Nghiên cứu thu cao tổng methanol và định danh thành phần hóa học của dịch chiết dichlormethane và ethyl acetate của hoa đậu biếc

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA HÓA HỌC
-----***-----

THÁI TRÍ

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:

Nghiên cứu thu cao tổng
methanol và định danh thành
phần hóa học của dịch chiết
Dichloromethane và Ethyl
acetate của Hoa Đậu biếc
Lớp

: 16CHDE

Chuyên ngành : Hóa dược
(Tăng cường Tiếng Anh)

Đà Nẵng, tháng 6 năm 2020


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA HÓA HỌC
-----***-----

THÁI TRÍ

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:

Nghiên cứu thu cao tổng
methanol và định danh thành
phần hóa học của dịch chiết
Dichloromethane và Ethyl
acetate của Hoa Đậu biếc
Giáo viên hướng dẫn
GS.TS.NGND ĐÀO HÙNG CƯỜNG

Đà Nẵng, tháng 6 năm 2020


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: Đào Hùng Cường

LỜI CẢM ƠN
Với tấm lịng trân trọng và biết ơn sâu sắc, tơi gửi lời cảm ơn chân thành
tới Thầy Đào Hùng Cường đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho tơi trong suốt thời
gian thực hiện khóa luận và đề tài nghiên cứu khoa học.
Các thầy/cơ Khoa Hóa học – Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà
Nẵng, đặc biệt là thầy/cô bộ mơn đã nhiệt tình giảng dạy, chỉ bảo và tạo điều
kiện để tơi hồn thành khóa luận này.
Thầy/cơ Khoa Hóa học – Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng đã
nhận lời phản biện, đóng góp nhiều ý kiến giúp tôi hiểu rõ thêm nội dung bài
luận này.
Các bạn sinh viên Khoa Hóa học – Trường Đại học Sư phạm – Đại học

Đà Nẵng, đặc biệt là các bạn sinh viên lớp 16CHDE đã cộng tác và giúp đỡ tôi
thực hiện đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Đà Nẵng, ngày 01 tháng 6 năm 2020
Sinh viên thực hiện

Thái Trí

Thái Trí – 16CHDE

1


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: Đào Hùng Cường

MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................................2
1. Tính cấp thiết của đề tài ...........................................................................................2
2. Mục tiêu nghiên cứu.................................................................................................2
3. Đối tượng và Phạm vi nghiên cứu ...........................................................................2
4. Phương pháp nghiên cứu..........................................................................................2
5. Bố cục đề tài.............................................................................................................2
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN............................................................................................3
1.1. Tổng quan về cây Đậu biếc...................................................................................3
1.2. Cơng trình nghiên cứu về loài hoa Đậu biếc.........................................................4
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ..............................6
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và dụng cụ .........................................................................6
2.1.1. Nguyên liệu.....................................................................................................6

2.2.2. Hóa chất ..........................................................................................................6
2.2.3. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu.......................................................................7
2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................................7
2.3.1. Phương pháp xác định thơng số hóa lý của ngun liệu ................................7
2.3.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)......................................10
2.3.3. Phương pháp chiết tách thu nhận cao chiết từ mẫu thực vật ........................11
2.3.4. Phương pháp phân tích và định danh thành phần hóa học ...........................13
2.4. Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm ...........................................................................16
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................17
3.1. Kết quả xác định các thơng số hóa lý..................................................................17
Thái Trí – 16CHDE


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: Đào Hùng Cường

3.1.1. Độ ẩm mẫu nguyên liệu ................................................................................17
3.1.2. Xác định hàm lượng tro ................................................................................17
3.1.3. Xác định hàm lượng kim loại nặng ..............................................................18
3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết tách.....................................19
3.2.1. Khảo sát tỉ lệ rắn – lỏng ................................................................................19
3.2.2. Khảo sát thời gian .........................................................................................20
3.2.3. Khảo sát nhiệt độ ..........................................................................................21
3.3. Kết quả điều chế tổng cao methanol và các cao phân đoạn tách từ tổng cao
methanol .....................................................................................................................23
3.3.1. Kết quả điều chế tổng cao methanol bằng phương pháp chiết hồi lưu.........23
3.3.2. Điều chế các cao phân đoạn từ tổng cao methanol bằng phương pháp chiết
phân bố (chiết lỏng – lỏng) .....................................................................................24
3.4. Kết quả định danh các thành phần hóa học có trong nguyên liệu hoa Đậu biếc 26

3.4.1. Định danh các thành phần hóa học có trong cao phân đoạn dichlormethane
của Hoa Đậu biếc bằng phương pháp GC – MS.....................................................26
3.4.2. Định danh các thành phần hóa học có trong cao phân đoạn Ethyl acetate của
Hoa Đậu biếc bằng phương pháp GC – MS ...........................................................29
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................33
1. Kết luận ..................................................................................................................33
2. Kiến nghị ................................................................................................................33
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................34

Thái Trí – 16CHDE


KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: Đào Hùng Cường

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hoa Đậu biếc...................................................................................................3
Hình 1.2. Bộ khung chung của 6 loại anthocyanin ternatin............................................4
Hình 2.1. Nguyên liệu hoa Đậu biếc ...............................................................................6
Hình 2.2. Sơ đồ hoạt động của máy quang phổ hấp thụ nguyên tử ..............................11
Hình 2.3. Phương pháp chiết lỏng – lỏng. ....................................................................12
Hình 2.5. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) .........................................15
Hình 3.1. Sơ đồ điều chế tổng cao methanol từ Hoa Đậu biếc.....................................23
Hình 3.2. Chiết phân bố bằng Dichlormethane ............................................................25
Hình 3.3. Dịch chiết và cao chiết Dichlormethane .......................................................25
Hình 3.4. Chiết phân bố bằng Ethyl acetate .................................................................25
Hình 3.5. Dịch chiết và cao chiết Ethyl acetate ............................................................26
Hình 3.6. Sắc ký đồ GC – MS của cao phân đoạn Dichlormethane .............................27
Hình 3.7. Cấu trúc hóa học của D-Limonene ...............................................................29

Hình 3.8. Sắc ký đồ GC – MS của cao phân đoạn Ethyl acetate ..................................30

Thái Trí – 16CHDE


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: Đào Hùng Cường

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Sáu loại ternatin có trong hoa lồi CL ...........................................................4
Bảng 1.2. Một số loại anthocyanin khác có trong hoa lồi CL ......................................5
Bảng 2.1. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu................................................................6
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát độ ẩm của nguyên liệu Hoa Đậu biếc...............................17
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát hàm lượng tro của nguyên liệu Hoa Đậu biếc..................17
Bảng 3.3. Hàm lượng một số kim loại nặng có trong Hoa Đậu biếc............................18
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát tỉ lệ rắn lỏng......................................................................19
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát thời gian ............................................................................21
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ ....................................................22
Bảng 3.7. Kết quả điều chế tổng cao methanol.............................................................24
Bảng 3.8. Kết quả định danh thành phần hóa học trong cao phân đoạn
Dichlormethane .............................................................................................................28
Bảng 3.9. Kết quả định danh thành phần hóa học trong cao phân đoạn Ethyl acetate31

Thái Trí – 16CHDE


KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: Đào Hùng Cường

LỜI MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngày nay, con người từng bước chinh phục tự nhiên và ứng dụng các lợi ích tự
nhiên vào đời sống, họ bắt đầu biết làm ra các màu sắc, dùng nó để làm thuốc… Kể từ
thời điểm đó màu sắc tự nhiên được nhìn nhận là một ngành công nghiêp mũi nhọn mà
con người cần khai thác tới. Chính vì điều đó tơi có một tham luận về đề tài mà tơi
nghĩ nó có thể làm rõ phần nào về phẩm màu tự nhiên nên tôi chọn đề tài “Nghiên cứu
thu cao tổng methanol và định danh thành phần hóa học của dịch chiết
Dichlormethanee và Ethyl Acetate của Hoa Đậu Biếc”.

2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xây dụng quy trình chiếc tách thu nhận thành phần hóa học từ Hoa Đậu biếc
và Định danh thành phần có trong Hoa Đậu biếc.
- Chiếc tách màu Hoa Đậu biếc để ứng dụng vào sản xuất và phối màu với các
thành phần khác để thu được sản phẩm thương mại.

3. Đối tượng và Phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng Hoa Đậu biếc khô thu mua tại trang bán hàng điện tử Shopee.
- Phạm vi các thành phần hóa học có mặt trong dịch chiết.

4. Phương pháp nghiên cứu
- Lấy mẫu, xử lý, sơ chế mẫu.
- Xác định một số chỉ tiêu hóa lý.
- Chiết tách thu phẩm màu và các dịch chiết.
- Phương pháp sắc ký khí (GC-MS) để định danh thành phần hóa học.
- Phương pháp AAS để xác định hàm lượng kim loại nặng.

5. Bố cục đề tài
Bố cục gồm 3 phần: Tổng quan, phương pháp và đối tượng, kết quả và bàn

luận.

Thái Trí – 16CHDE

2


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: Đào Hùng Cường

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cây Đậu biếc
Cây Đậu biếc (danh pháp: Clitoria ternatea) là lồi thực vật có hoa thuộc bộ
Đậu (Fabales), họ Đậu (Fabaceae), chi Đậu biếc (Clitoria). Là loài thực vật thân thảo,
dây leo, sống ở vùng nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới, có nguồn gốc từ Đơng Nam Á, sau
đó được trồng nhiều tại Ấn Độ để ứng dụng vào y học cổ truyền tại nước này. Thân và
cành mảnh có lơng. Lá kép, có 5 – 7 lá chét hình trái xoan, có lơng rải rác ở cả hai mặt.
Hoa có màu xanh tím hoặc xanh lam đậm, với hình dáng lạ mắt. Hoa mọc riêng lẻ
hoặc thành chùm và nở rải rác quanh năm. Ở Việt Nam, cây Đậu biếc thường được
trồng làm cảnh, leo giàn ở bờ rào để lấy hoa và quả. Có nơi trồng rất nhiều dùng làm
cây phân xanh, cây che phủ đất và cải tạo đất. Rễ và hạt của cây Đậu biếc được sử
dụng trong y học dân gian như một bài thuốc có tác dụng lợi tiểu, nhuận tràng, gây xổ,
làm dịu và săn da. Cây Đậu biếc có hoa màu xanh tím, xanh lam đậm hoặc màu trắng,
nhưng phổ biến nhất vẫn là màu xanh tím. Hoa Đậu biếc Hình 1.1 có chứa
anthocyanin (một loại flavonoid) là thành phần chính tạo nên màu sắc đẹp cho hoa và
khơng độc hại nên thường được người dân địa phương sử dụng như một phẩm màu
hữu cơ an toàn dùng cho thực phẩm. Ngoài việc ứng dụng phẩm màu vào thực phẩm
thì hoa Đậu biếc cịn có nhiều vai trị đối với sức khỏe con người như chống lão hóa,
ngăn ngừa ung thư, tăng cường miễn dịch, kháng khuẩn, tốt cho tim mạch… [1]

Hình 1.1. Hoa Đậu biếc

Thái Trí – 16CHDE

3


KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: Đào Hùng Cường

1.2. Cơng trình nghiên cứu về loài hoa Đậu biếc
Norihiko Terahara và các cộng sự của mình vào năm 1990 đã định danh được 6
anthocyanin ternatin chính có mặt trong hoa của lồi CL là A1, A2, B1, B2, D1 và D2.
Cấu trúc của các loại anthocyanin ternatin trên giống với cấu trúc của Delphinidin-3malonylglucoside với các vị trí 3’,5’ là các đơn vị D-glucose và p-coumaric acid . Cấu
trúc của Delphinidin-3-malonylglucoside được thể hiện ở Hình 1.2 [2]

Hình 1.2. Bộ khung chung của 6 loại anthocyanin ternatin

Cấu trúc của 6 loại anthocyanin ternatin được tổng hợp ở Bảng 1.1 và có cấu
chung của Hình 1.2.

Bảng 1.1. Sáu loại ternatin có trong hoa lồi CL
STT
1
2
3
4
5

6

Ternatin

R

R’

A1
A2
B1
B2
D1
D2

GCGCG
GCGCG
GCGCG
GCGC
GCGC
GCGC

GCGCG
GCG
GCGC
GCG
GCGC
GC

Trong đó: G là D-Glucose

C là p-coumaric acid

D – Glucose

Thái Trí – 16CHDE

p – coumaric acid

4


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: Đào Hùng Cường

Kazuma (2003) nghiên cứu và định danh được 4 hợp chất anthocyanin từ cánh
hoa Đậu biếc có bộ khung được thể hiện ở Hình 1.3 và được tổng hợp ở Bảng 1.2.

Hình 1.3. Cấu trúc chung của 4 anthocyanin

.

Bảng 1.2. Một số loại anthocyanin khác có trong hoa lồi CL
Anthocyanin
Delphinidin-3-O-(2”-O--rhamnosyl-6”-Omalonyl)--glucoside)
Delphinidin-3-O-(6”-O-malonyl)--glucoside
Delphinidin-3-neohesperidoside
Delphinidin-3-O--glucoside

R1

R2

rhamnosyl

malonyl

H
rhamnosyl
H

malonyl
H
H

Trong đó rhamnosyl là tên của gốc đường a-L-rhamnose và malonyl là dẫn xuất
của acid malonic.

-L-Rhamnose

Thái Trí – 16CHDE

Malonyl

5


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: Đào Hùng Cường

CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và dụng cụ
2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu nghiên cứu là hoa Đậu biếc khô được đặt mua trên hệ thống bán
hàng online Shopee, đem phơi khơ thêm một lần nữa trong vịng 15 phút và bảo quản
trong hộp nhựa kín, trong mơi trường khơ ráo.

Hình 2.1. Ngun liệu hoa Đậu biếc
2.2.2. Hóa chất
Hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu này được trình bày ở Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
STT

Tên hóa chất

Độ tinh khiết

Tiêu chuẩn

Nguồn gốc

1

Methanol

Tinh khiết

TCCS

Trung Quốc

3

Dichlometane

Tinh khiết

TCCS

Trung Quốc

4

Ethyl acetate

Tinh khiết

TCCS

Trung Quốc

5

HNO3

68%

TCCS

Trung Quốc

Thái Trí – 16CHDE

6


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: Đào Hùng Cường

2.2.3. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
- Thiết bị đo sắc ký khí ghép phổ khối (GC-MS) của Trung tâm kỹ thuật tiêu
chuẩn đo lường chất lượng II tại số 2, đường Ngô Quyền, thành phố Đà Nẵng.
- Thiết bị đo AAS của Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng II tại
số 2, đường Ngô Quyền, thành phố Đà Nẵng.
- Máy UV-VIS của khoa Hóa học, Đại học Sư Phạm Đà Nẵng.
- Tủ sấy, lò nung, bộ chiết hồi lưu, bếp cách thủy, pipet, ống đong, bình định
mức, chén sứ, cốc, nhiệt kế, cân phân tích, bình hút ẩm, tủ hút, thiết bị cơ quay chân
khơng, bình tam giác, phễu chiết, phễu thủy tinh, giấy lọc…

2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp xác định thơng số hóa lý của ngun liệu
2.3.1.1. Xác định độ ẩm
a. Nguyên tắc
Dùng nhiệt độ cao để làm bay hết hơi nước có trong mẫu nguyên liệu. Dựa vào
hiệu khối lượng của mẫu nguyên liệu trước và sau khi đem sấy để tính tốn hàm lượng
nước có trong mẫu nguyên liệu.
b. Dụng cụ, thiết bị
Chén sứ, tủ sấy, bình hút ẩm, cân phân tích chính xác đến 0.001.

c. Cách tiến hành
Chuẩn bị 3 chén sứ có ký hiệu sẵn, rửa sạch và đem sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt
độ khoảng 100 - 105oC trong vòng 30 phút. Sau khi sấy xong đem chén sứ bỏ vào bình
hút ẩm cho đến khi đạt đến nhiệt độ phịng thì cân khối lượng của chén sứ trên cân
phân tích (m0). Cân vào mỗi chén m gam bột nguyên liệu, dàn đều nguyên liệu thành
lớp mỏng và đem đi cân ta có được khối lượng của chén cộng với khối lượng nguyên
liệu trước khi sấy (m1). Sau đó, đem chén sứ có chứa nguyên liệu vào tủ sấy và sấy ở
nhiệt độ 105oC trong khoảng 1 giờ 30 phút. Lấy mẫu ra, cho vào bình hút ẩm đến khi
đạt tới nhiệt độ phịng và đem đi cân. Sau đó, lặp lại quá trình sấy như trên vài lần, mỗi
lần khoảng 15 phút cho đến khi chênh lệch khối lượng giữa 2 lần cân liên tiếp khơng
Thái Trí – 16CHDE

7


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: Đào Hùng Cường

quá 0.001 gam. Ghi lại khối lượng cuối cùng (m2). Hàm lượng nước được xác định
theo cơng thức:
%H2 O =

m1 - m2
×100%
m

Trong đó:
m1: khối lượng của chén sứ và mẫu trước khi sấy (g);
m2: khối lượng của chén sứ và mẫu sau khi sấy (g);

m: khối lượng của mẫu nguyên liệu (g).
2.3.1.2. Xác định hàm lượng tro
a. Mục đích
Mục đích của việc xác định hàm lượng tro của một nguyên liệu là để xác định
khối lượng của chất phi hữu cơ khơng cháy cịn lại sau khi nung cháy mẫu ở nhiệt độ
cao.
b. Nguyên tắc
Dựa trên ngun tắc tro hóa hồn tồn mẫu bằng cách nung mẫu trong lò nung
ở nhiệt độ cao (450-500oC) trong 7 giờ cho đến khi khối lượng không đổi (phương
pháp tro hóa khơ). Khi mẫu thực vật nung ở nhiệt độ cao có mặt khơng khí, các thành
phần hữu cơ sẽ bị đốt cháy thành CO2 và hơi nước, cịn các thành phần vơ cơ cịn lại
khơng cháy chủ yếu là các oxit kim loại.
c. Dụng cụ, thiết bị
Chén sứ, lị nung, bình hút ẩm, bếp điện, cân phân tích.
d. Cách tiến hành
Mẫu sau khi sấy để xác định độ ẩm tiếp tục được đem than hóa sơ bộ trên bếp điện
(than hóa đến khi khơng cịn khói bốc lên). Sau đó, đem mẫu đã than hóa vào lị nung
và nung ở 450-500oC (không nên nung ở nhiệt độ quá cao vì sẽ làm bay hơi một số
kim loại) trong vịng 7 giờ. Sau thời gian tro hóa, ta thấy ngun liệu hoa Đậu biếc bị
tro hóa hồn tồn, cho chén sứ vào bình hút ẩm đến khi đạt tới nhiệt độ phịng sau đó
cân chén sứ trên cân phân tích và ghi lại giá trị khối lượng (m3). Tiếp tục cho cốc vào
lò nung, nung tiếp 30 phút và lấy ra, ghi lại giá trị khối lượng. Lặp lại q trình trên
Thái Trí – 16CHDE

8


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: Đào Hùng Cường

cho đến khi chênh lệch khối lượng giữa hai lần cân không quá 0.001g thì dừng lại.
Hàm lượng tro của hoa Đậu biếc được tính theo cơng thức:
%H =

m3 - m0
×100%
m

Trong đó:
m3: khối lượng của chén sứ và mẫu sau khi nung (g)
m0: khối lương của chén sứ (g)
m: khối lượng của nguyên liệu ban đầu (g)
%H: hàm lượng tro trong mẫu (%)
2.3.1.3. Xác định hàm lượng kim loại nặng
a. Mục đích
Các loại thực vật luôn chứa hàm lượng kim loại nặng nhất định, các kim loại
nặng có thể gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người nếu chúng tích trữ
trong cơ thể ở một thời gian dài. Vì vây, các loại thực vật (dược liệu) ln có một quy
định về giới hạn hàm lượng kim loại nặng an toàn đối với sức khỏe con người. Việc
xác định hàm lượng kim loại nặng sẽ đánh giá được mức độ an toàn của một loại thực
vật khi được sử dụng làm thực phẩm hay dược liệu. Hàm lượng thấp thì an tồn với
người sử dụng, hàm lượng cao thì phải dùng ở một mức độ phù hợp.
b. Ngun tắc
Vơ cơ hóa mẫu bằng các loại acid có tính oxi hóa mạnh như HNO3, H2SO4…
Sau đó đem mẫu đi phân tích bằng phương pháp AAS.
c. Dụng cụ, thiết bị
Bình định mức, máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS.
d. Cách tiến hành
Mẫu sau khi tro hóa được hịa tan bằng HNO3 2N (pha từ acid HNO3 68%),

đem dung dịch mẫu đi lọc bằng giấy lọc để loại bỏ cặn khơng tan sau đó định mức lên
50ml trong bình định mức ta có được mẫu dung dịch trong suốt. Lấy mẫu phân tích
cùng với ống mẫu trắng (HNO3 2N) đem đi phân tích hàm lượng kim loại nặng bằng

Thái Trí – 16CHDE

9


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: Đào Hùng Cường

phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS tại Trung tâm kỹ thuật đo lường tiêu
chuẩn chất lượng II tại số 2 đường Ngơ Quyền, thành phố Đà Nẵng. Cơng thức tính
hàm lượng kim loại nặng trong mẫu ban đầu như sau:
C (mg/kg) =
Trong đó:

C (mg/L)
×V (ml)
m

m: khối lượng mẫu hoa Đậu biếc trước khi tro hóa (g)
C (mg/kg): Hàm lượng kim loại năng tính theo mg/kg
C (mg/l): Hàm lượng kim loại nặng tính theo mg/L
V: Thể tích của bình định mức (ml)
2.3.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)
2.3.2.1. Giới thiệu chung
Phương pháp AAS là phương pháp dựa trên nền tảng chính là sự hấp thụ ngun

tử có nghĩa là khi ta chiếu một luồng sáng có bước sóng thích hợp ta sẽ đưa nguyên tử
lên trạng thái kích thích mới (Excited State). Trạng thái này kém bền và phát ra nguồn
bức xạ từ chính ngun tử đó cho ra phổ. Nguyên lí chính là chùm ánh sáng khi chiếu
vào sẽ làm cho lớp vỏ ngoài cùng của nguyên tử dày hơn chứa năng lương cao hơn
bình thường và lúc này chính nguồn năng lượng đó sẽ hướng vào tâm hạt nhân làm
cho momen bắt đầu tăng lực và chuyển các electron sang trạng thái quay mạnh làm
cho nguyên tử bắt đẩu tăng từ tính và đánh bật bức xạ ra ngoài, sự đánh bật này cho ra
các mã phổ khác nhau của từng nguyên tử cho biết các đặc thù của nguyên tố đó. [3]
2.3.2.2. Sơ đồ của máy quang phổ hấp thụ nguyên tử được thể hiện trong
Hình 2.2
- Nguồn phát tia bức xạ cộng hưởng của nguyên tố cần phân tích: Là nguồn tạo
ra ánh sáng đơn sắc của nguyên tố cần phân tích, chủ yếu chiếu vào đám hơi nguyên tử
tự do.
- Hệ thống nguyên tử hóa mẫu phân tích: Bộ phận ngun tử hóa mẫu chuyển
mẫu từ trạng thái ban đầu thành dạng hơi cuả các nguyên tử tự do dưới tác dụng của
nhiệt độ. Đám hơi ngun tử tự do này chính là mơi trường hấp thụ bức xạ và sinh ra
phổ hấp thụ nguyên tử. Có hai loại kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu [4]:

Thái Trí – 16CHDE

10


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: Đào Hùng Cường

+ Kỹ thuật nguyên tử hóa bằng ngọn lửa, sử dụng khí C2H2 và khơng khí nén,
hoặc N2O2, gọi là F-AAS.
+ Kỹ thuật ngun tử hóa ngọn lửa, sử dụng lị đốt điện, gọi là ETA-AAS.

Hình 2.2. Sơ đồ hoạt động của máy quang phổ hấp thụ nguyên tử

2.3.3. Phương pháp chiết tách thu nhận cao chiết từ mẫu thực vật
Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện 2 phương pháp chiết tách là ngâm
dầm (chiết rắn – lỏng) và chiết phân đoạn (chiết lỏng – lỏng).
2.3.3.1. Phương pháp ngâm dầm (chiết rắn – lỏng)
a. Dụng cụ, hóa chất
Methanol (CH3OH), bình cầu 1000ml, ống sinh hàn, bếp cách thủy, giấy lọc,
máy cất quay chân không áp suất thấp.
b. Cách tiến hành
Cho m gam nguyên liệu hoa Đậu biết đã cắt nhuyễn vào bình cầu 1000ml. Đổ một
lượng dung môi methanol sao cho dung môi ngập bề mặt nguyên liệu. Lắp ống sinh
hàn, mở hệ thống nước, đưa bình cầu vào bếp cách thủy, bật và điều chỉnh nhiệt độ
bếp cách thủy sao cho dung mơi trong bình cầu sơi nhẹ đều. Dung mơi tinh khiết khi
được đun nóng sẽ bốc hơi lên cao, ngưng tụ tại ống sinh hàn và chảy xuống. Sau khi
thực hiện xong quá trình chiết, để nguội bình cầu, tháo ống sinh hàn, đem toàn bộ
lượng dịch chiết thu được lọc qua vải lọc một đến hai lần và lọc qua giấy lọc 2-3 lần
để loại bỏ cặn từ nguyên liệu trong quá trình chiết. Dịch chiết sau khi lọc được đem đi
cô đuổi dung môi bằng máy cất quay chân không dưới áp suất thấp. Cân xác định khối
lượng cao thu được và tính % khối lượng cao chiết so với khối lượng mẫu ban đầu.
Thái Trí – 16CHDE

11


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: Đào Hùng Cường

2.3.3.2. Phương pháp chiết phân đoạn (Chiết lỏng – lỏng)
a. Dụng cụ, hóa chất
- Dụng cu: phễu chiết 250ml, bình tam giác 250ml, cốc thủy tinh 500ml, máy
cô quay chân không, bếp cách thủy, bình penicillin.
- Hóa chất: Dichlormethane, Ethyl acetate, muối Na2SO4 khan

Hình 2.3. Phương pháp chiết lỏng – lỏng

b. Cách tiến hành
- Cao tổng methanol sau khi thu được từ việc cô đuổi dung mơi hịa lỗng với
một lượng nước vừa đủ và ta gọi đây là dịch nước. Việc chiết được thực hiện lần lượt
từ dung môi kém phân cưc đến dung môi phân cực nhất, được thực hiện theo thứ tự
dichlormethane, ethyl acetate. Với mỗi dung môi, ta thực hiện việc chiết nhiều lần,
lượng dung môi được sử dụng trong q trình chiết mỗi lần gấp 2 lần thể tích dịch
nước.
- Kiểm tra khóa phễu chiết xem có vấn đề gì khơng, sau đó đổ tồn bộ lượng
dịch nước vào phễu chiết, sau đó cho vào lượng thể tích dung môi chiết gấp đôi lượng
dịch nước vào phễu. Đậy nút, một tay giữ nút và phễu, một tay giữ khóa phễu, lắc nhẹ
và cẩn thận, đảo ngược nhiều lần. Khi áp suất trong bình tăng, để ngược khóa phễu lên
trên mở khóa cho cân bằng áp suất với bên ngồi rồi cài khóa tiếp tục lắc. Lặp đi lặp
lại nhiều lần q trình đó cho đến khi áp suất khơng thay đổi thì mới lắc mạnh trong 1
– 2 phút. Lắc xong để phễu trên giá, để yên cho dung dịch tách thành hai lớp thỉnh
thoảng mở nút. Mở nút phễu, từ từ mở khóa để thu 2 lớp chất lỏng, một lớp là dịch
chiết, lớp còn lại là dung dịch nước (tùy thuộc vào khối lượng riêng của dung mơi mà
Thái Trí – 16CHDE

12


KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: Đào Hùng Cường

lớp dịch chiết có thể nằm ở trên hoặc ở dưới lớp dung dịch nước). Lượng dịch chiết
thu được cho vào bình tam giác, lượng dịch nước cho vào một cốc riêng. Lặp lại thí
nghiệm với cùng thể tích dung mơi ban đầu, cho đến khi lượng dịch chiết trong sạch.
Gộp tất cả dịch chiết lại cho vào cốc thủy tinh 500ml, làm khan nước trong dịch chiết
bằng Na2SO4, sau đó cơ đuổi dung môi bằng máy cất quay chân không và bếp cách
thủy, ta thu được dịch cô đặc (cao chiết). Cho lượng dịch cơ đặc đó vào bình penicillin
và bảo quản trong bình hút ẩm.
- Ta thực hiện quy trình như vậy theo thứ tự 2 dung môi như trên. Sau giai đoạn
này, ta thu được 2 phân đoạn cao chiết và đem đi định danh thành phần hóa học có
trong đó.
2.3.4. Phương pháp phân tích và định danh thành phần hóa học
Ở đây, chúng tơi phân tích và định danh thành phần hóa học có trong 2 phân
đoạn cao chiết, dichlormethane và ethyl acetate từ hoa Đậu biếc bằng phương pháp đo
sắc ký khí ghép phổ khối (GC – MS).
2.3.4.1. Phương pháp sắc ký khí (GC)
a. Mục đích của sắc ký khí (GC)
Sắc kí khí dựa vào q trình bay hơi chất lỏng ở mức nhiệt vừa phải với một
nguồn chất khí mang đưa luồng khí này lên cao (pha động) và dưới sức kéo của pha
tĩnh các chất khí bắt đầu phân tách ra và tạo thành peak.
b. Sơ đồ hệ thống của máy sắc ký khí được thể hiện trong Hình 2.4
Một hệ thống sắc ký khí cơ bản gồm có:
 Hệ thống cung cấp khí mang
 Bộ tiêm mẫu
 Lò cột và cột phân tách
 Đầu dò
 Bộ phận ghi nhận tín hiệu

Hình 2.4. Sơ đồ của máy sắc ký khí (GC)

Thái Trí – 16CHDE

13


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: Đào Hùng Cường

2.3.4.2. Phương pháp khối phổ (MS)
- Phương pháp khối phổ là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân
tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các hạt
mang điện hay ion trong một điện trường hay từ trường nhất định.
- Máy khối phổ là thiết bị dùng cho phương pháp phổ khối, cho ra phổ khối
lượng của một mẫu, để tìm ra thành phần của nó.
- Theo tính năng của bộ ghi, người ta chia các máy khối phổ thành 2 loại:
+ Máy khối phổ ký ghi bằng hình ảnh: tín hiệu phổ được ghi bằng hình ảnh ở
dạng vạch có độ đen khác nhau.
+ Máy khối phổ kế: các tín hiệu của chùm ion được ghi dưới dạng xung điện
bằng các dao động ký điện từ nhiều kênh hoặc đưa vào máy tính điện từ, tín hiệu
sẽ được đưa ra dưới dạng bản đồ hoặc đồ thị thích hợp. Ngày nay, trong phương
pháp khối phổ người ta thường sử dụng các máy khố phổ kế. [5]
2.3.4.3. Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS)
Phương pháp GC – MS Hình 2.5 dựa trên cơ sở “nối ghép” máy sắc kí khí (Gas
Chromatography) với máy khối phổ (Mass Spectometry). Việc liên kết hai kĩ thuật đó
đã tạo ra một cơng cụ mạnh mẽ để tách biệt và nhận biết các hợp chất. Nhờ có sự liên
kết chặt chẽ này người ta có thể thu được phổ khối lượng đủ chấp nhận đối với tất cả
các hợp phần mà sắc ký lỏng tách ra được, kể cả những hợp phần với khối lượng chỉ

cỡ vài picogam và có mặt trong vài giây.
Hệ thống sắc kí khối phổ là một detector khối phổ được ghép nối với thiết bị sắc
kí khí nối với nhau qua bộ kết nối nhằm mục đích loại bớt khí mang như N2, He để
giảm áp suất của dịng khí mang và phân tử mẫu chất đi vào buồng ion hóa của khối
phổ. Phần thiết bị sắc kí dùng làm mao quản, phần phổ khối sử dụng buồng ion hóa và
bộ tách từ cực và detector khối phổ.
Sau khi đi qua các cột sắc kí khí, các hóa chất tiếp tục đi vào pha khối phổ. Ở đây
chúng bị ion hóa. Sau khi đi qua khối phổ chúng sẽ tới bộ phận lọc, dựa trên khối
lượng, bộ lọc lựa chọn chỉ cho phép các hạt có khối lượng nằm trong một giới hạn
nhất định đi qua [6].

Thái Trí – 16CHDE

14


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: Đào Hùng Cường

Thiết bị cảm biến có nhiệm vụ đếm số lượng các hạt có cùng khối lượng. Thơng
tin này sau đó chuyển đến máy tính và xuất kết quả gọi là khối phổ. Khối phổ là một
biểu đồ phản ánh số lượng các ion với các khối lượng khác nhau đã đi qua bộ lọc.
- Xác định công thức phân tử, dựa vào cường độ tương đối của ion phân tử đồng
vị xuất hiện trên phổ đồ.
- Xác định công thức cấu tạo: dựa vào giá trị m/e, cường độ tương đối giữa các
ion phân tử cũng như ion màng.
- Định lượng thành phần nguyên tố của ion cần xác định.

Hình 2.5. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS)

Sau khi đã có phổ đồ, ta so sánh kết quả khối phổ thu được trong thí nghiệm với
thư viện phổ của các chất đã được xác định trước. Nếu tìm được các chất tương ứng
trong thư viện thì có thể định danh được chất đó. Nếu phép so sánh khơng tìm được
kết quả tương ứng thì có thể thêm được một dữ kiện mới và đóng góp vào thư viện cấu
trúc sau khi tiến hành thêm các quá trình thực nghiệm xác định chính xác các loại hợp
chất mới [7].

Thái Trí – 16CHDE

15


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: Đào Hùng Cường

2.4. Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm
Hoa Đậu biếc
Xử lý
Khảo sát
yếu tố ảnh hưởng

Xác định
chỉ tiêu hóa lí

Bột hoa Đậu biếc
(ngun liệu)

Tỉ lệ rắn lỏng

Độ ẩm

Thời gian

Tro

Kim loại
nặng

Methanol

Nhiệt độ

Dịch chiết methanol
Cao chiết methanol
Chiết với dichlormetane
ddđicddichlormethane
Dịch chiết
dichlormethane

Dịch chiết
ethyl acetate

Cao chiết
dichlormet
hanee

Dịch chiết 1
Chiết với ethyl acetate
Dịch chiết 2

Cao chiết
Etyl acetate

Đo GC – MS

Thái Trí – 16CHDE

16


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: Đào Hùng Cường

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả xác định các thông số hóa lý
3.1.1. Độ ẩm mẫu nguyên liệu
Độ ẩm mẫu nguyên liệu được xác định theo mục 2.3.1 và kết quả thể hiện trên
Bảng 3.1
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát độ ẩm của nguyên liệu Hoa Đậu biếc
STT

m (g)

m1 (g)

m2 (g)

%H2O

1

2.004

50.387

50.131

12.774

2

2.001

45.451

45.192

12.943

3

2.002

89.904

89.648

12.787

12.835

Độ ẩm trung bình (%)

Nhận xét: Kết qủa Bảng 3.1 cho thẩy độ ẩm chênh léch trong khoảng cho phép 10 15% nên mẫu hoa Đậu biết có thể sử dụng lâu dài mà khơng bị hư hay mốc, nên có thể
dùng trong chiếc tách và nghiên cứu.
3.1.2. Xác định hàm lượng tro
Mẫu sau khi xác định độ ẩm được đem đi than hóa sơ bộ và tro hóa trong vịng
7 tiếng. Bằng phương pháp định lượng đã nêu ở chương 2, hàm lượng tro của nguyên
liệu Hoa Đậu biếc được xác định và tổng hợp ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát hàm lượng tro của nguyên liệu Hoa Đậu biếc
STT

m (g)

mo (g)

m3 (g)

%H

1

2.004

48.387

48.594

10.329

2

2.001

43.453

43.664

10.545

3

2.002

87.903

88.117

10.689

Hàm lượng tro trung bình (%)

Thái Trí – 16CHDE

10.525

17

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: Đào Hùng Cường

Nhận xét: Kết quả của Bảng 3.2 cho thấy hàm lượng tro trung bình của bột nguyên
liệu Hoa Đậu biếc là 10.525%. Đây là hàm lượng các chất vô cơ không bay hơi tồn tại
trong nguyên liệu Hoa Đậu biếc.
3.1.3. Xác định hàm lượng kim loại nặng
Mẫu sau khi tro hóa được hịa tan vào HNO3 2N, đem lọc loại bỏ cặn và định
mức lên 50ml, sau đó đem đi xác định hàm lượng kim loại nặng nặng bằng phương
pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS tại Trung tâm kỹ thuật đo lường tiêu chuẩn
chất lượng II tại số 2 đường Ngô Quyền, thành phố Đà Nẵng. Kết quả được xác định
và tổng hợp tại Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Hàm lượng một số kim loại nặng có trong Hoa Đậu biếc
STT

Kim
loại

Phương pháp thử (AAS)

Kết quả Kết quả Hàm lượng cho
(mg/L) (mg/kg) phép (mg/kg)

1

Pb

SMEWW 3113B:2017(NA)

0.04

1

2

2

As

SMEWW 3114B:2017(NA)

0.018

0.45

1

3

Cu

SMEWW 3113B:2017(NA)

0.373

9.325

30

4

Zn

SMEWW 3113B:2017(NA)

1.88

47

40

5

Cr

SMEWW 3113B:2017(NA)

0.041

1.025

2

Nhận xét: Căn cứ vào quy chuẩn Việt Nam (QCVN 8-2:2011/BYT) cho thực phẩm
(theo thông tư số 02/2011/TT-BYT ngày 13 tháng 01 năm 2011) về hàm lượng kim
loại nặng tối đa cho phép trong rau quả sấy khơ thì hàm lượng các kim loại như Pb,
As, Cu, Cr có mặt trong ngun liệu Hoa Đậu biếc khơ thấp hơn so với hàm lượng tối
đa cho phép ngoại trừ hàm lượng Zn có mặt lại cao hơn so với hàm lượng cho phép
trong quy chuẩn. Điều này phụ thuộc nhiều vào điều kiện thổ nhưỡng, nguồn nước.

Cho nên cần có các lưu ý và biện pháp khi sử dụng nguyên liệu Hoa Đậu biếc với một
lượng phù hợp.

Thái Trí – 16CHDE

18


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: Đào Hùng Cường

3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết tách
3.2.1. Khảo sát tỉ lệ rắn – lỏng
Cho khoảng 10 gam (mo) nguyên liệu hoa Đậu biếc đã được cắt nhỏ và V (ml)
CH3OH vào bình cầu 1000ml, lắp ống sinh hàn vào bình cầu. Tiến hành đun hồi lưu ở
nhiệt độ 75oC ở bếp cách thủy ứng với 5 mẫu thí nghiệm với các thể tích lần lượt là
75ml, 100ml, 125ml, 150ml, 175ml. Sau thời gian 60 phút, lấy dịch chiết ra khỏi bình
cầu, lọc bằng vải lọc và giấy lọc để loại bỏ cặn từ nguyên liệu và đem đi đong để xác
định thể tích dịch chiết (Vdc).
Chuẩn bị một bình định mức đã sấy khơ và biết trước khối lượng, hút 10ml
dung mơi methanol tinh khiết cho vào bình định mức và đem đi cân, ta có được khối
lượng của 10ml dung môi methanol (m1). Tiếp tục chuẩn bị một bình định mức khác
đã sấy khơ và biết trước khối lượng, hút 10ml dịch chiết vào bình định mức và đem đi
cân, ta thu được khối lượng của 10ml dịch chiết (m2). Như vậy để xác định toàn bộ
lượng chất tan (m3) có trong dịch chiết, ta thực hiện theo cơng thức:
m3 =

m2 - m1
× V dịch chiết (ml)

10

Lượng chất tan ở mỗi thí nghiệm được xác định và tổng hợp tại Bảng 3.4.
Nhiệm vụ của quá trình khỏa sát tỉ lệ rắn lỏng nhằm mục đích dị tìm điều kiện
tối ưu tương ứng với từng thể tích dung môi. Dung môi càng nhiều lượng chất bán dẫn
chảy ra càng nhiều.Vì sao lại có sự chuyển dịch các chất từ mẫu hoa ra dung mơi đó là
bởi vì trong q trình ngâm ở một nhiệt độ nào đó, các phân tử dung môi bắt đầu sôi,
methanol từ từ chậm rãi ngấm dần vào hoa Đậu Biếc dần dần trong hoa xảy ra hiện
tượng chuyển dịch (vì đã vượt qua điểm nút thăng bằng chất bên trong hoa). Methanol
sẽ len lõi và chiếm lĩnh những vị trí mà các chất nền có trong Hoa Đậu Biếc để lại và
phần đi ra là lượng chất đặc hữu của có trong hoa.

Thái Trí – 16CHDE

19