Nghiên cứu sự phân bố và khả năng cố định đạm của vi khuẩn đất trong vùng rễ cỏ vetiver (vetiverria zizanioides l ) ở một số địa phương tại tỉnh quảng nam

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
v

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA SINH – MƠI TRƢỜNG

HỒNG THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ
VÀ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM CỦA VI
KHUẨN ĐẤT TRONG VÙNG RỄ CỎ VETIVER

(Vetiverria zizanioides L.) Ở MỘT SỐ
ĐỊA PHƢƠNG TẠI TỈNH QUẢNG NAM

Đà Nẵng – Năm 2015


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA SINH – MƠI TRƢỜNG

HỒNG THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ
VÀ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM CỦA VI
KHUẨN ĐẤT TRONG VÙNG RỄ CỎ VETIVER
(Vetiverria zizanioides L.) Ở MỘT SỐ
ĐỊA PHƢƠNG TẠI TỈNH QUẢNG NAM

Ngành: Sƣ phạm sinh học

Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Đỗ Thu Hà

Đà Nẵng – Năm 2015


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả trong khóa luận là trung thực, khách quan, nghiêm
túc và chưa từng được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác. Nếu có gì
sai sót, tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm.

Tác giả khóa luận

Hồng Thị Nhung


LỜI CẢM ƠN
Em xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô giáo hướng dẫn TS.
Đỗ Thu Hà đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm
quý báu trong quá trình thực hiện khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn thầy cơ khoa Sinh – Môi trường – Đại học Sư
Phạm – Đại học Đà Nẵng đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho em
trong 4 năm học.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ,
động viên em trong suốt thời gian làm khóa luận.
Xin chân thành cảm ơn!

Hồng Thị Nhung

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .....................................................................................................
LỜI CẢM ƠN ...........................................................................................................
MỤC LỤC .................................................................................................................
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .........................................................................
DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ .......................................................................
MỞ ĐẦU .................................................................. Error! Bookmark not defined.
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ........................ Error! Bookmark not defined.
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU: ................................ Error! Bookmark not defined.
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI: ............... Error! Bookmark not defined.
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................ Error! Bookmark not defined.
1.1. TỔNG QUAN VỀ VI SINH VẬT ĐẤT ........ Error! Bookmark not defined.
1.1.1. Sự phân bố của vi sinh vật trong đất và vai trò của vi sinh vật đất. Error!
Bookmark not defined.
1.1.2. Mối quan hệ giữa đất – vi sinh vật – cây trồng ..... Error! Bookmark not
defined.
1.2. QUÁ TRÌNH CỐ ĐỊNH NITƠ PHÂN TỬ VÀ VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM
............................................................................... Error! Bookmark not defined.
1.2.1. Sơ lƣợc về nitơ và vai trị của q trình cố định nitơ. .. Error! Bookmark
not defined.
1.2.2. Cơ chế của quá trình cố định nitơ phân tử ............ Error! Bookmark not
defined.
1.2.3. Vi khuẩn cố định nitơ sống tự do ............ Error! Bookmark not defined.
1.3. GIỚI THIỆU SƠ Ƣ C VỀ CỎ VETIVER . Error! Bookmark not defined.
1.3.1. Phân loại .................................................. Error! Bookmark not defined.
1.3.2. Đặc điểm sinh học ................................... Error! Bookmark not defined.
1.3.3. Đặc tính sinh thái .................................... Error! Bookmark not defined.
1.3.4. Vi khuẩn trong vùng rễ cỏ vetiver .......... Error! Bookmark not defined.

1.2.5. Lợi ích từ cỏ vetiver ................................ Error! Bookmark not defined.
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP ............ Error! Bookmark not
defined.


2.1. ĐỐI TƢ NG NGHIÊN CỨU ....................... Error! Bookmark not defined.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .......................... Error! Bookmark not defined.
2.3. ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU . Error! Bookmark
not defined.
2.3.1. Địa điểm nghiên cứu ............................... Error! Bookmark not defined.
2.3.2. Thời gian nghiên cứu .............................. Error! Bookmark not defined.
2.3.3. Phạm vi nghiên cứu ................................. Error! Bookmark not defined.
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. Error! Bookmark not defined.
2.4.1. Phƣơng pháp thu mẫu ngoài thực địa...... Error! Bookmark not defined.
2.4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu trong phịng thí nghiệm Error! Bookmark not
defined.
2.4.3. Phƣơng pháp xử lí số liệu ....................... Error! Bookmark not defined.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ........... Error! Bookmark not defined.
3.1. SỰ PHÂN BỐ CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN TRONG ĐẤT CĨ TRỒNG
VÀ KHƠNG TRỒNG CỎ VETIVER Ở MỘT SỐ ĐỊA PHƢƠNG TẠI TỈNH
QUẢNG NAM ...................................................... Error! Bookmark not defined.
3.1.1. Sự phân bố của các chủng vi khuẩn trong đất không trồng cỏ vetiver tại
tỉnh Quảng Nam ................................................ Error! Bookmark not defined.
3.1.2. Sự phân bố của các chủng vi khuẩn trong đất trồng cỏ vetiver ở một số
địa phƣơng tại tỉnh Quảng Nam ........................ Error! Bookmark not defined.
3.2. SỐ Ƣ NG VI KHUẨN TRONG ĐẤT TRỒNG CỎ VETIVER Ở CÁC
KHOẢNG CÁCH GẦN RỄ VÀ XA RỄ CỎ VETIVER TẠI CÁC KHU VỰC
NGHIÊN CỨU CỦA TỈNH QUẢNG NAM ........ Error! Bookmark not defined.
3.3. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN AZOTOBACTER CÓ KHẢ
NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM TRONG ĐẤT TRỒNG CỎ VETIVER TẠI TỈNH

QUẢNG NAM ...................................................... Error! Bookmark not defined.
3.3.1. Sơ tuyển các chủng vi khuẩn Azotobacter có khả năng cố định đạm ..... Error!
Bookmark not defined.
3.3.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Azotobacter có khả năng cố định đạm
........................................................................... Error! Bookmark not defined.
3.3.3. Đặc điểm ni cấy và hình thái của chủng vi khuẩn VKN1 và VKN3
tuyển chọn ......................................................... Error! Bookmark not defined.


KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................ Error! Bookmark not defined.
1. KẾT LUẬN ....................................................... Error! Bookmark not defined.
2. KIẾN NGHỊ ...................................................... Error! Bookmark not defined.
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ............... Error! Bookmark not defined.
PHỤ LỤC……………………………………………………………………………

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
CFU

: Colony Foming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc)

cs

: Cộng sự

MT

: Môi trƣờng

KL

: Khuẩn lạc

Gđ

: gam đất

NXB

: Nhà xuất ản

QN

: Quảng Nam

TB

: Tế bào

TS

: Tổng số

VK

: Vi khuẩn

VKHK

: Vi khuẩn hiếu khí

VSV

: Vi sinh vật


DANH MỤC CÁC BẢNG

Số hiệu
bảng

Tên bảng

Trang

3.1

Số lƣợng vi khuẩn trong đất không trồng cỏ vetiver tại
tỉnh QN (tháng 5/2014)

21

3.2

Số lƣợng vi khuẩn trong đất không trồng cỏ vetiver tại
tỉnh QN (tháng 10/2014)

22

3.3

Số lƣợng vi khuẩn trong đất trồng cỏ vetiver tại tỉnh QN
(tháng 5/2014)

25

3.4

Số lƣợng vi khuẩn trong đất trồng cỏ vetiver tại tỉnh QN
(tháng 10/2014)

26

3.5

So sánh số lƣợng các chủng vi khuẩn trong đất trồng và
không trồng cỏ vetiver ở tỉnh QN

29

3.6

Số lƣợng vi khuẩn trong đất trồng cỏ vetiver ở các
khoảng cách gần rễ và xa rễ cỏ vetiver tại một số địa
phƣơng của tỉnh QN

33

3.7

Số lƣợng các chủng vi khuẩn Azotobacter có khả năng

cố định đạm trong đất trồng và không trồng cỏ vetiver ở
một số địa phƣơng tại tỉnh QN

35

3.8

Hàm lƣợng NH4+ trong dịch nuôi cấy của các chủng vi

36


khuẩn Azotobacter phân lập đƣợc từ mẫu đất trồng cỏ
vetiver tại tỉnh Quảng Nam
3.9

Tỉ lệ chủng VK Azotobacter có hoạt tính cố định đạm (%)

37

3.10

Đặc điểm ni cấy và hình thái của các chủng vi khuẩn
VKN1 và VKN3 tuyển chọn

40


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Số hiệu

Tên hình vẽ

hình vẽ
3.1

3.2

3.3

3.4

3.5

3.6

Một số chủng vi khuẩn phân lập từ đất trồng cỏ vetiver ở
một số địa phƣơng tại tỉnh QN
Một số chủng vi khuẩn phân lập từ đất không trồng cỏ
vetiver ở một số địa phƣơng tại tỉnh QN
Hình ảnh khuẩn lạc một số chi vi khuẩn hay gặp trong đất
trồng cỏ vetiver ở một số địa phƣơng tại tỉnh QN
Tỉ lệ chủng vi khuẩn Azotobacter có hoạt tính cố định
đạm (%)
Hình ảnh phản ứng màu của 19 chủng VK sơ tuyển với
thuốc thử Nessler
H nh ảnh 19 chủng VK Azotobacter đƣợc phân lập từ đất
trồng cỏ vetiver tại tỉnh QN

Trang

30

31

32

37

38

39

3.7

Hình ảnh ống giống và khuẩn lạc chủng VKN1

41

3.8

Hình ảnh ống giống và khuẩn lạc chủng VKN3

41


1

MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Đất là nguồn tài nguyên vô cùng quý giá. N tham gia điều chỉnh chu
tr nh sinh địa h a toàn cầu và là nơi thực hiện các quá trình biến đổi, phân
hủy phế thải khoáng, chất hữu cơ lọc xử l các chất gây ô nhiễm. Đối với một
nƣớc nông nghiệp nhƣ Việt Nam thì vai trị của đất lại càng quan trọng.
Hiện nay, nhằm thực hiện định hƣớng phát triển nền kinh tế ổn định,
bền vững thu đƣợc năng suất nông nghiệp cao nhất mà không gây hại đến hệ
sinh thái và môi trƣờng đất con ngƣời không ngừng nỗ lực hạn chế sử dụng
phân bón hóa học một cách tối đa. Cải thiện và làm tăng độ phì nhiêu của đất
bằng phƣơng pháp sinh học đã và đang đƣợc các nhà khoa học quan tâm,
nghiên cứu nhiều hơn. Một thành phần quan trọng g p phần làm tăng độ màu
mỡ của đất đ là khu hệ vi sinh vật (VSV đất 11 . Thời gian qua đã c rất
nhiều nghi n cứu về VSV n i chung và hệ VSV đất n i ri ng để t m ra các
chủng VSV mới c hoạt t nh sinh học mạnh nhằm ứng ụng vào thực tiễn
sản xuất g p phần thực hiện một nền nông nghiệp sạch và ền vững.
Cỏ vetiver cịn gọi là cỏ hƣơng ài thuộc họ Poaceae có nguồn gốc từ
Ấn Độ đƣợc trồng trên khắp thế giới đặc biệt là Haiti, Ấn Độ và đảo Java.
Cỏ vetiver có sức sống mạnh mẽ, thích nghi rộng với các điều kiện khí hậu và
thổ nhƣỡng của vùng nhiệt đới, dễ nhân giống t địi hỏi cơng chăm s c. Khi
mọc nó chỉ chiếm một khoảng khơng gian tối thiểu và hồn tồn khơng có
tiềm năng trở thành cỏ dại.
Trên thế giới, nhiều nghiên cứu đã cho thấy ngoài khả năng t ch lũy
kim loại nặng, xử l nƣớc thải, hay chống xói mịn, rửa trơi, cỏ vetiver cịn có
khả năng cải tạo và làm tăng độ phì nhiêu của đất. Vậy VSV với khả năng


