Nghiên cứu sự đa dạng sinh học của một số chủng xạ khuẩn thuộc chi streptomyces phân lập tại thái nguyên và định hướng ứng dụng

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
-------*-------

ĐỖ THỊ TUYẾN

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ
CHỦNG XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES PHÂN
LẬP TẠI THÁI NGUYÊN VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên, 2011

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
-------*-------

ĐỖ THỊ TUYẾN

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG
XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES PHÂN LẬP TẠI
THÁI NGUYÊN VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Vi Thị Đoan Chính

Thái Nguyên, 2011
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan ................................................................................................................i
Lời cảm ơn ................................................................................................................. ii
Mục lục ..................................................................................................................... iii
Danh mục các kí hiệu, viết tắt ....................................................................................vi
Danh mục các bảng .................................................................................................. vii
Danh mục các hình vẽ ............................................................................................. viii
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................. 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3
1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ XẠ KHUẨN........................................................................... 3
1.1.1. Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên ............................. 3
1.1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn ....................................................................... 4
1.1.3. Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces ............................................................... 6
1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN............................................ 7
1.2.1. Phƣơng pháp phân loại truyền thống ................................................................ 7
1.2.2. Phƣơng pháp phân loại dựa vào chỉ thị phân tử gene 16S rRNA .................... 9
1.3. SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN ...........................12
1.3.1. Cơ chế sinh tổng hợp các chất kháng sinh ......................................................12

1.3.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh ..............................13
1.3.3. Tách chiết chất kháng sinh ..............................................................................15
1.4. XẠ KHUẨN ỨNG DỤNG TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT ............................16
1.4.1. Vi nấm là nguyên nhân chủ yếu gây ra các bệnh hại cây trồng ......................16
1.4.2. Xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật .........................................................17
1.5. XẠ KHUẨN ỨNG DỤNG TRONG BẢO VỆ MƠI TRƢỜNG .......................19
iii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




1.5.1. Tuyển chọn xạ khuẩn sinh enzyme .................................................................19
1.5.2. Một số enzyme chủ yếu ứng dụng trong bảo vệ môi trƣờng ..........................20
Chƣơng 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............................23
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ...............................................................................23
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu......................................................................................23
2.1.2. Vi sinh vật kiểm định ......................................................................................23
2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ MƠI TRƢỜNG ...................................................23
2.2.1. Hóa chất ..........................................................................................................23
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị ..........................................................................................24
2.2.3. Môi trƣờng nghiên cứu....................................................................................24
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................................26
2.3.1. Phƣơng pháp phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn ..............................................26
2.3.2. Phƣơng pháp đếm số lƣợng tế bào ..................................................................26
2.3.3. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng sinh ...................................................27
2.3.4. Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme ........................................................28
2.3.5. Phƣơng pháp xác định khả năng chịu nhiệt của enzyme ................................28
2.3.6. Phƣơng pháp nghiên cứu các đặc điểm sinh học của xạ khuẩn ......................28
2.3.7. Phƣơng pháp xác định trình tự đoạn gene 16S rRNA ....................................30

2.3.8. Nghiên cứu bƣớc đầu quá trình lên men sinh tổng hợp kháng sinh................33
2.3.9. Phƣơng pháp tách chiết chất kháng sinh .........................................................33
2.3.10. Xác định ảnh hƣởng của dịch nuôi cấy đến khả năng nảy mầm của hạt ......34
2.3.11. Phƣơng pháp xử lý số liệu.............................................................................34
Chƣơng 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...............................................................35
3.1. SỰ PHÂN BỐ VÀ TÍNH ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN............35
3.1.1. Sự phân bố của xạ khuẩn trong đất .................................................................35
iv
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




3.1.2. Tính đa dạng sinh học của xạ khuẩn ...............................................................36
3. 2. Hoạt tính kháng sinh và chọn lọc chủng xạ khuẩn có HTKS cao.....................37
3.2.1. Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập .................................37
3.2.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao ........................41
3.3. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI 2 CHỦNG HT17.8 VÀ HT19.1 ...44
3.3.1. Đặc điểm hình thái 2 chủng xạ khuẩn HT 17.8 và HT19.1 ............................44
3.3.2. Đặc điểm nuôi cấy ...........................................................................................45
3.3.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ..............................................................................46
3.3.4. Phân loại 2 chủng xạ khuẩn HT17.8 và HT19.1 .............................................51
3.4. NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP VÀ MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA CHẤT
KHÁNG SINH CHỦNG HT17.8 VÀ HT19.1 .........................................................59
3.4.1. Nghiên cứu sinh tổng hợp chất kháng sinh .....................................................59
3.4.2. Tách chiết và xác định một số tính chất của chất kháng sinh chủng HT17.8 .62
3.5. TUYỂN CHỌN XẠ KHUẨN CĨ HOẠT TÍNH ENZYME.............................64
3.5.1. Hoạt tính enzyme của xạ khuẩn ......................................................................64
3.5.2. Khả năng chịu nhiệt của enzyme ....................................................................66
3.6. BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA CKS TRONG DỊCH NUÔI

CẤY CHỦNG HT17.8 VÀ HT19.1 TỚI KHẢ NĂNG NẢY MẦM CỦA HẠT ....68
KẾT LUẬN ...............................................................................................................71
KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................72
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................73

v
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hàng năm, trên thế giới các vi nấm gây bệnh thực vật nhƣ đạo ôn, khô vằn, thối
cổ rễ, mốc sƣơng… đã gây tổn thất nặng nề cho mùa màng, chúng chiếm tới 83%
trong số các bệnh ở cây trồng [15]. Theo thống kê của Tổ chức Nông Lƣơng Liên
hiệp Quốc (FAO), thiệt hại trong nông nghiệp do các bệnh vi nấm lên tới 11,6%
tổng sản lƣợng nông nghiệp thế giới [46].Trong khi đó, việc sử dụng thuốc hóa học
trong bảo vệ thực vật từ lâu đã gây ảnh hƣởng nghiêm trọng tới sức khỏe con ngƣời,
làm mất cân bằng sinh thái và gây ơ nhiễm mơi trƣờng. Chính vì vậy, việc sử dụng
các loại VSV đối kháng, các chất sinh học diệt khuẩn vào các vùng sinh thái khác
nhau của cây trồng đã và đang là đích mà các nhà khoa học hƣớng đến, và xạ khuẩn
sinh kháng sinh là đối tƣợng trung tâm trong cuộc tìm kiếm này [22].
Xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật nhân sơ (Prokaryote) với số lƣợng loài lớn và
phân bố ở nhiều vùng sinh thái khác nhau. Chúng ngày càng đƣợc biết đến rộng rãi
với nhiều ứng dụng thực tế thông qua việc tạo ra các sản phẩm trao đổi thứ cấp có
giá trị sử dụng cao nhƣ CKS, chất chống ung thƣ, chất kích thích sinh trƣởng và
nhiều hợp chất y dƣợc khác. Thêm vào đó, XK cịn khả năng sinh các enzyme ngoại
bào nên đƣợc sử dụng rộng rãi làm các chế phẩm sinh học có ý nghĩa đặc biệt quan
trọng trong cơng nghệ xử lý rác thải [9], [18].

