Ứng dụng IGG trong nghiên cứu đặc tính Lectin và phân loại tụ cầu khuẩn

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.37 MB, 5 trang )

(1)<div class='page_container' data-page=1>

TAP CHÍ KHO A H Ọ C ĐHQGHN, KHTN & CN. T.xx, số 2PT-, 2004

Ú N G D Ụ N G IG G T R O N G N G H IÊ N c ứ u Đ Ặ C T ÍN H L E C T IN VÀ
P H Â N L O Ạ I T Ụ C Ẩ U K H U Ẩ N

B ù i P h ư ơ n g T h u ậ n

K hoa S in h học, Trường Đ ại học Khoa học T ự nhiên, Đ H Q G H N
M ở đ ầ u

M ột tro n g n h ữ n g ứng dụng thự c tế của láp globulin m iễn dịch IgG là để tách và
nghiên cứu đặc tín h của các hợp c h ấ t sinh học n hư các glycoprotein, đặc biệt là lectin. Nhờ
vào k h ả n ăng gây ngưng k ế t và k ế t tủ a chọn lọc, lectin đ ang được sử dụng nhiều trong
nghiên cứu t ế bào và miễn dịch, để xác dịnh nhóm m áu ... [2,4,5]. N hững k ế t q u ả nghiên
cứu trước đây của chúng tơi cho thấy IgG có tương tác với lectin từ sam biên và m ột sô lectin
thực vật. T rong nghiên cứu này, chúng tôi xem xét ảnh hưởng của IgG lên phản ứng gây ngưng
kết tế bào vi khuẩn của lectin, nhằm mở rộng kh ả n ăn g ứng dụng IgG và lectin trên thực tế.

Chi tụ cầu k h u ẩ n (Staphylococcus) bao gồm nhiều tác n h â n gây bệnh cho ngưòi và
động vật. Thưòng chúng được chia làm hai loại dựa trên k h ả n ă n g làm đông h u yết tương
(phán ứng coagulase): loại dương tính, chủ yếu là Staph, aureus (tụ cầu vàng) gây bệnh
nhiều n h ất, còn loại ám tính là các lồi tụ cầu trắ n g (trong đó có Staph, negative coagulase
(SNC) và Staph. epiderm idỉs) ít gây tác hại hơn. Tuy nhiên, cách ph ân chia này khơng
chính xác và có khi gáy nhẩm lẫn. Do vậy, việc tìm ra m ột phương thức nh ận biết nhanh, nhạy
những khác biệt cơ b ản của hai loài tụ cầu này để phân loại chúng có ý nghĩa lớn trong thực tế.
N g u y ê n liệ u v à p h ư ơ n g p h á p

N guyên liêu:

-Dịch chiết lectin thô được chuẩn bị từ các m ẫu thực v ậ t (hoa, quả, h ạt) bằn g dung
dịch đệm PBS [2].

- Các chủng vi khuẩn

Staphylococcus

(do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp)

được nuôi cấy, xử lý, tạo huyền dịch và điều chỉnh đến độ đục thích hợp ỏ bước sóng 540 nm
trên m áy đo quang phổ.

- Chê phẩm LgG và h u yết tương (tách từ m áu người b ình thư òng do T ru n g tâm huyết
học v à truyền m áu T ru n g ương cung cấp).

P hư ơ n g p h á p n g h iê n cứ u

■ Xác đ ịnh k h ả n ăn g gây ngưng k ế t t ế bào vi k h u ẩ n của lectin [1]:

- Sử dụng kỹ th u ậ t ELISA [3] để nghiên cứu tương tác giữa IgG với lectin và vi khuẩn.
K ế t q u ả , t h ả o l u ậ n

1- T ác d ụ n g c ủ a IgG lê n p h ả n ứ ng g â y n g ư n g k ế t t ế bào vi k h u ẩ n c ủ a lec tin
a- H oạt tín h gã y ngưng kế t t ế bào vi kh u ẩ n của lectin

Một sô lectin biểu hiện kh ả n ăn g gây ngưng k ế t không chỉ trê n t ế bào hồng cầu, mà
cả trê n t ế bào vi k h u ẩn . Đặc tín h n ày có những ứng dụng r ấ t q u a n trọ n g tro n g nghiên cứu
miễn dịch v à trong địn h loại vi sinh v ật [1,6]. C húng tôi đã sử dụng các vi k h u ẩ n có ý nghía
về m ặt dịch tễ đan g được q u an tâ m là sáu chủng tụ cầu vàn g Staph, aureus (S. au) 4, 15,
16, 17, 25923 và 29213,; bốn chủng tụ cầu trắ n g là SNC 20 và 19, Staph, epiderm is (s . ep)
21, Staph, xy lu su s (S. xy) để nghiên cứu tương tác lectin - vi k h u ẩ n (kết quả ở h àn g trê n của
bảng 1) và tác dụng của IgG lên tương tác này (kết quả trong ngoặc đơn ở hàng dưới của bảng 1).