2

tham gia chuyển hóa một số chất nhƣ cố định đạm, chuyển hóa lân khó tan,
phân giải xenluloza… c vai trò g trong khả năng cải tạo đất của cỏ vetiver.
Mặt khác, tại Việt Nam, các nhà khoa học chỉ mới tập trung nghiên cứu

vai trò của cỏ vetiver trong xử lí ơ nhiễm kim loại nặng và chống rửa trôi đất.
Chƣa c tác giả nào nghiên cứu sự đa ạng, hoạt tính sinh học của các chủng
VSV trong vùng rễ cỏ vetiver để làm rõ vai trò của chúng trong việc cải thiện
độ phì nhiêu của đất.
Xuất phát từ những cơ sở khoa học trên, chúng tôi tiến hành nghiên
cứu đề tài: “Nghiên cứu sự phân bố và khả năng cố định đạm của vi khuẩn
đất trong vùng rễ cỏ vetiver (Vetiverria zizanioides L.) ở một số địa phương
tại tỉnh Quảng Nam”.
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU:
Nghiên cứu sự phân bố và khả năng cố định đạm của các chủng vi
khuẩn đất trong vùng có trồng và khơng trồng cỏ vetiver ở một số địa phƣơng
tại tỉnh Quảng Nam. à cơ sở khoa học để chứng minh sự đa ạng của vi
khuẩn đất trong vùng rễ cỏ vetiver và vai trị của chúng trong việc cải thiện
độ phì nhiêu của đất.
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI:
- Cung cấp một số dữ liệu an đầu về sự phân bố của vi khuẩn đất
trong vùng rễ cỏ vetiver.
- Phân lập và sơ tuyển các chủng vi khuẩn trong vùng đất trồng cỏ
vetiver có khả năng cố định đạm mạnh. Từ đ

đề xuất ứng dụng trồng cỏ

vetiver để cải thiện độ phì nhiêu của đất trồng.
- Hiểu thêm về các loại vi khuẩn trên hệ rễ cỏ vetiver đặc biệt là vi
khuẩn cố định đạm, về sự hiện diện của chúng, tác dụng của chúng đối với cỏ
vetiver và với môi trƣờng đất. Tiếp cận thêm một khía cạnh mới về khả năng
của cỏ vetiver, khả năng làm giàu đạm cho đất.


3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ VI SINH VẬT ĐẤT
1.1.1. Sự phân bố của vi sinh vật trong đất và vai trò của vi sinh vật
đất
a. Đất là môi trường sống tốt nhất cho vi sinh vật
Đất là nơi cƣ trú của con ngƣời và hầu hết các loài động vật, thực vật
hay VSV. Riêng với VSV đất là mơi trƣờng rất thích hợp để chúng sinh
trƣởng và phát triển cả về thành phần cũng nhƣ số lƣợng so với các môi
trƣờng khác. Sở ĩ nhƣ vậy v trong đất có một khối lƣợng lớn chất hữu cơ là
nguồn thức ăn cho các nh m VSV ị ƣỡng nhƣ nh m VSV phân huỷ các
hợp chất các bon hữu cơ nh m VSV phân huỷ các hợp chất nitơ hữu cơ...
Các chất vô cơ c trong đất cũng là nguồn inh ƣỡng cho các nhóm VSV tự
ƣỡng, chẳng hạn các nhóm VSV phân huỷ chất vơ cơ chuyển hoá các hợp
chất S, P, Fe... Các chất inh ƣỡng không những tập trung nhiều ở tầng đất
mặt mà còn phân tán xuống các tầng đất sâu. Do đ ở các tầng đất khác nhau,
sự phân bố của VSV cũng c sự khác nhau phụ thuộc vào hàm lƣợng các chất
dinh dƣỡng có ở tầng đất đ [17]. Bên cạnh đ

nhiệt độ và độ ẩm trong đất

cũng thích hợp cho sinh trƣởng và phát triển của nhiều loại sinh vật nói
chung và VSV đất nói riêng [10].
b. Phân bố theo đặc điểm và tính chất của đất
Các loại đất khác nhau c điều kiện inh ƣỡng độ ẩm độ thoáng kh
pH khác nhau. Bởi vậy sự phân ố của VSV cũng khác nhau. Ta c thể thấy
thành phần và số lƣợng VSV thay đổi tùy tính chất đất. Đất tốt hàm lƣợng
chất inh ƣỡng cao điều kiện môi trƣờng sống thuận lợi thì số lƣợng VSV
tổng số cao. Ở đất tơi xốp không kh lƣu thông tốt quá tr nh ơxy hố chiếm
ƣu thế các lồi VSV hiếu kh phát triển mạnh. Ngƣợc lại đất càng xấu, bạc