Thái Nguyên là một tỉnh rất giàu tiềm năng về nơng, lâm nghiệp nên có khu
hệ VSV khá phong phú, trong số đó có khơng ít loài XK sinh CKS. Mặt khác, Thái
Nguyên lại nằm trong vùng sinh khống, có nhiều loại hình khống sản phân bố tập
trung. Điển hình là khu vực núi Pháo thuộc xã Hà Thƣợng, huyện Đại Từ và khu
vực thị trấn Trại Cau thuộc huyện Đồng Hỷ, là nơi đang diễn ra các hoạt động khai
thác khoáng sản mạnh mẽ. Các hoạt động khai thác khống sản đã có những tác
động đáng kể đến môi trƣờng đất, nƣớc và qua đó, rất có thể sẽ ảnh hƣởng đến hệ
VSV. Trên thực tế đã có những nghiên cứu về ảnh hƣởng của hoạt động khai
khoáng tới sự phát triển và đa dạng của các hệ động, thực vật nhƣng lại chƣa có
1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




nghiên cứu về ảnh hƣởng của hoạt động này tới sự phân bố và các hoạt tính sinh
học đến hệ VSV đất tại những khu vực này.
Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn đặt ra nhƣ trên, cũng nhƣ để góp phần khai thác
nguồn VSV vơ cùng phong phú của Thái Nguyên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện
đề tài: “Nghiên cứu sự đa dạng sinh học của một số chủng xạ khuẩn thuộc chi
Streptomyces phân lập tại Thái Nguyên và định hướng ứng dụng”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Khảo sát sự phân bố, đặc điểm hình thái của XK trong các mẫu đất thu tại
các địa điểm nghiên cứu.
- Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các chủng XK phân lập đƣợc để từ đó có
thể tuyển chọn ra một số chủng có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tế, đặc biệt
là trong công tác bảo vệ thực vật và môi trƣờng.
3. Nội dung nghiên cứu
- Lấy mẫu, phân lập và thuần khiết XK từ các mẫu đất.
- Kiểm tra HTKS của các chủng đã phân lập đƣợc với các VSV kiểm định để

tuyển chọn ra các chủng có HTKS cao.
- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, ni cấy, sinh lý – sinh hóa và phân loại
một số chủng XK có hoạt tính kháng nấm đã đƣợc tuyển chọn.
- Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp CKS của các chủng XK lựa chọn.
- Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào và nghiên cứu tuyển chọn ra một số
chủng có hoạt tính enzyme cao, có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tiễn.

2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ XẠ KHUẨN
1.1.1. Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên
Theo hệ thống phân loại hiện nay, XK thuộc ngành Tenericutes (gồm vi
khuẩn G (+) và XK), thuộc giới vi khuẩn thật (Eubacteria) và siêu giới nhân sơ
(Prokaryota).
Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, bộ
Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ, 110 chi và khoảng hơn 1.000 lồi.
Trong đó có 478 lồi thuộc chi Streptomyces và hơn 500 lồi thuộc các chi cịn lại
đƣợc xếp vào nhóm XK hiếm [58], [5].
Tên xạ khuẩn – Actinomycetes – bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “actys” (tia) và
“mykes” (nấm) và ban đầu XK đƣợc coi là vi nấm vì chúng sinh trƣởng giống với
nấm. Tuy nhiên, đến nay, XK đã đƣợc chứng minh là thuộc nhóm vi khuẩn G(+), có
tỷ lệ G+C cao (>55%) trong DNA [60].
Xạ khuẩn là một nhóm VSV rất đa dạng trong đó đa số sinh trƣởng hiếu khí,
hoại sinh và phân bố rộng rãi trong đất, nƣớc, khơng khí, xác thực vật... Nhƣng chủ

yếu XK phân bố nhiều ở trong đất. Số lƣợng XK trong đất khơng chỉ phụ thuộc
vào thành phần, tính chất của đất mà còn phụ thuộc vào độ ẩm, mức độ canh tác
và khả năng che phủ của thảm thực vật. Xạ khuẩn phân bố nhiều hơn ở trong lớp
đất đất tơi, xốp, có độ ẩm thích hợp, giàu chất hữu cơ và chất khống. Số lƣợng
XK có thể đạt tới 9.800.000 – 80.000.000 CFU trong 1 gam đất [33].
Sự phân bố của XK trong đất còn phụ thuộc nhiều vào pH của đất. Xạ
khuẩn phân bố nhiều trong các loại đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu, có
pH khoảng 6,8 – 7,5. Trong các lớp đất kiềm hay axit ít gặp XK và càng hiếm gặp
hơn trong các lớp đất có độ kiềm mạnh. Nhìn chung, nhiệt độ ơn hịa 25 - 30ºC và
pH trung tính là điều kiện tối ƣu cho XK phát triển. Mặc dù vậy, nhiều loài XK đã
đƣợc phân lập ở các mơi trƣờng khắc nghiệt ví dụ nhƣ lồi Arthrobacter ardleyensis
ƣa lạnh đƣợc phân lập từ trầm tích hồ ở Nam cực có thể sống ở nhiệt độ 0ºC [27] và
3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




loài Nocardiopis alkaliphila đƣợc phân lập từ đất sa mạc ở Ai Cập có thể sống ở pH
9,5 - 10 [32].
Xạ khuẩn là nhóm VSV đóng vai trị quan trọng trong tự nhiên. Chúng
tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp
trong đất mà nhiều VSV khác không hấp thu đƣợc. Các XK chi Streptomyces đặc
biệt nhiều trong đất nơi chúng phân hủy hoại sinh rất nhiều các hợp chất hữu cơ
bằng các enzyme ngoại bào. Chúng phân hủy và sử dụng các chất hữu cơ khó phân
hủy nhƣ axit humic trong đất [5]. Nhiều chủng XK có khả năng hịa tan lignin bằng
cách sinh các enzyme thủy phân cellulase, hemicellulase ngoại bào có ý nghĩa quan
trọng đối với cơng nghiệp và bảo vệ môi trƣờng. Thực tế, mùi mốc đặc trƣng của
nhiều loại đất liên quan đến sự sản sinh hợp chất hữu cơ dễ bay hơi có tên là
geosmin [57], [25], [44].

1.1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn
1.1.2.1. Đặc điểm hình thái
Đặc điểm nổi bật của XK là có hệ khuẩn ty (mycelium) phát triển, phân nhánh
và khơng có vách ngăn. Đƣờng kính của khuẩn ty thay đổi trong khoảng từ 0,2 µm
– 3 µm, chiều dài có thể đạt tới một vài cm. Kích thƣớc và khối lƣợng khuẩn ty
thƣờng không ổn định và phụ thuộc vào từng loại điều kiện nuôi cấy.
Theo ISP, màu sắc KTKS của các chủng XK đƣợc chia thành 8 nhóm màu:
White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm
vàng, Green (Gn) nhóm xanh, Blue (B) nhóm xanh da trời, Violet (V) nhóm tím, và
nhóm màu khơng xác định (X) [5], [40].
Khi nuôi cấy trong môi trƣờng dịch thể, XK tạo thành dạng bông, khi già tạo
thành kết tủa lắng xuống đáy, phần kết tủa này bao gồm các hạt liti, đó là sản phẩm
phân hủy của màng nguyên sinh chất và vách tế bào [19].
Khi nuôi cấy trên môi trƣờng đặc khuẩn ty của XK phát triển thành 2 loại. Một
loại cắm sâu vào môi trƣờng gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất - substrate
mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dƣỡng. Một loại phát triển trên bề mặt thạch
gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh - aerial mycelium) với chức năng chủ yếu là
4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




sinh sản [41]. Nhiều loại XK, các KTKS phát triển theo hình phóng xạ, tạo thành
nhiều vịng trịn đồng tâm. Bản chất của hiện tƣợng này vẫn chƣa đƣợc giải thích
một cách thỏa đáng [19].
Sau một thời gian phát triển, trên đỉnh của KTKS sẽ xuất hiện các cuống sinh
bào tử – là cơ quan sinh sản đặc trƣng của XK. Trên mỗi CSBT mang từ 30 ÷ 100
bào tử, đơi khi có thể mang tới 200 bào tử, nhƣng cũng có khi chỉ mang một bào tử
hoặc hai bào tử. CSBT là một trong những đặc điểm rất quan trọng để phân loại

