Nghiên cứu nhân giống thông caribe (pinus caribaeca morelet) bằng phương pháp nuôi cấy invitro

-1-

Mở đầu
Một trong những loài cây đà được dẫn nhập vào trồng thành công ở Việt
Nam là Thông caribê (Pinus caribaea Morelet), Thông caribê gồm ba biến chủng
là Pinus caribaea var caribaea, Pinus caribaea var hondurensis vµ Pinus caribaea
var bahamensis đều có phân bố tự nhiên ở vùng Trung Mỹ [27].
Đây là loài cây gỗ lớn, có thể cung cấp gỗ làm nguyên liệu để sản xuất bột
giấy, ván nhân tạo và đồ gia dụng. Là loài cây có sinh trưởng nhanh, cành nhánh
nhỏ, thân thẳng đẹp, tỷ lệ lợi dụng gỗ cao đáp ứng được nhiều mục tiêu kinh tế,
nên đến nay đà có trên 65 nước nhập giống gây trồng, chủ yếu là các nước thuộc
vùng nhiệt đới và á nhiệt đới [9].
Thông caribê được nhập vào trồng thử nghiệm ở nước ta năm 1963 tại Lâm
Đồng [9], qua các khảo nghiệm và rừng trồng thử nghiệm cho thấy Thông caribê
tỏ ra là loài cây có sức sinh tr­ëng nhanh, thÝch øng réng víi nhiỊu vïng sinh th¸i.
KÕt quả nhiều nơi cho thấy rừng sinh trưởng khá tốt và Thông caribê có khả năng
thích ứng lớn với môi trường. Đặc biệt Thông caribê có thể sinh trưởng được trên
các vùng đất trống, đồi trọc nghèo dinh dưỡng, một bộ phận đất đai rất lớn ở nước
ta [2], [3].
Những dấu hiệu đó cho thấy Thông caribê là một trong số những loài cây
trồng rừng có triển vọng cung cấp gỗ nhỡ, gỗ lớn, gỗ nguyên liệu giấy cho nền
kinh tế quốc dân và đồng thời sớm nâng cao độ che phủ của rừng góp phần ổn định
môi trường sinh thái và đang được nhiều cơ quan nghiên cứu, nhiều cơ sở sản xuất
hết sức quan tâm.
ở Việt Nam các loài thông được trồng chủ yếu hiện nay là Thông ba lá
(Pinus kesiya), Thông nhựa (Pinus merkusii), Thông đuôi ngựa (Pinus masoniana)
và gần đây là Thông caribê (Pinus caribaeea) với các biến chủng khác nhau [11].
Nhìn chung trong các loài thông này, Thông caribê là loài thông có sinh trưởng
nhanh, thân cây thẳng đẹp, cành nhánh nhỏ hơn Thông ba lá và Thông đuôi ngựa,
có tỷ lệ gỗ sử dụng cao nên được ưa thích gây trồng. Với đặc ®iĨm sinh lý, sinh th¸i

-2-

và giá trị kinh tế của Thông caribê, trong chương trình trồng mới 5 triệu hecta rừng
hiện nay, Thông caribê đà được chọn là một trong những cây trồng chính quan
trọng cần được ưu tiên phát triển.
Tuy nhiên sự ra hoa kết quả của Thông caribê ở Việt Nam từ nhiều năm
trước đây có một số vấn đề. Trên cơ sở theo dõi vật hậu các lâm phần Thông caribê
trong cả nước và số liệu điều tra các nguồn giống, có thể thấy là khả năng cung ứng
giống Thông caribê ở Việt Nam chưa đủ đáp ứng nhu cầu trồng rừng trong nước.
Tình trạng thiếu giống hiện nay là do một số nguyên nhân. Nguyên nhân tạo ra
biến động về năng suất và chất lượng hạt giống Thông caribê ở Việt Nam là do một
số lâm phần có diện tích lớn mới bắt đầu đến tuổi thành thục và cho hạt hữu thụ
như ở Uông Bí (Quảng Ninh), Hương Sơn (Hà Tĩnh). Ngoài ra năng lực sản xuất
hạt giống của các lâm phần Thông caribê ở Việt Nam chưa đươc tận dụng hết để
đáp ứng nhu cầu giống trong nước [1]. Nhiều khu rừng trồng thông không ra hoa
kết quả hoặc chỉ ra quả mà không có hạt hữu thụ hoặc số hạt hữu thụ rất ít, không
đủ hạt giống cung cấp cho trồng rừng. Trong khi khả năng cung cấp hạt của Thông
caribê chưa đủ, giá thành hạt nhập ngoại đắt, nhân giống vô tính thông có vai trò
quan trọng trong việc phát triển cây giống để cung cấp cho trồng rừng.
Ngày nay, kỹ thuật nhân giống cây trồng đà có những bước phát triển vượt
bậc, bằng công nghệ nhân giống vô tính có thể tạo ra một số lượng lớn cây giống
mang bản chất di truyền giống hệt cây mẹ trong một thời gian ngắn. Trên thế giới
công nghệ nhân giống vô tính thông bao gồm kỹ thuật nuôi cấy in vitro (nuôi cấy
mô tế bào) và kỹ thuật nhân giống hom, chiết, ghép trong đó nuôi cấy in vitro và
giâm hom ngày càng đóng vai trò chủ đạo. Lần đầu tiên năm 1976, những thực
nghiệm về nhân giống hom với một số loài thông nhiệt đới đà được tiến hành tại
Trung tâm nghiên cứu cây có sợi (nay là Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy) ở
mức là những nghiên cứu rất sơ khai và đà đạt được một số kết quả. Trung tâm
nghiên cứu giống cây rừng ( Viện KHLN ) cũng đà thử nghiệm giâm hom một số

loài thông và đà thành công bước đầu với cây thông lai và cây Thông Caribê. Tuy
nhiên Thông caribê lại là loài khi nhân giống bằng phương pháp gi©m hom trùc tiÕp


-3-

từ cây trội không phải luôn đạt được kết quả. Khi giâm hom cho loài thông này từ
cây non ở vườn cấp hom thì dễ thành công hơn [8]. Như vậy giâm hom thông ở
Việt Nam kết quả chưa cao, chưa thể đưa vào sản xuất quy mô lớn. Hiện nay nuôi
cấy in vitro đà được áp dụng trong một số nước có nền lâm nghiệp phát triển và đÃ
được thùc hiƯn ë quy m« c«ng nghiƯp. Nu«i cÊy m« tế bào là một kỹ thuật tiên tiến
trong nhân giống cây trồng, đặc biệt đối với các cây thân gỗ như cây ăn quả và cây
lâm nghiệp. Nuôi cấy mô tế bào có nhiều ưu việt hơn hẳn các phương pháp nhân
giống khác: cho hệ số nhân giống cao, từ một cây mẹ ưu việt ban đầu có thể tạo ra
hàng triệu cây đà được làm trẻ hoá và sạch bệnh Cây ưu việt đượctrẻ hoá qua
nuôi cấy mô là ngn vËt liƯu lý t­ëng ®Ĩ cung cÊp hom gièng cho nhân giống
bằng giâm hom. Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề
tài:
Nghiên cứu nhân giống Thông caribê (Pinus caribaea Morelet)
bằng phương pháp nuôi cấy in vitro
Đối tượng nghiên cứu là loài Thông caribê (Pinus caribaea var hondrensis),
loài thông này là một trong 3 biến chủng của Thông caribê có nhiều triển vọng ë
ViÖt Nam.