4

màu, kết cấu chặt khô cằn hay ị chua mặn

inh ƣỡng thấp khiến cho các

điều kiện môi trƣờng sống kém chất lƣợng thì sự có mặt của VSV là rất ít [6].
Ngoài ra, địa h nh khác nhau cũng cho số lƣợng VSV khác nhau. Đất vùng
đồng ằng c số lƣợng VSV cao hơn trung u miền núi và vùng gò đồi [2].
c. h n ố theo c

tr ng

Đối với tất cả các loại cây trồng, vùng rễ là vùng VSV phát triển mạnh
hơn so với vùng khơng có rễ vì rễ cây làm cho đất thống khí, giữ đƣợc độ
ẩm và thƣờng xuyên tiết chất hữu cơ làm nguồn inh ƣỡng cho VSV. Khơng
những vậy, trong q trình sống, rễ của mỗi loại cây khác nhau thƣờng tiết ra
các hợp chất khác nhau. Khi chết đi mỗi loại cây cũng phân hủy thành các
chất khác nhau. Thành phần và số lƣợng các chất đ khác nhau tùy thuộc vào
từng loại cây. Do đ

số lƣợng và thành phần VSV vùng rễ là khác nhau và

đặc trƣng cho mỗi loại cây. Chẳng hạn lúa ngô rau thu hút nhiều VK cố
định đạm sống tự o nhƣ Azotobacter. Trong khi đ

cây họ đậu thu hút nhiều

VK cố định đạm sống cộng sinh nhƣ Rhizobium nhƣng vùng rễ chè lại thu
hút nhiều nấm [9].
1.1.2. Mối quan hệ giữa đất – vi sinh vật – cây trồng
a. Mối quan hệ giữa đất và vi sinh vật đất
Đất có kết cấu từ những hạt nhỏ liên kết với nhau gọi là keo đất. Ngƣời
ta đã t m ra vai trò trực tiếp của VSV trong việc tạo thành kết cấu đất. Hoạt
động của VSV, nhất là nhóm hiếu kh đã h nh thành n n axit humic. Các
muối của axit humic tác dụng với ion canxi tạo thành một chất dẻo gắn kết
những hạt đất với nhau. Trong quá trình phân giải chất hữu cơ nấm mốc và
xạ khuẩn phát triển thành một hệ khuẩn ty khá lớn trong đất. Khi nấm mốc và
xạ khuẩn chết đi VK phân giải chúng tạo thành các chất dẻo có khả năng kết
dính các hạt đất với nhau. Bản thân VK khi chết đi và tự phân huỷ cũng tạo
thành các chất kết dính. Ngồi ra lớp dịch nhày bao quanh các VK có vỏ


5

nhày cũng c khả năng kết dính các hạt đất với nhau.
Th m vào đ sự hình thành và phân giải mùn đều o VSV đ ng vai trị
tích cực. Các biện pháp canh tác nhƣ cày ừa, xới xáo

n phân… đều ảnh

hƣởng trực tiếp đến VSV và qua đ ảnh hƣởng đến hàm lƣợng mùn trong đất.
Khi xới lớp đất canh tác nhƣng không lật mặt, số lƣợng VSV cũng nhƣ cƣờng
độ hoạt động c tăng l n nhƣng khơng nhiều bằng xới đất có lật mặt hoặc cày
sâu. Tuy nhiên không phải đất nào cũng theo qui luật đ

đối với đất úng

ngập, qui luật trên thể hiện rõ hơn. Trong khi đ ở đất cát nhẹ khô hạn thì
việc xới xáo khơng hợp lý lại làm giảm lƣợng VSV [10].
b. Mối quan hệ giữa vi sinh vật đất và cây tr ng
Vi sinh vật sống trong vùng rễ có quan hệ mật thiết với cây trồng.
Chúng tiết ra các vitamin, chất sinh trƣởng có lợi đối với cây trồng và cung
cấp chất inh ƣỡng cho cây qua quá trình phân giải mùn bã hữu cơ. Những
vi sinh vật cố định nitơ nhƣ Azotobacter, Rhizobium, Clostridium
pasteurianum, thanh tảo và nấm hàng năm làm giàu cho đất một lƣợng nitơ
mà cây trồng yêu cầu. Hoạt động của quần thể VSV cịn oxy hóa các hợp
chất có hại cho cây trồng, biến những chất có hại này thành những sản phẩm
khác, hoặc có lợi cho cây trồng.
Bên cạnh đ

những chất tiết của rễ có ảnh hƣởng quan trọng đến VSV

vùng rễ. Vi sinh vật sử dụng chất tiết của cây làm chất dinh ƣỡng. Do đ
trên bề mặt và lớp đất nằm sát rễ chứa nhiều chất inh ƣỡng, tập trung số
lƣợng lớn VSV. Càng xa rễ số lƣợng VSV càng giảm đi [24].
Thành phần và số lƣợng VSV vùng rễ phụ thuộc vào loại cây và thời kì
phát triển của cây. Số lƣợng VK Azotobacter c nhiều khi cây lúa còn non
đạt cực đại ở giai đoạn lúa làm đòng sau đ giảm ần khi lúa ch n. VSV
phân giải xenluloza có rất t khi lúa cịn non nhƣng khi cây già th rất nhiều.


6

Trong vùng rễ cây trồng, ngồi sự có mặt những nhóm VSV có ích,
cịn có VSV ức chế sự sinh trƣởng của cây, gây bệnh cho cây và tàn phá mùa
màng nghiêm trọng. Đ là mối quan hệ kí sinh của VSV trên thực vật. Nhóm
VSV gây bệnh cho cây thuộc loại dị ƣỡng, sống nhờ vào chất hữu cơ của

thực vật đang sống.
1.2. QUÁ TRÌNH CỐ ĐỊNH NITƠ PHÂN TỬ VÀ VI KHUẨN CỐ
ĐỊNH ĐẠM
1.2.1. Sơ lƣợc về nitơ và vai trị của q trình cố định nitơ.
Nitơ là nguy n tố inh ƣỡng quan trọng không thể thiếu đối với cây
trồng và cả VSV. Nguồn dự trữ nitơ trong tự nhiên rất lớn, chỉ tính riêng
trong khí quyển nitơ chiếm khoảng 78,16% thể tích [4]. Nhƣng tất cả nguồn
nitơ tr n cây trồng đều không tự đồng h a đƣợc mà phải nhờ VSV. Trong
quá trình cố định nitơ thông qua các hoạt động sống của VSV nitơ ở các
dạng khác nhau đƣợc chuyển hóa thành dạng dễ ti u để cây trồng có thể sử
dụng [1].
Hàng năm cây trồng lấy đi từ đất hàng trăm triệu tấn nitơ. Bằng cách
n phân con ngƣời trả lại cho đất đƣợc khoảng 40% lƣợng thiếu hụt còn lại
cơ ản đƣợc bổ sung bằng nitơ o hoạt động sống của VSV. Vì vậy, việc
nghiên cứu sử dụng nguồn đạm sinh học này đƣợc xem là một giải pháp vô
cùng quan trọng trong sản xuất nơng nghiệp.
1.2.2. Cơ chế của q trình cố định nitơ phân tử
Cơ chế của quá trình cố định nitơ đã đƣợc Vinogratskii và nhiều nhà
khoa học ngiên cứu ở tế bào VSV cố định nitơ. Trong đ VSV với sự trợ giúp
của nitrogenaza đã phá vỡ liên kết 3 của phân tử nitơ một cách dễ dàng ngay
trong điều kiện thƣờng về nhiệt độ và áp suất. Quá trình cố định nitơ phân tử là
quá trình khử N2 thành NH3 có sự xúc tác của enzym nitrogenaza khi có mặt
của ATP [9].


7

Nitrogenaza
N2 + 8H + 8e + 16Mg.ATP + 16O
2NH3+H2 + 16Mg.ADP + 16P

+

-

2[H]
N2 => N ≡ N

2[H]

2[H]

HN = NH

H2N – NH2

Diimit

Hydrazin

ATP

ATP

2NH3

ATP

1.2.3. Vi khuẩn cố định nitơ sống tự do
Nhiều loài VSV có khả năng cố định nitơ phân tử. Chúng bao gồm 3
nhóm chính: nhóm vi khuẩn cố định nitơ sống cộng sinh, nhóm vi khuẩn cố

định nitơ sống tự do và nhóm vi khuẩn lam cố định nitơ. Ở đây chúng ta chỉ
nghiên cứu nhóm VKHK cố định nitơ sống tự o trong đất.
* Vi khuẩn Azotobacter
Năm 1901 nhà ác học Beijerinck đã phân lập đƣợc từ đất một loài
VK c khả năng cố định nitơ phân tử đặt t n là Azotobacter chrococcum.
Azotobacter c h nh cầu là vi khuẩn gram âm không sinh ào tử.
K ch thƣớc TB ao động từ 1 5 - 5,5 m khuẩn lạc màu trắng trong lồi và
nhầy. Khi già khuẩn lạc c màu vàng lục hoặc nâu sẫm, c màng nhầy điển
hình. Tế ào khi cịn non c ti n mao (flagellum c khả năng i động nhờ
ti m mao. Khi già tế ào thƣờng đƣợc ao ọc lớp vỏ ày và tạo thành nang
xác. Khi gặp điều kiện thuận lợi nang xác sẽ nứt ra và tạo thành các tế ào
mới. Vi khuẩn Azotobacter th ch ứng ở nhiệt độ 28 - 300C độ ẩm 40 - 60%
và pH = 7,2 - 8,2, song chúng c thể phát triển đƣợc ở pH từ 4 5 - 9,0.
Azotobacter đồng hoá tốt các loại đƣờng đơn và đƣờng kép, cứ tiêu
tốn 1 gram đƣờng glucoza nó có khả năng đồng hố đƣợc 8 – 18 mg, 15 – 20
mg N2. Ngoài ra Azotobacter cịn có khả năng tiết ra một số vitamin nhóm B


8

nhƣ B1 B6 một số axit hữu cơ nhƣ axit nicotimic axit pantotenic

iotin...

các chất kháng sinh thuộc nhóm anixonyixin.
Trong đất thƣờng phổ iến những loài Azotobacter sau: Azotobacter
chrococum, Azotobacter acidum, Azotobacter araxii, Azotobacter gracias...
* Vi khuẩn Beijerinskii
Năm 1893 nhà ác học Ấn Độ Stacke đã phân lập đƣợc VK có khả
năng cố định nitơ ở ruộng lúa nƣớc ông đặt tên là Beijerinskii.

Beijerinskii có hình cầu, bầu dục hoặc h nh que k ch thƣớc tế bào dao
động từ 0,5 - 4,5 m. Một số loại có khả năng i động nhờ tiên mao.
Beijerinskii là vi khuẩn gram âm, không sinh bào từ, hiếu khí. Khuẩn lạc
nhầy, lồi, khơng màu hoặc nâu tối, khi già không tạo nang xác.
Vi khuẩn Beijerinskii sinh trƣởng và phát triển ở độ ẩm 70 - 80% và
nhiệt độ từ 25 - 28oC. Chúng có tính chống chịu cao với axit, có thể phát triển
đƣợc ở môi trƣờng pH = 3,0. Phân bố rộng, nhất là ở vùng nhiệt đới và Á
nhiệt đới.
Vi khuẩn Beijerinskii có khả năng đồng hố tốt các loại đƣờng đơn
đƣờng kép. Chúng có khả năng cố định đƣợc 5 – 10 mg N2 từ 1 gam đƣờng
glucoza.
* Vi khuẩn Clostridium
Vi khuẩn Clostridium đƣợc phát hiện từ năm 1939 ởi một nhà bác học
Nga. Chúng là trực khuẩn Gram (+), sinh bào tử k ch thƣớc tế ào ao động
0,7 - 2,5 m. Khuẩn lạc của VK Clostridium có màu trắng đục, lồi và nhầy.
Chúng sinh trƣởng và phát triển ở pH = 4,5 - 9 0 độ ẩm 60 - 80%. Khi sử
dụng 1 gam đƣờng đồng hoá đƣợc 5 - 12 mg N2.
Ta có thể gặp VK Clostridium nhiều trong ruộng lúa nƣớc, tiêu biểu là
Cl. butyricum, Cl. pectinovorum, Cl. gracis…
Ngồi ra trong đất cịn có các vi khuẩn cố định nitơ khác nhƣ VK


9

Pseudomonas azotogensis, Azotomona insolita, Chromaticum sp...
1.3. GIỚI THIỆU SƠ LƢỢC VỀ CỎ VETIVER
1.3.1. Phân loại
Vetiverria zizanioides L. là loài thực vật thuộc lớp Liliopsida, bộ
Poales, họ Poaceae và giống Vetiverria [24].
Ở Việt Nam trong quyển “T n cây rừng Việt Nam” của NXB Nông

nghiệp 1992 ghi nhận cỏ vetiver đƣợc gọi là cỏ hƣơng ài hoặc cỏ hƣơng
lau c t n khoa học là Vetiverria zizanioides . Giống cỏ này đã đƣợc trồng
ở Thái B nh để sản xuất ầu thơm.
1.3.2. Đặc điểm sinh học
Cỏ vetiver có thể mọc cao tới 1,5 m và tạo thành các bụi cây rộng gần
nhƣ vậy. Thân cây cao, các lá dài, mỏng và cứng. Từ gốc rễ mọc ra rất nhiều
chồi ở các hƣớng. Phần thân trên không phân nhánh, phần ƣới đẻ nhánh rất
mạnh. Cỏ vetiver có phiến lá tƣơng đối cứng, hẹp, dài khoảng 45 -100 cm,
rộng khoảng 6-12 mm, dọc theo rìa lá c răng cƣa én, tán lá phần lớn nằm ở
phần gốc. Các bẹ lá phủ lên nhau, ép sát và xếp úp vào nhau tạo thành một
rào cản cơ học, mật độ dày trên bề mặt đất, sẽ rất hiệu quả trong việc ngăn
chặn sự mất inh ƣỡng và x i mòn đất.
Rễ là phần hữu dụng và quan trọng nhất. Đa số cỏ dại có rễ dạng sợi,
trải dài ra từ phần thân cỏ trên mặt đất và cặm vào đất theo hƣớng ngang, còn
rễ cặm đứng vào đất không mọc sâu. Ngƣợc lại, cỏ vetiver khơng bị lan, thân
rễ đan xen nhau và c thể phát triển rất nhanh. Do đ

hệ thống rễ cỏ vetiver

không mọc trải rộng mà lại cắm thẳng đứng sâu vào trong đất, kể cả rễ chính,
rễ thứ cấp hoặc rễ dạng sợi. Rễ có dạng chùm khơng mọc trải rộng mà lại
cắm thẳng đứng sâu 3 - 4 m, rộng đến 2 5 m sau hai năm trồng. Rễ của lồi
Vetiverria zizanioides có chứa tinh dầu, chất lƣợng tốt nhất 18 tháng sau khi
trồng với lƣợng tinh dầu 2 - 2,5% trọng lƣợng khô.


10

Loài Vetiverria zizanioides đƣợc ùng phổ iến v c đặc điểm không
tạo hạt nhân giống chủ yếu ằng phƣơng pháp vô t nh n n không thể mọc

tràn lan nhƣ một loại cỏ ại khác. Cỏ vetiver là cây lƣỡng t nh c hoa lƣỡng
tính, màu tía ánh nâu.
Cỏ vetiver c quan hệ họ hàng gần gũi với các loài cỏ c hƣơng thơm
khác nhƣ sả (Cymbopogon citratus, C. nardus, C. winterianus, C. martinii).
1.3.3. Đặc tính sinh thái
Cỏ vetiver khá dễ trồng, dễ sống, chịu hạn tốt, ít bị sâu bệnh, thấm
nƣớc và giữ nƣớc. Nó vừa ƣa khơ vừa ƣa nƣớc, trồng đƣợc ở bất kỳ loại đất
nào, không kể độ màu mỡ. Cỏ đƣợc nhân giống bằng cụm rễ, cành giâm. Cây
mọc thành bụi hay khóm lớn.
Cỏ vetiver mọc tốt nhất ở đất cát sâu tuy nhi n n cũng phát triển
đƣợc ở phần lớn các loại đất. Cỏ vetiver có khả năng th ch nghi rộng ở nhiều
vùng sinh thái khác nhau, phát triển đƣợc ở những vùng đất tƣơng đối khắc
nghiệt và thƣờng đƣợc trồng với mục đ ch chống xói mịn và sạt lở đất để bảo
vệ đất đai.
Mặc dù nó có nguồn gốc từ Ấn Độ nhƣng theo nhiều tài liệu, cỏ vetiver
hiện đƣợc trồng nhiều ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới nhƣ châu Phi nhiệt
đới (Ethiopia, Nigeria...), châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ, Malaysia, Indonesia,
Philippines, Thái Lan...), châu Úc, Trung và Nam Mỹ (Colombia...).
* Khí hậu
Cỏ vetiver phát triển đƣợc ở mức nhiệt độ trung bình là 18 - 25°C. Cỏ
vetiver có sức chịu đựng đối với sự biến động khí hậu cực kỳ lớn nhƣ hạn
hán kéo ài lũ lụt, ngập úng. Khả năng chịu ngập úng kéo ài đến 45 ngày ở
luồng nƣớc sâu 0,6 - 0,8 m và chịu đƣợc i n độ nhiệt từ -10°C đến 48°C.
* Lượng mưa và độ ẩm


11

Cỏ vetiver phát triển tốt ở điều kiện ẩm hoặc ngập nƣớc hoàn toàn trên
3 tháng, cần lƣợng mƣa khoảng 300 mm nhƣng tr n 700 mm. Thông thƣờng

cỏ vetiver cần một mùa ẩm ƣớt ít nhất 3 tháng lý tƣởng nhất là c mƣa hàng
tháng.
Tuy nhi n chúng cũng sinh trƣởng tốt ở điều kiện khô hạn nhờ hệ
thống rễ đâm sâu vào đất nên cỏ vetiver có thể chịu đựng đƣợc khô hạn và
trên các triền dốc.
* Ánh sáng
Cỏ vetiver là loại cây C4 nên chúng thích hợp trong vùng c lƣợng
ánh sáng cao. Loài này phát triển yếu ƣới

ng râm khi

ng râm đƣợc bỏ

đi th cỏ sẽ phục hồi sinh trƣởng rất nhanh.
1.3.4. Vi khuẩn trong vùng rễ cỏ vetiver
Vi khuẩn và nấm là những VSV đất tiêu biểu phát triển quanh hệ rễ cỏ
vetiver rất nhiều. Vi khuẩn xâm nhập vào mặt trên rễ, tạo thành những đƣờng
dẫn truyền inh ƣỡng nối đất và cây, rễ tiết ra polysaccharit là chất hữu cơ
hoà tan giúp cho sự chuyển hố sinh học của đất và sự thích nghi của cây
[22]. Vi khuẩn gắn liền với rễ cỏ vetiver là các VK cố định đạm, VK hoà tan
lân, các nấm rễ và các vi khuẩn phân giải xenluloza... Các chủng VK này sản
xuất chất inh ƣỡng cho sự sinh trƣởng, phát triển và thúc đẩy các hormon
sinh trƣởng thực vật tác động trực tiếp lên cỏ vetiver [3].
Riêng vi khuẩn cố định đạm hiện diện ở bề mặt rễ, trong các gian bào
hoặc trong các tế bào rễ đã chết. Các VK này có vai trị quan trọng trong việc
cung cấp đạm cho cỏ vetiver, sản xuất enzym chuyển hoá nitơ tự do thành
nitơ sinh học ƣới dạng N - ammonia cho cây hấp thụ. Trong vùng rễ cỏ
vetiver thƣờng gặp những loài VK cố định đạm nhƣ Azospirillum,
Aiotobacter, Acetobacter alicaligen, Beijerinckia, Enterobacter, Klebsiella
và Pseudomonas.

12

1.2.5. Lợi ích từ cỏ vetiver
* Cải tạo đất, kiểm sốt xói mịn và hấp thụ kim loại nặng
Khơng giống nhƣ phần lớn các loài cỏ khác hệ thống rễ chùm của cỏ
vetiver cắm thẳng sâu xuống lòng đất c tác ụng chống x i mịn rửa trơi.
Hệ rễ cỏ còn c tác động đệm rất tốt làm giảm lƣợng nƣớc ề mặt thoát đi và
tăng hiệu quả giữ nƣớc ngầm. Trong “Nghi n cứu đa ạng sinh học của VSV
đất ở vùng rễ cỏ vetiver trong đất nhiễm mặn” Piriyaprin Siangjeaw và cs đã
chỉ ra rằng cỏ vetiver c vai trò quan trọng trong việc ảo tồn đất và kiểm
sốt x i mịn. Trồng cỏ vetiver cịn c tác ụng giảm mức độ muối trong đất
mặn giữ độ ẩm đất ngăn ngừa sự xâm nhiễm muối trong đất [24].
B n cạnh đ , cỏ vetiver còn làm tăng độ phì nhiêu của đất một cách tự
nhiên nhờ tác dụng giữ ẩm cho đất. Rễ và thân cỏ mọc ày đặc góp phần giữ
đất, mùn... khơng bị rửa trơi. Khi chết chúng đƣợc vùi lấp vào đất, phân hủy
thành chất hữu cơ làm cho đất trở n n tơi xốp thoáng hơn và màu mỡ hơn.
Do đ cải thiện đƣợc đặc t nh cơ học của đất [8].
Tại Trung Quốc nghi n cứu của Bo Huang và cs cho thấy sử ụng cỏ
vetiver nhƣ một hàng rào ảo vệ c thể chống x i mịn và cải thiện mơi
trƣờng đất tr n sƣờn núi ốc. Bo Huang và cs cũng tiến hành so sánh với
sƣờn núi không trồng cỏ vetiver. Kết quả cho thấy nhiều sƣờn núi ị x i mịn
mạnh và iễn ra sạt lở đất [20].
Ngồi ra cỏ vetiver cịn giúp ảo vệ các cơng tr nh đập k nh đƣờng
ộ sông hồ, thuỷ điện không ị ồi lấp chống lũ lụt hạn chế òng chảy mất
mùa trên iện rộng [12].
Không những vậy, nhiều nƣớc tr n thế giới nhƣ Đức Thái an Thụy
Sĩ Bồ Đào Nha Đan Mạch Trung Quốc… đã nghi n cứu và sử ụng cỏ
vetiver để giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng cho kết quả tốt.

13

Đến nay, về vấn đề an tồn đối với mơi trƣờng ngƣời ta chƣa thấy ảnh
hƣởng nghịch nào trong việc sử dụng công nghệ cỏ vetiver cũng nhƣ chƣa c
phản ứng phụ nào tác động xấu đến con ngƣời và hệ sinh thái.
* Lợi ích kinh tế:
Cỏ vetiver đƣợc trồng chủ yếu để chƣng cất tinh ầu thơm từ rễ với sản
lƣợng tr n toàn thế giới khoảng 250 tấn/năm. Giá án tinh ầu cỏ vetiver tr n
thế giới khá cao khoảng 135 USD/kg (Nguồn: Sở NN&PTNN An Giang
2005). Tinh ầu vetiver đƣợc sử ụng rất nhiều trong ngành công nghiệp
ƣợc liệu nhƣ sản xuất xà phòng thơm nƣớc thơm chất khử mùi nƣớc hoa
mỹ phẩm…
B n cạnh đ

tinh ầu vetiver là thành phần trong một số thuốc nhƣ:

thuốc phá thai trị mụn trứng cá trị ệnh thiếu máu vi m khớp mất ngủ điều
kinh… Tinh ầu vetiver còn k ch th ch hƣng phấn

ồi ổ cơ thể trị cúm tẩy

trùng pha trà thƣ giãn tinh thần…
Ngoài ra, cỏ vetiver còn đƣợc tận dụng nhiều trong sinh hoạt và sản
xuất. Lá cỏ vetiver dùng lợp mái nhà, làm dây thừng, chiếu, nón, giỏ xách và
thức ăn cho gia súc. Thân và lá cỏ vetiver có thể dùng rải lên lớp đất mặt
quanh tán cây để giữ ẩm và diệt cỏ dại, hay làm vật liệu nuôi trồng nấm rơm
vật liệu nhồi nệm, làm chổi quét hay cây cảnh trang tr trong vƣờn, trong
nhà...

14

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
- Các chủng vi khuẩn đất đƣợc phân lập từ mẫu đất trồng và không
trồng cỏ vetiver.
- Các chủng vi khuẩn Azotobacter đƣợc phân lập từ mẫu đất có trồng
và không trồng cỏ vetiver.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Nghiên cứu sự phân bố của các chủng vi khuẩn trong đất có trồng và
khơng trồng cỏ vetiver ở 3 địa điểm (Phú Thọ Ái Nghĩa A Vƣơng tại tỉnh
Quảng Nam.
- Nghiên cứu số lƣợng vi khuẩn trong đất trồng cỏ vetiver ở các
khoảng cách gần rễ và xa rễ cỏ tại 3 địa điểm của tỉnh Quảng Nam.
- Nghiên cứu sơ tuyển và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng
cố định đạm mạnh trong đất trồng cỏ vetiver ở 3 địa điểm nghiên cứu tại tỉnh
Quảng Nam.
- Nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy và h nh thái của một số chủng vi
khuẩn Azotobacter c khả năng cố định đạm mạnh trong đất trồng cỏ vetiver
ở 3 địa điểm tại tỉnh Quảng Nam.
2.3. ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
2.3.1. Địa điểm nghiên cứu
* Địa điểm thu mẫu ngoài thực địa:
Lấy mẫu đất trồng cỏ vetiver và không trồng cỏ vetiver tại tỉnh Quảng
Nam ở 3 địa điểm:
- Xã Phú Thọ, huyện Quế Sơn.
- Xã A Vƣơng huyện Tây Giang.

15

- Thị trấn Ái Nghĩa huyện Đại Lộc.
Do t n địa điểm cụ thể tƣơng đối dài nên từ đây chúng tôi sẽ chỉ để tên
ngắn gọn: Phú Thọ A Vƣơng Ái Nghĩa.
* Địa điểm nghiên cứu trong phịng thí nghiệm
- Phịng thí nghiệm hóa sinh – vi sinh, khoa Sinh – Môi trƣờng trƣờng
Đại học Sƣ Phạm Đại học Đà Nẵng.
- Phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học, Khoa Sinh – Môi trƣờng,
trƣờng Đại học Sƣ Phạm Đại học Đà Nẵng.
- Phịng thí nghiệm mơi trƣờng của trung tâm môi trƣờng thành phố Đà
Nẵng.
2.3.2. Thời gian nghiên cứu
Thời gian thực hiện: từ tháng 05/2014 – 5/2015.
2.3.3. Phạm vi nghiên cứu
Do thời gian và điều kiện phịng thí nghiệm có hạn, chúng tôi chỉ giới
hạn nghiên cứu trong phạm vi sau:
- Lấy mẫu tại 3 địa điểm (Phú Thọ Ái Nghĩa A Vƣơng của tỉnh QN
trong vùng có trồng, khơng trồng cỏ vetiver và ở các khoảng cách gần rễ, xa
rễ cỏ vetiver.
- Nghiên cứu số lƣợng VSV trong các mẫu thu đƣợc: chọn đối tƣợng là
VKHK, thời gian là tháng 5/2014 và tháng 10/2014.
- Sơ tuyển và tuyển chọn các chủng VK Azotobacter có khả năng cố
định đạm mạnh trong đất có trồng cỏ vetiver.
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Phƣơng pháp thu mẫu ngoài thực địa
a. Nguyên tắc thu mẫu đất
- Nguyên tắc thu mẫu đất trồng và không trồng cỏ trong cùng một khu

vực nghiên cứu: