Tạo tôm càng xanh toàn đực Macrobrachium rosenbergii nhờ bất hoạt gen insulin like tuyến đực qua công nghệ can thiệp RNA

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2

TẠO TÔM CÀNG XANH TOÀN ĐỰC Macrobrachium rosenbergii
NHỜ BẤT HOẠT GEN INSULIN-LIKE TUYẾN ĐỰC QUA CÔNG
NGHỆ CAN THIỆP RNA
Bùi Thị Liên Hà1, Nguyễn Đức Minh1, Lê Thị Hoài Oanh1, Trần Thanh Võ1, Nguyễn Điền1,
Lê Chính1, Nguyễn Viết Dũng2, Nguyễn Văn Hảo3
TĨM TẮT
Nhu cầu cấp thiết về nguồn tơm giống càng xanh tồn đực (Macrobrachium rosenbergii) đang
là mối quan tâm hàng đầu của người dân nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam. Giải pháp cơng nghệ
sinh học mới có thể đáp ứng được nhu cầu thị trường và xã hội hóa là cơng nghệ can thiệp RNA
nhằm bất hoạt việc giải mã hormone được sinh ra từ tuyến đực cho mục đích tạo ra con tôm cái giả
(neo-female) để sản xuất con giống tôm càng xanh toàn đực. Kết quả hiện đạt được nghiên cứu là
tổng hợp thành công sợi đôi double-stranded RNA (dsRNA) trình tự mRNA mã hố gen tuyến đực
Androgenic Gland Hormone. Tơm post càng xanh tồn đực có độ tuổi càng nhỏ thì hiệu quả chuyển
cái càng cao. Tơm chuyển cái thành cơng thì sau 3,5 tháng tính từ thời điểm bắt đầu tiêm sẽ thành
thục sinh dục và tham gia sinh sản. Tỷ lệ chuyển cái sau 2,5 – 3 tháng tiêm hiện đạt 88-92%, tần xuất
tiêm sợi đôi dsRNA cho hiệu quả chuyển cái cũng như cho tỷ lệ sống cao là 2 tuần/lần.
Từ khóa: tơm càng xanh, chuyển giới, can thiệp gen.

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Tôm
càng
xanh
(Macrobrachium
rosenbergii) là một trong những đối tượng thủy
sản nước ngọt có giá trị kinh tế cao ở Việt Nam.
Việc ni tơm càng xanh tồn đực đang mang lại
lợi nhuận cao nhất cho người nuôi đối tượng này;
do đó nhu cầu về con giống cho việc ni đại trà
là rất lớn. Chính vì vậy mà việc tìm kiếm các giải

pháp cơng nghệ tạo ra nguồn tơm giống tồn đực
là một trong những ưu tiên hàng đầu của các nhà
nghiên cứu nuôi trồng thủy sản. Việc khám phá
cơ chế xác định giới tính trên tơm đã góp thêm
giải pháp đầy tiềm năng phục vụ trong sản xuất
tơm ni. Chuyển đổi giới tính trong tơm ni
có những lợi ích vượt bậc như: chọn giới tính có
biểu hiện tăng trưởng vượt trội, đạt kích thước
thương phẩm lớn, tăng sản lượng thu hoạch. Tôm
càng xanh là đối tượng kiểu mẫu cho ứng dụng

chuyển giới tạo quần thể đơn tính do những thuận
lợi về mặt giải phẫu học tuyến đực.
Cơ sở chính trong nghiên cứu sản xuất
nguồn tơm giống tồn đực là tạo ra được con
tôm cái neo-female (con tôm cái được chuyển
đổi giới tính từ con đực). Trên nền tảng cấu
trúc đặc biệt của cơ quan sinh sản của tơm càng
xanh nói chung và nhóm giáp xác Decapod nói
chung: tinh sào là cơ quan chuyên tạo tinh, còn
tuyến đực (androgenic gland – AG), một cơ
quan biệt lập khác có chức năng tiết ra hormone,
tuyến này thường nằm ở cận cuối và bám nhẹ
vào ống dẫn tinh, tham gia vào sự biệt hóa giới
tính và phát triển những đặc điểm sinh dục thứ
cấp, ảnh hưởng lên kích thước và sự tăng trưởng
(Sagi, 1995). Tuyến đực được chứng minh là có
vai trị chính trong điều chỉnh biệt hố tính đực
và tạo tinh ở tơm (Charniaux - Cotton và Peyen

