Nghiên cứu khả năng ứng dụng chủng acetobacter xylinum trong sản xuất đồ uống

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH MÔI TRƯỜNG


NGUYỄN VĨNH QUỐC

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG
CHỦNG ACETOBACTER XYLINUM
TRONG SẢN XUẤT ĐỒ UỐNG

Đà Nẵng – Năm 2016


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH MÔI TRƯỜNG


NGUYỄN VĨNH QUỐC

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG
CHỦNG ACETOBACTER XYLINUM
TRONG SẢN XUẤT ĐỒ UỐNG
Ngành: Công nghệ sinh học
Người hướng dẫn: TS. Đoàn Thị Vân

Đà Nẵng – Năm 2016


LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đề tài: “Nghiên cứu khả năng ứng dụng vi khuẩn Acetobacter
xylinum trong sản xuất đồ uống” là kết quả nghiên cứu của tôi.
Các số liệu nghiên cứu, kết quả điều tra, kết quả phân tích trung thực, chưa
từng được công bố. Các số liệu liên quan được trích dẫn có ghi chú nguồn gốc.
Tơi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm nếu kết quả là sản phẩm kế thừa hoặc đã
công bố của người khác.
Đà Nẵng, tháng 05 năm 2016
Tác giả

Nguyễn Vĩnh Quốc

i


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh – Môi trường,
Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng đã tạo điều kiện về cơ sở vật chất để tơi có thể
hồn thành tốt đề tài nghiên cứu này.
Tiếp đến, tôi xin gửi lời cảm ơn đến cán bộ giảng viên đang giảng dạy tại khoa
đã cung cấp kiến thức nền tảng trong bốn năm qua và đã giúp đỡ cho tôi trong suốt
q trình thực hiện đề tài. Đặc biệt, tơi xin cảm ơn Giảng viên hướng dẫn trực tiếp
cho tôi, TS. Đoàn Thị Vân, đã giúp đỡ và chỉ dẫn tận tình trong cả q trình thực hiện
đề tài.
Cuối cùng tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè, những người đã quan
tâm, giúp đỡ, động viên tôi khi gặp khó khăn trong trong q trình thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn!
Đà Nẵng, tháng 05 năm 2016
Tác giả
Nguyễn Vĩnh Quốc

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN........................................................................................................ ii
MỤC LỤC ............................................................................................................. iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.........................................................................vii
DANH MỤC BẢNG BIỂU .............................................................................. viii
DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ .................................................................ix
MỞ ĐẦU..................................................................................................................1
1.

Đặt vấn đề......................................................................................................1

2.

Mục tiêu của đề tài ......................................................................................2

3.

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài.................................2

3.1.

Ý nghĩa khoa học .....................................................................................2

3.2.

Ý nghĩa thực tiễn......................................................................................2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................3
1.1.

Tổng quan về vi sinh vật - Vi khuẩn A. xylinum ...............................3

1.1.1. Phân loại.....................................................................................................3
1.1.2. Đặc điểm hình thái.....................................................................................3
1.1.3. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa .....................................................................3
1.1.3.1. Đặc điểm sinh lý .....................................................................................3
1.1.3.2. Đặc điểm sinh hóa..................................................................................3
1.1.4. Một số nghiên cứu về A. xylinum .............................................................4
1.1.4.1. Một số nghiên cứu trong nước..............................................................4
1.1.4.2. Một số nghiên cứu quốc tế ....................................................................4
1.2.

Nguyên liệu khảo sát quá trình lên men A. xylinum tạo đồ uống .5

iii


1.2.1. Cây mía .......................................................................................................5
1.2.1.1. Phân loại .................................................................................................5
1.2.1.2. Mơ tả về cây mía.....................................................................................5
1.2.1.3. Thành phần dinh dưỡng của nước mía................................................6
1.2.1.4. Những ứng dụng của cây mía trong thực tiễn ....................................6
1.2.2. Trà túi lọc Lipton .......................................................................................7
1.2.3. Dưa hấu.......................................................................................................8
1.2.3.1. Phân loại .................................................................................................8
1.2.3.2. Thành phần hợp chất có trong quả dưa hấu.......................................8

1.2.3.3. Những ứng dụng của dưa hấu trong thực tiễn....................................9
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ................................................................................................................................... 10
2.1.

Đối tượng nghiên cứu........................................................................... 10

2.2.

Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 10

2.3.

