Nghiên cứu tạo dòng callus cây đinh lăng (polyscias fruticosa (l ) harms)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MƠI TRƯỜNG

VÕ THỊ NHƯ LỤA

NGHIÊN CỨU TẠO DỊNG CALLUS CÂY ĐINH
LĂNG (POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÀ NẴNG - Năm 2016


J

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MƠI TRƯỜNG

VÕ THỊ NHƯ LỤA

NGHIÊN CỨU TẠO DỊNG CALLUS CÂY ĐINH
LĂNG (POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS)

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn: ThS. TRẦN QUANG DẦN

Niên khóa: 2012 - 2016

LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai cơng bố
trong bất kì cơng trình nào khác.
Tác giả

Võ Thị Như Lụa


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp tại Khoa Sinh – Môi trường,
trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng, tôi đã học hỏi được rất nhiều kiến thức
lý thuyết cũng như thực hành thí nghiệm về ni cấy mơ tế bào thực vật, qua đó bản
thân tơi đã trưởng thành hơn trong nghiên cứu khoa học.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến ThS. Trần Quang Dần người thầy đã tận
tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi trong suốt q trình tôi thực hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS. Bùi Thị Thơ những người đã giúp
đỡ tôi rất nhiều trong việc làm quen và phát triển kĩ năng thực hành thí nghiệm trong
q trình tơi thực hiện đề tài khố luận của mình.
Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các nhóm nghiên cứu, đã luôn giúp đỡ và chia
sẻ kinh nghiệm trong thời gian tơi thực hiện khóa luận.
Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đối với gia đình, bạn bè đã ln động viên,
khích lệ tơi cả về vật chất lẫn tinh thần để tơi có thể đạt được kết quả tốt nhất.

Đà Nẵng, tháng 4 năm 2016
Sinh viên thực hiện

Võ Thị Như Lụa

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
1.Tính cấp thiết đề tài .................................................................................................. 1
2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu ............................................................................ 2
2.1. Mục tiêu nghiên cứu............................................................................................. 2
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................ 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn................................................................................. 2
3.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................................. 2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn .................................................................................................. 3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................. 4
1.1. Giới thiệu về cây Đinh lăng ................................................................................. 4
1.1.1. Phân loại ............................................................................................................ 4
1.1.2. Mô tả ................................................................................................................. 4
1.1.3. Nguồn gốc-phân bố ........................................................................................... 4
1.1.4. Hợp chất tự nhiên trong cây Đinh lăng ((Polyscias fruiticosa (L.) Harms) ..... 5
1.1.5. Tác dụng dược lý - Công dụng.......................................................................... 5
1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu về cây Đinh lăng .............................................. 7
1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới ............................................................................. 7
1.2.2. Các nghiên cứu trong nước ............................................................................... 8
1.3. Callus .................................................................................................................. 10
1.3.1. Khái niệm ........................................................................................................ 10
1.3.2. Đặc điểm của callus ........................................................................................ 11
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành callus trong nuôi cấy mô thực vật . 11
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................... 14
2.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................... 14
2.2. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 14
2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với KIN lên khả năng cảm ứng callus
của lá in vitro ............................................................................................................. 14

2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D lên khả năng cảm ứng callus của thân in
vitro ........................................................................................................................... 15
2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA lên khả năng cảm ứng callus
của thân in vitro ......................................................................................................... 15
2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D lên khả năng cảm ứng callus của rễ in vitro .. 15
2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA lên khả năng cảm ứng callus
của rễ in vitro ............................................................................................................ 15
2.2.6. Bố trí thí nghiệm và xử lí số liệu..................................................................... 15
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ........................................................... 16
3.1. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với KIN lên khả năng cảm ứng callus
của lá in vitro ............................................................................................................. 16
3.2. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D lên khả năng cảm ứng callus của đoạn thân in
vitro ........................................................................................................................... 18
3.3. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA lên khả năng cảm ứng callus
của thân in vitro ......................................................................................................... 19
3.4. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D lên khả năng cảm ứng callus của rễ in vitro ..... 20
3.5. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA lên khả năng cảm ứng callus
của rễ in vitro ............................................................................................................ 22
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 24
1. Kết luận ................................................................................................................. 24
2. Đề nghị .................................................................................................................. 24
PHỤ LỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................... 29


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

2,4-D

: Diclorophenoxyacetic acid

BA

: 6 - benzyl adenine

BAP

: 6 - benzyl amino purine

ĐHST

: Điều hòa sinh trưởng

IAA

: Indole-3-acetic acid

IBA

: Indole 3 - butyric acid

KIN

: Kinetin

MS

: Murashige và Skoog (1962)

NAA

: α-naphthalen acetic acid

SH

: Schenk và Hildebrandt (1972)

TDZ

: Thidiazuron

Cs

: Cộng sự


DANH MỤC BẢNG
Tên bảng

Bảng

Trang

Bảng kết quả ảnh hưởng của nồng độ 2,4D và KIN lên khả
3.1

năng tạo callus của lá cây Đinh lăng in vitro sau 30 ngày

16

nuôi cấy
Bảng kết quả ảnh hưởng của nồng độ 2,4D lên khả năng
3.2

tạo callus của thân cây Đinh lăng in vitro sau 30 ngày nuôi

19

cấy
3.3

Bảng kết quả ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D. lên khả năng
tạo callus của rễ cây Đinh lăng in vitro sau 30 ngày nuôi

21

cấy
3.4

Bảng kết quả ảnh hưởng của nồng độ 2,4D và BA lên khả
năng tạo callus của rễ cây Đinh lăng in vitro sau 30 ngày
nuôi cấy.

22


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình

Tên hình

Trang

1.1

Cây Đinh lăng ngồi tư nhiên.

4

2.1

Cây Đinh lăng in vitro

14

Ảnh hưởng của 2,4-D và KIN lên sự tạo callus từ lá Đinh
3.1

lăng in vitro : (A) MS + 0,5 mg/L 2,4-D + 2 mg/L KIN ; (B)

17

MS + 2 mg/L 2,4-D +1 mg/L KIN.
3.2

3.3

3.4

3.5

Callus tạo từ đoạn thân cây Đinh lăng in vitro trong môi
trường MS + 1,5 mg/L 2,4-D sau 30 ngày nuôi cấy.
Callus tạo từ thân cây Đinh lăng in vitro trong môi trường
MS + 1,5 mg/L 2,4-D + 1,5 mg/L BA sau 30 ngày nuôi cấy.
Callus tạo từ rễ cây Đinh lăng in vitro trong môi trường MS
+ 1,5 mg/L 2,4-D sau 30 ngày nuôi cấy.
Callus tạo từ rễ cây Đinh lăng in vitro trong môi trường MS+
0,5 mg/L 2,4-D + 0,5 mg/L BA sau 30 ngày nuôi cấy.

19

20

21

22


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết đề tài
Sử dụng thảo dược làm thuốc để chữa bệnh và chăm sóc sức khỏe đang được
ưa chuộng trên thế giới. Việc khai thác nguồn dược liệu tự nhiên từ thực vật đang trở
thành một vấn đề quan trọng mang tính tồn cầu và chúng ngày càng được thương
mại hóa nhiều hơn. Tuy nhiên, vấn đề được đặt ra hiện nay là nơi sống tự nhiên của
các cây thuốc đang bị biến mất nhanh chóng do nhiều yếu tố như: sự biến đổi khí hậu
tồn cầu, sự khai thác bừa bãi của con người…Vì vậy việc trồng theo phương pháp

truyền thống để tổng hợp các hợp chất hóa học sẽ có nhiều hạn chế và khó có thể đáp
ứng đủ nhu cầu dược liệu ngày càng tăng trong tương lai [39]. Công nghệ nuôi cấy
huyền phù tế bào thực vật được xem là con đường hữu hiệu để sản xuất các hợp chất
thứ cấp phục vụ cho công nghiệp dược phẩm. Ưu điểm của nuôi cấy huyền phù tế
bào thực vật là sản xuất lượng sinh khối lớn trong thời gian ngắn, tạo nguồn nguyên
liệu ổn định phục vụ chiết tách các hoạt chất sinh học trên quy mơ cơng nghiệp, góp
phần giải quyết những khó khăn về nguồn dược liệu tự nhiên [7].
Callus là một khối tế bào khơng có tổ chức, hình thành từ các mơ hoặc cơ quan
đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt như vết thương, xử lý với các chất điều hòa
sinh trưởng thực vật [20]. Theo Nguyễn Đức Thành (2000), nuôi cấy callus là một
khâu quan trọng trong nuôi cấy tế bào. Callus được xem là nguyên liệu lý tưởng khởi
đầu cho các nghiên cứu quan trọng như: phân hóa mơ và tế bào, chọn dịng tế bào,
protoplast, sản xuất các chất hoạt tính sinh học,…[24].
Cây Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms) thuộc họ Ngũ Bì
Araliaceae [4], là cây thuốc được sử dụng nhiều trong y học dân gian Việt Nam và
Trung Quốc. Cây Đinh lăng có nhiều tác dụng dược lí giống Nhân sâm, đặc biệt dược
liệu từ cây Đinh lăng có tác dụng tăng cường thể lực, tăng sức đề kháng và tăng khả
năng thích nghi. Chúng được dùng cả lá thân và rễ, lá dùng để ăn sống, làm gỏi, rễ
được dùng để ngâm rượu làm thuốc. Theo các kết quả nghiên cứu gần đây, trong cây
Đinh lăng có hai hợp chất chính quan trọng là polyacetylen và saponin, các hợp chất
này có nhiều ở rễ và lá. Hợp chất saponin, đặc biệt là triterpen, có tác dụng ức chế tạo
thành malonyl dialdehyde trong q trình peroxy hóa lipid màng tế bào, tích cực


2

chống oxy hóa chống stress và các triệu chứng trầm cảm [11,10]. Tuy nhiên, nhóm
chất saponin tự nhiên trong cây Đinh lăng khá hạn chế, không đủ đáp ứng nhu cầu về
dược liệu. Vì vậy, để thu nhận một lượng lớn hợp chất này mà không phụ thuộc vào
nguồn thực vật trồng trong tự nhiên, các nhà khoa học đang nổ lực nghiên cứu quy

trình sản xuất bằng con đường nuôi cấy hu yền phù tế bào. Phạm Văn Lộc và cs
nghiên cứu tạo rễ bất định cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) bằng
phương pháp nuôi cấy in vitro (nuôi cấy rễ và callus)[18]. Năm 2007, Phạm Thị Tố
Liên và cs đã bước đầu nghiên cứu sự tạo dịch treo tế bào cây Đinh lăng với một số
yếu tố ảnh hưởng [13]. Kết quả nghiên cứu cho thấy các dòng tế bào callus phát sinh
vẫn chưa phải là dòng callus cố định cho nuôi cấy huyền phù.
Xuất phát từ những cở sở trên chúng tôi đã lựa chọn và thực hiện đề tài
“Nghiên cứu tạo dòng callus cây đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms)”.
2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
Tìm được nồng độ thích hợp các chất ĐHST cho quá trình tạo callus của lá,
thân và rễ cây Đinh lăng in vitro.
2.2. Nội dung nghiên cứu
Để đạt được mục tiêu nghiên cứu, đề tài thực hiện các nội dung sau đây:
-

Khảo sát ảnh hưởng nồng độ 2,4-D và KIN lên quá trình tạo callus của lá

Đinh lăng in vitro.
-

Khảo sát ảnh hưởng nồng độ 2,4-D và BA lên quá trình tạo callus của thân

Đinh lăng in vitro.
-

Khảo sát ảnh hưởng nồng độ 2,4-D và BA lên quá trình tạo callus của rễ

Đinh lăng in vitro.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học về quá trình
phát sinh callus ở cây đinh lăng.


3

3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Cơ sở nghiên cứu sản xuất các hoạt chất sinh học có giá trị cao từ nuôi cấy tế
bào thực vật.


4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây Đinh lăng
1.1.1. Phân loại
Họ:

Araliaceae

Giống :

Polyscias

Lồi:

Polyscias fruiticosa (L.) Harm

Tên thơng thường : Đinh lăng lá nhỏ, cây Gỏi cá, Nam dương lâm

Hình 1.1. Cây Đinh lăng ngồi tư nhiên.
1.1.2. Mơ tả
Cây Đinh lăng (Polyscias fruiticosa (L.) Harms) là cây ưa bụi cao 0,5 - 2
m, thân khơng có lơng,rễ có thể phù như củ,lá có mùi thơm, hoa nhỏ 5 cánh , trái trịn
hơi dẹp có màu trắng bạc [7].
1.1.3. Nguồn gốc-phân bố
Cây Đinh lăng có nguồn gốc từ vùng đảo Polynesie ( Thái Bình Dương)
thuộc họ Araliaceae, chi Polyscias Forst.f. Chi này có gần 100 lồi trên thế giới phân
bố rải rác ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới nhiều nhất là vùng đảo Thái Bình


5

Dương[1]. Ở Việt Nam, hiện có hơn 10 lồi Đinh lăng [7]. Đa số Đinh lăng hiện nay
trồng làm cảnh, chỉ có vài loại được dùng làm thuốc, lồi Đinh lăng được sử dụng
làm thuốc phổ biến nhất là polyscias fruiticosa (L.) Harm. Đây là loại có nhiều tác
dụng dược lý giống nhân sâm [1].
1.1.4. Hợp chất tự nhiên trong cây Đinh lăng (polyscias fruiticosa (L.) Harm)
Cây Đinh lăng chứa saponin, alkaloid, vitamin B1, B2, B6, C, 20 acid amin,
glycosid, alkaloid, phytosterol, tanin, acid hữu cơ, tinh dầu, nhiều nguyên tố vi lượng,
21,10% đường. Vỏ rễ và lá chứa saponin [1].
Lá Đinh lăng chứa saponin triterpen chiếm 1,65%, saponin trong lá là một
genin dạng acid oleanoic, đây là hợp chất thứ cấp có tác dụng dược liệu.
Trung tâm Sâm và Dược liệu Thành phố Hồ Chí Minh đá phân lập được 5 chất
polyacetylen từ lá Đinh lăng là: panaxynol, panoxydol,Heptadecan-1,8(E)-dien4,6diyn-3,10diol, Heptadecan-1,8(E)-dien-4,6diyn-3ol-10on và Heptadecan-1,8(Z)dien-4,6diyn-3ol-10on[1].
Trong rễ Đinh lăng mới chỉ tìm thấy 5 hợp chất polyacetylen, trong đó
panaxynol, panoxydol, Heptadecan-1,8(E)-dien-4,6diyn-3,10diol là 3 hợp chất giống
lá. Các hợp chất này có tác dụng kháng khuẩn mạnh và chống một số dạng ung thư
[1].

1.1.5. Tác dụng dược lý - Công dụng
Cây Đinh lăng người ta có thể dùng hầu hết các bộ phận của chúng để ăn hoặc
làm thuốc. Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là rễ (lấy ở những cây trồng từ 3 năm trở
lên). Người ta thường đào lấy rễ cây Đinh lăng vào mùa thu hay mùa đơng vì lúc này
hoạt chất tập trung ở rễ. Rễ đào về đem rửa sạch đất cát, thái nhỏ rồi phơi, hay sấy
khô. Cũng có thể tẩm thêm rượu, gừng và sao cho thơm. Ngồi rễ ra, người ta cịn
dùng cả thân và lá Đinh lăng [1].
Theo các nhà dinh dưỡng, trong rễ Đinh lăng có chứa nhiều saponin có tác dụng
như nhân sâm, nhiều sinh tố B1, ngồi ra rễ cịn chứa khoảng 13 loại axit amin cần
thiết cho cơ thể, nhờ đó Đinh lăng cịn giúp tăng trí nhớ, giúp cho cơ thể có sức đề
kháng tốt.


6

Theo Đơng y, rễ Đinh lăng có vị ngọt, hơi đắng, tính mát có tác dụng thơng
huyết mạch, bồi bổ khí huyết, lá có vị đắng, tính mát có tác dụng giải độc thức ăn,
chống dị ứng, chữa ho ra máu, kiết lỵ. Nói chung, ngồi tác dụng lương huyết và giải
độc thức ăn, những tính chất khác của Đinh lăng gần giống như nhân sâm có chức
năng chống mệt mỏi và làm tăng sức dẻo dai của cơ thể. Liều dùng trung bình là 0,250,50g một lần, ngày uống 2-3 lần, dùng dưới dạng thuốc bột (sao thơm, tán nhỏ, rây
bột mịn), thuốc viên, hoặc ngâm rượu [11].
Dưới đây là một số bài thuốc có cây Đinh lăng theo các thầy thuốc:
- Ho suyễn lâu năm: Rễ Đinh lăng, bách bộ, đậu săn, rễ cây dâu, nghệ vàng, rau
tần dày lá tất cả đều 8g, củ xương bồ 6g; gừng khơ 4g, đổ 600 ml sắc cịn 250 ml.
Chia làm 2 lần uống trong ngày. Uống lúc thuốc còn nóng.
- Chữa nổi mề đay, mẩn ngứa do dị ứng: Lá Đinh lăng khơ 80g, đổ 500 ml nước
sắc cịn 250 ml. Chia làm 2 lần uống trong ngày.
- Phong thấp, thấp khớp: Rễ Đinh lăng 12g; cối xay, hà thủ ô, huyết rồng, cỏ rễ
xước, thiên niên kiện tất cả 8g; vỏ quýt, quế chi 4g (quế chi bỏ vào sau cùng). Đổ 600
ml nước sắc còn 250 ml. Chia làm 2 lần uống trong ngày. ống khi thuốc cịn nóng.

- Bồi bổ cơ thể, ngừa dị ứng: Lá Đinh lăng tươi từ 150-200g, nấu sôi khoảng
200 ml nước. Cho tất cả lá Đinh lăng vào nồi, đậy nắp lại, sau vài phút, mở nắp và
đảo qua đảo lại vài lần. Sau 5- 7 phút, chắt ra để uống nước đầu tiên, đổ tiếp thêm
khoảng 200 ml nước vào để nấu sôi lại nước thứ hai để uống.
- Chống bệnh co giật hoặc trằn trọc vào ban đêm cho trẻ mới sinh, người ta lấy
lá Đinh lăng phơi khô đem bỏ vào gối cho trẻ nằm.
- Chữa tắc tia sữa: Rễ Đinh lăng 40g, gừng tươi 3 lát, đổ 500 ml nước sắc còn
250 ml. Chia làm 2 ần uống trong ngày. Uống khi thuốc cịn nóng.
Tuy nhiên, do thành phần saponin có nhiều trong rễ Đinh lăng, chất nàycó tính
phá huyết sẽ làm vỡ hồng cầu, vì vậy chỉ dùng khi cần thiết và phải dùng đúng liều
lượng mới có tác dụng.
Đây là các bài thuốc có cây Đinh lăng trong những bài thuốc Đông, Nam y và
những bài báo về thuốc. Chưa có bài báo cáo dẫn chứng cụ thể nói về tác dụng của
Đinh lăng.


7

Đinh lăng thuộc họ nhân sâm, chúng được sử dụng rất nhiều trong các bài thuốc
Đông y và Nam y và có những điểm tương đồng về hình dạng củ và các hợp chất gần
giống như nhân sâm. Những nghiên cứu về hóa học bằng diện di và sắc ký cho thấy
rễ cây Đinh lăng 3 năm tuổi chứa hàm lượng hoạt chất cao trong vỏ như gluxit,
saponin triterpenic, tanin. Thân và lá cũng chứa chúng nhưng hàm lượng thấp hơn.
Khi so sánh thành phần dịch chiết của Đinh lăng lá nhỏ và Nhân Sâm Triều Tiên,
người ta thấy dịch chiết rễ Đinh lăng lá nhỏ có 7 vết cịn Nhân sâm Triều Tiên có 12
vết, trong đó có 6 vết giống nhau. (BS Nguyễn Phước_CTQ số 02).
Rễ Đinh lăng (Polycias fruiticosa (L.) Harms) chứa saponin, alkaloid, vitamin
B1, B2, B6, C, 20 acid amin, glycosid, alkaloid, phytosterol, tanin, acid hữu cơ, tinh
dầu, nhiều nguyên tố vi lượng, 21,10% đường và 13 loại acid amin trong đó có lyzin,
xystein, methionin là những axit amin không thể thay thế được.[8]

Nhân sâm (Panax ginseng): thân rể và củ chứa 32 hợp chất soponin triterpen,
trong đó có 30 chất là saponin dammaran, là thành phần hoạt chất có tác dụng sinh
học chủ yếu của sâm. Hàm lượng saponin toàn phần rất cao đến 10,75% ở thân rể cây
mọc hoang. Cịn có 7 hợp chất polyacetylen, 17 acid béo trong đó có acid palnitic,
stearic, oleic, linoleic và linolenic, 17 acid amin trong đó có đủ 8 loại acid amin cần
thiết cho cơ thể, 20 nguyên tố di lượng trong đó có Fe, Mn, Co, Se, K. các thành phần
khác là glucid, tinh dầu. Trong thân rể tươi có daucosterol. (THDCANADA).
1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu về cây Đinh lăng
1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Năm 2008, A. Śliwińska, O. Olszowska, M. Furmanowa, and A. Nosov nghiên
cứu nhân nhanh chồi Polyscias filicifolia bằng phôi soma thứ cấp [36]. Trong nghiên
cứu này, đầu tiên, A. Śliwińska và cộng sự khảo sát tạo callus loại I trong mơi trường
MS có chứa 2,4D và BAP để tạo ra dịng callus có khả năng sinh phơi, sau đó chuyển
qua mơi trường nhân nhanh callus và thay chất kích thích sinh trường BAP bằng KIN,
tạo callus loại 2. Quan sát thấy có sự xuất hiện của tế bào tiền phơi, A. Śliwińska và
cộng sự tiếp tục nuôi cấy callus loại 2 trong mơi trường 1⁄2 MS và khơng có chất
kích thích sinh trưởng, phát sinh các cụm phơi sơ cấp. Nghiên cứu tiếp tục nuôi cấy


8

các cụm phôi sơ cấp trong môi trường 1⁄2 MS có lượng đường thấp để tạo ra các
phơi đơn (phơi thứ cấp) rời nhau để tái sinh chồi. Cuối cùng, tái sinh chồi từ phôi thứ
cấp trong môi trường Nitsch and Nitsch có bổ sung KIN và IAA cùng với adenine
sulfate. Chồi in vitro được tạo ra từ phơi có tỉ lệ nhân chồi cao hơn, tỉ lệ sống 90%.
Năm 2008, Salwa S. Sakr, Saad S. Melad, M. A. El-Shamy and Asmaa E. Abd
Elhafez nghiên cứu nhân nhanh cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harm) bằng
chồi, callus phát sinh cơ quan [38]. Trong nghiên cứu này, Salwa S. Sakr và cộng sự
đã sử dụng nguyên liệu nhân nhanh là chồi đỉnh được khử trùng trong sodium
hypochlorite. Mẫu sau khi khử trùng sẽ được cấy vào môi trường MS khảo sát có BA,

KIN với nhiều nồng độ khác nhau. Đưa ra kết quả môi trường nhân nhanh chồi tốt
nhất ở nồng độ 5 mg/L BA kết hợp 2 mg/L KIN. Sau giai đoạn nhân nhanh, chồi được
chuyển sang môi trường khảo sát cho ra rễ MS có mặt IAA và NAA. Kết quả cho
thấy ở nồng độ NAA 1 mg/L, tỉ lệ ra rễ tốt nhất, rễ khỏe, dài. Kết thúc quy trình nhân
nhanh, với nhiều cơng thức giá thể, nghiên cứu kết luận công thức tỉ lệ 1 cát: 1 bột
nhẹ giúp cây có tỉ lệ sống cao, lá nhiều.
Năm 2013, Saiqa Ilyas, Shagufta Naz, Sumeera Javad, Kiran Shehzadi, Amna
Tariq, Neelma Munir and Aamir Ali nghiên cứu sự ảnh hưởng của cytokinins, đường
và pH lên sự tái sinh cây Polyscias balfouriana [37]. Saiqa Ilyas và cộng sự đã khảo
sát sự ảnh hưởng đơn lẻ của các cytokinin như BAP, TDZ, KIN ở các nồng độ 0,2
mg/L đến 1,6 mg/L cũng như ảnh hưởng khi kết hợp các cytokinin này với IBA ở các
nồng độ 0,1 mg/L, 0.5 mg/L, 1 mg/L, 1,5 mg/L và 2 mg/L lên sự tái sinh cây Polyscias
balfouriana. Bên cạnh đó, sự ảnh hưởng của nồng độ đường (1% đến 5%), pH (5 đến
6,6) lên sự tái sinh và nhân nhanh chồi cũng được khảo sát. Kết quả nghiên cứu cho
thấy ở nồng độ BAP 1,2 mg/L kết hợp 0,5 mg/L IBA, nồng độ đường 3%, pH 5,8 cho
kết quả nhân nhanh chồi tốt nhất. Nồng độ IBA 3 mg/L với nồng độ đường và pH
tương tự cũng cho tỉ lệ ra rễ tốt nhất.
1.2.2. Các nghiên cứu trong nước
Năm 2005, Lê Thiên Thư, Võ Thị Bạch Mai nghiên cứu sự phát sinh hình thái
trong ni cấy in vitro cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) thông qua sự
phát triển phôi soma [28]. Trong nghiên cứu, Lê Thiên Thư và Võ Thị Bạch Mai đã


9

nghiên cứu sự phát sinh phôi soma cây Đinh lăng sau khi chuyển mô sẹo 14 tuần tuổi
(mô sẹo được tạo ra từ mẫu lá nuôi cấy trong môi trường MS có 2 mg/L 2,4D), trong
mơi trường MS có chứa 1 mg/L NAA.
Năm 2007, Phạm Thị Tố Liên, Võ Thị Bạch Mai bước đầu nghiên cứu sự tạo
dịch treo tế bào cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) [13]. Lá Đinh lăng in

vitro được ni cấy trong mơi trường có mặt 2 mg/L 2,4D để tạo mô sẹo. Mô sẹo 14
tuần tuổi được chuyển sang mơi trường MS lỏng có bổ sung 2,4D 1 mg/L và 20%
nước dừa, sau 8 tuần thu được dịch treo tế bào. Sự tăng trưởng của dịch treo tế bào
tốt và tạo được rễ khi trong mơi trường ni cấy có sự hiện diện của 1mg/L 2,4-D kết
hợp với BA 2,0 mg/L, 20% nước dừa và saccharose 30g/l.
Năm 2013, Hà Bích Hồng, Vũ Thị Thơm, Vũ Đức Lợi, Lê Anh Tuấn, Nguyễn
Thanh Hải nghiên cứu bước đầu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Đinh
lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms) [5]. Nghiên cứu đã bước đầu xây dựng
được quy trình nhân giống cây Đinh lăng lá nhỏ bằng phương pháp nuôi cấy mô - tế
bào. Sử dụng nguồn vật liệu ban đầu là chồi đỉnh, qua quá trình khử trùng, sau 2 tuần
cho tỷ lệ mẫu sạch tái sinh cao nhất là 73,33%. Các mẫu sạch được tái sinh tốt nhất
và nhanh nhất trên mơi trường MS có bổ sung BAP 2 mg/L và IBA 0,5 mg/L. Trong
môi trường tạo đa chồi (tăng các chất khống đa lượng trong mơi trường MS lên 1,5
lần và bổ sung 2 mg/L BAP), 100% mẫu cấy tạo đa chồi và số chồi trung bình đạt
7,13 chồi/ mẫu, chất lượng chồi tốt sau 6 tuần nuôi cấy.
Năm 2014, Phạm Văn Lộc, Nguyễn Thành Luân, Lương Thùy Ngân, Võ Thị
Xuân An, nghiên cứu tạo rễ bất định cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms)
bằng phương pháp nuôi cấy in vitro (nuôi cấy rễ và callus) [18]. Trong nghiên cứu
này, mẫu lá cây Đinh lăng được cấy vào mơi trường MS có bổ sung 2,4D để cảm ứng
tạo mô sẹo. Mô sẹo được cấy chuyền sang môi trường MS có bổ sung các chất điều
hịa tăng trưởng thực vật để cảm ứng tạo rễ. Kết quả cho thấy, bổ sung 2,4D 2,0 mg/L
cho tỷ lệ tạo sẹo 100%. Bổ sung NAA 0,1 mg/L và IBA 1.0 mg/L cho tỉ lệ tạo rễ cao
và số lượng rễ tạo ra nhiều.
Năm 2015, Nguyễn Trung Hậu, Lê Thị Như Thảo, Trần Văn Minh nghiên cứu
sự tích lũy saponin từ các mơ lá Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) được nuôi


10

cấy in vitro [34]. Nghiên cứu sử dụng nguyên liệu lá Đinh lăng một năm tuổi được

khử trùng trong javel thương mại (đã làm loãng 50%). Sau khử trùng, mẫu lá được
cấy vào mơi trường MS có mặt NAA và IAA đơn lẻ. Kết quả nghiên cứu cho thấy rễ
tơ phát sinh từ lá mạnh nhất trong môi trường MS có mặt 0,5 mg/L NAA. Từ đó đánh
giá khả năng tích lũy saponin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC),
thu nhận axit oleanolic 40,1 µg/g và saponin 396,2 µg/g tích lũy.
Năm 2015, Đỗ Tiến Vinh, Mai Thi Phương Hoa, Lê Thị Như Thảo, Nguyễn
Hòang Trang Nha, Trần Văn Minh nghiên cứu sản xuất saponin bằng kĩ thuật nuôi
cấy tế bào cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) [33]. Nghiên cứu tạo mô
sẹo từ lá Đinh lăng in vitro được ni cấy trong mơi trường MS có mặt 2 mg/L 2,4D,
1 mg/L kinetin, 3% sucrose, cho tỷ lệ tạo mơ sẹo 94,63%. Chuyển mơ sẹo đã có vào
mơi trường MS có bổ sung 1 mg/L 2,4D, 0,5 mg/L kinetin, 3% sucrose, nước dừa
10% để tăng sinh mô sẹo với tỉ lệ 19,83. Các tế bào mô sẹo là khối mô trắng, mềm
với tốc độ tăng trưởng cao. Bổ sung dịch nấm men, chitosan, casein thủy phân một
cách riêng biệt để tăng sinh khối và hàm lượng hoạt chất trong các tế bào mô sẹo đã
nuôi cấy. Kết quả cho thấy khi sử dụng nấm men, hàm lượng các chất tích lũy thu
được là cao nhất: saponin 3480,2 µg/g.
1.3. Callus
1.3.1. Khái niệm
Callus là một khối tế bào khơng có tổ chức, hình thành từ các mơ hoặc cơ quan
đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt như vết thương, xử lý với các chất điều hòa
sinh trưởng thực vật…[20].
Xét về mặt cấu trúc thì callus là một khối vơ định hình của các tế bào nhu mơ
có vách mỏng, được sắp xếp lỏng lẻo. Còn xét về mặt chức năng thì callus là những
tế bào khơng phân hóa [24]. Theo Nguyễn Đức Thành (2000), nuôi cấy callus là một
khâu quan trọng trong nuôi cấy tế bào. Callus là nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên
cứu quan trọng như: phân hóa mơ và tế bào, chọn dịng tế bào, protoplast, sản xuất
các chất hoạt tính sinh học,…[24]. Theo Vũ Văn Vụ (1999) việc nuôi cấy callus được
ứng dụng trong nhiều trường hợp [32] :

11

- Nhân giống in vitro ở những loài thực vật mà phương pháp nhân giống bằng nuôi
cấy đỉnh sinh trưởng ít có hiệu quả hoặc khơng thực hiện.
- Làm ngun liệu cho nuôi cấy tế bào đơn, thu nhận các chất có hoạt tính sinh học…
- Ngun liệu cho chọn dòng tế bào: đột biến, chọn dòng chịu mặn, chịu phèn…
- Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan.
1.3.2. Đặc điểm của callus
Kỹ thuật tạo callus được tiến hành lần đầu tiên vào cuối những năm 20 đến
đầu những năm 30 của thế kỷ 20 và là một trong những phương pháp đầu tiên của
kỹ thuật nuôi cấy mô trong nhiều năm. Đa số các mô và cơ quan của thực vật đều
có khả năng tạo callus dưới một tác động thích hợp nào đó.
Các tế bào thuộc mơ hoặc các cơ quan đã phân hóa của cây song tử diệp thường
phản phân hóa dưới tác động của auxin (riêng rẽ hay kết hợp với cytokinin) để cho
ra callus.
Theo Vũ Văn Vụ (1999) callus khi hình thành gồm hai loại [32] :
- Loại xốp: chứa nhiều tế bào xốp với nhân nhỏ, tế bào chất lỗng và khơng bào to.
- Loại cứng: các tế bào chắc, nhân to, tế bào chất đậm đặc và không bào nhỏ.
Callus thường được chuyển sang môi trường dinh dưỡng mới theo từng giai
đoạn. Nếu như cứ nuôi mãi không tách ra và cấy chuyền thì callus sẽ bị hoại tử và
chết. Callus có khả năng tạo phôi sẽ tăng trưởng chậm hơn callus không có khả năng
tạo phơi [20]. Mẫu cấy của vài lồi thực vật có thể hóa nâu hoặc đen, khi mẫu bị hóa
nâu thì sự tăng trưởng sẽ bị ức chế nếu để lâu ngày mẫu sẽ chết. Các mơ cịn non thì
ít bị hóa nâu hơn mơ già. Hiện tượng hóa nâu là do hoạt động của oxydase có nhân
đồng được tổng hợp và phóng thích tùy thuộc vào vết thương trong suốt quá trình
cắt và khử mẫu.
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành callus trong ni cấy mô thực
vật
 Ảnh hưởng của loại cơ quan tạo callus
Callus có thể được tạo ra từ nhiều loại cơ quan khác nhau của cơ thể thực vật.

Có thể sử dụng các mô hay cơ quan của thực vật để tạo callus như: rễ, thân, lá, chồi


12

hoa, túi phấn, phôi hợp tử chưa trưởng thành, phôi hợp tử trưởng thành, tượng tầng
libe gỗ…
Theo tác giả Hoàng Thị Kim Hồng (2011), “Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi
và cụm chồi trong nuôi cấy in vitro cây Hà Thủ Ô Đỏ (Polygoum Multiflorum
Thunb)”. Kết quả này cho thấy các đoạn thân tách từ chồi in vitro tạo callus tốt trên
mơi trường MS có bổ sung NAA 0,2 mg/L và BAP 4,0 mg/L hoặc NAA 0,3 mg/L
và BAP 5,0 mg/L [6].
Theo tác giả Nguyễn Trung Thành (2008), “Nghiên cứu nhân nhanh rễ bất
định nhân sâm (Panax ginseng C.A. Meyer: ảnh hưởng của một số nhân tố lý hoá
lên sự tăng trưởng sinh khối và sản phẩm trao đổi chất ginsenosides”. Kết quả sự
hình thành callus và tăng trưởng của rễ bất định cho thấy ở mơi trường MS có bổ
sung 2,4-D 2,0 mg/L là tối ưu cho sự hình thành callus. Cịn mơi trường MS nồng
độ IBA 2,0 mg/L + kinetin 0,1 mg/L và 3% đường là thích hợp cho sự tăng trưởng
rễ bất định [25].
Theo tác giả Nguyễn Thị Phương Thảo và cs (2010), “Nghiên cứu nhân nhanh
in vitro cây dưa hấu (Citrullus Lanatus)”. Kết quả nghiên cứu khả năng phát sinh
chồi bất định từ phần gần cuống lá mầm cho thấy mơi trường MS có bổ sung BA
1,5 mg/L có tỷ lệ tạo callus là 100% mẫu ngọn lá mầm [26].
 Ảnh hưởng tuổi của cơ quan trong sự tạo callus.
Những mảnh cơ quan trưởng thành luôn bao gồm các mô trưởng thành lẫn mô
luôn ở trạng thái phơi, ở cây trưởng thành, mơ phân sinh cịn lại rất ít và được duy
trì ở những vùng đặc biệt là các đỉnh sinh trưởng này nằm ở đầu ngọn thân, ngọn
cành, chót rễ, chồi nách nên những mảnh cơ quan trưởng thành khơng có khả năng
tạo callus. Ngược lại, cây còn non hay những mảnh thân còn rất non của cây trưởng
thành nhờ sự phân cắt và sự tăng dài của tế bào. Hai hoạt động này chịu ảnh hưởng

của nhiều hormon sinh trưởng khác nhau, đặc biệt là auxin, gibberellin và cytokinin
có thể hình thành callus trên mơi trường có chất điều hịa sinh trưởng thực vật, đặc
biệt là auxin.
Theo tác giả Nguyễn Thị Mỹ Duyên và Trương Thị Hằng (2014), “Nghiên cứu
khả năng tạo callus từ cuống lá, phiến lá và nụ hoa non phục vụ cho việc vi nhân


13

giống hoa Đồng tiền (Gerbera Jamesonii Bolus)”. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của
BA, NAA và 2.4-D đến sự tạo callus của cuống lá, phiến lá và nụ hoa non của hoa
Đồng tiền cho thấy ở mơi trừng MS có bổ sung 2,4-D 1,5 mg/L có tỷ lệ tạo callus
cao nhất đạt 83,3%, hình thái callus ở phiến lá là những khối có màu xanh tốt, nụ
hoa non các callus có màu trắng và khối chặt [2].
 Ảnh hưởng của ánh sáng trong sự hình thành callus
Theo Pierik (1987) trong suốt thời gian tạo callus tùy theo mẫu cấy mà ánh
sáng có thể cần hay khơng cần thiết. Đa số trường hợp, trong tối sự tạo callus diễn
ra tốt hơn ngoài sáng, đặc biệt với mẫu cấy là lá [35].
 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật.
Auxin có vai trị quan trọng trong sự tạo callus, trong môi trường nuôi cấy,
auxin thường gây ra sự tạo bướu ở các mơ và cơ quan, kích thích sự phân chia tế
bào (tạo callus), kích thích sự tạo rễ bất định, gây ra sự phát sinh phôi từ tế bào
soma, từ huyền phù tế bào (Pierik, 1987).
Đa số mẫu thực vật thuộc nhóm song tử diệp khơng có khả năng tạo callus
trong mơi trường chỉ có auxin mà cần phải có sự phối hợp của auxin và cytokinin.
Chẳng hạn như môi trường để tạo callus đối với cây thuốc lá là mơi trường MS có
chứa NAA 1 mg/L và BA 0,1 mg/L (Nguyễn Đức Thành, 2000) [24].
Callus khi hình thành nếu được tiếp tục duy trì trong mơi trường có auxin thì
sự tăng sinh của callus sẽ nhanh, nhưng nếu chuyển sang một mơi trường có đầy đủ
các thành phần dinh dưỡng nhưng khơng có sự hiện diện của auxin thì sự tăng sinh

của callus diễn ra rất chậm (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) [20].


14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
-

Cây Đinh lăng in vitro họ Araliaceae giống Polyscias loài Polyscias

fruiticosa (L.) Harms..
- Nguyên liệu nghiên cứu là lá, thân và rễ cây Đinh lăng in vitro 2 tháng tuổi
ni cấy tại phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học thực vật, hoa Sinh – Môi trường,
trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng.

Hình 2.1. Cây Đinh lăng in vitro
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với KIN lên khả năng cảm ứng
callus của lá in vitro
Các lá in vitro được băm 2 mặt cấy lên mơi trường MS có bổ sung 3% sucrose,
0,8% agar, pH = 5,85 và 2,4-D (nồng độ 2; 0,5 – 2,0 mg/L) kết hợp KIN (nồng độ 2;
0,2 – 1,0 mg/L). Khả năng tạo callus được đánh giá sau 30 ngày với các chỉ tiêu tỷ lệ
mẫu (%) tạo callus và hình thái callus lá.


15

2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D lên khả năng cảm ứng callus của thân in
vitro

Thân in vitro cắt thành các đoạn 0,2 cm được cấy lên môi trường MS cơ bản
bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, pH = 5,85 và 2,4-D (nồng độ 0,5 – 2,0 mg/L). Khả
năng tạo callus được đánh giá sau 30 ngày với các chỉ tiêu tỷ lệ mẫu (%) tạo callus
và hình thái callus đoạn thân.
2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA lên khả năng cảm ứng
callus của thân in vitro
Thân in vitro cắt thành các đoạn 0,2 cm được cấy lên môi trường MS 3%
sucrose, 0,8% agar, pH = 5,85 và 2,4-D (nồng độ 0,5-2,0 mg/L) kết hợp với BA (nồng
độ 0,5 – 2,0 mg/L). Khả năng tạo callus được đánh giá sau 30 ngày với các chỉ tiêu
tỷ lệ mẫu (%) tạo callus và hình thái callus đoạn thân.
2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D lên khả năng cảm ứng callus của rễ in vitro
Rễ in vitro cắt thành các đoạn 0,5 cm được cấy lên môi trường MS 3%
sucrose, 0,8% agar, pH = 5,85 và 2,4-D (nồng độ 0,5 – 2,0 mg/L). Khả năng tạo callus
được đánh giá sau 30 ngày với các chỉ tiêu tỷ lệ mẫu (%) tạo callus và hình thái callus
rễ.
2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA lên khả năng cảm ứng callus
của rễ in vitro
Rễ in vitro cắt thành các đoạn 0,5 cm được cấy lên môi trường MS 3% sucrose,
0,8% agar, pH = 5,85 và 2,4-D (nồng độ 0,5-2,0 mg/L) kết hợp với BA (nồng độ 0,5
– 2,0 mg/L). Khả năng tạo callus được đánh giá sau 30 ngày với các chỉ tiêu tỷ lệ mẫu
% tạo callus và hình thái callus rễ.
2.2.6. Bố trí thí nghiệm và xử lí số liệu.
Mỗi thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần. Số liệu thực nghiệm được xử lí thống
kê theo phương pháp Ducan (p<0,05) bằng phần mềm SPSS


16

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với KIN lên khả năng cảm ứng callus

của lá in vitro
Sau 30 ngày nghiên cứu, tiến hành xác định chỉ tiêu số mẫu tạo callus. Số
liệu được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Bảng kết quả ảnh hưởng của nồng độ 2,4D và KIN lên khả năng tạo
callus của lá cây Đinh lăng in vitro sau 30 ngày ni cấy.
Nồng độ 2,4-D

Nồng độ KIN

Tỷ lệ

Hình thái callus

( mg/L)

( mg/L )

mẫu (%)

2,0

0,2

24,44d

Vàng, cứng

2,0

0,4

47,78c

Vàng, cứng

2,0

0,6

55,55c

Vàng, cứng

2,0

0,8

66,67b

Vàng, cứng

2,0

1,0

86,67a

Vàng, cứng

0,5

2,0

91,11a

Trắng, mọng nước

1,0

2,0

44,44b

Trắng, mọng nước

1,5

2,0

27,78c

Trắng, mọng nước

2,0

2,0

7,00d

Trắng, mọng nước

Chú thích: Các chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống
kê của trung bình mẫu với p<0,05.
Qua khảo sát nghiên cứu thí nghiệm, chúng tôi thấy rằng: khi giữ nguyên
nồng độ 2,4-D là 2 mg/L và tăng nồng độ KIN từ 0,2 mg/L đến 1 mg/L thì thí nghiệm
đạt được tỉ lệ tạo callus tốt nhất là 86,67% ở nồng độ 2 mg/L 2,4-D kết hợp với 1
mg/L KIN, tỷ lệ thấp nhất là 24,44% ở nồng độ 2 mg/L 2,4-D kết hợp với 0,2 mg/L
KIN. Khi nồng độ KIN tăng từ 0,2 mg/L đến 1 mg/L thì tỉ lệ tạo callus của mẫu cũng
tăng theo, đạt mức 86,67% ở nồng độ 2 mg/L 2,4-D kết hợp với 1 mg/L KIN. Chứng
tỏ nồng độ KIN tăng lên sẽ ảnh hưởng đến tỉ lệ tạo callus của mẫu, giúp tỉ lệ mẫu tạo
callus tăng lên đáng kể.
Khi giữ nguyên nồng độ KIN 2 mg/L và tăng nồng độ 2,4-D từ 0,5 mg/L đến
2 mg/L thì tỉ lệ tạo callus cao nhất là 91,11% ở nồng độ 0,5 mg /L 2,4-D kết hợp với