XK. Tuy nhiên trong nhiều trƣờng hợp, đặc điểm này khơng đƣợc ổn định mà vẫn
có thể thay đổi theo mơi trƣờng ni cấy.
Bào tử XK có nhiều hình dạng khác nhau, thƣờng có hình trụ, hình ovan, hình
cầu, hình que với kích thƣớc trung bình khoảng 0,7 ữ 0,9 ì 0,7 ữ 1,9 àm. B mt
bo tử XK có thể nhẵn (Sm - Smooth), có gai (Sp - Spiny), khối u (Wa - Warty),
nếp nhăn (Ru - Rugose) hay dạng tóc Ha - Hair like. Nhìn chung, trong cùng một
lồi, hình dạng bào tử XK tƣơng đối ổn định, vì vậy có thể xem đây là một trong
những đặc điểm quan trọng để phân loại XK [47].
Hình thái của khuẩn lạc XK rất khác nhau, kích thƣớc và hình dạng của chúng
có thể thay đổi phụ thuộc vào môi trƣờng và điều kiện nuôi. Khuẩn lạc thƣờng có
đƣờng kính 0,5 ÷ 2 mm, nhƣng cũng có khuẩn lạc có đƣờng kính đạt tới 1 cm hoặc
lớn hơn nữa. Khuẩn lạc XK thƣờng rắn chắc, không trơn ƣớt hay trong suốt nhƣ của
vi khuẩn hay nấm men mà thƣờng có dạng thơ ráp, xù xì, có dạng vơi với nhiều
màu sắc khác nhau và có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ.
1.1.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
XK thuộc nhóm sinh vật dị dƣỡng, chúng sử dụng đƣờng, rƣợu, axit hữu cơ,
lipit, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác để làm nguồn cacbon, sử dụng muối
nitrat, muối amôn, urê, pepton để làm nguồn nitơ. Tuy nhiên khả năng hấp thụ các
chất này không giống nhau ở các loài hay các chủng khác nhau.
Phần lớn XK là nhóm VSV hiếu khí, ƣa ấm, một số ít ƣa nhiệt, nhiệt độ thích
hợp cho sự sinh trƣởng là 25 - 300C. Tuy nhiên, nhiệt độ tối ƣu cho sinh tổng hợp

5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




CKS thƣờng chỉ nằm trong khoảng 18 - 280C. Độ ẩm thích hợp đối với XK dao
động trong khoảng 40 - 50%, pH thích hợp trong khoảng 6,8 - 7,5 [9], [3], [10].

Xạ khuẩn có hệ enzyme vơ cùng phong phú. Chúng có khả năng phân hủy và
sử dụng các chất hữu cơ khó phân hủy nhƣ axit humic trong đất đến các hợp chất
hữu cơ phức tạp nhƣ: tinh bột, protein, các pectin, cellulose… chứng tỏ rằng XK
phải có khả năng sinh những hệ enzyme tƣơng ứng. Điều đó cho phép mở ra khả
năng tìm kiếm và chọn lựa những phức hệ enzyme cần thiết phục vụ cho các nhu
cầu cơng nghệ khác nhau, đặc biệt là các nhóm enzyme không thể khai thác đƣợc từ
nguồn động vật và thực vật.
Ngoài ra, XK đƣợc đặc biệt quan tâm là do khả năng sinh ra các hợp chất thứ
sinh có giá trị ứng dụng cao. Trong các hợp chất tự nhiên do VSV sinh ra đã đƣợc
công bố sử dụng trên tồn thế giới thì 45% đƣợc sinh ra từ XK, 38% từ nấm và 17%
từ vi khuẩn đơn bào [48].
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy có khoảng 60 – 70% XK phân lập từ đất có
khả năng sinh CKS. Trong số 8.000 CKS đã đƣợc biết thì có tới hơn 80% là có
nguồn gốc từ XK mà phần lớn là XK thuộc chi Streptomyces [39]. Một số hợp
chất của XK đã đƣợc công bố nhƣ: aminoglycoside, anthracyclin, glycopeptide, βlactam, macrolides, nucleoside, polyene, polyeste, actinomycin, tetracycline. Các
hợp chất này đã đƣợc sử dụng thành công làm thuốc diệt cỏ, thuốc chống ung thƣ,
các chất điều hòa miễn dịch, các chất chống ký sinh trùng [18], [42].
Ngồi ra, trong q trình sống, XK còn sinh ra nhiều sản phẩm trao đổi chất
quan trọng nhƣ một số vitamin nhóm B, một số axit hữu cơ nhƣ các axit lactic,
axit axetic, axit sucxinic… các axit amin nhƣ axit glutamic, metionin, alanin,
valin... chất kích thích sinh trƣởng và sắc tố melanin [52].
Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất nhƣ CKS, độc tố, enzyme… có thể
đƣợc tích lũy trong sinh khối tế bào hay đƣợc tiết ra mơi trƣờng ni cấy. KTCC có
thể tiết vào mơi trƣờng các loại sắc tố, thƣờng có màu xanh, tím, hồng, nâu, đen…
có sắc tố chỉ tan trong nƣớc, có sắc tố chỉ tan trong dung mơi hữu cơ [5], [53].
1.1.3. Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces
6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Trong số hơn 1.000 lồi XK đã đƣợc mơ tả thì có tới 478 lồi thuộc chi
Streptomyces và hơn 500 lồi thuộc các chi cịn lại đƣợc xếp vào nhóm XK hiếm.
XK hiếm chia thành hơn 50 chi khác nhau và gồm nhiều lồi chƣa cơng bố. Chúng
thƣờng sinh trƣởng chậm, tạo thành khuẩn lạc nhỏ, thƣờng khó bảo quản và ni
cấy trong mơi trƣờng nhân tạo. Thêm vào đó, mật độ XK hiếm trong tự nhiên ít
hơn nhiều so với chi Streptomyces và phải sử dụng các phƣơng pháp phân lập đặc
hiệu nên thƣờng ít đƣợc quan tâm nghiên cứu hơn [47]. Trong khi đó, XK thuộc chi
Streptomyces lại rất thuận tiện cho việc tìm kiếm và sàng lọc CKS. Chúng đặc biệt
nhiều trong đất nơi chúng phân hủy hoại sinh rất nhiều các hợp chất hữu cơ bằng
các enzyme ngoại bào.
Streptomyces là chi XK bậc cao đƣợc Waksman và Henrici đặt tên năm
1943, có số lƣợng lồi đƣợc mô tả nhiều nhất. Các đại diện của chi này có hệ KTKS
và hệ KTCC rất phát triển và phân nhánh. Để phân loại chi Streptomyces đến loài,
các nhà phân loại đã phải sử dụng nhiều khoá phân loại khác nhau nhƣ:
Craxilnhicôp (1970), Gause và cộng sự (1983), Bergey (1989) ...
Các XK chi Streptomyces (lồi chuẩn Streptomyces albus) có cấu tạo giống
vi khuẩn G (+), tỷ lệ G + C trong DNA là 69 – 78%. Nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu là
25 - 35 oC, pH tối ƣu là 6,5 - 8,0. Chúng có KTCC phân nhánh nhiều lần, ít khi đứt
đoạn, đƣờng kính 0,5-2,0 μm. KTKS ở giai đoạn trƣởng thành tạo chuỗi từ ba đến
nhiều bào tử. Các khuẩn lạc ban đầu thƣờng trơn nhẵn nhƣng sau đó KTKS sẽ phát
triển rất mạnh mẽ tạo khuẩn lạc gồ ghề, thô ráp. Chúng sinh nhiều loại sắc tố khác
nhau và có khả năng khuếch tán ra mơi trƣờng [56], [60].
Chi Streptomyces đƣợc biết đến nhiều nhất bởi khả năng sinh kháng sinh của
chúng và thƣờng đƣợc gọi là “các nhà máy sản xuất kháng sinh”. Rất nhiều chủng
sản sinh ra một hoặc nhiều loại CKS. CKS do XK nói chung và từ Streptomyces nói
riêng thƣờng có hoạt phổ rộng, có tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn và đặc biệt
một số loại kháng sinh đƣợc sử dụng trong điều trị bệnh ung thƣ [3].
1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN

1.2.1. Phương pháp phân loại truyền thống
7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Hiện nay, có nhiều khóa phân loại khác nhau đƣợc đƣa ra nhằm mục đích
phân loại XK tới chi và lồi, nhƣ các khóa phân loại của Waksman (1916, 1919,
1961), của Craxilnhicop (1949, 1970), của Flaig - Kutzner (1954, 1960), của Gause
(1957), Pridham (1972), Bergey (1989), Goodfellow (2000)… [53]. Đồng thời để
thống nhất trong cách mơ tả XK, chƣơng trình xạ khuẩn quốc tế (ISP) đã đƣa ra các
phƣơng pháp chung và mơi trƣờng chuẩn để phân loại nhóm VSV này. Đánh giá
của ISP dựa trên các đặc điểm về hình thái, đặc điểm ni cấy, các đặc điểm sinh lý,
sinh hóa của XK trên các mơi trƣờng từ ISP1 đến ISP9 [47].
Ngày nay, nhờ sự phát triển mạnh mẽ của một số ngành nhƣ: sinh học phân
tử, hóa sinh học, lý sinh học… những kiến thức về phân loại học XK đã có nhiều
thay đổi. Do số lƣợng các lồi XK mới đƣợc mơ tả ngày càng nhiều nên để cho việc
phân loại đƣợc nhanh và chính xác tới mức độ phân tử, ngoài các phƣơng pháp
phân loại truyền thống, ngƣời ta còn sử dụng kết hợp với các phƣơng pháp phân
loại bằng sinh học phân tử.
 Phân loại theo đặc điểm hình thái và tính chất ni cấy
Đặc điểm hình thái và tính chất ni cấy là những chỉ tiêu quan trọng đƣợc sử
dụng trong phân loại XK. Hầu hết các chi XK đƣợc mô tả hiện nay đƣợc phân loại
theo các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy nhƣ: màu sắc của hệ KTKS,
KTCC, màu sắc của sắc tố hịa tan, hình dạng và kết cấu bề mặt của bào tử, hình
dạng của CSBT, sự phân đốt của khuẩn ty.
Tuy nhiên, cũng nhƣ các VSV khác, XK rất không bền vững về mặt di truyền,
thƣờng xuyên xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử DNA. Trong cùng một lồi có thể
biểu hiện khác nhau về hình thái hay những lồi khác nhau có thể giống nhau về

hình thái. Vì vậy để phân loại đƣợc chính xác, ngày nay ngƣời ta phải dùng thêm
các chỉ tiêu khác bổ sung nhƣ các đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch hay sinh
học phân tử.
 Phân loại theo đặc điểm hóa phân loại
Đây là phƣơng pháp cơ bản và có hiệu quả thơng qua việc định tính và định
lƣợng thành phần hóa học của tế bào VSV. Trong đó việc phân tích cấu trúc mạch
8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




tetrapeptide của peptydoglycan đƣợc xem là tiêu chuẩn hóa phân loại thiết yếu nhất
cho nhóm vi khuẩn G (+), trong đó có XK. Các đồng phân của diaminopimelic
(DAP) trong thành phần peptydoglycan là một trong những axit amin có ý nghĩa
quan trọng trong phƣơng pháp phân loại này.

 Phân loại theo đặc điểm sinh lý – sinh hóa:
Ngƣời ta có thể nuôi cấy các chủng XK cần định loại trên các môi trƣờng
dinh dƣỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định để nghiên cứu
các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chúng. Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa thƣờng
đƣợc sử dụng nhƣ: khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, khả năng phân
hủy các cơ chất khác nhau nhờ hệ thống enzyme, nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt
độ tối ƣu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của mơi trƣờng, tính chất đối
kháng và nhạy cảm với CKS, khả năng tạo thành CKS và các sản phẩm trao đổi
chất đặc trƣng khác của XK… [19].
Tuy nhiên, phần lớn các đặc điểm sinh lý – sinh hóa cùng đặc điểm ni cấy
dễ bị biến động và có giá trị thấp về mặt phân loại. Do vậy, ngày nay những nguyên
tắc trong việc sử dụng các đặc điểm sinh lý – sinh hóa để phân loại XK cũng có sự
thay đổi [17].

Tóm lại, có nhiều phƣơng pháp truyền thống khác nhau đƣợc sử dụng trong
nghiên cứu phân loại VSV nói chung và XK nói riêng nhƣng khơng có phƣơng
pháp nào tỏ ra vạn năng, thích hợp cho mọi đối tƣợng VSV. Vì vậy, để đảm bảo
tính chính xác cần phải kết hợp đồng thời nhiều phƣơng pháp khác nhau, trong đó
đặc biệt quan tâm tới các phƣơng pháp phân loại hiện đại khi phân loại VSV.
1.2.2. Phương pháp phân loại dựa vào chỉ thị phân tử gene 16S rRNA
Trong một số trƣờng hợp, phƣơng pháp phân loại truyền thống gặp trở ngại
do một số các đặc tính dùng cho nhóm VSV này nhƣng lại khơng có ý nghĩa với
nhóm VSV khác. Điều này dẫn đến nhiều trƣờng hợp phải xác định lại tên phân loại
của một số VSV. Mặt khác, đối với những lồi có độ tƣơng đồng cao về mặt hình
thái thì phƣơng pháp phân loại truyền thống sẽ khó có thể đạt đƣợc hiệu quả. Nhƣợc
9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




điểm này của phân loại truyền thống hồn tồn có thể bổ sung nhờ phân loại học
phân tử. Ngày nay, phần lớn các nhà khoa học đều thống nhất rằng, phân loại học
phải dựa vào rất nhiều tiêu chí phân loại kết hợp cả phƣơng pháp phân loại truyền
thống và phƣơng pháp phân loại hiện đại, trong đó nhấn mạnh vai trò của phƣơng
pháp phân loại bằng sinh học phân tử [25]. Hiện nay, đại đa số các nhà khoa học
đồng ý với quan niệm 2 chủng đƣợc coi là 2 loài riêng biệt nếu chúng giống nhau
dƣới 70% khi tiến hành lai DNA. Keswani và cộng sự (2001) đã chứng minh rằng
nếu sự tƣơng đồng giữa hai trình tự rRNA 16S thấp hơn 98.6% thì xác suất để mức
độ giống nhau trong phép lai DNA thấp hơn 70% sẽ là 99%. Vì thế giá trị tƣơng
đồng 98.6% của trình tự rRNA 16S đƣợc coi là ngƣỡng để phân biệt hai lồi khác
nhau. Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá trị này là 98% [36].
Trong những năm gần đây, với sự ra đời của nhiều kỹ thuật sinh học phân tử,
đã giúp việc phân loại các VSV trở nên dễ dàng và có tính chính xác cao hơn. Ngày