Phương pháp.......................................................................................... 10

2.3.1. Các phương pháp vi sinh ....................................................................... 10
2.3.1.1. Phương pháp hoạt hóa vi khuẩn A. xylinum từ mẫu đông khô...... 10
2.3.1.2. Phương pháp pha loãng mẫu............................................................. 10
2.3.1.3. Phương pháp nhuộm Gram................................................................ 11
2.3.1.4. Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật..................................... 12
2.3.2. Các phương pháp hóa sinh .................................................................... 12
2.3.2.1. Phương pháp xác định hoạt tính Catalase ....................................... 12
2.3.2.2. Phương pháp xác định khả năng tổng hợp cellulose ...................... 13
2.3.2.3. Phương pháp xác định sự có mặt acid acetic trong dịch ni cấy13
2.3.2.4. Phương pháp định lượng acid acetic................................................ 13
iv


2.3.3. Các phương pháp khảo sát khả năng tạo sản phẩm lên men của A.
xylinum

................................................................................................................... 13

2.3.3.1. Phương pháp khảo sát tỷ lệ tiếp giống và thời gian lên men......... 13
2.3.3.2. Phương pháp thanh trùng Pasteur .................................................... 14
2.3.3.3. Phương pháp đo độ pH....................................................................... 15
2.3.3.4. Phương pháp đo hàm lượng đường .................................................. 15
2.3.3.5. Phương pháp đánh giá cảm quan ..................................................... 15
2.3.3.6. Phương pháp kiểm tra tổng số vi sinh vật........................................ 16
2.3.3.7. Phương pháp kiểm tra coliform......................................................... 16
2.3.3.8. Phương pháp xác định độ chua Thorner của sản phẩm sau khi
lên men

............................................................................................................... 16

2.3.3.9. Phương pháp xử lí số liệu .................................................................. 16
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ................................................... 18
3.1.

Kết quả thí nghiệm vi sinh-hóa sinh xác định chủng A. xylinum18

3.1.1. Hoạt hóa chủng A. xylinum từ mẫu đông khô và tách rời khuẩn lạc18
3.1.2. Nhuộm Gram và soi kính hiển vi........................................................... 18
3.1.3. Xác định hoạt tính Catalase .................................................................. 19
3.1.4. Xác định khả năng tổng hợp cellulose ................................................. 20
3.1.5. Xác định sự có mặt acid acetic trong dịch nuôi cấy........................... 21
3.1.6. Định lượng acid acetic ........................................................................... 21
3.2.

Ứng dụng chủng A. xylinum để tạo đồ uống lên men ................... 22

3.2.1. Xác định số lượng vi sinh vật có trong 1ml dịch giống ..................... 22
3.2.2. Khảo sát tỷ lệ tiếp giống và thời gian lên men.................................... 22
3.2.3. Xác định 1 số chỉ tiêu chất lượng của sản nước mía lên men ........... 31
3.2.3.1. Đánh giá cảm quan ............................................................................. 31
v


3.2.3.2. Sự biến thiên hàm lượng đường ........................................................ 32
3.2.3.3. Độ chua Thorner ................................................................................. 32
3.2.3.4. Sự biến thiên pH .................................................................................. 33
3.2.3.5. Tổng số vi sinh vật............................................................................... 33
3.2.3.6. Chỉ tiêu Coliform................................................................................. 34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
A. xylinum

Acetobacter xylinum

BC

Bacterial cellulose

CFU

Colony Forming Unit

S. officinarum

Saccharum officinarum

S. spontaneum

Saccharum spontaneum

TGA

Tryptone Glucose Agar

vii


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Số hiệu bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Thành phần dinh dưỡng của nước mía

7

1.2

Phân tích thành phần hóa lí và khống chất của trà Lipton

9

nhãn vàng
1.3

Thành phần dinh dưỡng trong 100g phần ăn được của quả
dưa hấu

10

3.1

Khối lượng acid acetic có trong 1ml dịch lên men sau 32

23

nuôi cấy (g)
3.2

Kết quả đếm số lượng vi sinh vật của dịch giống

23

3.3

Kết quả đánh giá cảm quan của nước trà đen lên men

24

3.4

Kết quả đánh giá cảm quan của nước dưa hấu lên men

24

3.5

Kết quả đánh giá cảm quan của nước mía lên men

25

3.6

Hàm lượng đường của nước mía nguyên chất và nước mía
lên men (%)
Độ chua Thorner của nước mía nguyên chất và nước mía
lên men (oT)
Độ pH của nước mía nguyên chất và nước mía lên men
(đvpH)

33

3.7
3.8

33
34

viii


DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
Số hiệu

Tên hình vẽ.

Trang

1.1

Cây mía.

6

1.2

Hộp trà Lipton nhãn vàng.

8

1.3

Cây và quả dưa hấu.

9

3.1

Khuẩn lạc tách rời của A. xylinum sau khi hoạt hóa.

19

3.2

Vi khuẩn A. xylinum bắt màu nhuộm Gram (-).

20

3.3

A. xylinum phản ứng catalase.

20

3.4

Phản ứng màu cellulose.

21

3.5

Phản ứng giữa acid trong dịch lên men và CaCO3.