-4-

Chương 1
Tổng quan tàI liệu
1.1. Một số kết quả ứng dơng kü tht nu«i cÊy in vitro thùc vËt trong sản

xuất nông lâm nghiệp
Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào hay vi nhân giống là tên gọi chung cho
các phương pháp nuôi cấy in vitro cho các bộ phận nhỏ được tách khỏi cây
(George, 1993) đang được dùng phổ biến để nhân giống thực vật, trong đó có cây
lâm nghiệp. Các bộ phận được dùng để nuôi cấy có thể là chồi đỉnh, chồi bên, chồi
bất định, bao phấn, phấn hoa, phôi và các bộ phận khác như vỏ cây, lá non, thân
mầm [18], [19].
Nhờ ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô vào nhân giống, người ta đà tạo ra hàng
loạt cây con đồng nhất về kiểu gen với số lượng lớn mà các phương pháp nhân
giống vô tính thông thường khác không thể có được. Nuôi cấy mô có ưu thế hơn
các phương pháp nhân giống vô tính khác là có tỷ lệ nhân giống cao, tới hàng triệu
cây mỗi năm. Ngoài ra có thể áp dụng nhiều biện pháp xử lý lên nuôi cấy in vitro
hơn là các phương pháp khác. Cây giống tạo ra bằng phương pháp nuôi cấy in vitro
vừa khoẻ, trẻ sinh lý và có thể sạch virus ngay cả khi mẫu lấy từ đỉnh sinh trưởng
của những cây đà nhiễm virus.
Năm 1960, Morell đà nhận thấy mô phân sinh của địa lan và phong lan có rất
ít hoặc không có virus, từ đó ông phát hiện ra khả năng nhân nhanh cây sạch bệnh
của các giống này. Chỉ sau một năm, ông thu được 4 triệu cây đồng nhất về mặt di
truyền từ một chồi lan ban đầu [22]. Sau đó Morell và cộng sự đà phục tráng giống
khoai tây bằng cách dùng kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh và đà tạo ra được những
cây khoai tây không chứa virus (1968) [22].
Theo Murashige (1974) có khoảng 300 loài cây có thể nhân giống bằng
phương pháp nuôi cấy in vitro) [33]. Kỹ thuật nuôi cấy mô đà được hơn 600 công
ty trên thế giới áp dụng để nhân hàng triệu cây giống hàng năm, trong đó chủ yếu


-5-

là nhân giống cây hoa, cây cảnh, cây ăn quả, cây công nghiệp và một số cây rau
(Vasin, 1994) [21]. Nhu cầu cây giống in vitro ngày càng nhiều, mấy năm gần đây

hàng năm trên thế giới sản xuất khoảng 50 triệu cây các loại, ước tính phải đạt 250
triệu cây/năm mới đáp ứng được yêu cầu thực tiễn [19].
Dự kiến thị trường cây giống được nhân bằng kỹ thuật nuôi cấy mô vào
khoảng 15 tỷ USD/năm và tốc độ tăng trưởng hàng năm của thị trường là khoảng
15% (Govil và Gupta, 1997) [21]. Thái Lan mỗi năm xuất khẩu hoa thu khoảng 20
triệu USD, trong đó phần lớn là hoa được nhân giống bằng nuôi cấy in vitro.
Việc chọn vật liệu ban đầu cho vi nhân giống là rất quan trọng, không những
quyết định sự thành công ban đầu mà cả quá trình nhân tiếp theo. Các công trình
của D’Amato (1977) cho thÊy chØ cã ®Ønh sinh tr­ëng cđa chồi mới đảm bảo về sự
ổn định di truyền. Tiếp đến là đỉnh mô phân sinh với kích thước nhỏ, kết hợp với xử
lý nhiệt để làm sạch bệnh là vật liệu tốt để nhân. Các chồi nhân ban đầu thường
được lấy từ đỉnh chồi hoặc đỉnh mô phân sinh trên môi trường thạch chứa các muối
khoáng, đường, vitamin và các chất điều hoà sinh trưởng. Vi nhân giống được bắt
đầu bầu bằng tách đỉnh chồi hoặc mô phân sinh từ các cây định nhân, sau đó khử
trùng và đưa vào nuôi cấy ở môi trường phù hợp. Các chồi được hình thành và được
tách ra cấy chuyển sang môi trường mới, quy trình cứ thế được lặp lại. Đây là
phương pháp cho hệ số nhân thấp hơn phương pháp nhân qua giai đoạn mô sẹo
hoặc phôi, nhưng các chồi được hình thành giữ được đặc điểm của cây mẹ, ít hoặc
không bị thay đổi về mặt di truyền. Trong một số trường hợp, vi nhân giống có thể
thực hiện thông qua việc tạo phôi hoặc tái sinh cây trực tiếp từ mô sẹo. Phương
pháp này cho hệ số nhân cao hơn nhưng thường kéo theo sự biến dị soma [19].
Ưu điểm của nuôi cấy in vitro là: cho hệ số nhân cao sẽ rút ngắn thời gian
đưa giống vào sản xuất; nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ;
thuận tiện và làm hạ giá thành vận chuyển, việc bảo quản cây giống thuận lợi. Cây
nuôi cấy mô thường được trẻ hoá cao độ và có rễ giống như cây mọc từ hạt, thậm
chí không có sự khác biệt đáng kể so với cây mọc từ hạt. Trong lúc cây hom lại


-6-

thường không có rễ cọc, rễ cây không thể đâm sâu xuống đất như cây mọc từ hạt và
thường có hiện tượng bảo lưu cục bộ. Ví dụ, cây mô Keo lai ở giai đoạn 1-2 tháng
tuổi (cũng như các loài cây bố mẹ là Keo tai tượng và Keo lá tràm) có đủ các loại lá
kép một lần, kép hai lần và lá giả, lại có rễ theo kiểu rễ cọc như những cây mọc từ
hạt điển hình, thì cây hom cũng của giống này lại chỉ có lá giả của cây trưởng
thành và không có rễ cọc (nghĩa là tính trẻ hoá bị hạn chế , còn tính bảo lưu cục bộ
thì biểu hiện rõ rệt). Vì thế nuôi cấy mô còn là một biện pháp trẻ hoá giống trong
sản xuất lâm nghiệp [13].
Khác với cây nông nghiệp ngắn ngày, cây rừng có đời sống dài ngày và phải
mất nhiều năm mới ra hoa kết quả. Sau khi chọn được cây trội, muốn có giống tốt
để đưa vào sản xuất, phải xây dựng vườn giống và rừng giống và phải đợi thêm một
số năm mới có thể thu được một lượng hạt đủ lớn phục vụ trồng rừng, tuy nhiên cây
giống từ những hạt này sẽ bị phân hoá dẫn đến năng suất rừng biến động. Nhân
giống bằng phương pháp nuôi cấy in vitro là một trong những biện pháp hữu hiệu
để duy trì những đặc tính tốt nhất của cây mẹ cho các thế hệ cây sinh dưỡng tiếp
theo. Do vậy nuôi cấy in vitro đà được áp dụng rộng rÃi cho một số loài cây rừng
như bạch đàn [14].
Hiện nay nuôi cấy in vitro đà và đang được ứng dụng rộng rÃi trong sản xuất
thương mại ở nhiều nước trên thế giới, hàng trăm loài cây lá rộng và hàng chục loài
cây lá kim đà được nuôi cấy mô thành công. Cho tới năm 1991, Thái Lan đà nhân
giống thành công bằng nuôi cấy mô cho 55 loµi trong tỉng sè 67 loµi tre tróc thư
nghiƯm. Công nghệ này cho phép nhân nhanh loài Dendrocalamus asper với công
suất 1 triệu cây mỗi năm. Với loài Dendrocalamus asper, trong năm 1980 họ chỉ
có trong tay vài trăm hạt giống và đà nhanh chóng có trên 100 000 cây con được
đưa ra huấn luyện tại vườn ươm, đến năm 1992 mục tiêu của họ là sản xuất vài
triệu cây con phục vụ trồng rừng [14].
Số các loài bạch đàn đà được nhân giống bằng phương pháp in vitro ngày
một tăng, tới năm 1987 đà có trên 20 loài bạch đàn khác nhau tạo được cây con in