nay, việc nghiên cứu phân tử rRNA đƣợc coi là phƣơng pháp hữu hiệu nhất để xác
định mối quan hệ trên cây tiến hóa của các VSV. Phân tử rRNA là thành phần cấu
tạo nên các tiểu phần ribosome có mặt ở tất cả các loại VSV, có chức năng xác định
và là trình tự có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm VSV.
Dựa vào sự khác nhau này, ngƣời ta có thể đánh giá đƣợc mối quan hệ phát sinh
chủng loại và phân loại các chủng VSV.
Khác với các VSV nhân chuẩn (eukaryotes), ribosome chứa 4 loại phân tử
rRNA là: 5S, 5,8S, 28S và 18S. Đối với các VSV nhân sơ (prokaryotes), ribosome
chỉ chứa 3 loại phân tử rRNA là: 5S, 16S, 23S. Trong đó, gene 16S rRNA mã hóa
cho phân tử rRNA loại 16S đƣợc xem là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân
loại các VSV nhân sơ, bao gồm cả XK. Gene mã hóa cho 5S rRNA có kích thƣớc
khoảng 120 nucleotide, dễ đọc và so sánh trình tự, nhƣng lại không đủ để phân biệt
một cách chi tiết giữa các chủng. Ngƣợc lại, gene mã hóa cho 23S rRNA lại có kích
thƣớc lớn, khoảng 3.000 nucleotide, do đó gây khó khăn cho việc tách dịng, đọc và
so sánh trình tự. Chỉ có gene 16S rRNA với kích thƣớc khoảng 1500 nucleotide vừa
đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng và cũng khơng gây khó khăn trong nghiên
cứu nên đƣợc ƣu tiên lựa chọn trong phân loại prokaryotes. Thêm vào đó, trên gene
10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




16S rRNA có chứa các vùng biến đổi (variable) và vùng bán bảo tồn (semi conserved) cho phép xác định tính đặc trƣng ở mức độ chủng, lồi [27]. Do vậy,
gene 16S rRNA đã đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu kỹ lƣỡng và đã thiết lập đƣợc
rất nhiều cặp mồi để nhân đoạn gene này bằng kỹ thuật PCR. Đây là một thuận lợi
lớn cho các nghiên cứu phân loại dựa trên các gene mã hóa 16S rRNA. Ngồi ra,
ngƣời ta còn sử dụng vùng đệm giữa gene 16S rRNA và 23S rRNA để nghiên cứu
đa dạng của prokaryotes [34], [37].
Theo Ludwing và Schleifer (2000) đã có tới 16.000 gene 16S rRNA từ các

chủng VSV đƣợc giải trình tự nucleotide. Vì vậy, khi phân lập đƣợc chủng mới,
bằng việc so sánh trình tự gene 16S rRNA của có thể cho chúng ta biết nó thuộc
lồi nào, có họ hàng nhƣ thế nào và vị trí phân loại của nó [44].
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu áp dụng cách phân loại này để định
tên các chủng VSV nhƣ: Kataoka và cộng sự (1997) đã ứng dụng vùng bất biến của
gene 16S rRNA tạo ra một chỉ thị so sánh để định loại các loài trong chi
Streptomyces [35]. Takeuchi và cộng sự (1996) đã phân tích sự phát sinh loài của 12
chủng XK thuộc chi Streptomyces gây bệnh nấm vẩy ở khoai tây dựa trên 16 trình
tự 16S rRNA [48].
Ở Việt Nam cũng có rất nhiều cơng trình nghiên cứu sử dụng trình tự gene 16S
rRNA để định tên VSV, nhất là các lồi có khả năng sản sinh ra các chất có hoạt tính
sinh học nhƣ XK. Dựa vào trình tự gene 16S rRNA, Đỗ Thu Hà và cộng sự (2001) đã
định loại chủng XK Streptomyces ĐN – 05 sinh CKS có hoạt phổ rộng phân lập từ
đất Quảng Nam – Đà Nẵng [9]. Bùi Thị Việt Hà và cộng sự (2006) đã tiến hành xác
định các đặc điểm hình thái, sinh lý - sinh hóa kết hợp với việc phân tích trình tự
gene 16S rRNA định tên đƣợc 3 chủng XK: Streptomyces antimycoticus T-41,
Streptomyces diastatochromogenes D-42 và Streptomyces hygroscopicus TC-54 đều
có phổ kháng sinh rộng, có khả năng sinh CKS chống vi khuẩn G(+), vi khuẩn G(-)
và nấm gây bệnh thực vật [10]. Nghiên cứu về một số hoạt chất có khả năng kháng
VSV và kháng dòng tế bào ung thƣ từ XK, Nguyễn Huỳnh Minh Quyên và cộng sự
11
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




(2011) đã phân loại đƣợc 5 chủng XK hiếm đều thuộc chi Nonomuraea [18]. Trên cơ
sở kết hợp phƣơng pháp phân loại truyền thống và phƣơng pháp phân loại dựa vào
trình tự gene 16S rRNA, Vi Thị Đoan Chính và cộng sự (2011) đã định tên đƣợc
chủng XK Streptomyces kurssanovii K4 phân lập ở Thái Nguyên có khả năng đối

kháng với các chủng vi khuẩn Staphylococcucs aureus và Pseudomonas aeruginosa
gây nhiễm trùng bệnh viện [3].

1.3. SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN
1.3.1. Cơ chế sinh tổng hợp các chất kháng sinh
1.3.1.1. Con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh
Chất kháng sinh là sản phẩm trao đổi thứ cấp của VSV. Chúng khơng có
chức năng rõ ràng trong sự trao đổi chất của tế bào, nghĩa là tế bào vẫn có thể tồn
tại và phát triển bình thƣờng khi khơng có hợp chất này. Mặc dù các CKS có cấu
trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng rất đa dạng, nhƣng quá trình sinh tổng
hợp chúng chỉ theo một số con đƣờng nhất định. Các con đƣờng này cũng chỉ là sự
cải biến các con đƣờng sinh tổng hợp của tế bào dƣới sự tham gia của các enzyme
hoặc hệ thống enzyme đặc biệt. Vì vậy, chỉ cần tác động làm thay đổi đƣờng hƣớng
trao đổi chất là có thể cho hàng loạt các sản phẩm khác nhau. Các vật liệu ban đầu
của q trình chuyển hóa trao đổi chất thứ cấp cũng chính là những sản phẩm trao
đổi sơ cấp. Demain đã mô tả con đƣờng sinh tổng hợp CKS từ VSV có thể thực
hiện theo 3 con đƣờng [28]:
- CKS đƣợc tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp duy nhất nhƣ:
chloramphenicol, các CKS nhóm nucleoside.
- CKS đƣợc tổng hợp từ 2 hoặc 3 chất chuyển hóa sơ cấp khác nhau nhƣ:
lincomixin, novobioxin.
- CKS đƣợc tổng hợp bằng cách polime hóa các chất chuyển hóa sơ cấp, sau
đó có thể tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzyme khác. Thuộc con đƣờng này có
12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




nhiều loại kháng sinh đã đƣợc tổng hợp.