Phịng Sinh học Thực nghiệm, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2
Email:
2
Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa Dịch bệnh Thủy sản Khu vực Nam bộ,
Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2
3
Viện Nghiên cứu Ni trồng Thủy sản 2
1

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014

3


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
1988). Sự cắt bỏ tuyến đực ở tôm càng xanh
Macrobrachium rosenbergii trong giai đoạn
sớm có thể gây đảo giới hồn tồn, với sự cái
hố các tính trạng sinh dục sơ cấp và thứ cấp và
con vật có thể sinh sản như con cái (Sagi và ctv.
1989, 1997a). Thêm vào đó, khi cấy ghép tuyến
đực vào con cái thì tuyến này có tác động đực
hố con tơm cái (Nagamine và ctv 1980, 1987).
Như vậy ý tưởng cho việc tạo con tôm cái neofemale được thực hiện khi can thiệp thành công
vào tuyến đực của con tôm càng xanh đực trong
giai đoạn sớm.
Giải pháp tạo con tôm cái neo-female cơ bản
nhất là can thiệp bằng phương pháp vật lý nhằm
loại bỏ tuyến đực. Viện Nghiên cứu Nuôi trồng
Thủy sản 2 (Viện TS 2) hiện đã thực hiện thành

công công nghệ vi phẫu loại bỏ tuyến đực nhằm
sản xuất giống tơm càng xanh tồn đực từ năm
2004. Trên nền tảng thành công đạt được từ công
nghệ vi phẫu loại bỏ tuyến đực, Viện TS 2 tiếp tục
thăm dò và đạt được những kết quả thử nghiệm
thành công bước đầu của giải pháp khác trong
việc tạo con tôm cái neo-female. Đây là giải pháp
công nghệ can thiệp vào tuyến đực bằng phương
pháp sinh học. Công nghệ này được gọi là sự can
thiệp vào sợi RNA thông tin (RNA interference –
iRNA) nhằm bất hoạt việc giải mã hormone được
sinh ra từ tuyến đực. Interference RNA (iRNA)
gene, tạm dịch là can thiệp gene RNA. Cơ chế của
công nghệ iRNA là dùng trình tự RNA đặc biệt
(siRNA), small interfering RNA, để can thiệp sự
biểu hiện của gene đích. siRNA là những đoạn
RNA ngắn khoảng từ 19 - 22 nucleotide đã được
phát hiện từ lâu trong di truyền vi sinh vật, động
vật, thực vật và người. Trong tế bào, siRNA được
cho là mang một vai trò quan trọng trong việc
điều tiết tiết sự phân giải mRNA. Khi đoạn mạch
đôi siRNA kết hợp với sự hiện diện của phức hợp
RISCs, RNA-induced silencing complexes, nó
sẽ được tháo xoắn và thực hiện q trình iRNA.
Quá trình được xảy ra khi phức hợp đoạn mạch
đơn siRNA và RISCs tiến đến trình tự bổ sung
RNA. Tại dây, phức hợp này sẽ cắt và phân hủy
đầu điều khiển hoạt động của RNA (cognate
4

RNA). Kết quả là không có RNA cho q trình
giải mã tổng hợp protein hay hormone của gene
đó. Cơng nghệ can thiệp iRNA bất hoạt sợi RNA
thơng tin mã hóa gen tuyến đực insuline–like
của tơm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii
insulin–like androgeneic gland, Mr–IAG) được
nghiên cứu và cơng bố bởi nhóm tác giả Ventura
và ctv năm 2009.

Mục tiêu của nghiên cứu này là xây dựng
quy trình tổng hợp Mr - IAG RNA mạch đôi dsRNA (sợi đôi RNA của Insulin-like Gene tạo
hormone của tuyến đực quy định giới tính tơm
càng xanh) nhằm ứng dụng trong việc chuyển
giới tơm càng xanh tạo con tơm neo-female cho
mục đích sản xuất ra quần thể tơm tồn đực.
II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
* Thời gian thực hiện: từ ngày 01 tháng
05 năm 2012 đến ngày 01 tháng 11 năm 2013.