-7-

vitro (Gupta và Mascarenhas, 1987). Các nhà khoa học ấn Độ đà tạo thành công
cây mô từ các cây trôi bạch đàn Eucalyptus camandulensis, Eucalyptus globulus,
Eucalyptus tereticornis, Eucalyptus torelliana và cả từ các cây trội có hàm lượng
tinh dầu cao của bạch đàn chanh Eucalyptus citriodora. Cây mô có nguồn gốc từ
cây ưu việt sinh trưởng nhanh gấp 3 lần và đồng đều hơn là cây mọc từ hạt của
cùng cây mẹ. Tại úc, nhân giống bằng nuôi cấy in vitro đà được áp dụng để nhân
nhanh các cây được chọn cho tính chịu mặn trong đất và đang được đưa vào sản
xuất lớn cho loài E. camaldulensis. Vào năm 1987, khoảng 20 000 cây mô của các
dòng vô tính chịu mặn đà được tạo ra để trồng lại rừng ở các mỏ bauxite gần Perth,
Tây úc [14].
Trung Quốc đà tạo cây in vitro thành công cho 100 loài cây thân gỗ như
dương, bạch đàn, bao đồng, tếch Là nước ứng dụng sớm và thành công nuôi cấy
mô vào trồng rừng diện rộng, cây được nhân giống thành công chính là E.
urophylla. Đến năm 1991 ở vùng Nam Trung Quốc, người ta đà tạo ra trên 1 triệu
cây mô của các cây và dòng lai được chọn lọc. Những cây mô này được dùng như
là các cây đầu dòng để tạo cây hom tại các vườn ươm địa phương và dùng thẳng
vào trồng rừng [15].
Nhiều loài cây lá rộng châu Âu đà được thử nghiệm nhân giống thành công
bằng các biện pháp nuôi cấy mô, đó là các loài nh­: Acer, Beluta, Carpinus, Fagus,
Quercus, Ulmus, Fraxinus, Prunus, Juglans, Castanea, Tilia, Sorbus Các cây
mô đà được trồng ra thực địa để so sánh và đà cho thấy chúng có phenotip gièng
nhau, tû lÖ sèng ë rõng trång sau khi cây được huấn luyện là khá cao, đạt 90 -100%
cho các loài Beluta, Quercus, Sorbus và Salix [15].
Hiện nay nuôi cấy in vitro cũng là một biện pháp nhân giống được áp dụng
nhiều ở các loài cây lá kim nhằm phục vụ cho các chương trình trồng rừng dòng vô
tính. Đối với các loài thông P. nigra, P. pinaster, P. sylvestris giâm hom từ cây già
là rất khó cho nên người ta đang áp dụng các biện pháp nuôi cấy mô như nuôi cấy
phôi, nuôi cấy tạo mô sẹo và các biện pháp này có nhiều triển vọng, nhất là đối

-8-

với thông P. pinaster. Nhân chồi in vitro từ cây non loài Vân sam (Picea
sitchensis) cho hệ số nhân biến động rất lớn tuỳ theo cây mẹ, cụ thể là 17 5000
chồi mỗi năm. Có tới 30 loài trong số các loài cây lá kim được nghiên cứu nuôi cấy
mô và đà đạt được những thành công bước đầu, trong đó phải kể đến các loài như
Abies balsamea (tạo được chồi ở cây 15 20 tuổi), các loài B¸ch t¸n Araucaria,
LiƠu sam Cryptomeria japonica, Larix sp., Picea glauca, ThiÕt sam Pseudotsuga
menziesii, Cï tïng Sequoia sempervirens, Sequoiadendron gigenteum, Thuja sp.,
Tsuga heterophylla [15].
Nuôi cấy mô có thể là biện pháp tốt để trẻ hoá và tăng hệ số nhân, nhất là
biện pháp tạo phôi vô tính. Người ta đà nghiên cứu tạo nuôi cấy phôi vô tính cho
cây Thiết sam (Pseudotsuga menziesii), mặc dù chưa tạo ra được cây hoàn chỉnh từ
các phôi vô tính của cây này nhưng chồi bất định đà được tạo ra từ đỉnh thân cây
mẹ 64 tuổi. Bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, các loài Bách tán cho hệ số nhân
thấp, chỉ tạo được 20 – 60 chåi míi tõ mét c©y con trong vòng 4 tháng đối với loài
A. cunninghamii và mới chỉ có các chồi của loài cây này ra rễ in vitro [15]
Trong số 30 loài cây lá kim đà được nuôi cấy mô, có bốn loài được đưa vào
sản xuất diện rộng, đó là Cù tùng Sequoia sempevirens ở AFOCEL (Pháp); thông
P. radiate ở Viện nghiên cứu lâm nghiệp New Dilân; P. taeda và Pseudotsuga
menziesii ở Mỹ .
Các biện pháp nuôi cấy mô cũng đà được áp dụng cho cây Tếch, Gupta và
các cộng sự (1979) đà mô tả sự hình thành cụm chồi từ phần cắt của cây non và từ
mầm cây 100 tuổi. Từ đó họ có thể tạo được 500 cây in vitro từ một chồi ở cây
trưởng thành và 3000 cây từ một cây non trong một năm. Kaosa-ard (1990) cho
biết Thái Lan cũng đà phát triển thành công kỹ thuật nuôi cấy mô (nuôi cấy đỉnh
thân và phôi) vào năm 1986 cho cây Tếch và cho phÐp t¹o 500 000 chåi tõ mét chåi
trong mét năm. Perhutani (1991) cũng cho biết Indonexia đà thử nghiệm nuôi cấy

mô thành công và một vài cây mô đà ®­ỵc ®em trång thư [15].


-9-

Người ta cũng đà nhân giống thành công Phi lao bằng các biện pháp nuôi
cấy mô và đà trồng so sánh với cây hạt trong nhà kính. Kỹ thuật này đang được
dùng để tạo cây mô Phi lao sinh trưởng nhanh, kháng bệnh và cố định đạm cao cho
trồng rừng [15].
1.2. Thông caribê, vị trí trong sản xuất lâm nghiệp và triển vọng trồng rừng ở
Việt Nam
Thông caribê (Pinus caribaea Morelet) được gây trồng ở nước ta từ những
năm 1963, những thông báo đầu tiên cho thấy Thông caribê là loài sinh truỏng
nhanh thân thẳng đẹp, cành nhánh nhỏ hơn Thông ba lá và Thông đuôi ngựa nên
được nhiều địa phương ưa thích gây trồng. Tuy nhiên chưa được đánh giá đầy đủ, vì
vậy có nhiều ý kiến khác nhau trong việc sử dụng loài thông này [9], [12].
Thông caribê gåm 3 biÕn chđng lµ: Pinus caribaea var caribaea, Pinus
caribaea var hondurensis và Pinus caribaea var bahamensis đều có phân bố tự
nhiên ở vùng Trung Mỹ. Trong đó biến chủng caribaea có phân bố từ 16o 20o độ
vĩ Bắc, phân bố tự nhiên ở Cuba và đảo Juventus thuộc vùng biển Caribê, chủ yếu
tập trung ở những vùng thấp, ®åi b¸t óp, th­êng ë ®é cao 330 m so với mặt nước
biển. Ngoài ra biến chủng caribaea còn xuất hiƯn ë ®é cao xÊp xØ 760 m, Ýt cã
tr­êng hợp phân bố ở độ cao trên 1200 m (Poyton, 1997) [4].
Biến chủng bahamensis phân bố tự nhiên từ 22o 27o độ vĩ Bắc, thuộc vùng
đảo Bahamas và Caicos, ngoài ra còn tìm thấy ở bán đảo Yucutan thuộc vùng Đông
Bắc Mỹ. Biến chủng hondurensis phân bố tự nhiên từ 12o 16o độ vĩ Bắc, tập trung
chủ yếu ở đảo Belize, Guatelama, Poptun, Guanaja, Nicazagua. Sinh trưởng chủ yếu
trên các khu vực đồng cỏ, đồng bằng ven biển có độ cao so với mặt nước biển là
460 760 m, nh­ng ph©n bè tËp trung nhiỊu nhÊt ë độ cao 460 m (Perry JP Jr,
1991) [4].

Gỗ Thông caribê có thớ thẳng mịn, độ bóng vừa phải, thường được sử dụng
làm ván ép, thân Thông caribê thẳng, dễ cưa xẻ nhưng phụ thuộc nhiều vào độ tuổi


- 10 -

(Bredenkamp vµ Van Vuuren, 1987) [25]. Ngoµi ra Thông caribê còn có nhiều
công dụng khác như: gỗ xây dựng, gỗ trụ mỏ, ván dăm, ván ép, bột giấy, gỗ đóng
tàu thuyền, ván ốp tường, gỗ đóng congtenơ, ván ốp trần, gỗ đóng đồ hộp, gỗ cột
điện, gỗ cột nhà, gỗ nội thất, than củi
Với tốc độ sinh trưởng nhanh và khả năng thích ứng rộng với các vùng sinh
thái khác nhau trên thế giới, đáp ứng được nhiều mục tiêu kinh tế nên Thông caribê
đà được dẫn nhập gây trồng ở 65 nước trên thế giới, chủ yếu là các nước thuộc
vùng Nhiệt đới và á nhiệt đới. Giới hạn vĩ độ trồng mở rộng nhiều so với nơi
nguyên sản, từ vĩ độ 55o Nam ở Argentina tới 33o vĩ độ Bắc ở ấn Độ Dương, giới
hạn kinh độ cũng được mở rộng từ 180o kinh đông ở Fiji tới 158o kinh độ tây ở
Hawaii. Độ cao vùng trồng biến động từ mặt nước biển tới 1200 m ë Zaire, 1220 m
ë Nigeria, trªn 1820 m ë Uganda vµ 2400 m ë Kenya (Anoruo vµ Berlyn, 1993) [5]
Nh­ vậy, Thông caribê đà được gây trồng ở tất cả các dạng khí hậu của các
nước nhiệt đới và cận nhiệt đới. Vùng phân bố rừng trồng của loài được mở rộng cả
về vĩ độ và kinh độ, cả vùng cã khÝ hËu miỊn nói tíi khÝ hËu cËn nhiƯt đới và vùng
ven biển (Anoruo và Berlyn, 1993) [5]. Nhìn chung thông Caribê có thể sinh trưởng
tốt trên nhiều loại đất khác nhau khi được trồng ngoài phạm vi phân bố tự nhiên
của chúng.
Việt Nam là một nước nằm trong khu vực nhiệt đới của Châu á, có các điều
kiện địa lý khá tương đồng với sự phân bố tự nhiên của Thông caribê, nên đà được
đưa vào trồng ở nước ta từ nhiều năm nay. Ngày nay Thông caribê đà được xác
định là một trong các loài cây trồng rừng trong chương trình 5 triệu hecta rừng. Các
kết quả khảo nghiệm bước đầu ở Việt Nam cho thấy thông là loài cây có nhiều
triển vọng, đặc biệt là biến chủng Pinus caribaea var hondurensis.

Kết quả khảo nghiệm Thông caribê tại Đà Lạt năm 1963 bước đầu cho thấy
biến chủng hondurensis của Thông caribê có sinh trưởng nhanh, hình dáng thân
đẹp, cao, thon đều, tán lá nhỏ, cành mọc ngang, có tốc độ sinh trưởng nhanh hơn
Thông ba lá. ở tuổi 12, cây cao bình quân 14.3 m và đường kÝnh ngang ngùc b×nh


- 11 -

quân đạt 16.3 cm, tăng trưởng bình quân về chiều cao là 1.19 m/năm và đường kính
là 1.35 cm/năm. ở tuổi 16, cây cao trung bình 19.9 m, đường kính ngang ngực
trung bình là 26.4 cm, tăng trưởng chiều cao bình quân là 1.24 m/năm và đường
kính là 1.65 cm/năm [12].
Khảo nghiệm tại Mang Linh cho thấy biến chủng hondurensis trồng trên đất
feralit vàng đỏ phát triển trên đá mẹ granit có tầng đất sâu, ẩm và lớp mùn khá dày
có sinh trưởng nhanh hơn Thông ba lá Đà Lạt. Sau 16 năm trồng, cây có chiều cao
bình quân là 17 m và đường kính là 26.6 cm, tăng trưởng bình quân hàng năm về
chiều cao là 1.21 1.22 m/năm và đường kính là 1.76 1.80 cm/năm [12].
Giai đoạn 1978 1982, một khảo nghiệm xuất xứ khá đầy đủ theo dự án
SIDA tại Phú Thọ (P. Stahl, 1984) [40]. VËt liƯu nghiªn cøu gåm bèn loài Thông:
Thông nhựa (P. merkusii) với 5 xuất xứ, Thông ba lá (P. kesiya) với 6 xuất xứ,
Thông oocarpa (P. oocarpa) với 1 xuất xứ, Thông caribê (P. caribaea) gồm 3 biÕn
chđng, trong ®ã biÕn chđng caribaea (1 xt xø), biÕn chđng bahamensis (1 xt
xø) vµ biÕn chđng hondurensis (4 xuất xứ). Khảo nghiệm được xây dựng trên 4 địa
điểm là Thái Long, Sơn Nam (Tuyên Quang), Đền Hùng và Yên Kiện (Vĩnh Phú
cũ). Trong 4 loài thông đưa vào khảo nghiệm (ở giai đoạn 6 8 tuổi) thì Thông
caribê là loài có sinh trưởng nhanh nhất, trong các biến chủng Thông caribê được
khảo nghiệm thì biến chủng hondurensis có sinh trưởng nhanh nhất, tiếp đến là
biến chủng bahamensis vµ ci cïng lµ biÕn chđng caribaea [16], [30], [41].
KÕt quả khảo nghiệm ở tuổi 8 cho thấy những xuất xø cã sinh tr­ëng tèt cđa
2 biÕn chđng hondurensis vµ bahamensis lµ xuÊt xø Potun (Guatemala), Guanaja

(Honduras), Cardwell (Queensland, Australia), Almicamba (Nicaragua) và Andros
(Bahamas). Tác giả đà đi đến kết luận: ở khu vực này nếu trồng rừng quy mô lớn
chỉ tập trung vào các xuất xứ tốt của hai biến chủng hondurensis và bahamensis
[41].
Kết quả nghiên cứu và đánh giá các khảo nghiệm loài và xuất xứ Thông
caribê sau 9 năm trồng khảo nghiệm ở Đại Lải (Vĩnh Phúc), Đông Hà (Quảng Trị),


- 12 -

Sông Mây (Đồng Nai), cho thấy Thông caribê là loài cây có triển vọng về sinh
trưởng nhanh, trong đó biến chủng P. caribaea var hondurensis được đánh giá là
biến chủng có sinh trưởng nhanh hơn hai biến chủng còn lại, trong biến chủng
hondurensis có xuất xứ Poptun, Alamicamba, Guanaja và Cardwell là những xuất
xứ có triển vọng nhất và phù hợp với một số vùng trồng ở nước ta [3].
Đánh giá những kết quả khảo nghiệm được xây dựng gần đây Lê Đình Khả
cũng cho thấy P. caribaea var hondurensis là một trong những biến chủng triển
vọng hơn hai biến chủng còn lại [9], [10], [29]. Đánh giá mới nhất của Phan Thanh
Hương (2000) khi nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng của một số xuất xứ Thông
caribê được khảo nghiệm trên một số trên một số vùng sinh th¸i ë ViƯt Nam cho
thÊy trong ba biÕn chđng Thông caribê được đưa vào khảo nghiệm, biến chủng
hondurensis có sinh trưởng tốt nhất tại 5 địa điểm: Đại Lải (Vĩnh Phúc), Đông Hà
(Quảng Trị), Pleiku (Gia Lai), Lang Hanh (Lâm Đồng) và Sông Mây (Đồng Nai);
biến chủng Bahamensis sinh trưởng tốt nhất ở Xuân Khanh, Cẩm Quỳ (Hà Tây);
biến chủng caribeaea sinh trưởng kém nhất trên tất cả các lập địa [4].
1.3. Những nghiên cứu về nhân giống thông bằng phương pháp nuôi cấy in
vitro trên thế giới
1.3.1. Các nghiên cứu về vật liệu nuôi cấy in vitro và khả năng hình thành chồi
từ mẫu nuôi cấy
Những nghiên cứu nuôi cấy mô cho loài thông đà được tiến hành bằng việc

sử dụng mấu nuôi cấy ban đầu từ cây con, vì loaị vật liệu này thuận lợi cho việc
khử trïng mÉu cÊy. Theo B. Macdonald khi lÊy mÉu cÊy đối với cây thân gỗ nên
lấy vào sáng sớm và kích thước mẫu cấy nên dài từ 2 3 cm [17]. Murashige nhận
thấy đối với các cây thân gỗ, mẫu cấy lấy từ cây non tái sinh tốt hơn mẫu lấy từ cây
mẹ trưởng thành [34].
Sự hình thành các chồi bất định từ phôi trưởng thành đà được tiến hành cho
loài Thông P. radiate, P. loblolly vì khả năng cho hệ số nhân cao, các thử nghiệm