22

3.6
3.7
3.8
3.9
3.10
3.11
3.12
3.13
3.14
3.15

Biểu đồ sự biến thiên pH của các tỷ lệ nuôi cấy theo thời
gian của môi trường nước trà đen.
Biểu đồ sự biến thiên hàm lượng đường của các tỷ lệ nuôi
cấy theo thời gian của môi trường nước trà đen.
Biểu đồ sự biến thiên hàm lượng acid của các tỷ lệ nuôi cấy
theo thời gian của môi trường nước trà đen.
Biểu đồ sự biến thiên pH của các tỷ lệ nuôi cấy theo thời
gian của môi trường nước dưa hấu.
Biểu đồ sự biến thiên hàm lượng đường của các tỷ lệ nuôi
cấy theo thời gian của môi trường nước dưa hấu.
Biểu đồ sự biến thiên hàm lượng acid của các tỷ lệ nuôi cấy
theo thời gian của môi trường nước dưa hấu.
Biểu đồ sự biến thiên pH của các tỷ lệ nuôi cấy theo thời
gian của môi trường nước mía.
Biểu đồ sự biến thiên hàm lượng đường của các tỷ lệ nuôi
cấy theo thời gian của môi trường nước mía.
Biểu đồ sự biến thiên hàm lượng acid của các tỷ lệ nuôi cấy
theo thời gian của môi trường nước mía.

Dịch nước mía lên men với tỷ lệ tiếp giống 10% trong thời
gian 5 ngày

26
26
27
28
28
29
30
30
31
32

3.16

Khuẩn lạc trên đĩa môi trường thạch

34

3.17

Đĩa thạch môi trường Endo đã cấy dịch lên men sau 48h ủ
ấm, độ pha loãng dịch đến 10 -3

35

ix

x


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Acetobacter xylinum (A. xylinum) là một loại vi khuẩn khá phổ biến ở
Philippine được A.J. Brown phát hiện vào năm 1886 bởi khả năng tổng hợp cellulose
[28]. A. xylinum tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả. Khi nuôi cấy vi
khuẩn này trên môi trường dịch lỏng, chúng sẽ hình thành trên bề mặt một lớp màng
cellulose vi khuẩn (BC), đó là hợp chất polymer không phân nhánh của β- 1, 4glucopyranose [41].
Màng BC do A. xylinum tạo ra có cấu trúc hố học và đặc tính cơ học giống
với cellulose của thực vật, nhưng có thêm một số tính chất hố lý đặt biệt như: độ
tinh khiết cao (hơn 60%), độ bền cơ học, đường kính sợi nhỏ, tính đàn hồi lớn, khả
năng thấm hút nước nhanh, khả năng polymer hoá rất lớn, có khả năng phục hồi độ
ẩm ban đầu, có thể bị thuỷ phân bởi enzyme... Sợi cellulose được đánh giá cao khơng
hịa tan và khơng đàn hồi, vì cấu hình phân tử của chúng có độ bền co dãn tương
đương với thép. Vì vậy, màng BC được sử dụng rộng rãi trên thế giới, trong nhiều
lĩnh vực, công nghệ, như: công nghệ giấy, công nghệ pin, trong lĩnh vực y học (màng
trị bỏng, mặt nạ dưỡng da, mạch máu nhân tạo…) [44]. Đặc biệt màng BC đã và đang
được nghiên cứu, ứng dụng trong thực phẩm. Các nhà nghiên cứu đã tìm ra nhiều sản
phẩm từ ứng dụng màng BC vi khuẩn được người tiêu dùng yêu thích như: thạch dừa,
Nata de coco...
Trong bối cảnh quốc tế hiện nay, công nghiệp hóa - hiện đại hóa được xem là
xu hướng chung của các nước đang phát triển. Cùng với mục tiêu phát triển nền công
nghiệp và dịch vụ để hiện đại hóa đất nước, chúng ta khơng thể qn tầm quan trọng
của nền nơng nghiệp là chìa khóa để phát triển kinh tế, nâng cao đời sống nhân dân
và ổn đinh kinh tế xã hội [19]. Mặt khác, nhiều sản phẩm nông nghiệp cũng đồng thời
trở thành nguồn nguyên liệu cho các ngành công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp chế

biến.
Trong đó cây mía (chi Saccharum) là lồi trong những lồi cây cơng nghiệp
có giá trị về mặt kinh tế. Cây mía ở Việt Nam được trồng ở nước ta từ lâu đời và được


2

phát triển vào thời kỳ Pháp thuộc khi xuất hiện ngành cơng nghiệp đường mía. Hầu
hết cây mía được trồng ở Việt Nam là giống lai của lồi mía q (Saccharum
officinarum) với lồi mía dại (Saccharum spontaneum). Cây mía ngồi việc đáp ứng
nhu cầu của khẩu phần ăn hằng ngày, nó cịn có giá trị to lớn về mặt sản xuất công
nghiệp, đặc biệt là công nhiệp thực phẩm. [21].
Đồ uống là một trong những loại sản phẩm tiêu dùng được tiêu thụ mạnh mẽ
nhất hiện nay, đa đạng về chủng loại. Nhưng hầu hết các sản phẩm nước uống hiện
nay đều là các sản phẩm hóa chất tổng hợp, một số có nguồn gốc từ thảo dược, hoặc
là nước trái cây, tuy nhiên vẫn là thức uống có bổ sung thành phần hóa học. Vì vậy,
sản xuất một sản phẩm đồ uống có nguồn gốc tự nhiên và có lợi cho sức khỏe là một
hướng phát triển mới cần phải quan tâm. Với hàm lượng khoáng và dinh dưỡng của
trái cây cao, rất phù hợp để sử dụng làm nguyên liệu nuôi sinh khối vi sinh vật nhằm
sản xuất đồ uống bằng phương pháp vi sinh.
Trên cơ sở đó tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu khả năng ứng dụng chủng
Acetobacter xylinum trong sản xuất đồ uống”.

2. Mục tiêu của đề tài
Mục tiêu chính của đề tài là nghiên cứu khả năng ứng dụng chủng A. xylinum
trong sản xuất sản phẩm đồ uống lên men.

3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
- Bổ sung chủng A. xylinum vào bộ sưu tập giống vi sinh vật của khoa SinhMôi trường, Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng.

- Kết quả của đề tài sẽ là nguồn dẫn liệu bổ sung cho các nghiên cứu trước về
chủng vi khuẩn A. xylinum được ứng dụng trong sản xuất thực phẩm. Đồng thời tạo
tiền đề cho việc nghiên cứu về vi khuẩn A. xylinum ứng dụng trong thực tế.

3.2.Ý nghĩa thực tiễn
-

Kết quả của đề tài góp phần làm đa dạng thị trường đồ uống.

-

Sử dụng chủng A. xylinum lên men tạo ra sản phẩm có mùi vị đặc trưng, hỗ

trợ tiêu hóa cho con người.


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về vi sinh vật - Vi khuẩn A. xylinum
1.1.1. Phân loại
Theo hệ thơng phân loại của nhà khoa học Bergey thì A. xylinum được xếp vào:
Lớp:

Schizommycetes

Bộ:

Pseudomonadales

Họ:

Pseudomonadieae

Chi:

Acetobacter

Lồi:

A. xylinum

1.1.2. Đặc điểm hình thái
Vi khuẩn A. xylinum có dạng hình que thẳng hoặc hơi cong, có thể di động
hoặc khơng di động, khơng sinh bào tử thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt
buộc, không sinh bào tử [45].
Đặc điểm khuẩn lạc: trên môi trường đặc, vi khuẩn A. xylinum hình thành
khuẩn lạc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hoặc gợn sóng, màu trắng hoặc trong
suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên, dễ tách khỏi môi trường [8].
1.1.3. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa
1.1.3.1. Đặc điểm sinh lý
Trong tự nhiên A. xylinum được tìm thấy trong đất và thường được tìm thấy
trên trái cây thối rữa [42], đơi khi được tìm thấy cộng sinh với thực vật như mía hoặc
coffee [48]. Đặc biệt là trong nước dừa già để lên men tự nhiên ngồi khơng khí.
Theo Bergey, 1992, nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn A. xylinum là 25 oC – 35 oC,
pH tối ưu là 4.5 – 6.2 [25]. A. xylinum là vi khuẩn lên men hiếu khí bắt buộc. A.
xylinum tổng hợp tốt acid trong môi trường chứa glucose, sucrose, mannose, galactose
và xylose [51]; sinh trưởng tốt trong mơi trường có gelatin và latate [46].
1.1.3.2. Đặc điểm sinh hóa
Theo các nghiên cứu của Faster cho thấy A. xylinum có khả năng oxy hóa

acetic acid tạo thành CO2 và H2O, phản ứng catalase dương tính, hịa tan CaCO3 ,
chuyển hóa glucose thành acid, oxy hóa acetol thành acid acetic; điều này cho thấy
A. xylinum thuộc nhóm vi sinh vật acetic điển hình.


4

1.1.4. Một số nghiên cứu về A. xylinum
1.1.4.1. Một số nghiên cứu trong nước
Khảo sát khả năng tạo màng BC của A. xylinum trên nhiều loại cơ chất khác
nhau của Nguyễn Thúy Hương (2007) đã cho ra kết quả trên cơ chất như dịch mía, rỉ
đường, dịch hoa quả và đặc tính của màng BC khi ni cấy A. xylinum ở hệ lên men
chìm và lên men nổi. Đồng thời tác giả cũng đã công bố một nghiên cứu về khả năng
dùng A. xylinum để kết dính vật liệu.
Điều kiện nuôi cấy A. xylinum cũng đã được nghiên cứu và tối ưu hóa qua
khảo sát của Đinh Thị Kim Nhung (2007), bên cạnh đó nhà nghiên cứu cùng cộng sự
cũng công bố nghiên cứu chế tạo màng trị bỏng từ màng BC của A. xylinum.
A. xylinum cũng được nghiên cứu để tạo ra cellulose cố định vi khuẩn
Lactobaccillus bulgaricus (LB) và Streptococcus thermophillus (ST) và ứng dụng vi
khuẩn cố định được trong lên men sữa chua Lê Thị Bốn (2012).
Năm 2013, Hồ Lê Hân và cộng sự đã khảo sát một số môi trường khác nhau
để sản xuất bacterial cellulose từ vi khuẩn A. xylinum đã cho những kết quả đáng kể,
trong đó mơi trường dịch chiết nước thơm cho kết quả tốt nhất với sản lượng BC là
20g/l.
1.1.4.2. Một số nghiên cứu quốc tế
Ở một số quốc gia trên thế giới A. xylinum đã được ứng dụng rộng rãi để tạo
cellulose thay thế cho việc sử dụng cellulose thực vật. Nghiên cứu để xác định thời
gian và điều kiện bổ sung chủng vi khuẩn vào hệ lên men lớn trong quá trình sản xuất
BC từ A. xylinum đã cho thấy tầm quan trọng của sản phẩm này (Puji Lestari et al,
2014).

