Nghiên cứu sản xuất giống in vitro cây cà gai leo (solanum hainanense hance)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH - MÔI TRƢỜNG


DƢƠNG THỊ HIỀN MY

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT GIỐNG IN VITTRO
CÂY CÀ GAI LEO (SOLANUM HAINANENSE HANCE)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đà Nẵng – Năm 2016


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH - MÔI TRƢỜNG


DƢƠNG THỊ HIỀN MY

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT GIỐNG IN VITTRO
CÂY CÀ GAI LEO (SOLANUM HAINANENSE HANCE)

Ngành: Sƣ phạm Sinh học

Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Võ Châu Tuấn

NIÊN KHÓA 2012 - 2016

LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả
nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất kì cơng
trình nào khác.

Tác giả

Dƣơng Thị Hiền My


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp tại Khoa Sinh – Môi
trường, trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng, tôi đã học hỏi được rất nhiều
kiến thức lý thuyết cũng như thực hành thí nghiệm về ni cấy mơ tế bào thực vật,
qua đó bản thân tơi đã trưởng thành hơn trong nghiên cứu khoa học.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS. Võ Châu Tuấn, người thầy đã tận
tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi trong suốt q trình tôi thực hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS. Bùi Thị Thơ người đã giúp đỡ tôi
rất nhiều trong việc làm quen và phát triển kĩ năng thực hành thí nghiệm trong giai
đoạn đầu thực hiện đề tài khố luận của mình.
Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các nhóm nghiên cứu, đã ln giúp đỡ và chia
sẻ kinh nghiệm trong thời gian tôi thực hiện khóa luận.
Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đối với gia đình, bạn bè đã ln động
viên, khích lệ tơi cả về vật chất lẫn tinh thần để tơi có thể đạt được kết quả tốt nhất.
Đà Nẵng, tháng 5 năm 2016
Sinh viên thực hiện

Dương Thị Hiền My

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề ..............................................................................................................1
2. Mục tiêu đề tài .......................................................................................................2
3. Ý nghĩa ...................................................................................................................2
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 4
1.1. Tình hình sản xuất cây thuốc ở Việt Nam .......................................................4
1.2. Các nghiên cứu nhân giống cây thuốc bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro .........6
1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới .............................................................................6
1.2.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam ..............................................................................7
1.3. Giới thiệu về cây Cà gai leo .............................................................................10
1.3.1. Nguồn gốc và sự phân bố ................................................................................10
1.3.2. Đặc điểm về hình thái .....................................................................................10
1.3.3. Giá trị dược liệu ..............................................................................................11
1.3.4. Thành phần hố học ........................................................................................11
1.3.5. Tình hình sản xuất cây Cà gai leo ...................................................................11
1.3.6. Những nghiên cứu về cây Cà gai leo ..............................................................11
1.4. Sơ lƣợc một số yếu tố ảnh hƣởng đến q trình nhân giống in vitro ..........13
1.4.1. Mơi trường nuôi cấy ........................................................................................13
1.4.2. Điều kiện nuôi cấy ..........................................................................................17
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 19
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu.......................................................................................19
2.2. Nội dung nghiên cứu của đề tài .......................................................................19
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................19
2.3.1. Phương pháp khử trùng - Tạo nguyên liệu khởi đầu ......................................20
2.3.2. Phương pháp nhân nhanh chồi in vitro ...........................................................20
2.3.3. Phương pháp tạo rễ in vitro .............................................................................21
2.3.4. Phương pháp đưa cây ra đất ............................................................................21
2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................21

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................... 22
3.1. Đánh giá khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây Cà gai leo ........................22
3.1.1. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP, IBA và KIN đến khả năng nhân nhanh chồi
in vitro ......................................................................................................................22
3.1.2. Ảnh hưởng của nguồn mẫu vật đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro.........23
3.1.3. Ảnh hưởng của pH đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro............................25
3.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro ........26
3.2. Đánh giá khả năng tạo rễ in vitro....................................................................28
3.2.1. Ảnh hưởng của môi trường MS đến khả năng tạo rễ in vitro .........................28
3.2.2. Ảnh hưởng của IBA và NAA đến khả năng ra rễ in vitro ..............................29
3.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng tạo rễ in vitro..........................30
3.3. Ảnh hƣởng của giá thể trồng đến khả năng sống sót và sinh trƣởng của cây
Cà gai leo ngồi vƣờn ƣơm .....................................................................................32
3.4. Thiết lập quy trình sản xuất cây giống Cà gai leo in vitro ............................33
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 35
1. Kết luận ................................................................................................................35
2. Kiến nghị ..............................................................................................................35
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 36
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
2,4-D

: Diclorophenoxyacetic acid

BA

: 6 - benzyl adenine

BAP

: 6 - benzyl amino purine

B5

: Gamborg (1968)

cs

: cộng sự

ĐHST

: Điều hòa sinh trưởng

IBA

: Indole 3 - butyric acid

I&Y

: Ichihashi & Yamashita

KC

: Knudson C (1965)

KIN

: Kinetin

LS

: Linsmaier and Skoog(1965)

MS

: Murashige và Skoog (1962)

NAA

: α-naphthalen acetic acid

NN

: Nitsch & Nitsch(1969)

SH

: Schenk và Hildebrandt (1972)

VW

: Vacin và Went (1949)


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng
3.1

3.2
3.3
3.4

Tên bảng
Ảnh hưởng của tổ hợp BAP, IBA và KIN đến khả năng nhân
nhanh chồi invi tro
Ảnh hưởng của nguồn gốc mẫu vật đến khả năng nhân nhanh
chồi in vitro
Ảnh hưởng của pH đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro
Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng nhân nhanh chồi in
vitro

Trang
22

24
25
26

3.5

Ảnh hưởng của môi trường MS đến khả năng tạo rễ in vitro

28

3.6

Ảnh hưởng của IBA và NAA đến khả năng ra rễ in vitro

29

3.7

Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng ra rễ in vitro

31

3.8

Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống sót và sinh trưởng của
cây Cà gai leo sau 2 tuần.

32


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình

Tên hình

2.1

Cây Cà gai leo ngồi tự nhiên

3.1

Ảnh hưởng của tổ hợp BAP, IBA và KIN đến khả năng nhân
nhanh chồi invi tro

3.2

Ảnh hưởng của nguồn gốc mẫu vật đến khả năng nhân nhanh
chồi in vitro

3.3

Ảnh hưởng của pH đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro

3.4

Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng nhân nhanh chồi in
vitro

Trang
19
23

25
26
28

3.5

Ảnh hưởng của môi trường MS đến khả năng tạo rễ in vitro

29

3.6

Ảnh hưởng của IBA và NAA đến khả năng ra rễ in vitro

30

3.7

Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng ra rễ in vitro

32

3.8

Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống sót và sinh trưởng của
cây Cà gai leo sau 2 tuần.

3.9

Quy trình sản xuất cây giống Cà gai leo in vitro

33
34


1

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Hiện nay, cùng với sự phát triển của xã hội, dân số tăng nhanh, nhu cầu của
con người về nguồn dược liệu ngày càng tăng. Thảo dược là nguồn nguyên liệu
thực vật quý giá, cung cấp dược liệu để chế biến và sản xuất các loại thuốc hữu ích
phục vụ cho việc chữa bệnh và phục hồi sức khỏe con người. Nguồn dược liệu con
người đang sử dụng có thể được tổng hợp bằng nhiều con đường khác nhau như
tổng hợp hóa học, tổng hợp từ vi sinh vật, song nguồn dược liệu được khai thác từ
thực vật đã được con người sử dụng từ lâu và ngày càng có nhu cầu lớn [16].
Với sự phát triển của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được áp dụng
vào các lĩnh vực : nhân giống in vitro, dung hợp tế bào trần, tạo sinh khối tế bào
thực vật trong hệ lên men… việc nghiên cứu nuôi cấy mô và tế bào thực vật theo
hướng tạo nguồn nguyên liệu ổn định cung cấp cho quá trình tách chiết các hoạt
chất sinh học đã đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất các dược chất trong
ngành dược phẩm [38].
Trong đó Cà gai leo (Solanum hainanense Hance) là một trong những lồi cây
dược liệu có giá trị kinh tế cao. Cây được dùng trị phong thấp, sâu răng, đau nhức
các đầu gân xương, cảm cúm, ho, ho gà, dị ứng. Cây còn dùng trị rắn độc cắn, giải
độc rượu, bia, chống say tàu xe [16]. Hiện nay Cà gai leo đã được nghiên cứu và
chứng minh có tác dụng điều trị viêm gan do virus, xơ gan và ung thư gan.… Từ
năm 1980 đến nay, các nhà khoa học Việt Nam đã có nhiều cơng trình nghiên cứu
và chứng minh lồi cây này có tác dụng rất tốt với bệnh viêm gan, đặc biệt là viêm
gan virus B mãn tính thể hoạt động và xơ gan. Cà gai leo đã được Viện dược liệu
chứng minh có tác dụng chống viêm, bảo vệ gan, hạn chế sự hình thành xơ của các
tổ chức và thuốc “Haina” bào chế từ cà gai leo đã được thử nghiệm lâm sàng (tại
bệnh viện 103). Kết quả thử nghiệm lâm sàng sản phẩm chứa cà gai leo tại các bệnh
viện cho thấy bệnh nhân sau khi sử dụng sản phẩm đã cải thiện đáng kể các triệu
chứng chán ăn, mệt mỏi, vàng da, men gan trở về bình thường nhanh sau 2 tháng.
Đặc biệt sau 3 tháng sử dụng, hầu hết các bệnh nhân đều giảm nồng độ virus trong
máu rõ rệt, thậm chí đã ghi nhận trường hợp âm tính virus [10].

2

Mặc dù cà gai leo có ý nghĩa lớn trong điều trị bệnh, nhưng hiện nay nguồn
cây thuốc này chủ yếu được khai thác từ tự nhiên, chất lượng không đồng đều (do
sự khác nhau về điều kiện sống, sự không đồng đều về tuổi cây khi thu hái) phân bố
hẹp, trữ lượng có giới hạn và đang bị cạn kiệt nhanh chóng vì nhiều ngun nhân.
Việc nghiên cứu đưa cà gai leo vào trồng trọt đang trở thành nhu cầu cấp thiết. Hiện
nay Cà gai leo có thể trồng bằng hạt hoặc giâm cành nhưng cả hai đều có những hạn
chế. Trong các phương pháp nhân giống (giâm, chiết, ghép,…) thì phương pháp
ni cấy mơ là phương pháp hữu hiệu nhất hiện nay được sử dụng để sản xuất và
bảo tồn những đặc tính di truyền của giống cây trồng. Sự phát triển của cà gai leo
khơng địi hỏi nhiều cơng chăm sóc, rất dễ dàng sinh sơi, phát triển trên đất hoang
hóa, cằn cỗi, cây cối khơng mọc nổi, lại có nhiều cơng dụng q.
Hiện nay đã có nhiều đề tài nghiên cứu nhân giống Cà gai leo bằng kỹ thuật
ni cấy in vitro nhưng chưa có đề tài nghiên cứu nào khảo sát các điều kiện nuôi
cấy ảnh hưởng đến khả năng nhân nhanh chồi, khả năng tạo rễ in vitro và quy trình
sản xuất cây giống Cà gai leo in vitro.
Việc thực hiện đề tài này sẽ góp phần cung cấp cây giống cho các vườn cây
dược liệu, các hộ nông dân trên địa bàn giúp xóa bỏ diện tích đất hoang hóa, xóa đói
giảm nghèo nâng cao đời sống cho người dân và góp phần bảo vệ sức khỏe cộng
đồng. Cũng như góp phần lớn vào việc bảo tồn nguồn gen cây dược liệu quý ở Việt
Nam nói riêng cũng như góp phần lớn vào việc bảo tồn nguồn gen cây dược liệu
trên thế giới nói chung.
Vì vậy chúng tơi tiến hành chọn và thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sản xuất
giống in vitro cây Cà gai leo (Solanum hainanense Hance)”.
2. Mục tiêu đề tài
Xây dựng được quy trình sản xuất cây giống Cà gai leo in vitro với hệ số nhân
giống cao, chất lượng cây giống tốt.
3. Ý nghĩa

3.1 Ý nghĩa khoa học
Cung cấp dấu hiệu khoa học mới về các điều kiện và môi trường nuôi cấy tối
ưu để sản xuất nhanh giống cây Cà gai leo.


3

3.2 Ý nghĩa thực tiễn
Nhân nhanh giống cây Cà gai leo nhằm bảo tồn, phát triển bền vững nguồn
gen cây thuốc quý.


4

Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình sản xuất cây thuốc ở Việt Nam
Việt Nam là nước có một hệ sinh thái phong phú và đa dạng, một tiềm năng
lớn về tài nguyên cây dược liệu nói riêng và tài ngun dược liệu (thực vật, động
vật, khống vật) nói chung. Điều này thể hiện ở sự đa dạng về chủng loại cây dược
liệu (trong số hơn 12.000 loài thực vật Việt Nam thì có gần 4.000 lồi cho cơng
dụng làm thuốc), vùng phân bố rộng khắp cả nước, có nhiều loài dược liệu được
xếp vào loài quý và hiếm trên thế giới, như: Sâm ngọc linh, Sâm vũ diệp, Tam thất
hoang, Bách hợp, Thông đỏ, Vàng đắng, Cà gai leo, Hồng liên ơ rơ, Hồng liên
gai, Thanh thiên quỳ, Ba gạc Vĩnh Phú…[38].
Tiềm năng to lớn là vậy, song công cuộc bảo tồn và phát triển dược liệu ở
nước ta cũng đang gặp phải một số hạn chế, khó khăn, đặc biệt là các vấn đề liên
quan đến quy hoạch phát triển dược liệu, công tác bảo tồn và phát triển nguồn gen
dược liệu, việc tiêu chuẩn hóa dược liệu, cũng như việc hiện đại hóa sản xuất thuốc
từ dược liệu. Có thể kể đến một số ví dụ điển hình như tình trạng ni trồng và khai

thác dược liệu ở nước ta hiện nay cịn tự phát, quy mơ nhỏ dẫn đến sản lượng dược
liệu không ổn định, giá cả biến động. Việc khai thác dược liệu quá mức mà không
đi đôi với việc tái tạo, bảo tồn dược liệu đã dẫn đến số lượng loài cây dược liệu có
khả năng khai thác tự nhiên cịn rất ít (trên cả nước hiện chỉ cịn khoảng 206 lồi
cây dược liệu có giá trị có thể khai thác tự nhiên), nhiều loài cây dược liệu quý hiếm
trong nước đang đứng trước nguy cơ cạn kiệt. Dược liệu không được sản xuất theo
quy trình, quy hoạch cụ thể. Việc áp dụng thành tựu của khoa học, cơng nghệ vào
việc hiện đại hố sản xuất thuốc từ dược liệu chưa được quan tâm đúng mức... Việc
chưa có biện pháp quy hoạch được các nguồn dược liệu thành ngành ni trồng
phát triển, cũng chính là chúng ta đang bỏ lỡ một mũi nhọn rất lớn có thể vừa góp
phần chăm sóc sức khỏe, vừa cải thiện mạnh mẽ đời sống của nhân dân. Để có thể
nhanh chóng hội nhập, việc hiện đại hóa sản xuất thuốc từ dược liệu là yếu tố đóng
vai trị then chốt. Ví dụ điển hình là sâm Ngọc Linh. Mặc dù sâm Ngọc Linh là loại


5

sâm có hàm lượng Saponin cao nhất, cao hơn Sâm Triều Tiên. Tuy nhiên, trong khi
người Hàn Quốc với lợi thế về khoa học kỹ thuật từ lâu đã ứng dụng nhiều biện
pháp nâng cao chất lượng, sản xuất được nhiều loại sản phẩm khác nhau từ Sâm
Triều Tiên và mang lại lợi nhuận nhiều tỷ USD, thì cây Sâm Ngọc Linh ở nước ta
mới chỉ đang trong giai đoạn nghiên cứu bước đầu. Tương tự như thế, cây Linh Chi
Việt Nam có chất lượng khơng kém Linh chi Hàn Quốc, nhưng chưa phát huy triệt
để được hiệu quả khám chữa bệnh cũng như hiệu quả kinh tế, cải thiện đời sống cho
nhân dân [38].
Tại Việt Nam, theo kết quả điều tra, đánh giá tại một số vùng, nuôi trồng cây
dược liệu có giá trị kinh tế to lớn hơn bất kỳ cây lương thực, thực phẩm nào (có thể
thu nhập trên 100 triệu đồng/ha). Ví dụ, ở Sapa (tỉnh Lào Cai), việc thực hiện trồng
cây Artiso giúp đem lại doanh thu khi trồng đến khi thu hoạch đạt khoảng 115 triệu
đồng/vụ/năm. Ở Việt n (tỉnh Bắc Giang), mơ hình trồng cây Kim Tiền Thảo là

hướng mới trong chuyển đổi cơ cấu cây trồng ở tỉnh và đã thực sự góp phần giảm
nghèo cho người dân nơi đây [38].
Theo TS Trương Quốc Cường, Việt Nam cần quy hoạch nhiều vùng trồng
dược liệu quy mô lớn trên cơ sở khai thác các vùng có lợi thế về điều kiện tự nhiên,
thích hợp với sinh trưởng và phát triển của cây dược liệu. Phù hợp với nguồn nhân
lực có khả năng tiếp thu kỹ thuật mới ứng dụng vào sản xuất dược liệu. Dựa vào lợi
thế các vùng truyền thống của các cộng đồng miền núi của Việt Nam và các nghiên
cứu của các nhà khoa học. Bên cạnh đó cần đẩy mạnh công tác bảo tồn và phát triển
nguồn gen dược liệu. Để đảm bảo nguồn dược liệu chất lượng cao, cần đẩy mạnh
triển khai thực hiện GACP (thực hành tốt trồng cây dược liệu (GAP) và thực hành
tốt thu hái cây dược liệu hoang dã (GCP). Ngoài ra, cần xây dựng nhiều các Hồ sơ
về dược liệu. Hiện Bộ Y tế đang triển khai xây dựng Danh mục 40 dược liệu có
tiềm năng khai thác và phát triển thị trường để làm cơ sở trình Thủ tướng Chính phủ
ban hành các chính sách hỗ trợ, đầu tư, khuyến khích phát triển dược liệu trong giai
đoạn từ nay đến năm 2030 [38].
Với việc thực hiện tốt, đồng bộ các vấn đề nêu trên, chắc chắn chúng ta sẽ có
nguồn dược liệu chất lượng tốt, góp phần tạo ra các sản phẩm có chất lượng cao,


6

đảm bảo an toàn, hiệu quả cho người bệnh, hướng tới đưa dược liệu trở thành thế
mạnh của ngành dược Việt Nam. Điều này cũng được thể hiện rất rõ trong Chiến
lược quốc gia phát triển ngành Dược Việt Nam giai đoạn đến năm 2020 và tầm nhìn
đến năm 2030 (được ban hành theo Quyết định số 68/QĐ-TTg ngày 10/01/2014 của
Thủ tướng Chính phủ): phát huy thế mạnh, tiềm năng của Việt Nam để phát triển
sản xuất thuốc từ dược liệu, trong đó mục tiêu cụ thể đến năm 2020 là phấn đấu sản
xuất được 20% nhu cầu nguyên liệu cho sản xuất thuốc trong nước, thuốc sản xuất
trong nước chiếm 80% tổng giá trị thuốc tiêu thụ trong năm, trong đó thuốc từ dược
liệu chiếm 30% [38].

1.2. Các nghiên cứu nhân giống cây thuốc bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro
1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Chi Curcuma là một chi có nhiều lồi được sử dụng làm thuốc. Đã có rất
nhiều tác giả nghiên cứu nhân giống in vitro trên các đối tượng khác nhau của chi
Curcuma, chẳng hạn như: Sunitibala H. và cs (2001) tiến hành nhân giống invitro
loài C. longa L [51]. Zhang và cs (1999) đã nghiên cứu nhân nhanh cây Thông dù
(Toona sinensis) bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro. Mẫu cấy là các mắt thân có mang
chồi nách. Mẫu cấy bật chồi sớm và sinh trưởng nhanh trên mơi trường MS có bổ
sung 0,2 mg/L BA. Môi trường để nhân nhanh chồi là MS có bổ sung 0,2 mg/L BA
+ 2 mg/L GA hoặc MS có bổ sung 0,2 mg/L TZ + 2 mg/L GA, hệ số nhân nhanh
đạt 3.1 – 4.0 trong vịng 30 ngày. Mơi trường tạo rễ là MS bổ sung 1 mg/L IBA, tỷ
lệ ra rễ đạt 73% và rễ sinh trưởng tốt. 72% cây con sống sót sau khi chuyển ra điều
kiện thích hợp [53].
Li - Chang Lin và cs (2003) đã nghiên cứu vi nhân giống bằng kỹ thuật in
vitro đối tượng Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb). Tác giả đã thu được
hệ số nhân chồi đạt 4,7 lần ở cơng thức thí nghiệm có bổ sung 2 mg/L BA và 0,2
mg/L NAA [46].
Salema Valencio và cs (2007) đã nghiên cứu trên cây Sâm cau ( Curculigo
orchioides Gaertn.) thì trên mơi trường MS có bổ sung 1,5 mg/L BA và 100 mg/L
Ads, 3% sucrose thì chồi tái sinh tốt nhất, trên mơi trường MS có bổ sung 1,5 mg/L
BA và 100 mg/L Ads, 0,25 mg/L IBA và 3% sucrose thì tỷ lệ nhân nhanh chồi cao


7

nhất và môi trường MS bổ sung 0,25 - 1 mg/L IBA và 2% sucrose thì tỉ lệ ra rễ đạt
92,2% [49].
Năm 2009, một nhóm tác giả người Malaisia đã nghiên cứu nhân nhanh cây
Gynura procumbens (Lour.) Merr để chiết xuất hoạt chất sinh học. Cây này thường
được nhân giống bằng cách giâm cành, nhưng phương pháp này không thể đáp ứng

được yêu cầu này. Mẫu vật phục vụ cho nhân giống là đốt thân. Cấy mẫu vật trên
môi trường MS có bổ sung 2mg/L BA, sau 10 ngày có 12 chồi mới phát sinh. Nếu
bổ sung lượng nhỏ NAA vào mơi trường MS + 2mg/L BA thì trung bình khoảng 18
chồi con/mẫu chồi phát sinh. Toàn bộ chồi con tạo rễ sau 2 tuần ni cấy trên MS
khơng có chất ĐHST [41].
1.2.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam
Năm 2004, Trần Thị Liên đã nghiên cứu quy trình nhân giống vơ tính cây Hà
thủ ơ đỏ bằng kỹ thuật in vitro. Tác giả đã sử dụng 0,5 mg/L BA và 0,1 mg/L NAA
kết hợp trong quá trình nhân nhanh chồi cây Hà thủ ô đỏ, sau 6 tuần nuôi cấy trong
điều kiện 25oC, cường độ ánh sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 14 giờ/ngày kết
quả thu được đạt hệ số nhân chồi là 5 lần so với đối chứng [14].
Các cây thuộc họ Nhân sâm (Araliacea) là những đối tượng được nhiều nhà
khoa học chú ý và được nhân giống in vitro ở nhiều nước như Mỹ, Trung Quốc,
Nhật, Nga, Hàn Quốc, Việt Nam. Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et
Grush), một loài đặc hữu của Việt Nam, đã được Dương Tấn Nhựt và cs (2006)
nghiên cứu nhân nhanh từ các mô rễ. Một đối tượng khác trong họ Nhân sâm là cây
Đinh lăng (Poliscias fruticosa L.) đã được nhân giống in vitro bởi các tác giả
Nguyễn Ngọc Dung và Nguyễn Văn Uyển (1997) [5].
Cây Trinh nữ (Crium latifolium L.) thuộc họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) là
cây thuốc có tác dụng chữa trị thấp khớp, đắp lên mụn nhọt. Ngoài ra còn được
dùng để chữa một số bệnh như ung thư tiền liệt tuyến, ung thư vú (Võ Văn Chí,
1997). Trong tự nhiên hệ số nhân của nó thấp. Tạ Như Thục Anh và cs (1998) đã
tiến hành nhân giống theo phương pháp in vitro bằng tái sinh chồi trực tiếp [1].
Củ mài (Dioscorea persimills Prain et Burk.) thuộc họ Dioscoreaceae là cây
vừa lấy củ để ăn vừa để làm thuốc. Tuy nhiên, phương pháp nhân giống truyền thống


8

có hệ số nhân giống thấp và tốn một lượng lớn củ làm giống. Phạm Văn Hiển và

Nguyễn Thị Chinh (1997) đã nghiên cứu nhân nhanh in vitro Củ mài từ đốt thân [7].
Cây Actiso (Cynana scolymus L.) thuộc họ Cúc (Asteraceae) là một cây dược
liệu quý có chứa nhiều axit amin, muối hữu cơ của các kim loại K, Ca, Mg, Na,… các
chất bổ dưỡng cho gan và rất giàu vitamin C. Khuất Hữu Trung và cs (2001) đã ứng
dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào để nhân nhanh đối tượng này từ chồi ngọn [33].
Một số cây có dầu như sả, bạc hà, hương nhu,…cũng được đưa vào nhân
giống và bảo quản in vitro [36]. Trung tâm ứng dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật Bình
Định đã nhân giống và bảo quản in vitro các loài Bạch đàn (E. Urophylla), cây
hồng, trầm hương, giổi xanh [35]
Cây Cà gai leo (Solanum hainanense Hance) thuộc họ Solanaceae, là một loại
cây thuốc quý. Rễ Cà gai leo được dân gian làm thuốc chữa bệnh phong thấp, đau
nhức xương, đau răng, sâu răng,… Huỳnh Văn Kiệt, Cao Đăng Nguyên (2006) đã
ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô nhằm tạo nguồn nguyên liệu in vitro để bước đầu
nghiên cứu đặc trưng protein ở lồi cây này [12].
Cây Gió bầu (Aquilaria agallocha) là loài cây gỗ quý, dùng làm chất thơm,
làm thuốc chữa bệnh như hen suyễn, bí tiểu tiện, cây cịn dùng để phối chế dầu cù
là. Bùi Thị Trường Thu và cs (1998) nghiên cứu cho thấy có thể dùng phương pháp
ni cấy mơ để nhân giống cây Gió bầu với tốc độ nhân lý thuyết khoảng 3 x 36
cây/năm từ một mẫu ban đầu trên mơi trường WPM có bổ sung 0,1 mg/L BA và
100ml/L nước dừa [14].
Một số loài thược họ Gừng (Zingiberaceae) như gừng, riềng, sa nhân, nghệ,…
là những cây được dùng với nhiều mục đích khác nhau (gia vị, hương liệu, dược
liệu). Lâm Thị Ngọc Phượng và cs (1999) đã tiến hành nhân giống vơ tính cây gừng
(Zingiber officinale Rosc) bằng phương pháp nuôi cấy mô [22].
Cây Nghệ đen (Curcuma zedoaria R.) trong y học dân tộc gọi là vị Nga truật
hoặc Ngãi tím, có khả năng trị được các bệnh: đau dạ dày, vàng da, phụ nữ bị đau
bụng sau sinh, thổ huyết, máu cam, chống những bệnh viêm khớp xương, chữa lành
sẹo của các loại mụn và vết thương ngồi da. Trong tự nhiên thì cây Nghệ đen sinh
trưởng và phát triển chậm, thời gian thu hoạch dài. Năm 2002, Đoàn Trọng Đức đã

9

nghiên cứu và đưa ra một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng nhân giống cây Nghệ
đen theo phương pháp in vitro [6].
Bùi Văn Lệ và Quánh Diễm Phương (2007) đã nghiên cứu nhân giống in vitro
cây Bắt ruồi để thu nhận hợp chất quinone có hoạt tính sinh học. Theo kết quả
nghiên cứu, để nhân giống in vitro cây Bắt ruồi, hạt được khử trùng 10% (v/v)
Javen bổ sung 0,01% (v/v) Tween 20 trong 10 phút và nuôi cấy trên mơi trường ½
MS cơ bản bổ sung đường (30g/L), than hoạt tính (1g/L), Casein hydrosylate (100
mg/L) và pH 5,8. Đốt thân từ cây con D. burmanni Vahl được ni cấy trong mơi
trường ½ MS rắn và lỏng có bổ sung đường (30g/L), than hoạt tính (1g/L), Casein
hydrosylate (100 mg/L). Ở cả 2 môi trườngđều cho kết quả tốt [13].
Lô hội (Aloe vera L.) là cây dược liệu dùng trong cả đông y và tây y. Nguyễn
Thị Kim Thanh và Dương Huyền Trang (2008) nghiên cứu đã chỉ ra rằng: để tạo vật
liệu khởi đầu in vitro cây Lô hội nên sử dụng mẫu ở vụ xuân, khử trùng bằng HgCl2
0,1% trong 7 phút cho hiệu quả khử trùng cao (68,5%). Môi trường MS bổ sung 2,5
mg/L BA cho hệ số nhân cao (5,3 lần/3 tuần), chất lượng chồi tốt. Bổ sung than
hoạt tính 1,5 – 2,0 g/L cho khả năng ra rễ đạt cao nhất. Tỉ lệ ra rễ đạt 100%, chất
lượng rễ tốt. Giá thể ra cây Lơ hội in vitro thích hợp là cát mịn, tỷ lệ sống cao
(81,4%), cây sinh trưởng phát triển tốt [25].
Trung tâm Sinh học Thực nghiệm (2009) đã tiến hành nghiên cứu nhân nhanh
in vitro lồi Lan kim tuyến nhằm góp phần bảo tồn và phát triển loài cây dược liệu
quý hiếm này. Các tác giả chỉ ra rằng để có tỷ lệ mẫu cao, khả năng bật mầm của
mẫu tốt, phương pháp khử trùng tối ưu nhất đối với Lan kim tuyến là kết hợp cồn
70% trong 5 phút + HgCl2 0,1% trong 5 phút, sau đó cấy trên mơi trường MS có 0,3
mg/L IBA + 1mg/L BA. Khi nhân nhanh cụm chồi, mơi trường thích hợp là MS +
0,3 mg/L IBA + 1mg/L BA + 0,4 mg/L KIN. Tỷ lệ chồi ra rễ cao nhất, chất lượng
bộ rễ tốt nhất trong mơi trường có NAA (1 mg/L) + than hoạt tính ( 0,2 g/L) [34].
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Haberlandt et Grush), một loài đặc hữu

của Việt Nam, trong thành phần củ có chứa tới 50 saponin, đã được Dương Tấn
Nhựt và cs (2006) nghiên cứu nhân nhanh từ các mô rễ. Theo tác giả, môi trường tối
ưu để nhân nhanh, môi trường các rễ bất định là môi trường SH (Schenk và


10

Hilđebrant, 1972) bổ sung 3 mg/L NAA, 30g/L sucroze, 8g/L agar [42]. Với sự
thành công trong nuôi cấy mô rễ bằng kỹ thuật nuôi cấy mô mở ra hướng mới trong
việc nhân nhanh và bảo tồn Sâm Ngọc Linh.
Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc) thuộc họ Thanh tùng (Taxaceae), là loài
cây rừng rất quý, có giá trị kinh tế cao. Theo Wichremesinhe (1994), Thông đỏ là
cây dược liệu quý giá trong y học. Đặc biệt nó có chất Taxol là chất có khả năng
chữa bệnh ung thư buồng trứng, ung thư vú. Dương Tấn Nhựt đã tiến hành nghiên
cứu nhân giống trên đối tượng này. Kết quả cho thấy: môi trường ni cấy MS có
bổ sung 5 mg/L BA và 5 mg/L BA + 1 mg/L KIN + 150 mg/L AgNO3 thích hợp
cho tái sinh chồi. Điều kiện ni cấy cho thấy kết quả nhân nhanh cao nhất là MS +
5mg/L BA + 1 mg/L KIN (3,4 chồi/ mẫu). Để tạo rễ in vitro cây Thông đỏ phải
chuyển sang nuôi cấy trên môi trường WPM + 3 mg/L NAA và Rhizopon (50
mg/L) sau 70 ngày nuôi cấy [21].
1.3. Giới thiệu về cây Cà gai leo
1.3.1. Nguồn gốc và sự phân bố
Cà gai leo (Solanum hainanense) hay còn gọi là cà quạnh, cà cườm, cà quánh,
cà quýnh, cà gai dây, cà vạnh, chẻ nan (Tày), b‟rongoon (Ba Na). Đây là cây mọc
hoang, thường được trồng làm hàng rào ở các nước châu Á như Lào, Trung Quốc…
Ở Việt Nam, cây phân bố khá rộng từ vùng núi thấp đến trung du và đồng bằng ven
biển thuộc tỉnh Thái Bình, Nam Hà, Thanh Hố, Nghệ An, Huế, Quảng Nam,…
1.3.2. Đặc điểm về hình thái
Cà gai leo thuộc loại cây nhỡ leo, thân dài 0,60 - 1m hay hơn, rất nhiều gai,
phân cành nhiều, cành non tỏa rộng, cành xoè rộng, trên phủ lông hình sao và rất

nhiều gai cong màu vàng. Lá mọc so le hình trứng hay thn, phiến lá nơng, phía
gốc lá hình rìu hay hơi trịn, mép ngun hay hơi lượn và khía thùy, hai mặt khơng
đều, mặt trên xanh sẫm, nhất là mặt dưới phủ lông trắng nhạt, phiến dài 3 - 4cm,
rộng 12 - 20mm, có gai, cuống dài 4 - 5mm. Hoa tím nhạt, nhị vàng, họp thành xim
gồm 2 - 5 hoa. Quả hình cầu, khi chín có màu vàng, bóng, nhẵn, đường kính 5 7mm. Hạt màu vàng, hình thận, có mạng, dài 4mm, rộng 2mm [23].


11

1.3.3. Giá trị dược liệu
Theo kinh nghiệm dân gian, cà gai leo dùng chữa: Viêm gan, xơ gan, hỗ trợ
chống tế bào gây ung thư, chữa tê thấp, đau lưng, nhức mỏi, giải ngộ độc rượu rất
tốt [16]. Trong y học hiện đại: Cà gai leo hỗ trợ điều trị bệnh nhân viêm gan siêu vi
B mạn tính thể hoạt động bằng thuốc từ Cà gai leo do có tác dụng giảm nhanh các
triệu chứng lâm sàng hạ men gan và có tác dụng làm âm tính Viêm gan siêu vi
mạnh nhất hiện nay. Cà gai leo có tác dụng chống viêm và ức chế sinh tổng hợp
colagen ở một số tổ chức mô liên kết [27]. Cà gai leo dược liệu được chứng minh là
kìm hãm và ngăn chặn xơ gan phát triển [28]. Gần đây các nhà ngiên cứu phát hiện
những tác dụng dược lý mới của Cà gai leo như tác dụng trên hệ miễn dịch, trên tế
bào ung thư cũng như thử tác dụng trên gen gây ung thư của virus và gen ức chế
ung thư P53 và Rb [10].
1.3.4. Thành phần hoá học
Thân, lá, rễ và quả Cà gai leo có những thành phần hóa học chủ yếu như
alcaloid, glycoalcaloid, steroid saponin, flavonoid, phytosterol, chất béo, carotenoid,
coumarin, acid hữu cơ, đường khử tự do, amino acid . Viện dược liệu chứng minh
glycoalcaloid là hoạt chất chính có tác dụng ức chế sư phát triển của xơ gan, chống
viêm, bảo vệ gan trong cao toàn phần của cà gai leo [37].
1.3.5. Tình hình sản xuất cây Cà gai leo
Công ty TNHH Tuệ Linh là đơn vị tiên phong phát triển dược liệu này và là
công ty đầu tiên triển khai xây dựng vùng nguyên liệu Cà gai leo tại xã Hành Trung,

huyện Nghĩa Hành, tỉnh Quảng Ngãi. Ở Thanh Hóa mơ hình trồng cà gai leo, thực
hiện thí điểm tại gia đình chị Nguyễn Thị Hồ và gia đình chị Lê Thị Thuỷ thơn 3,
xã Đơng Hoàng bước đầu mang lại những hiệu quả kinh tế cao [38]. Một số nơi sản
xuất và cung cấp cây giống Cà gai leo như Trung tâm cây giống, cây nguyên liệu
Tam Đảo, Trung tâm sản xuất cây giống Đức Thịnh,… Hiện nay một số nước châu
Á như Lào, Trung Quốc, Campuchia đang tiến hành trồng và sản xuất dược liệu từ
loài này.
1.3.6. Những nghiên cứu về cây Cà gai leo
Trong báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp nhà nước “Điều trị hỗ trợ bệnh


12

nhân viêm gan siêu vi B mạn tính thể hoạt động” bằng thuốc từ Cà gai leo do Viện
dược liệu trung ương chủ trì kết luận: Thuốc từ cà gai leo có tác dụng giảm nhanh
các triệu chứng lâm sàng (mệt mỏi, đau tức hạ sườn phải, nước tiểu vàng, da và
niêm mạc vàng); men gan (transaminase) và billirubin trở về bình thường [10].
Nguyễn Thị Minh Khai và cs (2001) nghiên cứu sử dụng Cà gai leo làm thuốc
chống viêm và ức chế sự phát triển của xơ gan. Cho kết quả: Cà gai leo có tác dụng
chống viêm và ức chế sinh tổng hợp collagen ở một số tổ chức mơ liên kết [10].
Nguyễn Thị Bích Thu (2001) đã nghiên cứu Cây cà gai leo (Solanum
procumbens Lour, Solanacenae) làm thuốc chống viêm gan và ức chế xơ gan, kết
luận: dạng chiết toàn phần của Cà gai leo làm giảm trọng lượng u trên mơ hình u
thực nghiệm 42,2% và làm giảm hàm lượng collagen gan trên mơ hình xơ gan là
27,0%. Đã nghiên cứu phát hiện những tác dụng dược lý mới của Cà gai leo như tác
dụng trên hệ miễn dịch, trên tế bào ung thư cũng như thử tác dụng trên gen gây ung
thư của virus và gen ức chế ung thư P53 và Rb [28].
Gần đây, sản phẩm Giải độc gan Tuệ Linh, với thành phần chính từ Cà gai
leo và Mật nhân, đã được thử nghiệm lâm sàng trên bệnh nhân viêm gan virus B thể
hoạt động tại Bệnh viện quân y 108, kết quả cho thấy: các triệu chứng như mệt mỏi,

chán ăn, gan to, đau hạ sườn phải, vàng da ở nhóm bệnh nhân nghiên cứu giảm
nhanh sau 1 tháng và hết hoàn toàn sau 2 tháng điều trị. Men gan (AST, ALT) về
bình thường sau 6 tháng, khơng có bệnh nhân nào xuất hiện các tác dụng ngoại ý
như đau đầu, nổi mẩn ngứa…
Năm 2008, Nguyễn Hoàng Lộc và Huỳnh Văn Kiệt đã nghiên cứu nhân nhanh
in vitro cây Cà gai leo (Solanum haninanense Hance) - Một loài thảo dược quý đã
khảo sát nồng độ các chất kích thích sinh trưởng ảnh hưởng đến khả năng kéo dài
chồi và tái sinh chồi và ra rễ của loài cây này [11].
Năm 2010, Nguyễn Hoàng Lộc và cs đã nghiên cứu sản xuất glycoalkaloids từ
callus Cà gai leo (Solanum hainanense Hance) cho kết quả ni cấy trên mơi trường
MS cơ bản có bổ sung 1 mg/L và BAP 0,5 mg/L 2,4 - D lượng Glycoalkaloid tích
lũy trong ống nghiệm đạt đến 188,65 mg/g [15].
Trần Văn Sung (2014) đã nghiên cứu “Hồn thiện quy trình công nghệ chiết


13

xuất Cà gai leo (Solanum hainanense)” đề tài đã xây dựng được quy trình chiết
xuất, tinh chế hoạt chất tinh khiết có tác dụng trong cây Cà gai leo, chế tạo và lắp
đặt dây chuyền chiết xuất Cà gai leo ở quy mơ sản xuất. Đồng thời nghiên cứu cũng
tìm ra một hoạt chất mới là CGL 07. Theo các nhà hóa học thuộc Viện Hóa học thì
chất này có đặc điểm cấu trúc giống với hoạt chất sinh học có trong một lồi Sâm
biến đổi gen (Transgenic Panax quiquefolium) rất phổ biến ở Mỹ. Loài Sâm biến
đổi gen này có rất nhiều các hoạt chất ginsenoside glycoside trong đó có 2 chất
ginsenoside Rh2 và Rh3 là các chất rất hiếm gặp trong tự nhiên và có hoạt tính sinh
học cao [24].
1.4. Sơ lƣợc một số yếu tố ảnh hƣởng đến q trình nhân giống in vitro
1.4.1. Mơi trường ni cấy
Môi trường là yếu tố quan trọng cho sự sinh trưởng và phát triển của mô tế
bào, là nguồn cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết nhằm duy trì sự sống, sinh

trưởng và phát triển của tế bào trong q trình ni cấy. Việc lựa chọn mơi trường
ni cấy phụ thuộc vào từng lồi thực vật được ni cấy. Thành phần của môi
trường nuôi cấy mô gồm:
a. Các chất dinh dƣỡng vô cơ
Các chất dinh dưỡng vô cơ là các nguyên tố khoáng được cung cấp dưới dạng
đa lượng và vi lượng. Sự sinh trưởng của thực vật trong ni cấy in vitro u cầu
cần phải có cả các nguyên tố đa lượng và nguyên tố vi lượng kết hợp với nhau. Các
nguyên tố đa lượng được sử dụng ở nồng độ lớn hơn 5 mM/L. Bao gồm các nguyên
tố sau: nitrogen (N), potassium (K), phosphorus (P), calcium (Ca), magnesium (Mg)
và sulphur (S) ở dạng muối khống trong mơi trường. nitrogen (N) thường được
cung cấp dưới dạng ammonium (NH4+) và nitrate (NO3-). Mơi trường ni cấy chứa
ít nhất 25 mM/L nitrogen (N) và potassium (K), các nguyên tố khác khoảng 1-3
mM/L [17], [48].
Các nguyên tố vi lượng được sử dụng ở nồng độ nhỏ hơn 0,05 mM/l. Bao gồm
các nguyên tố: iron (Fe), manganese (Mn), zinc (Zn), boron (B), copper (Cu) và
molybdenum (Mo). Các nguyên tố khoáng này mặc dù với nồng độ nhỏ nhưng cần
thiết cho sự sinh trưởng ở thực vật. Nguyên tố quan trọng nhất là Fe, Fe chỉ có hiệu


14

quả ở pH thấp, chính vì vậy nó được cung cấp ở dạng FDTA – Fe phức tạp để có
hiệu quả ở pH khác nhau [17], [48], ở dạng này khơng bị kết tủa và giải phóng dần
ra mơi trường theo nhu cầu của mô thực vật [18].
b. Nguồn cacbon
Nguồn cacbon giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp nên chất hữu cơ giúp tế bào
phân chia, nguồn cacbon bổ sung vào môi trường ở dạng đường [17].
Đường là một phần rất quan trọng của môi trường dinh dưỡng, như là nguồn
năng lượng. Vì hầu hết thực vật ni cấy mô không thể quang hợp hiệu quả do sự
phát triển tế bào và mô kém, thiếu chất diệp dục, hạn chế trao đổi khí và CO2 trong

bình ni cấy. Do đó khả năng tự dưỡng kém, phải cần có nguồn cacbon bên ngồi
để tạo năng lượng, nguồn cacbon thích hợp nhất là sucrose ở nồng độ 20 – 60 g/l.
Trong khi hấp khử trùng môi trường, sucrose bị thủy phân thành glucose và
fructose, được sử dụng cho sự tăng trưởng của thực vật nuôi cấy mô, fructose nếu
hấp môi trường sẽ gây độc hại cho cây [48].
c. Các chất hữu cơ
+ Vitamin
Là những chất hữu cơ cần thiết cho quá trình trao đổi chất, là thành phần của
các enzim. Do đó, muốn cây phát triển tốt thì mơi trường ni cấy cần bổ sung các
vitamin. Thiamine (B1), acid nicotinic (B3), pyridoxine (B6), acid pantothenic (B5)
là các vitamin thường được sử dụng. Trong đó B1 bổ sung vào mơi trường để tham
gia vào q trình chuyển hóa carbohydrate [48].
+ Axit amin
Bổ sung axit amin vào môi trường nuôi cấy là rất quan trọng, để kích thích
tăng trưởng trong tế bào, cũng như kích thích và duy trì các phơi soma. Lglutamine,
L-asparagine, L-cystein, L-glycine là các axit amin thường được sử dụng để bổ
sung vào môi trường nuôi cấy ở dạng hỗn hợp, nếu riêng lẻ thì sẽ ức chế sự tăng
trưởng của tế bào [17], [48].
+ Chất hữu cơ phức tạp
Là nhóm các chất hữu cơ bổ sung có thành phần không xác định như protein
hydrolysate, nước dừa, dịch nấm men, nước cam, nước ép cà chua, casein thủy


15

phân, casein thủy phân đã đem lại hiệu quả đáng kể trong nuôi cấy mô, chiết xuất
khoai tây cũng đã đem lại hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn [17], [48]. Công bố đầu
tiên về việc sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô được nhà khoa học Van Overbeek
và cs của ơng tìm ra (Van Overbeek và cs, 1941) [47]. Sau đó tác dụng tích cực của
nước dừa đã được nhiều nhà khoa học khác chứng nhận. Chất có hoạt tính trong

nước dừa được chứng minh là myo-inositol và một số các acid amin khác, nước dừa
là hợp chất tự nhiên chứa nhiều chất khống, vitamin, hợp chất kích thích sinh
trưởng thuộc nhóm Cytokinin có tác dụng kích thích hình thành chồi. Đây là thành
phần khơng thể thiếu trong q trình tạo chồi và cụm chồi từ mơ sẹo [45]. Nước dừa
thường được lấy từ quả dừa để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản. Thông thường nước
dừa thường được xử lý để loại trừ các protein, sau đó được lọc qua màng lọc để khử
trùng trước khi bảo quản lạnh. Tồn dư của protein trong nước dừa không gây ảnh
hưởng đến sinh trưởng của mô hoặc tế bào nuôi cấy, nhưng sẽ dẫn đến kết tủa dung
dịch khi bảo quản lạnh. Chất cặn có thể được lọc hoặc để lắng dưới bình rồi gạn bỏ
phần cặn. Nước dừa thường sử dụng với nồng độ 5 - 20% thể tích mơi trường, kích
thích phân hóa và nhân nhanh chồi.
d. Các chất điều hòa sinh trƣởng (ĐHST) ở thực vật
Bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng rất cần thiết để kích thích sự sinh
trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan. Các chất này kích thích sự phân chia tế bào,
do đó điều chỉnh sự phát triển của các chồi và rễ trên cây và phôi trong môi trường
nửa rắn hoặc lỏng. Bốn chất điều hịa sinh trưởng chính được sử dụng là: auxin,
cytokinin, giberelin và axit abscissic, các chất này được bổ sung trong môi trường
nuôi cấy. Tuy nhiên, yêu cầu các chất này thay đổi theo từng lồi thực vật, loại mơ,
hàm lượng các chất điều hịa sinh trưởng nội sinh trong cây [48], [9].
+ Auxin: phân chia tế bào, kéo dài tế bào, hình thành rễ, phát sinh phôi soma.
Khi được sử dụng ở nồng độ thấp, auxin kích thích tạo rễ, ở nồng độ cao sẽ hình
thành mơ sẹo. Các auxin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là: 1naphthaleneacetic acid (NAA), 2,4 dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), indole-3
acetic acid (IAA), indolebutyric acid (IBA) [48]. Auxin tự nhiên được tìm thấy
nhiều ở thực vật là indol axetic axit (IAA). IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng


16

kéo dài tế bào và điều khiển sự hình thành rễ. Ngồi IAA, cịn có các dẫn xuất của
nó là naphtyl axetic axit (NAA) và 2,4 - diclophenoxy axit (2,4 D). Các chất này

cũng đóng vai trị quan trọng trong sự phân chia của mơ và trong q trình hình
thành rễ. NAA được Went và Thimann (1937) phát hiện. Chất này có tác dụng tăng
hơ hấp của tế bào và mơ ni cấy, tăng hoạt tính enzim và ảnh hưởng mạnh đến trao
đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường.
NAA là auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA, NAA có vai trị
quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ [36].
+ Cytokinin: kích thích tổng hợp AND, thúc đẩy sự phân chia tế bào, kích
thích sự tăng trưởng của chồi, liên quan đến sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa
chồi trong ni cấy mô, các cytokinin thường được sử dụng là: Zeatin, 6benzylaminopurine (BAP), kinetin, 2-iP. Khi sử dụng ở nồng độ cao, các chất này
kích thích sự hình thành chồi và ức chế tạo rễ [36], [48]. Kinetin được Skoog phát
hiện ngẫu nhiên trong chiết xuất axit nucleic. Kinetin thực chất là một dẫn xuất của
bazơ nitơ adenine. BAP là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh
hơn kinetin. Kinetin và BAP cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài
thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự hoá già của tế bào.
Ngồi ra các chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp
ADN, tổng hợp protein và làm tăng cường hoạt tính của một số enzim. Những
nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy khơng phải các chất kích thích
sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với hoocmon sinh trưởng nội sinh. Phân
chia tế bào, phân hoá và biệt hoá được điều kiển bằng sự tác động tương hỗ giữa các
hoocmon ngoại sinh và nội sinh. Tác động phối hợp của auxin và cytokinin có tác
động quyết định đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và mơ. Tỉ lệ
auxin và cytokinin trong mơi trường nó quyết định đến sự phát sinh hình thái, nếu tỉ
lệ auxin/cytokinin cao sẽ dẫn đến việc tạo phôi, tạo callus và hình thành rễ, nếu
ngược lại tỉ lệ cytokinin/auxin cao dẫn đến sinh sản chồi và chồi nách. Das (1958)
và Nitsch (1968) khẳng định rằng chỉ khi tác dụng đồng thời của auxin và cytokinin
thì mới kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp DNA, dẫn đến quá trình cảm ứng cho sự
phân chia tế bào [36], [48].