</div>
(2)<div class='page_container' data-page=2>

174 Bùi Phuơng Thuận
Các số liệu th u được cho thấy có sự khác biệt giữa các m ẫu trong biếu hiện ho ạt tính
lectin. Các m ẫu từ đậu ván, đậu dải, đậu trạch lai, lá và h ạ t hoè, hoa kim cúc, củ lay ơn đểu
ít tác dụng lẽn vi k h u ẩn (với số chủng bị ngưng k ết tôi đa chỉ là 10%) tu y có kh ả n ăn g gây

ngưng kết hồng cầu m ạnh. Ngược lại, m ẫu từ h ạ t móng bị đỏ, h ạ t gội tía và củ m ã th ầy (có
hoạt tín h gây ngưng k ế t hồng cầu r ấ t th ấp ) lại tác d ụ n g lẽn h ầ u h ế t (từ 80- 100%) sô chủng
tụ cầu th ử nghiệm.

Một sơ lectin có tác dụng liên k ế t chọn lọc với tụ cầu vàng, điển h ình )à lectin từ h ạ t
dậu ván (với chủng s . au 17), h ạ t đ ậu ngự (với mức độ ngưng k ế t khác b iệt rõ rệ t và giảm
dần giữa 5 chủng đầu: từ (3+) với s . a u 4 đến (+) với s . a u 25923), h ạ t n h ã n ... Ngược lại,
một số lectin khác l ạ i gây ngưng k ế t r ấ t đặc hiệu các chủng tụ cầu trán g , ví d ụ n h ư lectin từ
hoa, lá và đặc biệt rõ là chê phẩm lectin vô hoè với mức độ ngưng k ết giảm dần từ (4+) với
s.ep 21 xuống (2+) với S N C 19 và (+) với s .xy , hay n h ư lectin h ạ t hoè có tác dụng p hân loại
đặc hiệu hẹp khi gây ngưng k ế t tối đa (4+) và duy n h ấ t ch ủ n g s .x y . Do vậy, có th ể sử dụng
nhũng lectin này dể p hân b iệt giữa h a i loài tụ cầu, th ậ m chí giữa các ch ủ n g trong từ ng loài.

B ả n g 1. Tác dụng của IgG lên h o ạt độ gây ngưng k ế t t ế bào tụ cầu của lectin
TT

Lectin
(OD)90nm trong
ELISA với IgG)

Tu cầu vàng Tu cầu trắng

s.au

4 S.au15 s.au16 s.au 17 29213s.au 25923s. au SNC19 SNC 20 s.ep21 s.xy

1 Hat dánh dành + + +

(0,039) (•) (*) (-) (+) (-) (*) (-> (’) (-) (+)

2 Hat đâu vàn 2+

(0.044) <-) (') (-) (-) (-) (•) (•) (•) (■) (•)

3 Hat dàu dái

(0) (-) (-) (2+) (*) {-) (•) (•) (•) (-) H

4 Hat dâu ngư 3+ 2+ 2+ + +

(0,050) (+> (-) (-> (-) (+) (-) (-) (-) (•) (-)

5 Hat đàu trach lai +

(Ĩ,131) (•) (•) (-) (■> (-) (+) (■) (•) (-> (-)

6 vỏhoè ♦ + +

(0,030) (+) (•) (■) (-) (•) (+) <•) (■) (•) H

7 Vị h (chế phầm) 2+ 4+ +

(0,078) (♦) (•) (-) {") (•) (•) (+) (■) {-) (+)

8 Hoa hoè + 2+

(0,068) (•) (-) (-) (•) (*) (•) (-) (■) (-) (-)

9 Hat hoè 4+

(0,032) (") (-> (-) (*) (-) (•) (-) (-) (•) (3+)

10 Cù lay ơn +

(0) (-) (+) (-) (-) (+) (■) (■) (*) (■) (-)

11 Hat gòi (ia 4+ 4+ 4+ 4+ 2* 4+ 3+ 4+

(0,269) <♦) (♦) (-) (•) (-) (-) (2+) (*) (■) (-)

12 Củ mả [háy 2+ + 2+ 4+ 3+ 2+ 2+ 3+ 3+ 4+

(0,095) (2+) (+) (2+) (+) (3+) {♦) (2+) {*) (-) (2+)

13 Hạl móng bổ dỏ 2+ 3+ + 2+ + * 2+ 2+

(4+) (2+) (*) (2+) (3+) H (+) (•) (•) (2+)

14 Hạt nhản + 2+

(+) W H ('-) (2+) (•) (-) (-) (-) (■)

15 Hal vải + + + + 2+

(o!ũ49) (2+) (-) (-) (-) (+) (-) (+) (-) (") (2+)

16 Huyết thanh sam + 2* + + 2+ 3+ +

(0,962) <♦) (+) (■) (2+) (3+) {-) <■) W (-) (+)

</div>
(3)<div class='page_container' data-page=3>

I Sig dung lg(i Irong nphign cứu dặc lính lectin vã. 175

Sự khác n hau trong h o ạ t tín h gáy ngưng kết tẽ bào vi k h u ẩn của các loại lectin cho
thấy có sự khơng đổng n h ấ t vể th ụ th ể (các đường - tru n g tám tương tác với lectin), hoặc về
th à n h phần và kiểu liên k ế t củ a th ụ thể với các gốc oligosaccharide và polypeptide có trên
bê m ặt các chủng Staphylococcus. Chính vì có khả n ăng n hận b iết sự sai khác này mà lectin
đã trớ th àn h m ột công cụ đắc lực trong n hận dạng và định loại vi sinh vật, th ay th ế cho các
phương pháp phân loại phức tạ p và tốn kém thưòng dùng [1,6].

b-Tác d ụ n g của IgG

B áng 1 củng cho th ấy IgG có những tác dụng khác n h a u lên p hản ứng ngưng k ế t giữa
lectin với tế bào lụ cầu. T rong 21% trường hợp, hoạt độ gáy ngưng k ế t của lectin lên tê bào
tụ cầu bị giám, cho thấy có tá c dụng ức chẽ của IgG (so vái 75% sô m ẫu bị ức chê hoạt độ
gây ngưng kết hồng cầu). H iện tượng này có thể do tru n g tâm liên k ế t saccharide của lectin
bị IgG phong toả nên khõng tiệp'xúc được với trung tâm tương tác với lectin trên bể m ặt tế
bào. dần đến m ất kh ả n ăng gâỹ-ĩigưng kết t ế bào.

Điểu khá lý th ú là IgG còn làm tán g phản ứng ngưng k ế t của lectin vối m ột sô chủng
tụ cầu vàng, như trưòng.hợp của lectin từ h ạ t móng bị đỏ với các chủng s .a u 4, 29213 và
17, h u y ết th anh sam với s .a u 29213 và 17, m ẫu h ạ t vải vối s .a u 4... Đặc biệt, lectin từ một
số m ầu chi biếu hiện khả n ăng gãv ngưng k ế t tê bào tụ cầu vàng khi có IgG: m ẫu h ạ t dành
d ành với s .a u 17, m ẫu đ ậu dải vói s .a u 16, m ẫu củ lay ơn với s .a u 15 và 29213 ...H iện
tượng này không th ấy có ờ các chủng tụ cầu trắng, và cũng khác với th ử nghiệm trẽn hoạt
tính gây ngưng kết hồng cầu với các ch ấ t ức chế thông thường (như các loại đường đơn). Do
vậy, có thê sử dụng IgG phôi hợp với m ột số lectin để n h ận dạng các chủng tụ cầu vàng.
Đồng thời điều này còn gợi ra rằ n g phải chảng IgG tự nó cũng có k h ả năn g gây ngưng kết tẽ
bào tụ cầu vàng? Đê khảng đ ịnh giá th iết này, chúng tôi tiến h à n h khảo s á t khả nảng lương
tác của IgG và t ế bào vi k h u ẩ n bằn g ELISA là một kỹ th u ậ t r ấ t n hạy và ít chịu ản h hưdng
của yếu tô chủ quan.

2- N g h iê n cứ u tư ơ ng tá c củ a IgG với lec tin và vi k h u ẩ n b a n g k ỹ t h u ậ t E L ISA
a ■ Tương tác IgG-lectin

Sô' đo độ h ấp th u q u an g (OD490nm) trên bảng 1 (ỏ phía dưới tên các lectin) biểu th ị mức
độ b ắ t giữ k h án g th ể IgG của các m ẫu lectin khi được sử dụng làm k h án g nguyên gắn bàn.
Tác dụng m ạnh n h ấ t là của m ẫu h u yết th an h sam (OD = 0,921), tiếp theo là m ẫu h ạ t gội tía
(OD = 0,269), đậu trạc h lai (OD = 0,131)... trong khi các m ẫu h ạ t đậu dải và củ lay ơn
không nh ận b iết được IgG. Có th ể th ấy sự tương đồng của các k ết q u ả này với tác dụng ức
chế của IgG lên tương tác lectin - tụ cầu. M ẫu h ạ t gội tía có mức b ắ t giũ IgG cao n h ấ t (vối
OD = 0,269), đồng thịi có k h ả n ă n g ngưng k ế t nhiều chủng tụ cầu n h ấ t (8/10), thì 7 trong sơ'
8 p hản ứng tương tác lectin -tụ cầu này đã chịu tác dụng kìm hãm m ạnh n h ấ t của IgG
(phản ứng ngưng kết giảm từ 4+ xuô'ng (+) và thậm chí là (-)). Tương tự như vặy là các kết
quả của m ẫu mă th ầy với s . a u 17 và 25923, huyết th a n h sam với S C N 20 và s.ep ...

</div>
(4)<div class='page_container' data-page=4>

176 Bùi Phưcmg Thuạn
Tiếp theo, để nghiên cứu tác dụng trự c tiếp của IgG lên t ế bào tụ cầu, chúng tôi đ ã cài
tiến kỹ th u ậ t ELISA b ăng cách sử dụng chính các vi k h u ẩn n ày làm k h á n g nguyên gắn bản.

B ả n g 2. Tương tác IgG - tụ cầu trong xét nghiệm ELISA (OD.ig0nm )

T u c ầ vàng Tu c ầ u trắ n g

IgG s .au

s .a u 15 S .a u l6 s .au
17

s .a u
25923

s .a u
29213

SNC
19

SNC s.ep

20 21

s.xy

Chẻ phẩm 0,804 1,096 0,758 0,592 0,650 1,028 0,072 0,087 0,122 0,055

Huyết tương 0,848 0,836 0,446 0,800 1,086 0,632 0,028 0,060 0,027 0/138
Ghi chú: s.au: Staphylococcus aureus s.ep: Staphylococcus epidermidis

SNC: Staphylococcus negative congulase s.xy: Staphylococcus xylusus
SỐ liệu trê n bảng 2 cho th ấy có sự khốc b iệt rõ rà n g giữa hai loài tụ cầu th ử nghiệm.
Các chủng tụ cầu vàng b ắt giữ r ấ t tốt IgG: kết quả cao n h ấ t là của Sta p h , aureus lõ (OD =
1,069), còn th ấp n h ấ t là của Staph, aureus 17 (OD = 0,592). T rong khi đó, vói tụ cầu trắn g
chí có Staph. E p iderm idis kết hợp được với IgG nhưng ỏ m ức độ th ấ p hơn nhiều (OD =
0,112), các chủng còn lại tác dụng r ấ t yếu. Các k ết quả so s á n h th u dược khi SÜ dụng huyết
tương người (với toàn bộ các lóp Ig và protein tạp khác) làm k h án g th ể cũng khá tương
đồng, thậm chí cịn cho th ấy sự khác b iệt rõ rệ t hơn giữa h ai loài tụ cầu, và đơn giản hơn
nhiều vì không cần phải tin h ch ế IgG. Nguyên n hân của sự sai khác giữa hai loài tụ cầu có
th ể là do protein A (m ột k h án g nguyên bề m ặt đặc trứ ng của th à n h t ế bào tụ cẩu vàng có

k hả năn g k ế t hợp với vùng Fc của IgG) có trê n bể m ặt Sta p h , aureus đã n h ặ n biết và liên
kết với IgG. Vặy giả th iế t về sự tương tác giữa trự c tiếp giũa IgG với các chủng tụ cầu vàng
nghiên cứu đã được k h ăn g định là đúng. Đồng thời cũng có th ể r ú t ra k ế t lu ận là do tụ cầu
trắn g không tác d ụ n g với IgG, nên trê n bề m ặt của chúng kh ơng có protein A. K ết luận này
là phù hợp vái k ế t quả nghiên cứu điều tra protein A ỏ các ch ủ n g tụ cẩu trắ n g mà chúng tôi
đã tiến hành.

Kếl quả th ử nghiệm cịn cho th ấ y có th ể dựa vào mức độ tương tá c của các tê bào tụ
cầu trực tiếp gắn bản trong kỹ th u ậ t ELISA cải tiến vổi IgG đê p hân b iệ t hai loài tụ cầu
vàng và trắn g , cũng như để phản b iệt giữa các chủng khác n h a u của tụ c ầ u vàng. Bên cạnh
dó, việc nghiên cứu ản h hư âng của IgG đến ho ạt tính gây ngưng k ế t t ế bào vi khuẩn của
lectin bằng kỹ th u ậ t k ế t tủ a m iễn dịch và kỹ th u ậ t ELISA đ ã cho n h ữ ng k ế t quả tương
dồng. Điểu này cho th ấy kỹ th u ậ t m iễn dịch tuy đơn giản n h ư ng hoàn toàn đán g tin cậy, rấ t
phù hợp cho các nghiên cửu đặc tín h của lectin (như tương tác lectin- IgG- vi khuẩn), n h ấ t
là trong điều kiện tra n g th iết bị còn h ạ n chê n h ư ỏ Việt nam .

K ế t lu ậ n

IgG có khả năn g kìm hãm ho ạt độ của 72% số m ẫu lectin trong p h ả n ù ng gây ngưng
kết hồng cầu và 21% sô m ẫu trong ph ản ứng gây ngưng k ế t tụ cầu.

</div>
(5)<div class='page_container' data-page=5>

So với kỹ th u ậ t ELISA, kỹ th u ậ t kết tủ a miễn dịch đ ạ t độ chính xác tương đương,
nhưng đơn gián và đõ tốn kém hơn, th u ậ n tiện cho nghiên cứu đặc tính của lectin (như
tương tác lectin -(IgG)- vi khuẩn).

T À I L IỆ U TH A M K H Ả O

1. Doyle R.J., Introduction to lectin and their interaction with microorganisms. Lectin 
-microorganism interactions (eds. Doyle R.J and Slifkin M. M. ), Marcel Dekker Publisher,
Inc, New York, 1994.

2. Goldstein I.J., & Poretz R. D., Isolation and chemical properties of lectins. The lectins:
properties, functions, and applications in biology and medecine (eds. Liener 1. E., Sharon N.
and Goldstein I.J.). Academic Press, Orlando, 1986.

3. Engvall E., Perlm ann p., Enzyme linked immunoabsorbent assay (ELISA), Quantitative
assay of immunoglobulin G"- Immunochemistry, New York, 8. 1971, pp. 871- 873.
4. Kilpatrick D. c , Handbook o f anim al lectins: properties and biomedical applications, John

Wiley & sons Publisher, LTD, New York, 2000.

5. Peum ans w . J . and Van Damme E. J. M., Lectins as plant defense proteins, Plant
Physiology, New York, 109, 1995, pp. 347- 352.

6. Slifkin M., Application of lectin in clinical bacteriology, Lectin ■ microorganism interactions,
(eds. Doyle R.J and Shfkin M. M.) Marcel Dekker Publisher, Inc, New York, 1994.

VNU JOURNAL OF SCIENCE. N at. S ci. & Tech.. T XX. Np2AP, 2004

ủhg dung IgO tmnÿ n g

11

1

C II cứu tlàc lính leclin vã...______________________________________________ 177

S T U D Y O N T H E IG G E F F E C T S O N L E C T I N A C T I V I T Y A N D T H E
S T A P H Y L O C O C C U S I D E N T I F I C A T I O N

B u i P h u o n g T h u a n
D epartm ent o f Biology, College o f Science, V N U

The study revealed th a t 21% vegetal lectin sam ples with Staphylococcus
a gglutinating activity are inhibited by IgG, compare w ith 72% for th e hum an red blood cells
a gglutinating activity. Beside th e modified ELISA assay (using directly bacteria to coat the

p late wells), th e lectins w ith proper specificities an d IgG can be used (separately or
combined w ith each other) for th e recognition of Staphylococcus aureus Strains, based on
th eir ability to ag g lu tin ate selectively cells.

</div>