đối quang
(diastereodisomers), như vậy chúng sẽ có tính chất vật lý và hóa lý khác nhau nhiều
hơn, do đó sẽ dễ tách ra khỏi nhau hơn [14,42,43].
Theo cách trực tiếp: các đồng phân đối quang được tách bằng một công cụ phân tích
có hiệu năng tách cao, và phải có sự góp mặt của một hay nhiều chất chọn lọc đối
quang. Các chất chọn lọc đối quang này có đặc điểm là tương tác khác nhau đối với
các đồng phân đối quang, do có cấu trúc khơng gian của chúng. Có nhiều nhóm chất
.
chọn lọc đối quang, được phân loại tùy theo cấu trúc của chúng; các cyclodextrin và
dẫn chất; các oligo và polysaccarid, crown ether, các kháng sinh vòng lớn, các chất
trao đổi ion, các chất diện hoạt và các calixaren [31]
Đặc điểm duy nhất có thể lợi dụng để tách riêng hai đồng phân đối quang là khả năng
tương tác khác nhau của chúng với những chất có ái lực đặc biệt với mỗi đồng phân
đối quang của một hỗn hợp racemic. Những chất này được gọi là chất chọn lọc đối
quang (chiral selector). Các chất này được đưa vào hệ thống tách để tương tác trực
tiếp với hỗn hợp đồng phân đối quang. Khi mức độ khác biệt giữa quá trình tương tác
với chất chọn lọc đối quang giữa hai đồng phân đối quang đủ lớn, chúng sẽ được tách
riêng. Các chất chọn lọc đối quang có bản chất hóa học khá đa dạng, có thể chia thành
các nhóm chính sau:
Nhóm 1: có bản chất protein (albumin huyết thanh (HAS, HBA), α1- acidglycoprotein (AGP),…),cyclopeptid, có một số kháng sinh macrocyclic glycopeptid
(vancomycin, teicoplanin, avoparcin, turbocuracin..) đã được dùng để tách nhiều
đồng phân đối quang.
Nhóm 2: các oligosaccarid khơng vịng và dẫn chất polysaccarid, phần lớn là các phân
tử monosaccarid. Một số phân tử disaccarid, trisaccarid cũng có thể ảnh hưởng giống
như mono saccarid tự nhiên đó là vị trí liên kết và loại liên kết tạo nên khả năng nhận
biết chất đối quang. Các chất hay dùng là dẫn chất maltoz , lactoz, sucroz, amyloz,
cellulose...
Nhóm 3: chất chọn lọc đối quang dựa trên cấu trúc tạo thành một “hốc” chọn lọc đối
quang (chiral cavity). Đây là các cyclodextrin (CD) và dẫn chất (β-cyclodextrin, dẫn
chất sulfat hóa, alkylhydroxyl hóa của β-CD), ether vịng, polymer.
Nhóm 4: chất chọn lọc đối quang dựa trên tương tác giữa nhóm cho điện tử π và nhóm
nhận điện tử π (chất chọn lọc kiểu Pirkle).
Nhóm 5: trao đổi lignand (ion đồng tạo phức với nhóm hoạt quang).
Sử dụng các chất chọn lọc đối quang kể trên, nhiều phương pháp đã được sử dụng để
phân tích các đồng phân đối quang, chủ yếu dựa trên các quá tình sắc kí (lỏng, khí,
.
pha siêu tới hạn) và điện di. Trong đó hai kỹ thuật phổ biến nhất hiện nay để tách
đồng phân đối quang là sắc ký lỏng hiệu năng cao và điện di mao quản hiệu năng cao.
1.2.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích đồng phân đối quang
Có 3 lựa chọn để phân tách các đồng phân đối quang:
- Sử dụng pha tĩnh không gắn chất chọn lọc đồng phân đối quang và sử dụng pha
động chứa chất chọn lọc đối quang.
- Tạo dẫn chất để biến hai đồng phân đối quang thành hai diastereoisomers có thể
tách được bằng cách sử dụng pha tĩnh- pha động thông thường.
- Sử dụng pha tĩnh gắn chất chọn lọc đối quang và pha động không chứa chất chọn
lọc đối quang.
Lựa chọn thứ hai khó áp dụng do khó khăn trong việc tìm ra dẫn xuất phù hợp và độ
tin cậy của phương pháp bị ảnh hưởng bởi độ lặp lại của phản ứng tạo dẫn xuất.
Lựa chọn thứ ba là phương pháp được sử dụng khá phổ biến hiện nay do số lượng
pha tĩnh thương mại hóa sẵn có lớn, rất nhiều loại cột khác nhau, giúp người phân
tích có nhiều lựa chọn phù hợp với nhu cầu nhưng có một trở ngại là chi phí lớn cho
cột quang hoạt.
HPLC là phương pháp ứng dụng rộng nhất, cho phép tách các đồng phân đối quang
của hầu hết các hợp chất hoạt quang có tác dụng dược lý. Kỹ thuật này được áp dụng
cho cả trong phân tích và sản xuất đồng phân đối quang tinh khiết cho quy mô công
nghiệp.
Lựa chọn thứ nhất có nhiều hạn chế do tiêu thụ nhiều chất chọn lọc đối quang và hiệu
quả tách kém không lớn bằng điện di mao quản, nhưng ưu điểm là không sử dụng cột
quang hoạt đắt tiền vì thế cần phát triển nghiên cứu sâu hơn để áp dụng rộng rãi trong
phân tích dược chất.
1.2.4. Điện di mao quản phân tích đồng phân đối quang
Tương tự, các chất chọn lọc đối quang được sử dụng trong các pha tĩnh HPLC cũng
được sử dụng trong điện di mao quản. Nhưng ở đây các chất chọn lọc đối quang được
hòa tan vào dung dịch điện ly nền (background electrolyte-BGE).
.