- 13 -

trồng rừng từ những cây mô (plantlet) đà được thiết lập (Smith, 1985; Amerson và
cộng sự, 1985) [38].
Dùng các mẫu cấy khác nhau thì sự hình thành chồi sẽ khó dễ khác nhau.
Phần lớn các công trình trong nhân giống cây lá kim đà xuất bản đều mô tả vật liệu
nuôi cấy ban đầu là những cơ quan của cây non vô trùng với phương thức tái sinh
tạo chồi và cây con. Chồi có thể được kích thích và hình thành trực tiếp trên phôi
hữu tính của cây lá kim và trên những cơ quan của cây non đặc biệt là lá mầm và
chồi đỉnh, trong đó lá mầm của cây non từ là vật liệu được sử dụng rộng rÃi nhất
[26]. Những loại mẫu cấy này thuận tiện cho việc khử trùng mẫu (lấy từ hạt) và
cũng thuận lợi cho phôi vô tính và lá mầm phân hoá tạo chồi bất định.
Trong hầu hết các nghiên cứu, lá mầm cây non được tách ra để nuôi cấy cho
số chồi bất định nhiều hơn phôi nguyên vẹn, trụ dưới lá mầm hoặc các mô khác của
cây non và trở thành mẫu cấy được sử dụng rộng rÃi. Khả năng tái sinh chồi của lá
mầm phụ thuộc độc lập với tuổi của chúng, lá mầm từ cây mầm P. radiate 1 ngày
tuổi ở trạng thái sinh lý tốt nhất cho sự tạo chồi (Aitken Christie và các cộng sù,
1982), trong khi chåi in vitro cđa c©y Linh sam ( Douglas) được tái sinh từ lá mầm
có tuổi tối ưu từ 2 4 tuần (Wochok và Abo El-Nil, 1977) [26]. Một nghiên cứu
khác được thực hiện bởi Cheng (1977) không tìm thấy sự ảnh hưởng của tuổi (2
tuần hoặc 2 tháng tuổi) đến số chồi được tạo ra từ lá mầm cây Linh sam (Douglas)

non. Số chồi được hình thành từ phôi hoặc mẫu cấy từ cây non có thể bị ảnh hưởng
lớn bởi các thủ tục xử lý trước khi tạo chồi. Sự tái sinh chồi in vitro sẽ thuận lợi nếu
hạt thông được xử lý lạnh (Smeltzer và cộng sự, 1977; Relly và Washer, 1977) [26]
hoặc được xử lý bằng H2O2 để phá vỡ trạng thái ngủ trước khi phôi được tách ra và
nuôi cấy (Mehra-Palta vµ céng sù, 1977) [31]; (Mott vµ Amerson, 1981) [32]. So
sánh các kết quả từ hạt được xử lý và không xử lý, một tỷ lệ lớn lá mầm của P.
taeda và P. monticola đà hình thành chồi và có một số lớn chồi trên một cây so với
hạt không ®­ỵc xư lý [26].


- 14 -

Tuy nhiên những mẫu cấy trên chỉ nên giới hạn trong việc nghiên cứu quá
trình phát sinh hình thái vì khó đảm bảo rằng các đặc tính di truyền của chúng có
được bảo vệ hay không và có phù hợp mục tiêu không, nên không thể dùng cho sản
xuất. Nếu mục đích là nghiên cứu, mẫu cấy đều có thể lấy từ phôi của hạt non, hạt
già. Nuôi cấy mô, cơ quan của cây trưởng thành sẽ khó khăn hơn vì khó tạo được
mẫu cấy, có thể không cho ra được chồi bất định hay chồi nách, đôi khi khó ra rễ
và thường tạo ra những cây có tính hướng nghiêng.
1.3.2. Các nghiên cứu về môi trường nuôi cấy trong nhân giống thông in vitro
Trên thế giới nhân giống các loài cây lá kim bằng phương pháp nuôi cấy mô
đà được thực hiện và công bố bởi nhiều tác giả (Aitken Christie và Thorpe, 1984;
Berlyn và các céng sù, 1986) [38].
Trong nu«i cÊy in vitro, chåi cã thể được tái sinh trực tiếp từ callus trên mẫu
cấy còn non của cây lá kim nhưng như vậy thường hay có những rủi ro về biến
động kiểu gen, đặc biệt là nuôi cấy những callus không có tổ chức (Aitken
Christie và các cộng sự, 1988) [38].
Nếu như sự hình thành chồi từ callus bị loại trừ, kỹ thuật nhân giống in vitro
thích hợp cho cây lá kim là: tạo chồi trực tiếp; tạo chồi từ chồi nách; nuôi cấy phôi
vô tính. Mẫu cấy sử dụng cho những kỹ thuật này là phôi hạt non, cây mầm, chồi

nách ... Mẫu cấy từ những cây trưởng thành khó được hình thành, có thể không cho
ra được chồi bất định hay chồi nách, đôi khi khó tạo rễ và kết quả thường tạo ra
những cây hướng nghiêng (Aitken Christie và cộng sự, 1988) [38].
Môi trường nuôi cấy đà được dùng cho nuôi cấy tạo chồi in vitro cây lá kim
có thĨ kĨ tíi lµ:

SH (1972); WPM (1981); GD (1972); MCM (1983); SH

(1972)các môi trường SH; GD; WPM; LPm cải tiến và thấy phần lớn các môi
trường tạo chồi tốt hơn so với môi trường MS (1962), chồi xuất hiện với tần số lớn
hơn nhiều [26]. Các môi trường nuôi cấy nói trên đều chứa đủ các nguyên tố đa
lượng và vi lượng nhưng sai khác về hàm lượng khá lín.


- 15 -

Thorpe và Harry (1991) đà nghiên cứu nuôi cÊy th«ng Pinus canariensis víi
ngn vËt liƯu sư dơng chđ yếu từ lá mầm của cây con mới nảy mầm vô trùng, tác
giả sử dụng hai loại môi trường nuôi cấy chính là môi trường SH (1972); môi
trường MCM (1983) có bổ sung 5-10 M BAP. Nghiên cứu đà xác định được môi
trường MCM với nồng độ BAP tối ưu trong giai đoạn tái sinh chồi là 10 M, xác
định được tổ hợp phytohormon là BAP/2 iP (tỷ lệ 1:1) là 5/5 M cho kết quả tái
sinh chồi tốt hơn môi trường chỉ có BAP; xác định được giá thể ra rễ là hỗn hợp vô
trùng than bùn/vermiculate (tỷ lệ 1:1) chøa 1/4 kho¸ng MCM, xư lý chåi ra rƠ bằng
IBA 1 M trong 4 giờ. Kết quả đà đưa cây in vitro vào giá thể trong bầu PVC ở
điều kiện nhà kính [42].
Shakya, Joshee và Agrawal (1989) đà thành công trong nghiên cứu nhân
giống thông P. wallichiana bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi có định hướng. Vật liệu
nuôi cấy là phôi được tách ra từ hạt thông P. wallichiana (còn gọi thông xanh hay
thông Bhutan). Phôi tách ra được nuôi cấy trên môi trường Aiken - Christie (LP1984) bổ sung BAP ở các nồng độ từ 0 - 88 M trong 10; 14; 21 ngày. Kết quả đạt

ít nhất 40 chồi/phôi trong 1 chu kỳ cấy chuyển 4 tháng [40].
Năm 1995, Okamura M. và Kondo T. công bố Hướng dẫn nuôi cấy mô cây
thông giới thiệu tạo cây con thông Pinus thunbergi trong ống nghiệm từ nuôi cấy
phôi và lá mầm. Trong hướng dẫn này dùng môi trường GD (1972) và môi trường
AE để nuôi cấy giai đoạn nhân chồi. Giai đoạn nuôi cấy ban đầu bổ sung 5 - 10
M BAP và 3 % đường. Giai đoạn ra rƠ dïng m«i tr­êng Risser and White cã bỉ
sung 10 M IBA và đà tạo thành công cây con trong ống nghiệm nhưng không thấy
công bố số lượng và các kết quả thí nghiệm [37].
Nuôi cấy mô cây lá kim có nhiều khó khăn, đặc biệt là đối với các loại cây
như thông. Các thông tin về mẫu nuôi cấy, môi trường dinh dưỡng khoáng và sử
dụng chất điều hoà sinh trưởng cho các loài cây lá kim nói chung và loài thông nói
riêng được kê trong biểu 1.1 [26]:
Biểu 1.1: Thông tin về nuôi cấy in vitro các loài cây lá kim


- 16 -

Môi
nuôi Môi
trường trường
kích
thích hình
nhân chồi
thành
chồi

Môi
trường
kéo
dài Nguồn tham khảo

chồi

Loài cây

Mẫu
cấy

Piece abies

Phôi hạt già

Piece glauca

Trụ dưới lá LPm-1981 + 2.2 LPm-1981
mầm
mg/lBAP

Ellis và các cộng sự
(1991)

Piece glauca

Trụ dưới lá CD-1975 +2.25 CD-1975
mầm
mg/lBAP

Campbell
(1975)

và

Durzan

Piece
ormorika

Chồi và lá LPm-1981 + 1.0 LPm-1981
mầm
cây mg/lBAP
con

Budimir
(1992)

và

Vujieie

Pinus briata

Phôi hạt và SH mod.- 1981 SH mod.- 1981
lá mầm
+ 3.0 mg/lBAP

Abdullah và các cộng sự
(1981)

Pinus
canariensis

Phôi
mới
mầm

Martinez Pulido và các
cộng sự (1991-1992)

Pinus caribeae Phôi hạt

1/2SH-1972 + 1/2SH-1972
1.1 mg/lBAP

hạt MCM-1983 + 1/2David
nảy 2.2 mg/lBAP
1982a

Cheng-

Von Arnold và Eriksson
(1987)
Von
Arnold
(1987)

1/2David
+
0.05%AC

Cheng-1977;1978

1977;1978 + 2
mg/lBAP

Halos và Go (1993); Go
và các cộng sự (1993)

Pinus contorta

lá mầm và 1/2LPm-1981 + 1/2LPmtrụ dưới lá 2.25 mg/lBAP
1981
mầm
cây
non

1/4LPm1981;
1/8LPm1981

Patel và Thorpe (1984)

Pinus elliotii

lá mầm từ GD-1975 + 10 GD-1975
phôi
mg/lBAP + 0.01
mg/lNAA

1/2GD1975

Lesney và các cộng sự
(1988)

Pinus

lá mầm từ GD mod.-1981 SH-1972

SH- 1972

Lopez Petalta và các cộng

virginiana

hạt đà nảy + 10 mg/lBAP
mầm

+
4
mg/lBAP

sự (1991)


- 17 -

Sơ đồ nuôi cấy in vitro cây lá kim từ các mẫu cấy có thể tóm tắt [26]:

S phỏt sinh
phụi

Tạo chồi
trực tiếp

Phụi

Cây mầm

Callus phụi
hoỏ

Phụi vụ
tớnh

Lá mầm

Chồi bất
định

Trụ dưới lá
mầm

Tạo chồi
trực tiếp

- Chồi nách
- Bó lá kim

Chồi sinh
trưởng và
vươn dài

Cõy con

in vitro

Cõy con
in vitro

Chồi nách

Trên cơ sở có môi trường dinh dưỡng khoáng với thành phần và hàm lượng
tương đối thích hợp thì điều quan trọng nhất còn lại là vấn đề sử dụng chất điều hoà
sinh trưởng (còn gäi lµ phytohormone hay hormon). BiĨu 1.1 cho thÊy trong nuôi
cấy in vitro cây thông, để kích thích hình thành chồi thường đòi hỏi hàm lượng chất
điều hoà sinh trưởng tương đối thấp. Phần lớn các môi trường hình thành và vươn
chồi không cần sử dụng phytohormon. Tuy nhiên nhiều tác giả cho rằng cho thêm
một số chất điều hoà sinh trưởng với liều lượng thích hợp là cần thiết. Có nghiên
cứu đà dùng BAP đến nồng độ 2 10 mg/l. Qua quá trình nghiên cứu thành công
với hơn 30 loài cây lá kim của các tác giả trên thÕ giíi, nhËn thÊy r»ng BAP 2 mg/l
– 2.25 mg/l là rất thích hợp cho sự phân hoá tạo chồi, kích thích phân hoá tạo chồi
từ phôi vô tính bằng BAP sẽ tương đối có hiệu quả.
Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy in vitro với thông, mặc dù các loài
có đòi hỏi gần giống nhau đối với môi trường nuôi cấy nhưng do mỗi đặc điểm


- 18 -

riêng của mỗi loài mà vẫn có thể yêu cầu những xử lý, điều chỉnh cá biệt khác
nhau.
Tác dụng dẫn dắt phân hoá tạo chồi của các cytokinin khác nhau không
giống nhau hoặc cũng có thể giống nhau, trong biểu có thể thấy tác dụng của BAP
rõ hơn Kinetin. Trong sự phối hợp giữa cytokinin và auxin, thường thấy sử dụng
BAP phối hợp với NAA hơn là với IAA và IBA.

Trong việc dẫn dắt hình thành rễ, các nghiên cứu có nhận xét khá thống nhất
với nhau và phần lớn đều chọn dùng IBA, tuy nhiên về chọn chất auxin nào và về
liều lượng thì còn cần phải thử nghiệm cho phù hợp với mỗi loài.
Trong các môi trường nuôi cấy bổ sung thêm cytokinin (thường sử dụng
BAP), đôi khi kết hợp với một auxin ở một nồng độ nhất định. Chồi thông sau đó
được ra rễ trên môi trường chứa IBA [26].
Môi trường nuôi cấy các loài thông thường được bổ sung thêm vitamin và
các acid aminCác chất này đều có ảnh hưởng tốt đối với sự phân hoá tạo chồi và
hình thành phôi vô tính. Những chất này có thể có tác dụng nâng cao tỷ lệ hình
thành chồi, đẩy nhanh tốc độ phát triển của chồi.
Trong nuôi cấy in vitro thực vật nói chung và thông nói riêng môi trường
nuôi cấy có hàm lượng đường khác nhau sẽ có hiệu quả khác nhau. Nồng dộ thấp
ảnh hưởng đến nguồn cung cấp Hidratcarbon sẽ không có lợi cho sinh trưởng của
chồi. Nồng độ quá cao làm ảnh hưởng đến áp suất thẩm thấu và sẽ không có lợi cho
quá trình hấp thụ và vận chuyển các chất. Các nghiên cứu nuôi cấy tạo chồi cây
thông thường chọn dùng nồng độ 2-3 %, phần lớn dùng đường sacaroza.
1.4. Những nghiên cứu về nhân giống cây thân gỗ và cây thông bằng phương
pháp nuôi cấy in vitro ở Việt Nam
Sau khi một số giống Bạch đàn có năng suất cao được nhập, các dòng vô tính
Bạch đàn và Keo lai có năng suất cao ra đời, nuôi cấy mô và giâm hom đà trở thành
một phong trào nhân giống được áp dụng rông rÃi trong sản xuất lâm nghiÖp.


- 19 -

Những cơ sở hiện đang nhân giống bằng nuôi cấy mô ở quy mô lớn trong lâm
nghiệp nước ta là Viện nghiên cứu cây nguyên liêụ giấy Phù Ninh, Trung Tâm
khoa học sản xuất lâm nghiệp Quảng Ninh, Xí nghiệp giống thành phố Hồ Chí
Minh, Trường Đại học Lâm nghiệp.
Trong khi năng suất rừng tự nhiên cửa ta chỉ đạt 2 - 6 m3/ha/năm, năng suất

rừng trồng quảng canh được trồng bằng cây hạt cũng chỉ đạt 5 - 7 m3/ha/năm, thì
năng suất rừng trồng của một số giống Bạch đàn mới chọn tạo hoặc mới nhập được
trồng bằng cây mô và cây hom có thể đạt 15 m3/ha/năm, còn năng suất giống Keo
lai được trồng bằng cây mô và cây hom ở một số nơi cũng có thể đạt 20 -30
m3/ha/năm [13]. Cùng với những kết quả về cải thiện giống Trung tâm nghiên cứu
giống cây rừng đà nghiên cứu thành công kỹ thuật nuôi cấy mô cho Keo lai, Bạch
đàn và một số giống cây rừng khác [13].
Nghiên cứu nuôi cấy mô cho giống lai giữa Bach đàn liễu và Bạch đàn trắng
đà được Nguyễn Ngọc Tân và cộng sự (1977) thực hiện thành công từ năm 1993 và
thấy rằng khi dùng BAP bổ sung vào môi trường cơ bản MS có thể tạo được 20 -30
chồi/cụm. Môi trường MS bổ sung IBA có thể đạt tỷ lệ ra rễ 80% [11]. Nghiên cứu
nuôi cấy mô cho giống Bạch đàn lai U29C3 do Đoàn Thị Mai và cộng sự (2000) tiến
hành và đà thu được cây mô từ tổ hợp lai này để khảo nghiệm. Kết quả cho thấy
thời kỳ mẫu bị nhiễm ít nhất và có tỷ lệ bật chồi cao nhất là từ tháng Năm đến
tháng Tám. Môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BAP cho số chồi trung bình trong mỗi
cụm cao nhất (16.6 chồi/cụm). Môi trường ra rễ thích hợp là môi tr­êng MS bỉ
sung 1,0 mg/l IBA, cho tû lƯ ra rễ tới 83,8% [11].
Dương Mộng Hùng (1993) nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy mô cho hai
loài bạch đàn Eucalyptus camaldulensis và Eucalyptus urophylla từ cây trội của 2
loài. Kết quả đà tạo được một số cây mô bạch đàn, tuy nhiên tỷ lệ mẫu nhiễm nấm
bệnh khi đưa mẫu vào môi trường vô trùng còn cao, hệ số nhân chåi thÊp (1 – 2
lÇn) [7].


- 20 -

Nuôi cấy mô cho Lát hoa (Chukrasia tabularis) đà được thực hiện cho chồi
lấy từ cây 2 tuổi. Giai đoạn nhân chồi dùng môi trường MS có 1,0 1,5 mg/l BAP
đạt 10 chồi/cụm. Giai đoạn ra rễ dùng môi trường MS bổ sung 0,1 mg/l IBA hoặc
0,1 mg/l IBA phèi hỵp víi 0,1 mg/l NAA cho tû lệ ra rễ đến 87,5% [10].

Nuôi cấy mô, tế bào cây thân gỗ có nhiều khó khăn, đặc biệt là với các loài
cây lá kim như cây thông. ở nước ta, kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào cho cây thân gỗ
mới ở thời kỳ của những bước đi ban đầu và ứng dụng vào sản xuất quy mô lớn chủ
yếu cho loài bạch đàn và đến nay các công trình đà được công bố chưa nhiều. Năm
2003, Trần Trung Hiếu, Nguyễn Xuân Thương và các cộng sự công bố kết quả
bước đầu nhân nhanh giống thông caribê (Pinus caribaea) bằng phương pháp nuôi
cấy in vitro. Kết quả đà tìm ra môi trường nhân chồi, ra rễ và tạo được cây con có
khả năng phát triển ngoài vườn ươm [6]. Các tác giả sử dụng mẫu cấy là đoạn chồi
non đầu cành của cây 3-5 tuổi do Trung tâm sản xuất Lâm nghiệp Đông Nam Bộ
Thống Nhất - Đồng Nai (Viện Khoa học Lâm nghiệp) cung cấp. Môi trường nuôi
cấy cơ bản là môi trường SH (1973), Litvay (1981) và các môi trường khoáng đa
lượng giảm đi một nửa là SH-1/2 và LV-1/2. Để tạo cụm chồi, tăng trưởng chồi và
ra rễ, các tác giả đà dùng chất điều hoà sinh trưởng là BAP, NAA, IBA. Kết quả
sau 6 tuần nuôi cấy, số chồi thu được cao nhất trên môi tr­êng SH7 (cã bæ sung 3
mg/l BAP; 0.5 mg/l IBA) là 6,17 1,13 chồi/mẫu; trên môi trường SH16 (có 0,1
mg/l BAP; 0,1 mg/l IBA) cho chiÒu cao chåi cao nhất là 3,41 0,51 cm; sau 9 tuần
nuôi cấy trên môi trường tạo rễ SH -1/2, chồi tạo 3 rễ/chồi và rễ dài nhất là 3 cm,
sau 12 tuần nuôi cấy cây con có thể phát triển ngoài vườn ươm. Công bố trên không
cho biết tỷ lệ tạo rễ của chồi in vitro và tỷ lệ cây sống sau khi đưa ra điều kiện
ngoài.
Cuối năm 2002 những nghiên cứu bước đầu về nuôi cấy mô cây Thông
caribê và Thông lai đà được tiến hành tại Trung tâm nghiên cứu cây nguyên liệu
giấy. Kết quả đà xác định được phương pháp khử trùng mẫu cho tỷ lệ mẫu sống và
sạch lµ 10,1% (khư trïng b»ng H2O2 5% trong 20 phót), đà thử nghiệm và xác định


- 21 -

được điều kiện nuôi cấy (ánh sáng, nhiệt độ) thích hợp cho nhân chồi thông. ĐÃ
tiến hành thử nghiƯm mét sè m«i tr­êng nu«i cÊy (MS; MCM; GD) và đà thu được

những cụm chồi in vitro. Tuy nhiên các nghiên cứu mang tính chất thăm dò và có
những tồn tại như hệ số nhân rất thấp (1,7 lần)
Tóm lại, nhiều công trình nghiên cứu đà đi sâu vào giải quyết các nội dung
cơ bản về nuôi cấy in vitro và sử dụng cây mô trong sản xuất. Các tác giả đà chỉ ra
một số môi trường nuôi cấy, tạo rễ Những kết quả nghiên cứu này làm cơ sở cho
những nghiên cứu tiếp theo và được ứng dụng cho từng loài. Đó cũng là những dẫn
liệu và định hướng quan trọng cho đề tài này. Kết quả nghiên cứu chủ yếu tập trung
vào nuôi cấy phôi vô tính và tạo chồi trực tiếp từ các cơ quan của cây mầm. Tuy
các công trình nghiên cứu ở các nước trên thế giới đà giải quyết nhiều các vấn đề
liên quan tíi viƯc nu«i cÊy in vitro th«ng, nh­ng Ýt có tác giả nào kể cả trong nước
và nước ngoài đề cập tới vấn đề nhân giống Thông caribê bằng phương pháp tái
sinh tạo chồi trực tiếp từ chồi non một cách tương đối đầy đủ về nghiên cứu thời
gian lấy mẫu trong năm, loại vật liệu nuôi cấy, tuổi vật liệu nhân giống, môi trường
nuôi cấy, chất điều hoà sinh trưởng, giá thể ươm cây in vitro. Đề tài này cố gắng đi
sâu giải quyết một số vấn đề nãi trªn.


- 22 -

Chương 2
mục tiêu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.1. Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu nhân giống, xác định được môi trường nuôi cấy thích hợp để
nhân giống thông và tạo được cây con Thông caribê hoàn chỉnh bằng phương pháp
nuôi cấy in vitro.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời điểm lấy mẫu , nguồn mẫu, tuổi mẫu nuôi
cấy đến khả năng tái sinh chồi in vitro.
2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh chồi in
vitro.

2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên quá trình sinh trưởng,
khả năng nhân nhanh cụm chồi.
2.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng ra rƠ cđa chåi in vitro:
ti chåi, m«i tr­êng nu«i cấy, chất kích thích ra rễ.
2.2.5. Xác định giá thể cấy cây con in vitro ra bầu.
2.3. Vật liệu nghiên cứu
* Chồi non của cây thông biến chủng Pinus caribaea var hondurensis (gieo ươm từ
nguồn hạt nhập nội) được 2 năm tuổi.
* Chồi đỉnh của cây mầm thông vô trùng nảy mầm trong ống nghiệm từ hạt (biến
chủng Pinus caribaea var hondurensis) nhập nội.
* Chồi của cây hom thông 4 năm tuổi của Trung tâm nghiên cứu cây nguyên liệu
giấy Phù Ninh được dẫn về từ cây trội thông Pinus caribaea var. hondurensis xuÊt
xø Poptun (Guatemala).


- 23 -

2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Điều kiện thí nghiệm
Các thí nghiệm được duy trì trong điều kiện nhân tạo với:
+ Số giờ chiếu sáng: 10 h/ ngày.
+ Cường ®é ¸nh s¸ng: 1500 - 3000 lux.
+ NhiƯt ®é: 25 - 29 oC.
2.4.2. Phương pháp nuôi cấy
Tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu cấy là đoạn chồi non của cây hom; cây hạt và
cây mầm vô trùng. Nuôi cấy đoạn chồi non là một phương pháp được ứng dụng
rộng rÃi trong sản xuất nông lâm nghiệp. Qúa trình nuôi cấy cơ quan qua các bước
sau:
- Cấy khởi động: là giai đoạn khử trùng, đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn
này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và t¸i

sinh tèt. Khư trïng mÉu b»ng chÊt ho¸ häc cã hoạt tính diệt nấm khuẩn, được tiến
hành qua các bước:
* Rửa sạch mẫu trong nước xà phòng loÃng trước khi sử dụng hợp chất tiệt
trùng.
* Rửa lại mẫu dưới vòi nước chảy trong vòng 10 - 15 phút.
* Nhúng mẫu trong dung dịch cồn 75o trong 20 giây.
* Ngâm mẫu trong dung dịch khử trùng với khoảng thời gian từ 5 - 30 phút.
* Đổ bỏ dung dịch khử trùng, rửa lại mẫu bằng nước cất đà vô trùng.
- Tạo và nhân nhanh chồi: là giai đoạn kích thích mô cấy phát sinh hình thành
nhiều chồi. Vấn đề là phải xác định được môi trường và điều kiện nuôi cấy thích
hợp để có thể có hiệu quả cao nhất.
+ Tái sinh chồi ban đầu từ mẫu nuôi cấy: Tiến hành nuôi cấy trên các môi
trườngdinh dưỡng cơ bản có bổ sung 4,5 g/l agar; 20 g/l đường và độ pH của các
môi trường được điều chỉnh đến 5,8. Khi xác định được công thức có hàm lượng
dinh dưỡng thích hợp thì tiếp tục thử nghiệm ảnh hưởng của việc bổ sung thêm các


- 24 -

chất cytokinin (Kinetin và BAP) ởcác nồng độ từ 0,1 2,5 mg/l, mục đích tìm ra
chất và nồng độ cytokinin thích hợp.
+ Nhân chồi: Trên cơ sở của thí nghiệm tái sinh mẫu ban đầu, tiếp tục thử nghiệm
môi trường tối ưu cho qúa trình nhân nhanh chồi thông. Tiến hành thử nghiệm ảnh
hưởng của việc bổ sung phối hợp giữa cytokinin với các chất auxin (NAA, IBA,
IAA), nồng độ từ 0,1 1,0 mg/l nhằm tìm ra m«i tr­êng tèi ­u cho viƯc nu«i cÊy
chåi th«ng.
- Tạo rễ và huấn luyện: là giai đoạn chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang
môi trường tạo rễ để có được cây con hoàn chỉnh. Chọn các chồi đủ tiêu chuẩn
(chiều cao, màu sắc, hình dạng) nuôi cấy trên các môi trường tạo rễ, mục đích
tìm ra môi trường thích hợp tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, rễ, lá. Sau đó

cây con được huấn luyện để thích nghi với điều kiện bên ngoài.
- Đưa cây in vitro ra điều kiện bên ngoài: Để tìm giá thể thích hợp cho cây con
có tỷ lệ sống cao khi đưa ra ngoài điều kiện tự nhiên, tiến hành các thử nghiệm về
thành phần ruột bầu.
2.4.3. Các thí nghiệm và phương pháp bố trí thí nghiệm
+ Thí nghiệm 1: Xác định thời điểm lấy mẫu vật nghiên cứu (4 đợt/năm; 3 lần
lặp/đợt; 30 mẫu/lần lặp).
Đợt 1 (8/2005).
Đợt 2 (11/2005).
Đợt 3 (2/2006).
Đợt 4 (5/2006).
+ Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại vật liệu nhân giống và tuổi vật liệu
nhân giống đến sự tái sinh chồi in vitro. Thí nghiệm tiến hành vào tháng Tám, được
bố trí 3 lần lặp, 20 mẫu /lần lặp. Các đoạn chồi được xử lý và khử trùng, đưa vào
ống nghiệm, sau 5 tuần nuôi cấy những mẫu sạch và có khả năng nảy chồi đà được
sử dụng trong thí nghiệm gồm:
Công thức A1: Chồi đỉnh của cây mầm vô trùng 45 ngày tuổi.


- 25 -

Công thức A2: Chồi đỉnh của cây mầm vô trùng 60 ngày tuổi.
Công thức A3: Chồi đỉnh của cây mầm vô trùng 75 ngày tuổi.
Công thức B1: Đoạn chồi non 45 ngày tuổi của cây hạt 2 năm tuổi.
Công thức B2: Đoạn chồi non 60 ngày tuổi của cây hạt 2 năm tuổi.
Công thức B1: Đoạn chồi non 75 ngày tuổi của cây hạt 2 năm tuổi.
Công thức C1: Đoạn chồi non 45 ngày tuổi của cây hom 4 năm tuổi.
Công thức C2: Đoạn chồi non 60 ngày tuổi của cây hom 4 năm tuổi.
Công thức C1: Đoạn chồi non 75 ngày tuổi của cây hom 4 năm tuổi.
+ Thí nghiệm 3: ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy (hàm lượng khoáng) lên khả

năng tái sinh chồi invitro từ mẫu nuôi cấy. Thí nghiệm được bố trí 3 lần lặp, 30
mẫu/lần lặp. Vật liệu nuôi cấy là các đoạn chồi non (1,7 2,0 cm) được tách riêng
ra khỏi cụm chồi, cấy vào các môi trường thí nghiệm có 2 % đường sacaroza, 4,5 %
agar và bổ sung BAP (0,5 mg/l).
Công thức 1 (WPM): Nuôi cấy trên môi trường WPM (1981)
Công thức 2 (SH): Nuôi cấy trên môi trường SH (1972)
Công thức 3 (LPm): Nuôi cấy trên môi trường LPm (1981)
Công thức 4 (MCM): Nuôi cấy trên môi trường MCM (1983)
Công thức 5 (AE): Nuôi cấy trên môi trường AE ()
Công thức 6 (Cheng): Nuôi cấy trên môi trường Cheng (1977,1978)
Công thức 7 (GD): Nuôi cấy trên môi trường GD (1972)
Công thức 8 (GD-mod): Nuôi cấy trên môi trường GD-mod (1981)
Công thức 9 (SH-mod): Nuôi cấy trên môi trường SH-mod (1981)
+ Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng lên khả
năng nhân chåi vµ sinh tr­ëng cđa chåi. ThÝ nghiƯm thùc hiƯn với 3 lần lặp, 5 bình
nuôi/lần lặp, 6 chồi /bình.
++ Thí nghiệm 4.1: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng nhóm
cytokinin lên khả năng nhân chồi và sinh trưởng của chồi. Vật liệu nuôi cấy là c¸c