* Địa điểm nghiên cứu:

- Phịng thí nghiệm Di truyền Phân
tử - Phịng Sinh học Thực nghiệm thuộc Viện
Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2, 116 Nguyễn
Đình Chiểu, phường Đa Kao, Quận 1, Thành
phố Hồ Chí Minh.
- Cơ sở Nghiên cứu Thực nghiệm và Sản
xuất Thủy sản Thủ Đức, địa chỉ 658 Kha Vạn

Cân, quận Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh.
2.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Tơm và hệ thống thí nghiệm: Tơm post
càng xanh tồn đực Pl l0-25: 2.000 con sử dụng
cho thí nghiệm tiêm sợi dsRNA; tơm được
cung cấp từ Cơ sở Nghiên cứu Thực nghiệm và
Sản xuất Thủy sản Thủ Đức (TP.HCM) và thí
nghiệm tiêm tơm sẽ được thực hiện tại cơ sở
này. Tơm thí nghiệm được ni trong hệ thống
nước tuần hồn RAS; tơm được cho ăn thức ăn
thương mại dạng viên Tomboy, có bổ sung thêm
thức ăn tươi: trùn chỉ, gan và đầu mực; mỗi ngày
cho ăn hai lần vào buổi sáng và chiều, định kỳ 2
tuần làm siphon, vệ sinh các bể một lần để loại
bỏ bớt chất thải.

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014


VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN 2

Hình 1. Hệ thống RAS cho hai bể tơm thí nghiệm: bể tơm mẹ đang ni sau 3 tháng thí nghiệm và
bể tơm đang tiêm sợi đơi dsRNA (có các giai nắp xanh)
Tổng hợp sợi đôi dsRNA Mr-IAG
- Vật liệu DNA mẫu cho việc tổng hợp sợi
đôi dsRNA Mr-IAG là chủng E.coli JM109 có
chứa vector pGEM–T Easy mang trình tự cDNA
mạch khn (JM109 (pGEMT-cDNA)).
Bảng 1. Trình tự mồi của hỗn hợp phản ứng
Thứ

tự

Primer

1
2

- Quy trình tổng hợp sợi đơi dsRNA MrIAG: sợi đơi dsRNA Mr-IAG được tổng hợp
bằng bộ kit T7 Express của Promega.

Sequence primer
Forward (5’→3’)

Reverse(5’→3’)

Mr–IAG
Sense

T7P (5-TAATACGACTCACTATAGGG-3)
ATGGGATACTGGAATGCCGG

CTGGAACTGCAGGTGTTAAG

Mr–IAG
Antisense

ATGGGATACTGGAATGCCGAG

T7P (5-TAATACGACTCACTATAGGG-3)
CTGGAACTGCAGGTGTTAACG

Khuếch đại số lượng sợi sense và antisense
DNA: thành phần chuẩn bị cho 2 eppendorf phản
ứng PCR: 48 µl Go Taq colorless master Mix –
Promega và 1µl mạch khn (vector pGEM–T
Easy mang trình tự cDNA mạch khn) cho cả
hai eppendorf; 0,5 µl mỗi mồi T7 sense forward
và reverse cho ống khuếch đại sợi sense; 0,5 µl
antisense T7 reverse và forward primer cho ống
khuếch đại số lượng sợi antisense. Chu trình
nhiệt cho phản ứng PCR như sau: chu kì 1 (x1)
94oC trong 3 phút, chu kì 2 (x 35) 94oC trong 30
giây, 57oC trong 30 giây, 72oC trong 1 phút, chu
kì 3 (x1) 72oC trong 10 phút, giữ sản phẩm ở 4oC.
Kết quả sản phẩm khuyếch đại khoảng 560bp.

Tổng hợp sợi đơn sense và antisense
RNA thành phần của phản ứng lai cho mỗi
tube sợi sense và antisense RNA từ sợi sense
và antisense DNA đã tinh sạch (The Wizard®
SV Gel and PCR Clean-Up kit – Promega):
Ribomax Express Buffer 10 µl, T7 DNA mạch
khn (sense hoặc antisense) 8 µl, Enzyme Mix
T7 2 µl. Điện di trên gel agarose 1.5 %, 100V,
40 phút để kiểm tra sự hiện diện của sợi sense,
antisense RNA trước khi lai tadsRNA sau khi
lai và các sợi này sau khi đã được xử lý với các
loại enzymetheo thứ tự RNase, DNase, hỗn hợp
RNase, DNase, RNase III.

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014

5


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Các tube sợi sense và antisense RNA này
được ủ ở 37oC qua đêm và sau đó đem trộn
chung ống sense và ống antisense, heat nhiệt
70oC trong 10 phút để lai hai mạch này lại với
nhau bằng máy luân nhiệt iCycle (Bio - rad),
làm lạnh xuống 4oC. Xử lý hỗn hợp tạo thành
bằng 1 µl theo thứ tự mỗi loại enzyme DNase,
RNase, RNase III, ủ ở 37oC trong 5 phút.
Tiêm dsRNA vào tôm: Trong thí nghiệm
này tơm sẽ được tiêm dsRNA với nồng độ 5μg/g
trọng lượng tôm và lô đối chứng chỉ tiêm nước
muối sinh lý 9‰. Mỗi nghiệm thức gồm 10 –
15 con tôm post, trọng lượng mỗi con khoảng
0,01g đến 0,1g được nuôi trong các giai lưới
2mx2m. Tiến hành tiêm dsRNA cho tơm liên
tục với tần suất tiêm (½ tuần/lần, 1 tuần/lần và
2 tuần/lần) trong khoảng thời gian là 3 tháng.
Tôm càng xanh đực có 2 lỗ sinh dục đực nằm
ở bên cạnh đốt gốc của đơi chân ngực thứ 5 do
đó chọn vị trí tiêm dsRNA vào tơm là ngay vị
trí xoang của gốc chân bò thứ 5 (Ventura, 2009).
DsRNA được tiêm vào tôm bằng kim tiêm
Exmire Microsyringe (Fuji, Japan) thể tích tối
đa của kim là 10µl, thể tích tiêm dsRNA vào

tôm là tùy vào nồng độ và tùy theo trọng lượng
của từng con.
Kiểm tra tơm: Sau mỗi tháng thí nghiệm tất
cả tôm (kể cả lô đối chứng) được kiểm tra giới
tính dựa vào đặc điểm hình thái của nó, đối với
những con trưởng thành thì việc phân biệt khá
dễ dàng chủ yếu vào nhú lồi sinh dục đực ở gốc
chân ngực số 5. Ngồi ra tơm đực cịn có nhánh
phụ đực nằm kế nhánh trong của chân bụng thứ
2 (chỉ có chân bụng thứ 2 mới có nhánh phụ đực
cịn các chân khác thì khơng có), ở con cái thì
khơng có nhánh này. Sau ba tháng thí nghiệm,
thơi ngưng tiêm dsRNA và tiếp tục nuôi dưỡng
trong điều kiện tốt nhất để kiểm tra sự chuyển
cái của tơm thí nghiệm. Những con cái chuyển
giới thành công do tiêm sợi đôi dsRNA được
đánh dấu bằng phẩm màu flourence để dễ theo
dõi trong các giai đoạn sau.
6

Xử lý số liệu: sử dụng thống kê Fisher exact
test (two-tailed) so sánh kết quả tỷ lệ chuyển
cái thành cơng ở các nghiệm thức trong các thí
nghiệm tiêm tôm.
III. KẾT QUẢ
3.1. Tổng hợp Mr-IAG dsRNA
3.1.1. Tổng hợp các sợi đơn sense và
antisense RNA
Sản phẩm các sợi đơn sense và antisense
RNA đúng kích thước 560 bp và sau đó được

tinh sạch trước khi cho vào lai ủ để tạo sợi đơi
dsRNA.

Hình 2. Sợi sense và antisen RNA. Bên trái
thang DNA là sản phẩm sau khi tinh sạch:
giếng S là sợi sense, giếng AS là sợi antisense.
Bên phải thang DNA là sản phẩm trước khi
tinh sạch:giếng S là sợi sense, giếng AS là sợi
antisense
3.1.2. Kiểm tra chất lượng sợi đôi dsRNA
Ở bước này, nghiên cứu kiểm chứng lại
một lần nữa là trình tự gen đích (dsRNA/MrIAG) có được tổng hợp thành công để chuyển
thành sợi đôi dsRNA hay không. Các mẫu
được pha loãng 50 lần để thực hiện bước kiểm
tra chất lượng.

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
kiểm tra xử lý sợi single - stranded RNA (sense
hoặc antisense) với RNase, sợi này sẽ bị phân
hủy bởi enzyme này nên khi điện di sẽ không
cho vạch xuất hiện trên gel. Nhưng khi xử lý nó
với DNase thì nó vẫn khơng bị phân giải do đó
có băng hình xuất hiện trên gel với kích thước
khoảng 560 bp. Khi nó được xử lý với hỗn hợp
hai enzyme DNase và RNase thì do có sự hiện
diện của RNase nên kết quả sau điện di cũng
khơng cho băng hình nào trên bảng gel.

Hình 3. Kết quả xử lý các sợi sense, antisense,
sRNA bằng các loại enzyme, mẫu được pha
loãng 50 lần
Các giếng bên trái thang DNA là các giếng
thể hiện phản ứng kiểm tra sợi đơn. Giếng S là
sợi đơn RNA sense, giếng D là sợi đơn RNA
sense xử lý với DNase, giếng R là sợi đơn RNA
sense xử lý với RNase, giếng D + R là sợi sense
được xử lý với hai loại enzyme DNase và Rnase.
Bên phải thang DNA là các thử nghiệm
kiểm tra sợi đôi double – stranded RNA
(dsRNA). Giếng DS là sợi đôi dsRNA sau khi
lai hai mạch sense và antisense, giếng D là sợi
đôi dsRNA được xử lý với DNase, giếng R là
sợi đôi dsRNA được xử lý với RNase, giếng D +
R là sợi đôi dsRNA được xử lý với hai enzyme
DNase và RNase, giếng RIII là sợi đôi dsRNA
được xử lý với RNase III, giếng C là Positive
control. Khi xử ký kiểm tra sợi dsRNA thì do
nó là sợi đơi nên khơng bị phân giải bởi RNase.
Tuy nó là sợi đơi nhưng bản chất nó khơng phải
là DNA nên cũng không bị phân giải bởi DNase.
Khi xử lý bằng hỗn hợp hai enzyme DNase và
RNase thì cũng khơng bị phân giải. Cho nên tất
cả các giếng này đều cho băng hình kích thước
khoảng 560 bp trên agrose 1.5%. Tuy nhiên khi
được xử lý bằng RNase III - một loại enzyme
có khả năng phân giải RNA sợi đơi thì trên gel
điện di khơng cho băng hình sản phẩm double –
stranded RNA. Positive control cho kết quả trên

gel điện di với kích thước khoảng 1000 bp.
Bên trái thang DNA là các thử nghiệm kiểm
tra sợi đơn single - stranded RNA (ss RNA). Khi

3.2. Thử nghiệm tiêm sợi đôi dsRNA
vào tôm
Kết quả các thí nghiệm tiêm sợi đơi dsRNA
vào tơm post càng xanh toàn đực được thể hiện
theo 3 độ tuổi tơm post tồn đực khác nhau:
PL17, PL25 và PL10 được thể hiện ở bảng 2
và một số hình ảnh tơm thí nghiệm chuyển cái
được minh họa ở hình 4. Trong thí nghiệm tiêm
tơm ở tuổi PL17, tổng số lượng tơm tiêm là 36
con chia đều 3 nghiệm thức tiêm. Số lượng tơm
chuyển cái cịn lại đến tháng thứ 4 sau khi loại
trừ số tôm hao hụt và tôm chuyển cái khơng
thành cơng là 20 con. Tương tự cho trường hợp
thí nghiệm tiêm tôm ở tuổi PL25, tổng số lượng
tôm tiêm là 45 con, số tôm chuyển cái cuối cùng
là 16 con. Nhìn chung, kết quả tỷ lệ chuyển cái
thành cơng ở hai thí nghiệm này có khác biệt
nhau (tỷ lệ này khoảng 55% ở thí nghiệm tơm
PL17 và 35% trong thí nghiệm tơm PL25). Tuy
nhiên khi sử dụng thống kê Fisher exact test
(two-tailed) so sánh kết quả hai thí nghiệm tiêm
tơm PL17 và PL25 thấy khơng khác biệt có ý
nghĩa (P = 0,1147).
Khi so sánh kết quả thí nghiệm tiêm tơm
ở tuổi tơm PL17 và PL10 thì thống kê Fisher
exact test (two-tailed) cho kết quả tỷ lệ chuyển

cái thành công ở hai thí nghiệm này là khác biệt
có ý nghĩa (P = 0,0291). Đồng thời kết quả tỷ
lệ chuyển cái thành cơng ở hai thí nghiệm tuổi
tơm PL25 và PL10 là có sự khác biệt có ý nghĩa
lớn (P < 0,0001).
Căn cứ trên yếu tố tần suất tiêm thì ở cả hai
thí nghiệm tơm PL17 và PL25 thì khơng có sự
khác biệt có ý nghĩa ở cả 3 nghiệm thức tiêm (P
> 0,05). Chỉ trong thí nghiệm tiêm tơm ở tuổi

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014

7


VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN 2
PL10 thì có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê
giữa nghiệm thức tần suất tiêm 1 tuần/lần và 2

tuần/lần (P = 0,0355). Như vậy tần suất tiêm có
ảnh hưởng đến khả năng chuyển cái.

Bảng 2. Kết quả các thí nghiệm tiêm sợi đơi dsRNA vào tơm post càng xanh tồn đực
Tuổi
tơm
PL17

PL25

PL10

Thời gian thí nghiệm

Đối chứng

Tần suất tiêm (tuần/lần)
½ tuần

1 tuần

2 tuần

Tổng số

Ban đầu

10

12

12

12

Tháng thứ 1

10

10

10

11

Tháng thứ 2

9

10

9

11

Tháng thứ 3: ngưng tiêm

9

7

6

7

20

Số tôm chuyển cái sau 1 tháng
ngưng tiêm

0

7

6

7

20

Ban đầu

13

15

15

15

45

Tháng thứ 1

13

15

10

15

Tháng thứ 2

10

13

7

15

Tháng thứ 3: ngưng tiêm

10

7

4

10

21

Số tôm chuyển cái sau 1 tháng
ngưng tiêm

0

7

1

8

16

100

100

200

67

81

148

67

81

148

Ban đầu

100

Tháng thứ 2,5: ngưng tiêm
Số tôm chuyển cái sau 1 tháng

ngưng tiêm

0

36

Hình 4. Tơm chuyển cái
thành cơng. A: quan sát nhú
lồi ở vị trí chân bị số 5. B:
quan sát gai sinh dục đực
ở chân bơi số 2 dưới kính
hiển vi. Tơm chuyển cái
khơng thành cơng C: nhú
lồi ở vị trí chân bị số 5. D:
gai sinh dục đực ở chân bơi
số 2. E: chân bơi số 2 của
tơm chuyển cái có dấu hiệu
bất thường.
8

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - 3 - THÁNG 6/2014


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
IV. THẢO LUẬN
Sản phẩm sợi đơi dsRNA Mr-IAG cho
kết quả ở kích thước khoảng 550bp và trình tự
tương đồng cao (99%: phân tích giải trình tự từ
kết quả trước của đề tài) với trình tự cơng bố của
tác giả Ventura (2009). Đồng thời qua việc kiểm

tra chất lượng dsRNA Mr-IAG ( kiểm tra, xử lý
bằng 3 loại enzyme đặc thù) cho thấy sản phẩm
sợi đôi dsRNA Mr-IAG tổng hợp được là RNA
mạch đôi và đứng trình tự cơng bố và sẵng sàng
cho việc thử nghiệm tiêm sợi dsRNA vào tôm.
Kết quả tiêm tôm cho thấy, trong cả ba
thí nghiệm trên 3 độ tuổi tơm post tồn đực
khác nhau: PL17, PL25 và PL10 thì đều cho
kết quả chuyển cái. Tuy nhiên ở độ tuổi càng
lớn PL25 thì hiệu quả chuyển cái thấp (ở đây
khơng báo cáo số liệu chi tiết về số tôm không
chuyển cái là do tôm bị hao hụt và một phần
do tơm đã chuyển cái nhưng bị quay trở lại giới
tính ban đầu là tôm đực – ‘lại đực’). Tuy nhiên
trong q trình thí nghiệm, tơm lớn PL25, rất
dễ tiêm, tỷ lệ sống cao, ít hao hụt nhưng tơm
ở tuổi này đã có dấu hiệu biệt hố giới tính
nên khả năng ức chế hoạt động phát triển của
hormone sinh dục đực của sợi dsRNA là không
đạt hiệu quả cao. Ngược lại, tơm nhỏ PL10, khi
tiêm thì chỉ có số liệu tơm do hao hụt cịn tỷ lệ
‘lại đực’ gần như khơng có. Trong thí nghiệm
tiêm tơm PL10, sự khác biệt có ý nghĩa giữa
hai tần suất tiêm chủ yếu là do khi giảm tần
suất tiêm sẽ giảm tỷ lệ hao hụt vì tiêm nhiều
lần, tơm yếu và dễ chết dẫn đến tỷ lệ tơm cịn
lại chuyển cái thành cơng thấp.
V. KẾT LUẬN
Chất lượng sợi đơi dsRNA có hiệu quả
chuyển đổi giới tính cho tơm càng xanh hậu ấu

trùng đực.
Tuổi tơm ảnh hưởng rất lớn đến sự chuyển
cái của tơm thí nghiệm tiêm sợi đơi dsRNA,
tuổi tơm càng nhỏ thì hiệu quả chuyển cái càng
cao và tỷ lệ tôm lại đực sẽ không xảy ra. Tần
suất tiêm không ảnh hưởng nhiều đến tỷ lệ tôm

chuyển cái thành công, nhưng tần suất tiêm
càng dày thì tơm phát triển kém hoặc tăng tỷ lệ
chết do tơm yếu khi tiêm nhiều lần.
LỜI CÁM ƠN
Nhóm thực hiện đề tài xin chân thành cám
ơn đến Vụ KHCN&MT, Ban lãnh đạo Viện
Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II, Trung tâm
Quốc gia Giống Thủy sản Nước ngọt Nam Bộ
và các thành viên đề tài đã tận tình định hướng
kịp thời, đóng góp ý kiến chiến lược để đề tài có
kết quả thành cơng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Aigner A., 2007. Nonviral in vivo delivery of therapeutic small interfering RNAs. Curr. Opin. Mol. Ther.
9, pp 345–352.
Davis M.E., Zuckerman, Chung Hang J., Choi, David
Seligson, Anthony Tolcher, Christopher A., Alabi,
Yun Yen, Jeremy D., Heidel & Antoni Ribas, 2010.
Evidence of IRNA in humans from systemically
administered siRNA via targeted nanoparticles.
Nature. 2010 Apr 15; 464(7291):1067–70. Epub
2010 Mar 21.
Fingerman M., 1997. Role of neurotransmitters in
regulating reproductive hormon release and

gonadal maturation in decapods crustaceans,
Invertebrate Reproduction and Development 31,
pp 47– 74.
Galvani A., and Sperling L., 2002. RNA interference by
feeding in Paramecium. Trends Genet 18, 11–12.
Guan, Haoji, 2006. Double–stranded RNA induced
gene silencing of neuropeptide genes in sand
shrimp, Metapenaeus ensis and development
of crustacean primary cell culture. Hong Kong
University.
Nagamine C., Knight W., Maggeneti A., and Paxman, G.,
1980. Masculinization of female Macrobrachium
rosenbergii (de Man) (Decapoda, Palaemonidae)
by androgeneic gland implantation, General and
comparative endrocrinology 31(4), 442–457.

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - 3 - THÁNG 6/2014

9


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Ongvarrasopone C., Roshorm Y., and Panyim S., 2007.
A Simple and Cost Effective Method to Generate
dsRNA for IRNA Studies in Invertebrates. Science
Asia 33, 35–39.

Sagi Amir, Snir Eviatar and Khalaila Isam, 1995. Sexual
differentiation in decapods crustaceans: role of the
androgeneic gland. Invertenrate Reproduction an

Development 31 (1–3), 55 – 61.

Paddison P.J., Caudy A.A., Bernstein E., Hannon
G.J., Conklin D.S., 2002. Short hairpin RNAs
(shRNAs) induce sequence–specific silencing in
mammalian cells. Genes Dev. 16, 948–958.

Sagi A., and Ra`ana Z., 1988. Morphotypic
differentiation of males of freshwater prawn
Macrobrachium rosengergii: changes in the
midgut glands and the reproductive system.
Journal of crustacean biology 8, 43–47.

Peng Y., Lu J.X., Shen X.F., 2007. shRNA driven by
Pol II/T7 dual–promoter system effectively induce
cell–specific RNA interference in mammalian
cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 360,
496–500.
Plasterk, 2002. RNA silencing: the geneome’s immune
system. Science 17 May 2002: Vol. 296 no. 5571
pp. 1263–1265.
Sachiko Suzuki, 1999. Androgeneic gland hormon
is a sex–reversing factor but cannot be a sex–
determining factor in the female Crustacean
Isopods  Armadillidium vulgare. General and
comparartive endrocrinology 115(3), 370–378.
Sagi A., and Afalo E.D., 2005. The androgeneic
gland and monosex culture of freshwater prawn
Macrobrachium Rosenbergii (De Man):a
biotechnological

perspective.
Aquaculture
Research 36, 231–237.
Sagi Amir, Cohen Dan, Milner Yoram, 1989. Effect
of androgene gland ablation on morphotypic
differentiation and sexual characteristics of male
Freshwater Prawn, Macrobrachium rosenbergii,
General and comparative
endocrinology 77,
15 – 22.
Sagi A., Milstein A., Eran Y., Joseph D., Khaila I.,
Abdu U., Harpaz S., and Karplis I., 1997. Culture
of the Australian redclaw crayfish (Cherax
quadricarinatus) in Israel, II. Second growout
season of overwintered populations. Israelli
Journal of Aquaculture–Bamidgeh 59, 222–229.
Sagi A., Khalaila I., Barki I., Hulata G., and Karplus
I., 1996. Intersex red claw crayfish, Cherax
quadricarinatu (Von martens): functional males
with pre–viellogeneic ovaries. Biol.Bull 190,
16–23.

10

Sanders B., 1983. Insulin–like peptides in the lobster
Homarus americanus.I. insulin immunoreactivity.
General and Comparative Endocrinology 50,
366–373.
Spence R. Malecha, Patricia, Nevin A., Phyllis Ha,
Loena E. Barck, Yara Lamadrid–Rose, Scott

Masuno and Dennis Hedgecock, 1992. Sex–
ratios and sex–determination in progeney from
crosses of surgically sex–reversed freshwater
prawns, Macrobrachium rosenbergii. Aquaculture
105(3–4), pp 201–218.
Tabara H., Grishok, A., Mello, C., 1998. IRNA in
C.elegans: Soaking in the Geneome Sequence.
Science 16 October 1998: Vol. 282 no. 5388, pp.
430–431.
The Nobel Prize in Physiology ỏ Medicin, 2006. RNA
interference, pp 1–10.
T., Ramos L., Huberman A., 2007. Effect of RNA
interference on gene functions of aquatic
organisms. Biotecnologia Aplicada Vol. 24, No. 2.
Ventura T., Manor R., Aflalo E.D., Weil S., Raviv S.,
Glazer L., and Sagi A., 2009. Temporal silencing
of an androgeneic gland–specific insulin–like
gene affecting phenotypical geneder differences
and spermatogenesis. Department of Life. General
Endocrinology 150, 1278–1286.
Zamore P.D., Tuschl T., Sharp P.A., and Bartel D.P.,
2000. IRNA: Double–stranded RNA directs the
ATP–dependent cleavage of mRNA at 21 to 23
nucleotide intervals. Cell. 101, 25–33.

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2

ALL MALE REPRODUCTION OF Macrobrachium rosenbergii BY INSULINLIKE GENE SILENCING IN THE ANDROGENIC GLAND THROUGH RNA
INTERFERENCE
Bui Thi Lien Ha1, Nguyen Duc Minh1, Le Thi Hoai Oanh1, Tran Thanh Vo1, Nguyen Dien1,
Le Chinh1, Nguyen Viet Dung2, Nguyen Van Hao3

ABSTRACT
Within the aquaculture industry in Vietnam, the demand of the all male prawn Macrobrachium
rosenbergii seed is one of overriding importance.  Macrobrachium rosenbergii is an important
freshwater prawn species having commercial importance in Vietnam. The all male prawn farming
brings most highly profitable for farmers; therefore seed demand for popular culture is always
very high. Lasted technology called RNA interference for creating neo-female is inactivated a
single IAG-encoding gene of male insulin-like prawn (Macrobrachium rosenbergii insulin-like
androgeneic gland, Mr-IAG) for producing all male seed is being successfully implemented at the
Research Institute for Aquaculture No. 2. The currently result has achieved with double-stranded
RNA (dsRNA) synthesis to mRNA encodes Androgenic Gland. The important factor for success is
very young shrimp age at the time of the first injection, period and time of injections. Sex reversal
rate after two to three months injection is 88-92% female, dsRNA of injection time around 2 months;
frequency of dsRNA injection is 2 weeks.
Keywords: fresh water prawn, sex-reversal, iRNA.

Người phản biện: ThS. Nguyễn Thị Hiền
Ngày nhận bài: 10/02/2014
Ngày thông qua phản biện: 28/02/2014
Ngày duyệt đăng: 01/4/2014

Department of Experimental Biology, Research Institute for Aquaculture No 2.
Email:
2
Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture No 2.
3

Research Institute for Aquaculture No 2.
1

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014

11