1.3.1.2. Di truyền học của sự hình thành chất kháng sinh
Các gene mã hóa cho các enzyme đặc biệt trong sinh tổng hợp CKS thƣờng
nằm trên nhiễm sắc thể, hoặc một số trƣờng hợp trên plasmid nhƣ: gene mã hóa cho
sinh tổng hợp chloramphenicol ở Streptomyces venezuelae nằm trên plasmid, trong
khi đó gene mã hóa cho sinh tổng hợp tetracycline lại nằm trên nhiễm sắc thể.
Sinh tổng hợp CKS còn phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gene. Không chỉ
gồm những gene chịu trách nhiệm trực tiếp tổng hợp CKS từ những đơn vị cơ bản,
mà cả những gene chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, coenzyme, cofactor
cũng nhƣ các gene phụ trách sản sinh năng lƣợng cho quá trình tổng hợp. Ƣớc tính
số lƣợng gene có liên quan đế sinh tổng hợp chlotetracyclin lên tới hàng trăm gene.
Điều đó cũng giải thích vì sao so với các chất trao đổi bậc một, tổng hợp CKS phụ
thuộc nhiều hơn vào các điều kiện sinh lý nhƣ: thành phần môi trƣờng, pH, nhiệt
độ, nồng độ ion, nồng độ phosphate vô cơ, độ thơng khí, thế oxy hóa khử [51].
Trong nghiên cứu sản xuất CKS, ngồi việc tìm kiếm ra các CKS mới phải
đồng thời với việc nghiên cứu nâng cao HTKS của các chủng. Các chủng hoang
dại thƣờng có hoạt tính thấp, để đƣa vào sản xuất cần phải tiến hành chọn lọc
chủng, sử dụng các biện pháp gây đột biến, các kỹ thuật di truyền hiện đại để chủ
động tạo ra đƣợc các chủng giống tốt. Điều quan trọng là các chủng mới đƣợc
tuyển chọn phải đảm bảo cho hiệu suất kháng sinh cao, an tồn và có hiệu quả về
mặt kinh tế.
1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh
1.3.2.1. Thành phần môi trường lên men
Thực tế cho thấy, thành phần mơi trƣờng lên men có vai trị rất quan trọng, khơng
chỉ ảnh hƣởng đến số lƣợng mà còn ảnh hƣởng đến cả chất lƣợng của CKS tạo thành. Vì
vậy thành phần mơi trƣờng lên men thích hợp cho việc sinh tổng hợp các CKS khác nhau
cũng sẽ khác nhau.
* Nguồn cacbon: Các chủng XK có khả năng đồng hóa đƣợc nhiều
nguồn cacbon khác nhau. Nhìn chung, nguồn thức ăn cacbon thƣờng đƣợc sử
13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

dụng làm môi trƣờng lên men rất đa dạng bao gồm: các loại bột và hạt ngũ cốc,
cám mỳ, cám gạo, các loại đƣờng đơn, đƣờng đôi, dịch thủy phân gỗ… Thông
thƣờng glucose là nguồn thức ăn cacbon tốt cho sự sinh trƣởng của nhiều chủng
XK nhƣng các oligosaccharide và polysaccharide lại thích hợp hơn cho sinh
tổng hợp CKS. Trong lên men CKS, nhiều trƣờng hợp dƣ thừa glucose trong
môi trƣờng sẽ ức chế quá trình này.
Một số nghiên cứu đã chứng minh chủng Streptomyces parvulus ATCC
12434 có khả năng sinh enzyme kynureninase (l-kynurenine hydrolase, EC 3.7.1.3)
khi có sự cảm ứng của tryptophan trong mơi trƣờng. Đây là enzyme đóng vai trò
quan trọng trong hệ thống sinh tổng hợp CKS actinomycin. Tuy nhiên, khi môi
trƣờng dƣ thừa lƣợng glucose cần thiết sẽ dẫn tới ức chế tổng hợp enzyme này [50].
* Nguồn nitơ: Nitơ là thành phần dinh dƣỡng không thể thiếu đƣợc trong
quá trình sinh trƣởng và tổng hợp CKS của XK. Nguồn thức ăn nitơ thƣờng đƣợc
sử dụng làm mơi trƣờng lên men kháng sinh có thể là bột đậu tƣơng, nƣớc chiết
ngô, cao nấm men, pepton, các muối nitrat, muối amơn… Trong một số trƣờng
hợp, q trình tổng hợp CKS lại đòi hỏi cả hai nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ trong
môi trƣờng.
* Nguồn photpho vô cơ: Photpho là yếu tố tham gia điều chỉnh sinh tổng
hợp CKS. Nồng độ photpho cao sẽ làm tăng tổng hợp axit nucleic trong tế bào, rút
ngắn pha tổng hợp và kéo dài pha dinh dƣỡng hoặc ức chế tổng hợp enzyme.
* Các nguyên tố vi lƣợng: Là một trong các thành phần không thể thiếu
đƣợc trong môi trƣờng lên men, góp phần thay đổi đáng kể khả năng tổng hợp
CKS của nhiều chủng XK [13].
1.3.2.2. Điều kiện nuôi cấy
Cùng với thành phần môi trƣờng lên men, điều kiện nuôi cấy cũng có ảnh
hƣởng rất lớn đến q trình tổng hợp CKS của XK. Vì vậy, trong lên men CKS,

ngƣời ta thƣờng tập trung khai thác hiệu quả tác động của các yếu tố trong môi
trƣờng nhƣ: nhiệt độ, pH, nồng độ oxy, thế oxy hóa khử, cƣờng độ sục khí… để
nhằm nâng cao hiệu suất tổng hợp CKS [17].
14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




1.3.3. Tách chiết chất kháng sinh
Phần lớn các chủng XK sinh kháng sinh và tiết ra môi trƣờng xung quanh,
nhƣng có một số chủng chỉ tiết một phần vào mơi trƣờng còn chủ yếu là vẫn nằm
trong sinh khối. Để lựa chọn đƣợc phƣơng pháp tách chiết CKS phù hợp phải dựa
vào bản chất hoá học của các CKS.
Khi tiến hành tách chiết CKS từ dịch lọc, cần lƣu ý là pH của dịch ni cấy
có ảnh hƣởng lớn đến việc CKS đi ra mơi trƣờng nhiều hay tích tụ trong sinh khối
nhiều. Ví dụ, nếu pH của dịch ni cấy chủng Streptomyces rimosus thấp, kháng
sinh oxytetracyclin đi ra môi trƣờng nhiều, ngƣợc lại nếu pH kiềm thì kháng sinh lại
tích tụ trong sinh khối nhiều hơn [14]. Đối với các dịch lên men có độ nhớt cao
thƣờng gây khó khăn cho quá trình lọc, vì vậy để khắc phục, ngƣời ta thƣờng bổ
sung một số chất trợ lọc giúp cho quá trình lọc diễn ra tốt hơn.
 Tách chiết chất kháng sinh từ sinh khối
Trƣớc khi tách chiết, cần phải rửa sinh khối bằng nƣớc để loại bỏ các thành
phần của mơi trƣờng. Chiết rút là phƣơng pháp thích hợp nhất để tách chiết CKS ra
khỏi sinh khối tế bào. Hiệu quả tách chiết phụ thuộc vào khả năng hồ tan của CKS
trong dung mơi chiết. Các dung mơi hữu cơ dùng để tách chiết CKS có thể là:
butanol, metanol, etyl axetat, axeton… [3], [10].
 Tách chiết chất kháng sinh từ dịch lọc
Trƣớc khi tiến hành chiết rút kháng sinh ra khỏi môi trƣờng nuôi cấy, cần phải
loại sinh khối tế bào ra khỏi dịch nuôi bằng phƣơng pháp lọc hay ly tâm. Phƣơng

pháp ly tâm không những loại đƣợc sinh khối mà còn loại bỏ đƣợc các chất khơng
có lợi ra khỏi dịch ni cấy. Tốc độ ly tâm đƣợc sử dụng với mục đích này thƣờng
là 15.000 vịng/phút [10].
Các CKS có trọng lƣợng phân tử thấp thƣờng hồ tan trong nƣớc và trong
dung mơi hữu cơ. Để tách chiết có hiệu quả cần phải lựa chọn các loại dung mơi có
khả năng hồ tan CKS [1].
Chất kháng sinh thô nhận đƣợc từ dịch lọc hay sinh khối đƣợc làm sạch bằng
cách cô đặc và loại bỏ tạp chất. Điểm đáng chú ý là các CKS thƣờng bị mất hoạt tính
15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




