Nghiên cứu chiết tách, phân lập và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hợp chất kaempferol 3 o d glucopyranoside từ hoa đu đủ đực thu hái tại quảng nam – đà nẵng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

LÊ CHUNG THÚY LY

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, PHÂN LẬP VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO
UNG THƢ CỦA HỢP CHẤT KAEMPFEROL-3-O-β-D-GLUCOPYRANOSIDE
TỪ HOA ĐU ĐỦ ĐỰC THU HÁI TẠI QUẢNG NAM - ĐÀ NẴNG

LUẬN VĂN CỬ NHÂN HÓA HỌC

Đà Nẵng - Năm 2020


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

LÊ CHUNG THÚY LY

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, PHÂN LẬP VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO
UNG THƢ CỦA HỢP CHẤT KAEMPFEROL-3-O-β-D-GLUCOPYRANOSIDE
TỪ HOA ĐU ĐỦ ĐỰC THU HÁI TẠI QUẢNG NAM – ĐÀ NẴNG

LUẬN VĂN CỬ NHÂN HÓA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
ThS. Đỗ Thị Thúy Vân

Đà Nẵng - Năm 2020

LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai cơng
bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Đà Nẵng, ngày tháng năm 2020
Tác giả

LÊ CHUNG THÚY LY


LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian học tập và rèn luyện tại Trƣờng Đại học Sƣ phạm - ĐHĐN,
bằng sự biết ơn và kính trọng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến khoa Ho Học
thu c Trƣờng Đại học Sƣ phạm và c c Thầy C trong khoa đã nhiệt tình hƣớng dẫn,
giảng dạy và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong suốt qu trình học tập,
nghiên cứu và hoàn thiện đề tài kh a luận tốt nghiệp.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới C Đ Thị Thúy Vân, ngƣời
đã trực tiếp hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong qu trình thực hiện c ng nhƣ hoàn thành
đề tài kh a luận tốt nghiệp
Xin chân thành cảm ơn bạn bè cùng đồng nghiệp đã tạo điều kiện đ cho em
tìm tịi, nghiên cứu đ hoàn thành đề tài này
Tuy nhiên điều kiện về năng lực bản thân còn hạn chế, chuyên đề nghiên cứu
khoa học chắc chắn kh ng tr nh khỏi những thiếu s t Kính mong nhận đƣợc sự
đ ng g p ý kiến của c c thầy c gi o, bạn bè và đồng nghiệp đ bài nghiên cứu của
em đƣợc hoàn thiện hơn
Em xin trân trọng cảm ơn!


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

1 Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................................... 1
2 Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................ 2
3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ........................................................................... 2
4 Phƣơng ph p nghiên cứu ......................................................................................... 2
4 1 Phƣơng ph p nghiên cứu lý thuyết .................................................................. 2
4 2 Phƣơng ph p nghiên cứu thực nghiệm ............................................................ 3
5 Bố cục của luận văn ................................................................................................ 3
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 4
1 1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ ........................................................................... 4
1 2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CUẢ CÂY ĐU ĐỦ
TRONG NƢỚC .......................................................................................................... 6
1 3 NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ NGỒI
NƢỚC ......................................................................................................................... 7
1 4 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ .... 9
1 4 1 T c dụng trị giun s n ......................................................................................... 9
1 4 2 T c dụng hạ huyết p ...................................................................................... 10
1 4 3 T c dụng kh ng sinh, kh ng nấm.................................................................... 10
1 4 4 T c dụng trị u bƣớu, ung thƣ........................................................................... 11
1 4 5 T c dụng chống oxi h a .................................................................................. 12
1.4.6. C c t c dụng dƣợc lý kh c .............................................................................. 12
1 4 7 C ng dụng trong dân gian ................................................................................ 12
1.5 CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO ............... 13
1 5 1 Phƣơng ph p MTT .......................................................................................... 13
1 5 2 Phƣơng ph p SRB ........................................................................................... 14
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 15
2 1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ............................. 15
2 1 1 Nguyên liệu ..................................................................................................... 15
2 1 2 H a chất và thiết bị nghiên cứu....................................................................... 15

2 2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 16
2 2 1 Phƣơng ph p chiết mẫu thực vật ..................................................................... 16
2 2 2 Phƣơng ph p t ch và tinh chế chất.................................................................. 16
2 2 3 Phƣơng ph p x c định cấu trúc hóa học của các hợp chất .............................. 16
2 3 SƠ ĐỒ ĐIỀU CHẾ CÁC CAO CHIẾT ............................................................. 17
2 4 THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƢ CỦA CAO CHIẾT
ETHYL ACETATE .................................................................................................. 17
2 5 CHẠY CỘT SẮC KÍ PHẦN CAO ETHYL ACETATE ................................... 18
2 6 THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƢ CỦA CHẤT SẠCH ...... 20
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 22
3 1 THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƢ CỦA CAO CHIẾT
ETHYL ACETATE TỪ HOA ĐU ĐỦ ĐỰC ........................................................... 22
3 2 PHÂN LẬP HỢP CHẤT HÓA HỌC TRONG PHÂN ĐOẠN CAO CHIẾT
ETHYL ACETATE .................................................................................................. 22
3 3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƢ CỦA
HỢP CHẤT CPE4..................................................................................................... 26
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 27
1 KẾT LUẬN ........................................................................................................... 27
2 KIẾN NGHỊ .......................................................................................................... 27
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 28


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
d

: Doublet (NMR)

J(Hz)

: Hằng số tƣơng t c (NMR)

Rf

: Retention factor

s

: Singlet (NMR)

ppm

: Parts per million

δ

: Đ chuy n dịch h a học (NMR)

BuOH

: Butanol

CD3OD

: Methanol- D

CHCl3

: Chloroform

D

: Dichlomethane

DMSO

: Dimethyl sunfoxide

DEPT

: Distortionless enhancement by polarisation transfer

EtOAc

: Ethyl acetate

EtOH

: Ethanol

HMBC

: Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HSQC

: Heteronuclear Single Quantum Corelation

MeOH

: Methanol

Me

: Methyl

MMT

: 3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide

NMR

: Nuclear magnetic resonance

SRB

: Sulforhodamine B

UV

: Ultraviolet

CPE4

: Tên hợp chất phân lập đƣợc


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Số hiệu
bảng

Tên bảng

Trang

2.1

Hợp chất CPE4: Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside

21

3.1

Hoạt tính gây đ c tế bào ung thƣ của cao chiết ethyl acetate

22

3.2

Số liệu phổ NMR của hợp chất CPE4 và hợp chất tham khảo

23

3.3

Hoạt tính gây đ c tế bào ung thƣ của hợp chất CPE4

27


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Số hiệu

Tên hình

hình

Trang

1.1

Hình ảnh đu đủ

5

2.1

Hoa đu đủ đực và b t hoa đu đủ đực

15

2.2

Sơ đồ điều chế các cao chiết

17

2.3

Sơ đồ phân lập hợp chất CPE4 từ phân đoạn dịch chiết ethyl
acetate hoa đu đủ đực

21

3.1

Cấu trúc hóa học của hợp chất CPE4

23

3.2

Phổ MS của hợp chất CPE4

24

3.3

Phổ 1H-NMR của hợp chất CPE4

25

3.4

Phổ 13C-NMR của hợp chất CPE4

25

3.5

Phổ DEPT của hợp chất CPE4

26


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cây đu đủ (Carica papaya Linn) là m t loại cây ăn quả c nguồn gốc từ vùng
nhiệt đới châu Mỹ Hiện nay, đu đủ đƣợc trồng ở c c nƣớc vùng nhiệt đới, những
nơi c nhiệt đ bình quân trong năm kh ng thấp hơn 150C Sản lƣợng đu đủ trên thế
giới khoảng trên 5 triệu tấn quả/năm
Ở Việt Nam, cây đu đủ đƣợc trồng hầu hết ở c c tỉnh miền Bắc và miền Nam
Tuy nhiên, chúng đƣợc trồng nhiều ở c c tỉnh đồng bằng, dọc theo c c con s ng,
trên c c loại đất phù sa C c tỉnh trồng nhiều đu đủ nhƣ: Hà N i, Hƣng Yên, Hà
Nam, Vĩnh Phúc, Tiền Giang, Cần Thơ, c c tỉnh Tây Nguyên,… Diện tích trồng đu
đủ của cả nƣớc ƣớc khoảng 10000 – 17000 hecta với sản lƣợng khoảng 200 – 350
nghìn tấn quả Cây đu đủ c lợi thế là loại cây dễ trồng, ra quả sớm, năng suất cao
đồng thời toàn b thân, l , quả đều đƣợc sử dụng với nhiều mục đích kh c nhau.
Ngồi việc lấy quả tƣơi, dùng làm nguyên liệu cho chế biến, đu đủ còn đƣợc trồng
đ lấy nhựa, dùng làm thức ăn chăn nu i
Trong dân gian lá cây đu đủ đƣợc sử dụng đ s t khuẩn, kh ng nấm, kh ng
viêm, chữa sốt rét, trừ giun s n… Đã c nhiều c ng trình nghiên cứu về hoạt tính
sinh học của l đu đủ Lá đu đủ đƣợc chứng minh là c khả năng chống oxy h a rất
mạnh Hoạt tính chống oxy h a này do c c hợp chất phenol gây ra L đu đủ c hoạt
tính kh ng khuẩn tốt, c khả năng kh ng nhiều loại vi khuẩn gram âm, gram dƣơng,
c c loại nấm Ngồi ra, l đu đủ cịn c khả năng kh ng viêm, giảm đau
Ở nƣớc ta, cao chiết với cồn từ l đu đủ đƣợc nghiên cứu trong m t số m hình
ung thƣ thực nghiệm và đƣợc chứng minh c t c dụng ức chế sự ph t tri n của khối
u gây bởi tế bào ung thƣ Sarcoma TG-180 ở chu t nhắt trắng Ngƣời dân nƣớc Úc
đã dùng l đu đủ chữa trị bệnh ung thƣ Đầu năm 2010, m t nh m nghiên cứu Nhật
Bản và Mỹ đã th ng b o dịch chiết nƣớc l cây đu đủ c t c dụng ức chế m t số

dòng tế bào ung thƣ ngƣời nhƣ ung thƣ dạ dày, ung thƣ phổi, ung thƣ m u,… Ngồi
ra, dịch chiết từ l đu đủ cịn c t c dụng h trợ hệ miễn dịch đ tấn c ng vào c c tế
bào ung thƣ Bằng c ch thúc đẩy sự gia tăng c c sản phẩm cytokine dạng Th1 nhƣ là
1


IL-12p40, IL-12p70, INF-γ và TNF-α, c c cytokine này c khả năng chống lại khối
u.
Gần đây, ngƣời dân địa phƣơng ở Quảng Nam – Đà Nẵng còn sử dụng hoa cây
đu đủ đực đ điều trị c c bệnh về đƣờng h hấp nhƣ viêm họng, ho… Ngoài ra, hoa
đu đủ đực còn đƣợc coi nhƣ thần dƣợc đ h trợ điều trị bệnh ung thƣ nhƣ: ung thƣ
phổi, ƣng thƣ vú và ung thƣ gan,…
Chính bởi c ng dụng chữa bệnh của cây đu đủ nhƣ trên, c rất nhiều đề tài nghiên
cứu đã tập trung x c định thành phần h a học và hoạt tính sinh học của lồi cây này
Thế nhƣng vẫn cịn rất ít nghiên cứu về b phận hoa của chúng
Việc sử dụng hoa đủ đực hiện nay vẫn chỉ theo kinh nghiệm dân gian Vì vậy,
việc tìm hi u thành phần h a học và cao hơn nữa là chứng minh đƣợc thành phần hoạt
chất cụ th của hoa đu đủ đực là m t việc làm hết sức cần thiết, tạo cơ sở khoa học cho
việc ứng dụng nguồn nguyên liệu sẵn c ở Việt Nam làm thuốc điều trị c c căn bệnh
hi m nghèo, trong đ c bệnh ung thƣ Trong điều kiện cho phép của luận văn cử nhân
h a học, t i chọn đề tài Nghiên cứu chiết tách, phân lập và hoạt tính gây độc tế bào
ung thƣ của hợp chất kaempferol-3-O--D-glucopyranoside từ hoa đu đủ đ c thu
hái tại Quảng Nam – Đà Nẵng làm đề tài luận văn của mình
2. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập hợp chất ho học từ phân đoạn dịch chiết ethyl acetate hoa đu đủ đực
và x c định cấu trúc ho học.
X c định hoạt tính gây đ c tế bào ung thƣ của hợp chất h a học đƣợc phân lập
từ hoa đu đủ đực
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
- Hoa đu đủ đực đƣợc thu h i tại Quảng Nam-Đà Nẵng

- Phân đoạn dịch chiết từ loài hoa trên với dung m i ethyl acetate.
- Hợp chất phân lập từ dịch chiết nghiên cứu
4. Phƣơng pháp nghiên cứu
4.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết
- Phƣơng ph p nghiên cứu c c hợp chất tự nhiên
2


- Nghiên cứu trên mạng Internet, tham khảo c c c ng trình nghiên cứu trên thế
giới về lồi cây này
- Tổng quan c c tài liệu về đặc đi m hình th i thực vật, thành phần ho học,
ứng dụng của c c b phận của cây đu đủ.
4.2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
- C c phƣơng ph p xử lý mẫu thực nghiệm
- C c phƣơng ph p chiết mẫu, phân lập c c hợp chất hữu cơ
- C c phƣơng ph p phân tích sắc ký lớp mỏng, sắc ký c t
- C c phƣơng ph p nghiên cứu cấu tạo hợp chất h a học: kết hợp c c phƣơng
ph p đo phổ c ng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, phổ hồng ngoại (IR), phổ
tử ngoại (UV) và c c phƣơng ph p kh c
5. Bố cục của luận văn
Luận văn gồm 32 trang, 3 bảng, 9 hình ảnh, 46 tài liệu tham khảo bao gồm:
Phần mở đầu (3 trang)
Chƣơng 1 – Tổng quan (11 trang)
Chƣơng 2 – Những nghiên cứu thực nghiệm (7 trang)
Chƣơng 3 – Kết quả và thảo luận (5 trang)
Kết luận (1 trang)
Tài liệu tham khảo (5 trang)

3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ
Đu đủ (Carica Papaya L), thu c họ đu đủ (Caricaceae), nguồn gốc Châu Mỹ
đƣợc trồng khắp nơi ở nƣớc ta Họ đu đủ (Caricaceae) trên thế giới gồm c 4 chi và
45 loài [16]. Cây đu đủ c tên khoa học là Carica papaya Linn. Cây nhỏ hoặc nhỡ,
cao từ 2 - 4 mét, thân thẳng, kh ng phân nh nh L to, mọc so le, tập trung ở ngọn
Cuống l rất dài, xẻ 5 - 7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, m i thùy lại chia tiếp
thành nhiều thùy nhỏ kh ng đều, gân l hình chân vịt, hai mặt nhẵn [1] Cây đu đủ
cịn đƣợc gọi thù đủ ở Huế, phiên m c, cà lào, phiên qua, phan qua thụ, l hong phlê
(Campuchia), mắc hung (Lào), m hống (Th i) Đu đủ thƣờng là cây đồng chu,
nhƣng đu đủ c th xếp thành 3 loại trên phƣơng diện giới tính: cây đực, cây lƣỡng
tính và cây cái. Vài cây đu đủ c ng c th trổ cả ba loại hoa n i trên Ngoài ra c ng
c cây ra hoa kh ng hẳn hoàn tồn đực, c i hay lƣỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít
đặc tính của ba loại hoa (Hình 1.1) Khuynh hƣớng thay đổi giới tính phần lớn do
thời tiết gây ra nhƣ kh hạn và thay đổi nhiệt đ [7] Ở Việt Nam, m t số giống đu
đủ hiện nay đang đƣợc trồng bao gồm:
* Giống Đu đủ ta: bao gồm c c giống đu đủ c từ lâu đời ở nƣớc ta Đặc tính
chung của nh m cây này là sinh trƣởng khỏe, l xanh đậm, song phiến l mỏng,
cuống l dài, mảnh nhỏ và thƣờng c màu xanh Thịt quả màu vàng, mỏng, năng
suất thấp
* Giống đu đủ Mêhico: là giống nhập n i trong những năm 70 của thế kỷ 20
Quả dài, tƣơng đối đặc ru t, thịt quả màu vàng, năng suất cao L xanh đậm, phiến
lá dày, cuống l to, màu xanh
* Giống đu đủ So Lo: còn c tên gọi kh c là đu đủ Mỹ, thân cây cao trung
bình, sinh trƣởng khỏe Quả hình quả lê, to, thịt quả màu vàng, chất lƣợng tốt, năng
suất cao, là giống yêu cầu nhiệt cao nên đƣợc trồng chủ yếu ở c c tỉnh phía Nam.
* Giống đu đủ Trung Quốc: là giống nhập từ Quảng Đ ng, Quảng Tây Trung
Quốc Cây thấp, sinh trƣởng trung bình, năng suất kh cao Quả dài, thu n dài, thịt

4


quả dày trung bình, thịt quả c màu vàng đến đỏ L c màu xanh đậm, chia thùy
sâu, phiến lá dày.
* Giống đu đủ Th i Lan: là giống đƣợc nhập trồng trong thời gian gần đây
Cây thấp, năng suất cao, quả to, ru t quả màu vàng, chất lƣợng tốt Tuy nhiên giống
này dễ bị nhiễm bệnh khảm l
* Giống đu đủ Đài Loan: là giống mới đƣợc nhập trồng trong thời gian gần
đây Cây thấp, sinh trƣởng khỏe, ít nhiễm bệnh, cho năng suất cao, khoảng 60 – 70
kg quả/ cây Thịt quả màu đỏ, ngọt, thơm, mềm mà kh ng n t, vỏ quả cứng dễ bảo
quản và vận chuy n L c màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến l dày [11]

A: hoa cái

D: tr i của cây c i

B: hoa lƣỡng tính

E: tr i lƣỡng tính
Hình 1.1. Hình ảnh Đu đủ

5

C: hoa đực

F: cây đực


1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CUẢ CÂY ĐU ĐỦ

TRONG NƢỚC
Năm 1983, Nguyễn Tƣờng Vân và c ng sự đã chiết xuất và x c định đƣợc
alkaloid carpaine trong lá đu đủ [13]
Năm 2007, Hà Thị Bích Ngọc đã sử dụng kỹ thuật HPLC phân tích c c chất
carotenoid trong lá đu đủ Kết quả cho thấy β-carotene, luteine chiếm tỷ lệ tƣơng
ứng là 57,05 và 11,864% so với tổng c c chất carotenoid, tuy nhiên kh ng x c định
đƣợc lycopene [9]
Năm 2012, Trần Thanh Hà đã phân lập đƣợc 4 chất từ phân đoạn chiết n-hexan
của l

đu đủ Bao gồm, β- sitosterol, daucosterol, cycloart -23-ene-3β,25-diol

(sterculin A) và cycloart-25-ene-3β,24 (R/S)-diol Trong đ , sterculin

A và

cycloart-25-ene-3β,24 (R/S)- diol là 2 tritecpen lần đầu tiên phân lập từ l đu đủ [4]
Theo nghiên cứu Nguyễn Văn Rƣ, V Quang Th i đã t ch chiết chymopapain
từ nhựa quả đu đủ xanh và chế thử thành dạng b t pha tiêm [10].

(1) β- sitosterol

(3) Sterculin A

(2) Daucosterol

(4) Cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol
6

Năm 2014, Hồ Thị Hà đã tiến hành chiết phân đoạn dịch chiết MeOH từ l đu
đủ bằng c c dung m i c đ phân cực tăng dần (n-hexan, CH2Cl2, EtOAc, buthanol).
Từ cặn chiết CH2Cl2 phân lập đƣợc 6 hợp chất: danielone, carpainone, axit pluchoic,
apocynol A, carpaine, pseudocarpaine Trong đ , carpainone là hợp chất mới và 2
chất danielone và apocynol A lần đầu tiên đƣợc chiết ra từ l đu đủ [5]
Năm 2015, Giang Thị Kim Liên và Đ Thị Lệ Uyên khảo s t thành phần h a
học của hoa đu đủ đực Kết quả cho thấy sự c mặt của alkaloid, este, acid béo, m t
số sterol trong hoa đu đủ đực thu h i tại Đà Nẵng [6].
1.3. NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ NGOÀI
NƢỚC
Trên thế giới, năm 1965, Govindachari Go, Nagarajan và Viswanathan đã x c
định đƣợc cấu trúc của carpaine và pseudocarpaine là alkaloid đƣợc chiết xuất từ l
đu đủ [27]

(5) Carpaine

(6) Pseudocarpaine

Năm 1979, Chung – Shih Tang đã phân lập đƣợc 2 alkaloid piperideine
là dehydrocarpaine I và dehydrocarpaine II từ l đu đủ [22] Cấu trúc của chúng
N
N

H

(7) Dehydrocarpaine I

(8) Dehydrocarpaine II

7

Năm 2002, David và c ng sự đã x c định đƣợc glycosid là prunasin và
sambunigrin trong l và thân đu đủ [23].

(9) Prunasin

(10) Sambunigrin

Năm 2007, Antonella Canini và c ng sự nghiên cứu c c hợp chất phenol trong
lá đu đủ cho kết quả c c hợp chất nhƣ sau: axit caffeic: axit p-coumari; axit
protocatechuic; kaempferol; quercetin và 5,7- dimethoxycoumair Cấu trúc phân tử
của m t số phenolic trong l đu đủ nhƣ sau [19].

(11) 5,7-dimethoxycoumair

(12) Axit protocatechuic

O
OH
O
COOH

OH

OH

OH
OH

(13) Axit chlorogenic
Năm 2008 Krishna K L và c ng sự đã tổng hợp c c c ng trình nghiên cứu về
thành phần h a học c c b phân cây đu đủ [30]


Quả: protein, chất béo, xenluloza, carbohydrate, chất kho ng, Ca, P, Fe,

vitamin C, B, B2, niacin và carotene, amino axit, acit citric, acid malic(quả xanh),
8


linalool, benzylisothiocyanate, cis và trans 2,6-dimethyl -3,6 epoxy-7 octen-2-ol,
alkaloid,

carpain,

benzy–β-D-glucoside,

2-phenylethyl–β-D-glucoside,

4-

hydroxyphenyl-2 ethyl –β-D-glucoside và 4 đồng phân benzyl-β-D-glucoside.


Nƣớc ép quả: N-butyric, n-haxanoic và n-octanoic acid, lipid, c c acid

myristic, palmatic, stearic, lioleic, linolenic, cis-vaccenic và oleic


Hạt: acid fatty, protein, chất xơ, dầu, carpaine, benzylisothiocyanate,

benzylglucosinolate, glucotropacolin, benzylthiourea, hentriacontane, β-sitosterol,
caricin và enzym myrosin.


R : carposide và enzym myrosin



L : alkaloid carpain, pseudocarpain và dehydrocarpain I và II, choline,

carposide, vitamin C, E.


Vỏ cây: β-sitosterol, glucose, fructose, sucrose, galactose và xylitol



Nhựa

mủ:

enzym

proteolytic,

papain

và

chemopapain,

glutamine

cyclotransferase, chymopapain A, B và C, peptid A và B và lysozyme
Năm 2015, Stephen Chinwendu và c ng sự c ng bố Nghiên cứu thành phần
h a học của hoa đu đủ ở Nigeria

Cho kết quả trong hoa chứa saponin (0.07%),

alkaloid (0.05%), tannin (0.002%) và flavonoid (2 8%) Ngồi ra cịn chứa c c
ngun tố v cơ Na, Ca, Mg, P và c c vitamin nhƣ B1, B2, B3, C [40]
C ng trong năm 2015, Marline Nainggolan, Kasmirul c ng bố kết quả trong
hoa đu đủ đực c chứa c c thành phần gồm triterpenoids, steroid, flavonoid, tannin,
và glycosides, saponin [33].
1.4. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ
C c phƣơng ph p nghiên cứu về hoạt tính sinh học, dƣợc lý của thực vậy đƣợc
c c nhà khoa học đặc biệt quan tâm [2], [3], [18], [29]. Hoạt tính sinh học của c c b
phận của cấy đu đủ nhƣ l , quả, nhựa đƣợc c c nhà khoa học trên thế giới c ng bố
khá phong phú.
1.4.1. Tác dụng trị giun sán
Năm 1994, Satrija và c ng sự nghiên cứu t c dụng trị giun s n của nhựa đu đủ
đã đƣợc thử nghiệm đ diệt giun s n ở súc vật [40]
9


Năm 2001, Kermanshai và c ng sự nghiên cứu dịch chiết từ hạt đu đủ đƣợc
thử nghiệm đ trị s n Caenorhabdi tiselegans. Kết quả cho thấy trong hạt c benzyl
isothiocynat (BITC) là hoạt chất chính c t c dụng diệt giun sán. C c phần kh c

nhau của cây c ng đã đƣợc thử nghiệm về hoạt tính diệt giun Ascaridia galli nhiễm
ở gia cầm [31]
1.4.2. Tác dụng hạ huyết áp
Năm 2000, Eno AE và c ng sự nghiên cứu dịch chiết ethanol từ tr i đu đủ
xanh đƣợc thử nghiệm trên chu t cống trắng đực C c kết quả nghiên cứu cho rằng
nƣớc ép từ quả đu đủ gây hạ huyết p do hoạt tính trên c c thụ th α-adrenoceptive
[24].
1.4.3. Tác dụng kháng sinh, kháng nấm
Năm 1997, Giordani và c ng sự nghiên cứu t c dụng của nhựa đu đủ ức chế sự
tăng trƣởng của nấm Candida albicans khi thêm vào m i trƣờng cấy nấm [26]
Đ Huy Bích, Đặng Quang Chung (2006) c ng bố nghiên cứu cao l đu đủ c
t c dụng kh ng khuẩn đối với Typhimurium mentagrophytes, T. rubrum và
Staphylococcus aureus. Cao chiết từ vỏ và hạt c t c dụng kh ng khuẩn đối với
Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa
và Shigella flexneri Benzyl isothiocyanate phân lập từ đu đủ, ức chế sự ph t tri n
của nhiều loại vi khuẩn gram dƣơng, gram âm nhƣ Escherichia coli, Penicillium
notatum và Shigella. Rễ đu đủ c t c dụng kh ng khuẩn yếu [1]
Năm 2011, Rahman và c ng sự nghiên cứu dịch chiết bằng ethanol 95% của l
và thân đu đủ đƣợc thử nghiệm hoạt tính kh ng vi khuẩn gram âm và gram dƣơng
tại nồng đ 5 và 10 mg/ml [38]
Năm 2014, Hồ Thị Hà đã chứng minh hợp chất pseudocarpaine c khả năng
kh ng vi khuẩn gram dƣơng Staphylococcus aureus với IC50 = 80 µg/ml, kh ng th
hiện hoạt tính kh ng c c chủng vi khuẩn gram dƣơng, gram âm và nấm kh c ở nồng
đ chất thử cao nhất là 128 µg/ml (với IC50 > 128 µg/ml) [5]

10


1.4.4. Tác dụng trị u bướu, ung thư
Năm 2001, T c giả Phạm Kim Mãn và c ng sự đã chứng minh cao chiết với

cồn từ l đu đủ c t c dụng ức chế sự ph t tri n u b ng gây bởi tế bào ung thƣ
Sarcoma TG -180 ở chu t nhắt trắng, làm giảm th tích u, giảm mật đ tế bào ung
thƣ, giảm sự tăng sinh khối u [8]
Theo Đ Thị Thảo (năm 2006), cặn chiết methanol của l đu đủ chỉ c t c
dụng gây đ c tế bào ung thƣ phổi LU với IC 50 = 19,2 μg/ml, và kh ng c t c dụng
gây đ c c c dòng tế bào ung thƣ kh c nhƣ ung thƣ bi u m KB, ung thƣ vú MCF-7,
ung thƣ m u cấp tính HL-60, ung thƣ tiền liệt tuyến LNCaP, ung thƣ gan
Hepa1c1c7 Đồng thời cặn chiết methanol c ng kh ng gây đ c với tế bào gốc t ch
từ ph i chu t [12]
Năm 2002, Rahmat và c ng sự đã ki m tra khả năng ức chế sự tăng sinh của tế
bào ung thƣ vú, ung thƣ gan bằng lycopene tinh khiết, lycopene t ch chiết từ quả đu
đủ và dƣa hấu, và nƣớc ép quả đu đủ [17]
Năm 2006, Rumiyati và c ng sự đã chứng minh trong l đu đủ c chứa protein
bất hoạt ribosome (RIPs) C c kết quả nghiên cứu cho thấy RIPs c khả năng dẫn
đến qu trình tự chết của tế bào ung thƣ [39]
Năm 2014, Hồ Thị Hà đã x c định đƣợc phân đoạn cặn chiết CH 2Cl2 của l đu
đủ c khả năng gây đ c tế bào ung thƣ bi u m KB (IC50 = 18,44 µg/ml), ung thƣ
phổi LU-1 (IC50 = 18,21 µg/ml) và ung thƣ vú MCF-7 (IC50 = 19,16 µg/ml) Đồng
thời hai hợp chất carpaine và pseudocarpaine phân lập từ cặn CH2Cl2 của l đu đủ
lần đầu tiên đƣợc chứng minh c hoạt tính gây đ c mạnh trên cả bốn dòng tế bào
ung thƣ ngƣời: ung thƣ bi u m KB, ung thƣ m u HL-60, ung thƣ phổi LU-1, ung
thƣ vú MCF-7 (IC50 từ 1,13 đến 3,49 µg/ml) [5]
Năm 2015, Marline Nainggolan và Kasmiru c ng bố nghiên cứu dịch chiết
ethanol của hoa đu đủ đực c t c dụng gây đ c tế bào trên MCF-7 dòng tế bào ung
thƣ vú [20]

11


1.4.5. Tác dụng chống oxi hóa

Gốc tự do là m t trong những nguyên nhân chủ yếu gây ra nhiều loại bệnh
trong cơ th , trong đ c ung thƣ Gốc tự do đƣợc tạo ra trong cơ th bởi nhiều c ch
kh c nhau nhƣ:

nhi m m i trƣờng, chất ph ng xạ, thuốc-h a chất, căng thẳng thần

kinh…
Năm 2010, Srikanth và c ng sự dùng nƣớc đ chiết c c chất c trong l đu đủ
Chất chiết thu đƣợc đem thử hoạt tính chống oxy h a bằng c c phƣơng ph p kh c
nhau [40].
Năm 2013, Maisarah và c ng sự nghiên cứu hoạt tính chống oxy h a từ c c b
phận kh c nhau của cây đu đủ bao gồm: quả chín, quả xanh, hạt và l non Hai t c
nhân đƣợc sử dụng đ đ nh gi là DPPH và β - carotene Kết quả cho thấy hoạt tính
chống oxy h a giảm dần theo thứ tự: l non →quả xanh → quả chín → hạt Tuy
nhiên, c c hoạt chất c t c dụng chống oxy h a còn chƣa đƣợc phân lập [35]
1.4.6. Các tác dụng dược l khác
Ngồi những hoạt tính sinh học trên, c c b phận kh c nhau của cây đu đủ
c ng đã đƣợc chứng minh c t c dụng nhƣ kh ng virus sốt xuất huyết, t c dụng
giảm thời gian đ ng m u, kh ng viêm…
Năm 2008, Bamidele V và c ng sự đã c ng bố hoạt tính kh ng viêm của dịch
chiết cồn từ l cây đu đủ [21] Năm 2013, Swati Patil và c ng sự đã c ng bố chất
chiết l đu đủ bằng nƣớc làm tăng số lƣợng ti u cầu và làm giảm thời gian đ ng m u
ở chu t [46].
Năm 2014, Hồ Thị Hà lần đầu tiên đƣợc chứng minh khả năng kích hoạt
enzyme caspase 3/7 của hai hợp chất carpaine và pseudocarpaine (tƣơng ứng là
386,5 và 778 RFU) ở nồng đ thử nghiệm cao nhất (tƣơng ứng 20 và 30 µg/ml)
nhƣng kh ng mạnh khi so với chất đối chứng là tamoxifen (là 3100 RFU ở nồng đ
thử 20 µg/ml) [5]
1.4.7 Cơng dụng trong dân gian
- Quả đu đủ chín là m n ăn bồi bổ và giúp sự tiêu h a c c chất thịt, c c chất

lòng trắng trứng
12


- Đu đủ xanh đƣợc nấu kỹ với thịt gà chữa viêm loét dạ dày
- Nhựa đu đủ đƣợc dùng làm thuốc giun
- L đu đủ đƣợc sử dụng làm mềm thịt khi nấu
- Trong dân gian hoa đu đủ đực tƣơi hoặc phơi kh hấp với đƣờng phèn dùng
chữa bệnh ho, viêm cuống phổi, khàn tiếng hoặc mất tiếng ở ngƣời lớn,nhất là ở trẻ
em. Ngoài ra, hoa đu đủ đực đƣợc dùng đ chửa sỏi thận hiệu quả [2], [7], [11], [16]
Nhận xét chung: Nhƣ vậy, hoạt tính dƣợc lý và thành phần hóa học của
cây đu đủ đã đƣợc nghiên cứu. Tuy nhiên các cơng trình nghiên cứu chủ yếu là
lá và quả đu đủ, các công trình nghiên cứu hoa đu đủ đ c hầu nhƣ rất ít.
1.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO
Hoạt tính gây đ c tế bào đƣợc thử theo phƣơng ph p của Scudiero D.A. và
c ng sự [41] Đây là phƣơng ph p thử đ đ c tế bào in vitro đƣợc viện Ung thƣ
Quốc gia (NIC) Maryland, Hoa Kỳ xác nhận là phép thử đ đ c tế bào chuẩn, nhằm
sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát tri n hoặc diệt tế bào ung
thƣ ở điều kiện in vitro.
Trong những năm gần đây, m t số phƣơng ph p so màu nhanh đã đƣợc miêu tả
trong thử nghiệm trên c c dòng tế bào ung thƣ ở mức đ in vitro, hiện nay hai phƣơng
ph p thƣờng đƣợc sử dụng là: phƣơng ph p MTT và phƣơng ph p SRB Trong đ ,
phƣơng ph p tetrazolium (MTT) đƣợc sử dụng phổ biến
1.5.1. Phương pháp MTT
Phƣơng ph p này lần đầu tiên đƣợc miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp chí
Immunological Methods năm 1983 [14] Theo t c giả, muối tetrazolium đƣợc dùng đ
tri n khai phép thử so màu, qua đ đ nh gi về sự sống s t và khả năng ph t tri n
của tế bào đ ng vật Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào ti th
của tế bào hoạt đ ng, dƣới t c dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT
biến đổi thành màu tím formazan Kết quả đọc trên m y quang phổ và c đ chính

x c cao Phƣơng ph p đƣợc dùng đ đo đ đ c của chất nghiên cứu, khả năng ph t
tri n và hoạt đ ng của tế bào
13


Tetrazolium (màu vàng)

Formaran (màu tím)

1.5.2. Phương pháp SRB
Phép thử SRB đƣợc ph t tri n bởi Philip Skehan và c ng sự năm 1990 đ đ nh
gi đ c tính của chất nghiên cứu và khả năng ph t tri n của tế bào trong ứng dụng
sàng lọc thuốc ở qui m lớn Nguyên tắc của phép thử là khả năng nhu m màu của
SRB lên protein SRB nhu m bằng c ch ph vỡ màng tế bào, những mảnh vỡ tế bào
kh ng bị nhu m, do đ kh ng ảnh hƣởng đến số liệu thực nghiệm
Phƣơng ph p SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thu c vào pH
của c c dƣ lƣợng amino acid của c c protein Dƣới c c điều kiện m i trƣờng axit
nhẹ, SRB liên kết với c c dƣ lƣợng amino acid trên c c protein của c c tế bào đã
đƣợc cố định bằng trichloroacetic acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu nhƣ Tris-base đ
hòa tan và đo mật đ quang của dịch chiết từ tế bào m t c ch định lƣợng

14


CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu hoa cây đu đủ đực đƣợc thu h i tại Quảng Nam-Đà Nẵng vào
th ng 01 năm 2017 Hoa đu đủ đực – đã đƣợc định danh, sau khi đƣợc thu h i sẽ
đƣợc rửa sạch, phơi, sấy kh và xay nhỏ thành b t đ sử dụng cho nghiên cứu B t

hoa đu đủ đực hơi th , màu vàng nhạt, đƣợc bảo quản trong bình hút ẩm (Hình 2.1).

Hình 2.1. Hoa đu đủ đ c và bột hoa đu đủ đ c
2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
Sắc ký lớp mỏng sử dụng bản mỏng nh m tr ng sẵn silica gel 60GF254, đ dày
0,2mm. Phân lập c c chất bằng phƣơng ph p sắc ký c t với chất hấp phụ là silicagel
cỡ hạt 0,040 – 0,063mm Merck và silicagel pha đảo RP-18.
C c thiết bị x c định cấu trúc chất: Phổ c ng hƣởng từ hạt nhân 1H – NMR,
13

C – NMR, HSQC và HMBC đo trên m y Bruker Avance – 500 MHz, chất chuẩn

n i là TMS cho 1H – NMR và tín hiệu dung m i (CDCl3) cho 13C – NMR. Đèn tử
ngoại (UV BIOBLOCK) bƣớc s ng λ = 254nm và 365nm dùng đ soi bản mỏng.
Ngồi ra cịn dùng m t số trang thiết bị kh c nhƣ m y quay cất chân kh ng,
m y sấy, m y nung, m y siêu âm, cân phân tích, cốc thủy tinh, bình tam gi c, c c
loại pipet, bình định mức, giấy lọc, c t sắc kí,…
Thuốc thử phun lên bản mỏng chủ yếu sử dụng dung dịch H2SO4 10%, sau đ
sấy ở nhiệt đ khoảng 110oC. Dung m i dùng đ chạy c t và tri n khai sắc kí lớp
mỏng bao gồm n-hexan, CH2Cl2, EtOAc, MeOH và BuOH loại tinh khiết đã đƣợc
cất lại qua c t Vigereux trƣớc khi sử dụng đ loại bỏ tạp chất, chất làm mềm
15


2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp chiết mẫu thực vật
Rót dung mơi tinh khiết (H2O, MeOH) vào bình cho đến bề mặt của lớp b t
cây. Chiết mẫu ở nhiệt đ từ 800C – 900C Sau đ , dung dịch chiết đƣợc lọc ngang
qua m t tờ giấy lọc. Quá trình chiết đƣợc lặp lại nhiều lần, m i lần chiết khoảng
24h. G p dịch chiết, cất loại dung m i dƣới áp suất thấp bằng máy quay cất chân

kh ng, thu đƣợc cao chiết tổng. Có th gia tăng hiệu quả chiết bằng cách thỉnh
thoảng đảo l n, xốc đều hoăc sử dụng máy siêu âm. Cao chiết tổng này đƣợc chế
thêm nƣớc và chiết phân lớp lần lƣợt với n-hexan, chloroform, dicholoromethane,
ethyl acetate và butanol bằng phễu chiết. Với m i loại dung môi thực hiện chiết 3
lần. Các dịch chiết đƣợc cất loại dung môi sẽ thu đƣợc các cao chiết tƣơng ứng (cao
chiết n-hexan, chloroform, dichloromethane, EtOAc và BuOH) đ tiếp tục nghiên
cứu.
2.2.2. Phương pháp tách và tinh chế chất
Các cao chiết trong các dung m i kh c nhau thu đƣợc đƣợc tách và tinh chế
bằng phƣơng ph p sắc kí c t kết hợp với sắc kí lớp mỏng với các hệ dung mơi thích
hợp. Sắc kí c t gồm sắc kí c t thƣờng sử dụng silicagel pha thuận và pha đảo. Đối
với các chất có khối lƣợng phân tử khác nhau có th sử dụng sắc kí c t Sephadex
LH–18 Trƣờng hợp cần thiết có th chạy c t lặp lại nhiều lần hoặc dùng phƣơng
pháp kết tinh phân đoạn, kết tinh lại đ tinh chế chất. Ki m tra đ tinh khiết của các
chất c ng nhƣ theo dõi qu trình t ch chất trên c t bằng sắc kí lớp mỏng với hệ dung
mơi thích hợp.
2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất
Việc x c định cấu trúc hóa học của các chất sạch đƣợc thực hiện thông qua
việc đo phổ c ng hƣởng từ hạt nhân m t chiều và hai chiều (1D và 2D NMR) nhƣ
1

H–NMR,

13

C–NMR, DEPT, HSQC, HMBC. Các loại phổ đƣợc đo tại Viện Hoá

học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

16