Ứng dụng lâu đời nhất của A. xylinum là Nata- de- coco, là một món ăn phổ
biến ở Philippines và các nước khác. BC được sản xuất bởi A. xylinum cũng được sử
dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm vì kết cấu mềm mại và hàm lượng chất xơ
cao [29].
Năm 1992 BC được đưa vào sản xuất đồ uống tại Nhật Bản. A. xylinum được
nuôi cấy cùng với nấm men trong môi trường gồm đường và chiết xuất trà, và được


5

bán trên thị trường như là Kombucha hay trà Mãn Châu, cho nhu cầu cải thiện sức
khỏe [39].
Ngoài ra, màng BC rất tốt cho bề mặt của da, chúng có thể bao phủ đa hình kể
cả một số vùng khó băng bó như khn mặt. Kỹ thuật này đã thành cơng và được
thương mại hóa. Bioprocess và Gengiflex là hai sản phẩm từ màng BC được ứng
dụng rộng rãi trong phẫu thuật và cấy ghép nha khoa [30].
1.2.

Nguyên liệu khảo sát quá trình lên men A. xylinum tạo đồ uống

1.2.1. Cây mía
1.2.1.1. Phân loại
Cây mía là một loại thực vật thân thảo cao thuộc chi Saccharum [33].
Hiện nay trên thế giới giống mía được trồng trong sản xuất gồm lồi S.
officinarum và các giống lai của nó. Tại Việt Nam giống mía được sử dụng là cây lai
từ 2 lồi S. officinarum với S. spontaneum có năng suất cao [21].
1.2.1.2. Mơ tả về cây mía
Cây mía là một lồi cây thân thảo, mọc thành bụi bao gồm những cành thẳng,
ít hoặc không phân nhánh. Một hệ thống thân rễ nằm dưới đất mọc chồi thứ cấp từ
cây cha mẹ xung quanh cành chính. Thân cây có màu sắc khác nhau, màu xanh lá cây,

hồng nhạt, hoặc màu tím và chiều cao có thể đạt 5m.

Hình 1.1. Cây mía
Các cành trên mặt đất chia thành nhiều đốt chứa lõi xơ xen kẽ với các mơ sáp
có đường. Lá thon dài, thẳng, có gân chính dày và các cạnh có răng cưa, phát triển
đến chiều dài khoảng 30-60 cm và chiều rộng 5 cm. Các cụm hoa là một chùm dài


6

lên đến 60 cm, một cụm hoa màu hồng rộng nhất tại phần đài hoa và nhọn về hướng
đỉnh. Những bông con được sinh ra trên cuống và dài khoảng 3 mm và được bọc
trong những túm lông dài, mượt. Quả khi chín chứa ít nước và mỗi một quả chứa một
hạt giống duy nhất [32], [26]. Mía được thu hoạch trước khi ra hoa, vì quá trình ra
hoa sẽ làm giảm hàm lượng đường [22].
1.2.1.3. Thành phần dinh dưỡng của nước mía
Cây mía là lồi thực vật giàu thành phần dinh dưỡng. Trong cây mía có
saccharose 7- 10%, protein 0.22%, các loại khoáng Ca, Mg, Fe, K, Na, Si, Mn,…
Ngồi ra cịn có glyxin, asparagin, glutamin, loxin, arabinose, tannin là các hợp acid
amin hoặc các hoặc các gợp chất tự nhiên có lợi cho sức khỏe.
Trong nước mía chứa khoảng 20% đường saccharose, ngồi ra cịn có glucose,
acid citric, myrixylic, galactoxylan và các loại muối khoáng [10]. Thành phần các
chất dinh dưỡng có trong nước mía được thể hiện cụ thể qua bảng sau [50]:
Bảng 1.1. Thành phần các chất dinh dưỡng có trong 28.35 gam đường thơ
Sugars
Protein
Calcium
Iron
Potassium
Sodium

26.98 g
0.27 g
11.23 mg
0.37 mg
41.96 mg
17.01 mg

1.2.1.4. Những ứng dụng của cây mía trong thực tiễn
Mía được dùng như một bài thuốc Đông Y đùng để tiêu đờm, bổ dưỡng [10].
Trong công nghiệp, ngoài việc cung cấp nguyên liệu trực tiếp cho ngành cơng
nghiệp chế biến đường, phụ phế phẩm của mía như lá, ngọn non được dùng để chăn
nuôi gia súc [26].
Bã mía có thể dùng làm ngun liệu để đốt lị góp phần làm giảm chi phí của
nhiên liệu trong việc nấu đường (03 tấn bã mía khơ cung cấp nhiệt lượng tương đương
01 tấn dầu). Ngồi ra, bã mía có thể dùng để chế tạo ván ép (cách âm, cách nhiệt),
dùng trong xây dựng và đóng đồ, làm bột giấy, than hoạt tính hoặc làm ngun liệu
cho cơng nghiệp chất dẻo, sợi tổng hợp...


7

Từ mật rỉ cho lên men chưng cất rượu Rum, sản xuất các loại men thực phẩm
(5 tấn mật rỉ cho 1 tấn men khô), dùng làm nguyên liệu sản xuất axit axetic, axit citric;
Một tấn mật rỉ có thể sản xuất 3800 lít rượu hoặc có thể sản xuất ra cồn nhiên liệu.
Từ bùn lọc sản xuất ra sáp dùng làm sơn, xi đánh bóng, chất cách điện... Sau
khi rút sáp, bùn lọc chế biến dùng làm phân bón cho mía.
Theo ước tính giá trị các sản phẩm phụ của cây mía như bã mía, mật rỉ, bùn
lọc nếu được khai thác triệt để thì giá trị đem lại cịn cao hơn sản phẩm chính là đường
gấp 2 - 3 lần. Vì nó là ngun liệu trực tiếp hay gián tiếp của nhiều ngành công nghiệp

chế biến: rượu cồn, giấy, ván ép, sản xuất nhựa, dược phẩm, thức ăn gia súc, phân
bón [2].
1.2.2. Trà túi lọc Lipton
a. Nguồn gốc
Lipton Nhãn Vàng đã được bán kể từ năm 1890, khi Sir Thomas Lipton tạo ra
phiên bản đầu tiên của gói màu vàng với một lá chắn Lipton đỏ, mà cho đến ngày nay
là tiêu biểu cho nhãn hiệu Lipton Yellow. Nó được bán tại 150 quốc gia trên tồn thế
giới [34].

Hình 1.2 Hộp trà Lipton nhãn vàng
Trà Lipton nhãn vàng có thành phần là 100% từ búp trà xanh, được sản xuất
theo dây chuyền công nghệ trà đen truyền thống, là loại trà túi lọc phổ biến đối với
người dân Việt Nam hiện nay.


8

b. Thành phần của trà đen
Thành phần dinh dưỡng của trà đen được ghi rõ trên bao bì của sản phẩm. Kết
quả phân tích lí hóa và chất khống được thể hiện qua bảng sau [36]:
Bảng 1.2 Phân tích hóa lí và khống chất của trà Lipton nhãn vàng
Độ ẩm
Protein
Chất béo
Chất xơ
Tro
Caffeine
Canxi
Magie
Natri

Kali
Mangan
Nước tách chiết

2.46%
0.95%
1.21%
11.23%
4.52%
2.34%
2.46mg/l
4.49mg/l
0.39mg/l
3.26mg/l
1.51ml/l
32.54%

1.2.3. Dưa hấu
1.2.3.1. Phân loại
Cây dưa hấu được phân loại trong họ nho leo, có tên khoa học là Citrullus
lanatus (Thunb.); cây dưa hấu có nguồn gốc từ châu Phi [24].

Hình 1.3. Cây và quả dưa hấu
1.2.3.2. Thành phần hợp chất có trong quả dưa hấu
Trong quả dưa hấu chín ngồi các thành phần chính như cacbonhydrat, protein,
lipid còn chứa nhiều vitamin như vitamin A, beta carotene, B1, B2, B3, B5, B6,


9

Vitamin C, choline và các muối khoáng như Mn, P, Mg, Zn, Fe, K, Na rất tốt cho sức
khỏe con người. Thông số cụ thể được thể hiện qua bảng:
Bảng 1.3. Thành phần dinh dưỡng trong 100g phần ăn được của quả dưa hấu [37].
Cacbohydrat
Đường
Chất xơ thực phẩm
Chất béo
Protein
Nước
Vitamin A
Thiamin (Vitamin B1)
Riboflavin (Vitamin B2)
Niacin (Vitamin B3)
Axit pantothenic (Vitamin B5)
Vitamin B6
Axit folic (Vit. B9)
Vitamin C
Canxi
Sắt
Magie
Phospho
Kali
Kẽm

7.55 g
6.2 g
0.4 g
0.15 g
0.61 g
91.45 g

28 μg
0.033 mg
0.021 mg
0.178 mg
0.221 mg
0.045 mg
3 μg
8.1 mg
7 mg
0.24 mg
10 mg
11 mg
112 mg
0.10 mg

1.2.3.3. Những ứng dụng của dưa hấu trong thực tiễn
Dưa hấu được sử dụng chủ yếu trong thực phẩm. Quả dưa hấu khi chưa chín
thể được dùng như một loại rau [47], hoặc dùng để xào [43]. Nước ép của quả đã chín
có thể được dùng để lên men rượu hoặc trộn cũng với các loại nước hoa quả khác
[31].
Ngồi ra dưa hấu cịn được dùng để làm siro (Nomin syrup), nước ép quả đóng
chai (ICERA, Snap Punch, WTRMLN WTR,…), hương phụ liệu cho công nghiệp
chế biến bánh kẹo và đồ ngọt (Oreo, Jolly Range, Thạch rau câu), kem (Lotte,
Friendly’s), sữa ,…


10

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

2.1.
-

Đối tượng nghiên cứu
Chủng vi khuẩn A. xylinum được mua từ trường Cao Đẳng Công Nghệ Đà

Nẵng
-

Nước ép dưa hấu

-

Trà túi lọc Lipton nhãn vàng

-

Nước ép từ cây mía

2.2. Nội dung nghiên cứu
Đề tài tập trung nghiên cứu các nội dung sau:
-

Nghiên cứu tổng quan tài liệu

-

Thực hiện các phản ứng hóa sinh để xác định chủng vi sinh vật.

-

Nghiên cứu tỷ lệ tiếp giống, thời gian lên men của vi khuẩn A. xylinum trên

các mơi trường ngun liệu nước mía, nước dưa hấu và nước trà đen. Dựa vào kết
quả của quá trình đánh giá cảm quan và giá trị của các thông số pH, lượng đường, độ
chua để lựa chọn sản phẩm lên men ngon nhất.
2.3.

Xác định một số chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm đồ uống lên men.
Phương pháp

2.3.1. Các phương pháp vi sinh
2.3.1.1. Phương pháp hoạt hóa vi khuẩn A. xylinum từ mẫu đơng khơ
Mẫu đơng khô sau khi được giao nhận dưới dạng rắn chứa trong một tube
Eppendorf 1.5 ml sẽ được hoạt hóa trong 100ml sữa tươi tách 2/3 chất béo trong 24h,
sau đó 1ml sữa sẽ được tiếp vào môi trường dịch lỏng theo cơng thức Hassid-Barker
trong vịng 24h.
2.3.1.2. Phương pháp pha lỗng mẫu.
Các mẫu được pha loãng dựa trên phương pháp của Egorow [4].
Cách tiến hành:


11

- Lấy 1ml dung dịch mẫu cho vào ống nghiệm có chứa 9ml nước cất, lắc đều,
ta có độ pha loãng 10 -1. Hút ra 1ml cho tiếp tục vào ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước
cất, lắc đều, ta có độ pha loãng 10 -2 . Tiếp tục pha loãng cho đến nồng độ cần thiết.
- Dùng pipet vô trùng hút dịch pha loãng ở nồng độ từ 10 -2 - 10-6 khoảng 0.1ml
nhỏ vào hộp lồng chứa môi trường phân lập đã vô trùng, dùng que gạt trang đều trên
mặt thạch. Sau đó, bao gói cẩn thận và ni cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 35-39 oC. Sau

2 – 3 ngày nuôi cấy, chọn những khuẩn lạc riêng lẻ, mọc mạnh, cấy sang ống thạch
nghiên chứa cùng một công thức môi trường nuôi cấy.
2.3.1.3. Phương pháp nhuộm Gram
Để quan sát khả năng bắt màu nhằm phân biệt đó là vi khuẩn Gram âm hay
Gram dương, đồng thời có thể nhận diện được hình dạng của các chủng vi khuẩn tôi
tiến hành nhuộm Gram theo phương pháp sau [19]:
Bước một, làm vết bôi và cố định tiêu bản:
Dùng que cấy vơ trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống thạch nghiêng hoà vào
1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khơ trong khơng khí, hơ nhanh vết bôi trên
ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính. Cố định vết bơi nhằm
3 mục đích: giết chết vi khuẩn, gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính và làm vết bơi bắt
màu tốt hơn vì các tế bào chết bắt màu tốt hơn các tế bào sống.
Bước hai, nhuộm màu:
- Thứ nhất, nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 30 giây đến 1 phút;
- Thứ hai, nhuộm thêm dung dịch lugol và giữ trong 1 phút, rửa nước;
- Thứ ba, nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu),
rửa nước;
- Thứ tư, nhuộm tiếp bằng dung dịch safranin hoặc fuchsin trong 1 phút, rửa
nước, để khô. Lần nhuộm này cả hai nhóm vi khuẩn đều bắt giữ thuốc nhuộm, nhưng
vi khuẩn Gram dương không bị thay đổi màu nhiều, trong khi vi khuẩn Gram âm trở
nên đỏ vàng (nhuộm safranin) hay đỏ tía (fuchsin).
Bước 3, quan sát ở vật kính dầu 100x. Nếu nhuộm đúng vi khuẩn Gram dương
bắt màu xanh đen hay tím, Gram âm bắt màu đỏ vàng (nhuộm safranin) hay đỏ tía
(fuchsin) [11], [17].