trong điều kiện nhiệt độ cao, axit và kiềm cao. Do vậy, khi tách chiết và tinh sạch,
phải nghiên cứu các điều kiện thích hợp sao cho CKS vẫn giữ đƣợc hoạt tính [2].
1.4. XẠ KHUẨN ỨNG DỤNG TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT
1.4.1. Vi nấm là nguyên nhân chủ yếu gây ra các bệnh hại cây trồng
Vi nấm là VSV có nhân điển hình, phát triển nhanh chóng do q trình phát
tán bào tử nhờ gió hoặc nƣớc, do đó dễ dàng xâm nhập vào cây trồng hoặc hạt
giống và lan truyền từ cây này sang cây khác, từ vùng này sang vùng khác. Ngồi ra
vi nấm cịn tồn tại ngay trong đất và xâm nhập vào cây trồng thông qua bộ rễ. Cây
có thể bị nhiễm bởi một hoặc vài loại nấm, có thể bao gồm cả những loại nấm ký
sinh không gây hại đến cây, nhƣng phần lớn là các loại nấm gây hại cây trồng. Theo
số liệu của Tổ chức Nông – Lƣơng của Liên Hợp Quốc (FAO), tổn thất hàng năm
về các sản phẩm nông nghiệp do các tác nhân gây hại khác nhau gây ra là 20% tổng
sản lƣợng tồn cầu, trong đó riêng tổn thất do nấm chiếm khoảng một nửa [29].
Việt Nam là nƣớc nhiệt đới, có khí hậu nóng ẩm, vì vậy việc nhiễm nấm là
không thể tránh khỏi. Một lƣợng lớn cây lƣơng thực, cây công nghiệp ngắn ngày bị
nhiễm các loại vi nấm gây bệnh tạo ra hàng loạt các dịch bệnh khác nhau ảnh hƣởng

lớn đến năng suất cây trồng, đặc biệt những cây có giá trị nhƣ: lúa, ngơ, đậu, chè…
Tính từ năm 1957 đến nay, nƣớc ta đã trải qua nhiều đợt dịch bệnh hại cây trồng
nhƣ đạo ôn, khô vằn, héo rũ, thối cổ rễ… mà tác nhân gây bệnh chủ yếu nghiêm
trọng nhất là vi nấm, phổ biến là Fusarium oxysporum, Fusarium solani,
Rhizoctonia sp., Aspergillus sp., Penicillium sp.… Hầu hết chúng là những loài bán
ký sinh và hoại sinh điển hình, có phạm vi ký chủ rộng, gây nhiều tổn thất lớn về
sản lƣợng thu hoạch và làm mất tính ổn định về năng suất của nhiều giống cây trồng
[24], [12].
Tình hình dịch hại do nấm qua các năm khơng hề giảm mà cịn có chiều
hƣớng tăng với các bệnh ngày càng phức tạp cùng với sự phịng vệ ngày càng cao
của chính các lồi nấm đó. Vì vậy việc nghiên cứu những chế phẩm nhằm hạn chế
những thiệt hại do nấm đang là mối quan tâm hàng đầu đƣợc các nhà khoa học đặt
ra hết sức cấp bách.
16
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




1.4.2. Xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật
Trong thiên nhiên, các loại VSV đối kháng ức chế hoạt động hoặc tiêu diệt
VSV gây bệnh chủ yếu bằng các CKS là các sản phẩm trao đổi chất của chúng. Đây
chính là cơ sở của biện pháp sinh học phòng chống bệnh cây. Sự có mặt của XK đối
kháng trong đất làm giảm rõ rệt tỷ lệ mắc bệnh của cây. Khi điều tra XK đối kháng
trong đất ở Nhật Bản cho thấy ở nơi có nhiều XK trong đất thì ở đó các dịng
Fusarium bị biến mất nhanh [53]. Thơng thƣờng, một loại XK đối kháng có thể ức
chế một vài loại nấm gây bệnh nhƣng có những lồi hoạt phổ rộng có thể ức chế
nhiều tác nhân gây bệnh có trong đất. Tuy nhiên, khi sử dụng các chủng có hoạt phổ
rộng phải chú ý để tránh XK ức chế ln cả khu hệ VSV có lợi cho vùng rễ.
Xạ khuẩn ngồi việc tiết ra các CKS, cịn tác động lên khu hệ VSV thông

qua các enzyme phân giải. Ngồi ra, nhiều XK cịn tiết ra các chất kích thích sinh
trƣởng thực vật cũng nhƣ kích thích các khu hệ VSV có lợi trong vùng rễ. Nhiều
nghiên cứu cho thấy CKS do XK sinh ra không những không ảnh hƣởng đến thực
vật mà ở nồng độ thấp cịn có khả năng kích thích sự sinh trƣởng của thực vật [10].
Năm 1954, Trung Quốc đã phân lập đƣợc chủng Streptomyces. sp 5406 có khả
năng sinh ra CKS phịng chống bệnh thối rễ và đã áp dụng trên 6 triệu ha trồng bông
thu đƣợc những kết quả khả quan. Mới đây, Bryden và cộng sự (2005) cũng đã tách
chiết thành công CKS jingangmyxin đƣợc tách chiết từ một loài Streptomyces
hygromyxin, ứng dụng rất rộng rãi trong phòng chống bệnh thối rễ [26].
Cùng với sự phát triển của khoa học, ngày càng có nhiều CKS có nguồn gốc
XK đƣợc tinh chế và đƣa vào sản xuất ở quy mô công nghiệp đƣợc sử dụng trong
phòng trừ nấm gây bệnh thực vật.
Chất kháng sinh Blasticidin S đƣợc Takeuchi tinh chế từ dịch nuôi chủng
Streptomyces griseochromogenes, dùng để phịng chống bệnh đạo ơn do Pyricularia
oryzae gây ra. Blasticidin S có phổ tác dụng rộng, ngoài khả năng ức chế sự sinh
trƣởng của P.oryzae chúng cịn có khả năng ức chế vi khuẩn, nấm và cịn có thể
chống khối u [43].

17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Polyoxin là nhóm kháng sinh thuộc họ nucleotide peptidylpyrimidin, đƣợc
tổng hợp bởi chủng XK Streptomyces cacaoi var.asoensis. Chất kháng sinh này
đƣợc coi là rất an toàn khi sử dụng trong phịng chống nấm bệnh, khơng độc cho vật
ni và cây trồng [43].
Validamycin A đƣợc tách chiết từ môi trƣờng nuôi cấy của chủng
Streptomyces hygroscopicus var limoneus [31]. Validamycin A đặc biệt có hiệu quả