12

2.3.1.4. Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật
Nhằm xác định số lượng vi sinh vật trên một đơn vị thể tích, tơi sử dụng

phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc trên môi trường đặc [16].
Cách tiến hành:
-

Chuẩn bị môi trường, phân phối vào đĩa petri tương tự như phương pháp phân

lập.
-

Pha lỗng mẫu dung dịch ni cấy lỏng với các nồng độ 10 -2 đến 10 -10 .

-

Nhỏ 1ml dung dịch ở mỗi độ pha loãng vào đĩa petri, dùng que trang đã khử

trùng trang đều trên bề mặt đĩa. Lặp lại thao tác, 3 đĩa petri ứng với mỗi nồng độ pha
lỗng.
-

Đậy nắp đĩa petri và ni cấy trong tủ ấm 28 oC – 30 oC.

-

Sau 48 – 72 h lấy đĩa petri ra và chọn những đĩa petri ở nồng độ pha lỗng mà

tại đó, số khuẩn lạc trên đĩa petri dao động từ 30 – 300.
-

Tính số lượng CFU (Colony Forming Unit: đơn vị hình thành khuẩn lạc) trong

1ml mẫu dung dịch ở mỗi độ pha lỗng theo cơng thức:
𝐌𝐢 =

𝑨𝒊 .𝑫𝒊
𝑽

(CFU/ml)

Trong đó:
Mi: tổng số CFU trong 1ml dung dịch ở mỗi độ pha loãng.
Ai: số khuẩn lạc trung bình/ đĩa
Di: độ pha lỗng mẫu
V: dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml)
Mật độ tế bào trung bình M trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi ở
các nồng độ pha lỗng khác nhau.
2.3.2.
2.3.2.1.

Các phương pháp hóa sinh
Phương pháp xác định hoạt tính Catalase

Nhỏ 1 giọt H2 O2 3% lên khuẩn lạc, nếu thấy hiện tượng sủi bọt khí thì chủng
vi khuẩn đó được coi là có hoạt tính catalase (calatase +). Ngược lại, chủng vi khuẩn
đó khơng có hoạt tính calatase (calatase -).


13

Ngồi ra, có thể nhỏ trực tiếp H2 O2 3% lên sinh khối tế bào của chủng nghiên
cứu đã được tách từ dịch nuôi cấy bằng cách đem li tâm 6000 vòng/10 phút, quan sát

hiện tượng như trên.
Phương pháp xác định khả năng tổng hợp cellulose

2.3.2.2.

Nuôi vi khuẩn trong môi trường thử khả năng tạo màng (Môi trường Schramm
và Hestrin), nuôi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường thạch ở nhiệt độ 28 – 30 oC
trong 3 – 4 ngày. Quan sát sự hình thành màng, kiểm tra khả năng bắt màu của màng
bằng cách nhỏ lên màng dung dịch lugol và H2SO4 60%, nếu là cellulose thì màng sẽ
chuyển sang màu xanh lam.
Phương pháp xác định sự có mặt acid acetic trong dịch nuôi cấy

2.3.2.3.

Nuôi vi khuẩn trong môi trường lỏng (Hassid- Barker) trong vịng 24h. Cho
một ít bột CaCO3 vào một ống nghiệm thủy tinh, sau đó thêm vào ống nghiệm 5ml
dịch nuôi cấy. Quan sát hiện tượng xảy ra. Nếu vi khuẩn oxy hóa đường tạo ra acid
acetic thì bột CaCO3 sẽ tan ra và dung dịch sẽ sủi bọt khí mạnh.
Phương pháp định lượng acid acetic

2.3.2.4.

Cho vào cốc thủy tinh (loại 100 ml hoặc 200 ml) dịch lên men, thêm vào đó
1– 2 giọt phenolphtalein 0,1%, chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N. Chú ý chuẩn
độ cần phải lắc nhẹ đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt. Sau đó tính số
gam acid acetic trong 100 ml dung dịch lên men theo công thức:
𝑋=

𝑉. 𝐾. 100 𝑔
( ⁄𝑚𝑙 )

10

Với:
X: Số gam acid acetic trong 100 ml dung dịch lên men
V: Số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ 10 ml dung dịch lên men
K: Lượng acid acetic tương ứng với 1 ml NaOH 0,1N (K = 0,006)
10: Số ml dịch lên men đem chuẩn độ
2.3.3.
2.3.3.1.

Các phương pháp khảo sát khả năng tạo sản phẩm lên men của A. xylinum
Phương pháp khảo sát tỷ lệ tiếp giống và thời gian lên men

Vi khuẩn được cấy chuyền trong ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng
Hassid- Barker được hoạt hóa trong mơi trường dịch lỏng trong vịng 72 h để làm