để phịng chống các bệnh nấm thực vật do Rhizoctonia solani gây ra nhƣ khô vằn,
thối thân, thối rễ, đốm đen trên nhiều loại hạt. Ngoài hoạt tính chống lại R.solani,
Validamycin A cịn có hoạt tính chống vi khuẩn và một số nấm khác nữa. Theo Cục
Bảo vệ mơi trƣờng Mỹ (FPA), Validamycin A có độ độc thuộc nhóm IV, nghĩa là
chúng đƣợc sử dụng trong thực tiễn và khơng độc. Vì thế, Validamycin đƣợc coi là
một trong những sản phẩm kháng nấm lý tƣởng có nguồn gốc VSV, có triển vọng
và an tồn cho mơi trƣờng [31].
Ở Việt Nam đã có những cơng trình nghiên cứu và ứng dụng CKS trong
phòng chống các bệnh do vi nấm ở thực vật. Bùi Thị Việt Hà và cộng sự đã ứng
dụng chế phẩm kháng sinh T-41 và D-42 có nguồn gốc XK để chống nấm
Sclerotium rolfsii gây bệnh mốc trắng ở cà chua và nấm R. solani gây bệnh lở cổ rễ,
thối bắp ở bắp cải và đã đƣợc thử nghiệm ngoài đồng ruộng cho kết quả khả quan
[10], [11].
Thực tế đã cho thấy, việc sử dụng các CKS có nguồn gốc XK trong lĩnh vực
bảo vệ thực vật có nhiều triển vọng hơn so với hóa chất bảo vệ thực vật bởi các hợp
chất tự nhiên này có nhiều ƣu việt: có tác dụng chọn lọc cao, có thể tiêu diệt VSV
gây bệnh ngay ở nồng độ thấp, có tác dụng nhanh, thƣờng khơng độc hoặc độc thấp
với ngƣời, động vật và thực vật, có khả năng ức chế VSV đã kháng thuốc hóa học,
thời gian bán hủy ngắn do đó khơng gây ơ nhiễm mơi trƣờng… CKS và dịch lên
men các chủng sinh CKS đƣợc dùng để xử lý hạt giống trƣớc khi gieo trồng nhằm
tiêu diệt mầm bệnh bên trong và ngoài hạt, diệt bệnh ở các bộ phận trên mặt đất của
cây và làm sạch mầm bệnh trong đất. Tuy nhiên, để khắc phục tính kháng thuốc của
VSV, ngồi việc định kỳ thay thuốc, ngƣời ta cịn dùng phối hợp nhiều CKS. Bên
18
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




cạnh đó cịn cần chú ý tới việc đảm bảo sự cân bằng của khu hệ VSV hữu ích trong

đất.
Nhìn chung, so với trong y học, việc sử dụng CKS trong lĩnh vực bảo vệ thực
vật vẫn còn ở mức độ thấp, tuy nhiên, những thành tựu thu đƣợc và xu hƣớng phát
triển hiện nay đã khẳng định tầm quan trọng của CKS trong nền nông nghiệp hiện
đại. Cần phải có sự phối hợp một cách có kế hoạch trong việc tìm kiếm CKS mới,
xây dựng biện pháp đấu tranh sinh học, đồng thời có thể phối hợp với các biện pháp
hóa học sẽ đem lại những hiệu quả to lớn trong phòng chống bệnh và nâng cao hiệu
suất cây trồng.
1.5. XẠ KHUẨN ỨNG DỤNG TRONG BẢO VỆ MÔI TRƢỜNG
Hiện nay, tốc độ ô nhiễm môi trƣờng đang ngày càng gia tăng, do đó cần
phải thực hiện nghiêm ngặt các tiêu chuẩn đối với việc xử lý chất thải ra ngồi mơi
trƣờng. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh đƣợc enzyme có khả năng và triển vọng
trong giám định và xử lý ô nhiễm môi trƣờng. Trong lĩnh vực này, VSV môi trƣờng
đang là phƣơng pháp tiếp cận nghiên cứu tốt nhất của thế giới.
1.5.1. Tuyển chọn xạ khuẩn sinh enzyme
VSV sống khắp nơi trên Trái Đất, chúng có khả năng biến dị nhanh để duy trì
sự sống và tồn tại trong các điều kiện sống thay đổi. VSV có hệ enzyme đa dạng và
phong phú. Tuy nhiên không phải tất cả các VSV đều có khả năng sinh enzyme nhƣ
nhau, ngay cả những chủng cùng một lồi cũng khơng cùng hoạt tính sinh tổng hợp
enzyme [21]. Vì vậy, việc nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng VSV có hoạt
lực cao trong việc tạo thành enzyme mong muốn là cần thiết. Ví dụ, muốn lựa chọn
các chủng VSV sinh enzyme chịu nhiệt nên lựa chọn từ suối nƣớc nóng hay bể ủ rác
thải; tuyển chọn các VSV sinh enzyme chịu kiềm, chịu axit thƣờng phân lập từ nơi có
độ kiềm cao hay axit cao; lựa chọn chủng sinh cellulase thƣờng tìm thấy ở các mẫu
đất có nhiều xác thực vật bị phân hủy… Tuy nhiên, trong thực tế, để tuyển chọn đƣợc
các chủng VSV có hoạt tính enzyme mạnh và có khả năng ứng dụng trong sản xuất
địi hỏi các bƣớc nghiên cứu công phu, mất nhiều công sức. Bên cạnh đó có nhiều

19
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

chủng VSV đã đƣa vào sản xuất nhƣng còn nhiều lĩnh vực đòi hỏi cần phải tiếp tục
nghiên cứu tuyển chọn các chủng mới nhằm phục vụ cao nhất cho con ngƣời.
Một số nghiên cứu trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam đã chỉ ra rằng các chủng
XK thuộc chi Streptomyces có khả năng sinh một số enzyme có ý nghĩa quan trọng
trong công nghệ xử lý môi trƣờng. Ziad Jaradat và cộng sự (2008) đã phân lập,
tuyển chọn đƣợc chủng Streptomyces sp. J2 từ các bãi rác thải cơng nghiệp có khả
năng sinh enzyme cellulase mạnh sử dụng trong xử lý rác thải [57]. De Azeredo và
cộng sự (2006) đã ứng dụng enzyme protease từ chủng XK Streptomyces sp. 594 ƣa
nhiệt để phân hủy các phế thải từ ngành công nghiệp gia cầm [38].
Theo nghiên cứu của tác giả Phạm Hồng Ngọc Thùy (2008) đã phân lập và
tuyển chọn đƣợc chủng Streptomyces griseus VTCC-A-1126 có khả năng sinh tổng
hợp chitosanase khi chúng đƣợc ni trong mơi trƣờng có chất cảm ứng là chitosan.
Chitin, chitosan là polymer hữu cơ phổ biến trong thiên nhiên, đặc biệt trong vỏ
tôm, cua, ghẹ. Trƣớc đây để phân hủy chitin, ngƣời ta thƣờng phải sử dụng axit HCl
đậm đặc gây ô nhiễm môi trƣờng. Vì vậy, việc thu nhận chế phẩm enzyme
chitosanase từ Streptomyces griseus có ý nghĩa quan trọng trong việc phân hủy
chitin bằng phƣơng pháp sinh học, giúp tạo sản phẩm có chất lƣợng tốt và ít gây ơ
nhiễm mơi trƣờng… [20].
Viện Công nghệ Môi trƣờng, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã
nghiên cứu cho ra một chế phẩm vi sinh xử lý môi trƣờng hiệu quả và đƣợc ứng
dụng rộng rãi tại Hà Nội, Phú Thọ, Thái Bình…, đó là chế phẩm Biomix 1. Đây là
một tập hợp gồm 10 chủng VSV ƣa nhiệt (sinh trƣởng tối ƣu ở 45 - 550C) thuộc
nhóm XK chi Streptomyces và vi khuẩn thuộc chi Bacillus. Các chủng này có ƣu
điểm là sinh các enzyme xenlulase, amylase, protease ngoại bào có tác dụng phân
hủy mạnh các chất hữu cơ trong chất thải và là những chủng VSV không gây bệnh
cho ngƣời và động vật, thực vật.

1.5.2. Một số enzyme chủ yếu ứng dụng trong bảo vệ môi trường
Cho tới nay, ngƣời ta đã biết đƣợc khoảng 3.000 enzyme. Tất cả các enzyme
đều đƣợc gọi tên và đƣợc xếp vào “Hệ thống phân loại” gồm 6 lớp. Trong đó, chỉ
20
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên