Khảo sát ảnh hưởng của một số chất thuộc nhóm auxin đến khả năng tạo mô sẹo phôi hóa phục vụ chuyển gen của một số giống sắn manihot esculenta crantz

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ HUYỀN
Tên đề tài:
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT THUỘC NHĨM AUXIN
ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO MƠ SẸO PHƠI HĨA PHỤC VỤ CHUYỂN GEN
CỦA MỘT SỐ GIỐNG SẮN (Manihot esculenta Crantz)

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Cơng nghệ sinh học

Lớp

: K42 CNSH

Khoa

: CNSH - CNTP

Khố học

: 2010 – 2014

Giảng viên hướng dẫn:

1. TS. Nguyễn Anh Vũ
Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam
2. Th.S. Lương Thị Thu Hường
Khoa CNSH – CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, năm 2014


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ HUYỀN
Tên đề tài:
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT THUỘC NHĨM AUXIN
ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO MƠ SẸO PHƠI HĨA PHỤC VỤ CHUYỂN GEN
CỦA MỘT SỐ GIỐNG SẮN (Manihot esculenta Crantz)

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Cơng nghệ sinh học

Lớp

: K42 CNSH

Khoa

: CNSH - CNTP

Khố học

: 2010 – 2014

Giảng viên hướng dẫn:
1. TS. Nguyễn Anh Vũ
Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam
2. Th.S. Lương Thị Thu Hường
Khoa CNSH – CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, năm 2014


LỜI CẢM ƠN
Với tấm lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin cảm ơn PGS. TS. Nguyễn
Văn Đồng (Giám đốc Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Tế bào Thực vật,
Viện Di truyền Nông nghiệp), TS. Nguyễn Anh Vũ người đã tận tình chỉ bảo và tạo
điều kiện giúp tơi hồn thành q trình thực tập.
Tơi xin chân thành cảm ơn KS. Lê Ngọc Quỳnh cùng toàn thể cán bộ và
nhân viên phịng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Cơng nghệ Tế bào Thực vật đã
hết lịng giúp đỡ tơi trong suốt q trình thực tập.
Tơi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, lời tri ân tới ThS. Lương Thị
Thu Hường đã tận chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong thời gian qua.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè,
những người ln dành cho tơi những tình cảm tốt đẹp nhất, luôn hỗ trợ, giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.

Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên đề tài khơng tránh khỏi những
sai sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp kiến của thầy cơ và các bạn để đề tài
của tơi được hồn thiện hơn.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2014
Sinh viên

Nguyễn Thị Huyền


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang

Bảng 2.1. Diện tích, năng suất và sản lượng sắn của thế giới từ năm 2000-2011 ....13
Bảng 2.2. Diện tích, sản lượng và năng suất trồng sắn của Việt Nam qua các năm
2000-2013..................................................................................................................14
Bảng 2.3. Các quốc gia phát triển nhiên liệu sinh học với quy mô lớn ....................16
Bảng 2.4. Tám nhà máy sản xuất Ethanol và rượu ...................................................17
từ sắn của Việt Nam năm 2010 .................................................................................17
Bảng 3.1. Các mơi trường sử dụng trong q trình nghiên cứu................................24
Bảng 4.1. Kết quả ảnh hưởng của NAA tới khả năng tạo mô sẹo sau 28 ngày ........32
Bảng 4.2. Kết quả ảnh hưởng của 2,4D tới khả năng tạo mô sẹo sau 28 ngày.........34
Bảng 4.3. Kết quả ảnh hưởng của picloram tới khả năng tạo mơ sẹo sau q trình
ni cấy .....................................................................................................................35
Bảng 4.4. Kết quả ảnh hưởng của NAA tới khả năng tạo mơ sẹo phơi hóa sau q
trình ni cấy.............................................................................................................37
Bảng 4.5. Kết quả ảnh hưởng của 2,4D tới khả năng tạo mơ sẹo phơi hóa sau q
trình ni cấy.............................................................................................................38
Bảng 4.6. Kết quả ảnh hưởng của picloram tới khả năng tạo mô sẹo phơi hóa sau
q trình ni cấy ......................................................................................................39

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang

Hình 2.1. Biểu đồ sản lượng trồng sắn của Việt Nam từ năm 2000 - 2013 ..............15
Hình 3.1. Cây sắn trong ống nghiệm ........................................................................24
Hình 3.3. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của NAA tới khả năng tạo mơ sẹo phơi hóa...27
Hình 4.1. Ảnh hưởng của NAA tới khả năng tạo mơ sẹo .........................................33
Hình 4.2. Ảnh hưởng của 2,4D tới khả năng tạo mơ sẹo ..........................................34
Hình 4.3. Ảnh hưởng của picloram tới khả năng tạo mô sẹo ............................................. 36
Hình 4.4. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của các auxin ở công thức tối ưu tới khả năng
tạo mô sẹo..................................................................................................................37
Hình 4.5. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của các auxin ở công thức tối ưu tới khả năng
tạo mô sẹo phơi hóa...................................................................................................40
Hình 4.6. Giống TMS60444 sau 2 lần cấy chuyển trong mơi trường MMS ...........41
Hình 4.7. Giống KM98 – 7 sau 2 lần cấy chuyển trong mơi trường ........................41
Hình 4.8. Giống sắn sau 4 lần cấy chuyển trong môi trường MMS .........................42


DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
2,4D

: Axit 2,4 dicloro-phenoxiaxetic(2,4D)

ADN

: Axit deoxyribonucleic

BAP

: 6-benzylaminopurine

CIAT

:International Center for Tropical Agriculture

CV

: Coeficient of Variation

Đ/C

: Đối chứng

FAO

: Food and Agriculture Organization

HCN

: Hidro xyanua

LSD

: Least Significant Difference

MS

: Murashige and Skoog’s

NAA

: α - Naphlene axetic axit

TN

: Thí nghiệm


MỤC LỤC
Trang

MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................9
1.2. Mục đích và mục tiêu nghiên cứu ......................................................................10
1.2.1. Mục đích..........................................................................................................10
1.2.2. Yêu cầu............................................................................................................10
1.3. Ý nghĩa của đề tài ...............................................................................................10
1.3.1. Ý nghĩa khoa học ............................................................................................10
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn .............................................................................................10
Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................11
2.1. Tổng quan chung về cây sắn ..............................................................................11
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại...................................................................................11
2.1.2. Đặc điểm thực vật học.....................................................................................11
2.1.3. Đặc điểm một số giống sắn nghiên cứu ..........................................................12
2.1.4. Thành phần dinh dưỡng và giá trị sử dụng .....................................................12
2.1.4. Tình hình sản xuất và tiêu thụ .........................................................................13
2.1.5. Nhu cầu sắn cho nhiên liệu sinh học ...............................................................16
2.2. Auxin và vai trò của auxin trong q trình tạo mơ sẹo ......................................18

2.3. Tình hình nghiên cứu chuyển gen sắn................................................................19
2.3.1. Trên thế giới ....................................................................................................19
2.3.2. Tại Việt Nam ...................................................................................................23
Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......24
3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu .......................................................................24
3.2. Môi trường nuôi cấy ...........................................................................................24
3.3. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất ..............................................................................24
3.4. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu ......................................................25
3.5. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................25
3.6. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................25
3.6.1. Nội dung 1: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của auxin (NAA, 2,4-D, picloram) tới
khả năng tạo mô sẹo ..................................................................................................27
3.6.2. Nội dung 2: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của auxin (NAA, 2,4-D, picloram) tới
khả năng tạo mô sẹo phơi hóa ...................................................................................29
Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................................................32


4.1. Kết quả ảnh hưởng của auxin (NAA, 2,4-D, picloram) tới khả năng tạo mô sẹo .....32
4.2. Kết quả ảnh hưởng của auxin (NAA, 2,4-D, picloram) tới khả năng tạo mơ sẹo
phơi hóa .....................................................................................................................37
4.2.3. Kết quả ảnh hưởng của picroram tới khả năng tạo mơ sẹo phơi hóa ..............39
Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................43
5.1. Kết luận ..............................................................................................................43
5.2. Kiến nghị ............................................................................................................43
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................45
I. Tài liệu tiếng Việt ..................................................................................................45
II. Tài liệu tiếng anh ..................................................................................................45


MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Sắn (Manihot esculenta Crantz) hiện được trồng trên hơn 100 nước có khí
hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc ba châu: châu Á, châu Phi và châu Mỹ La Tinh.
Tổ chức Nông lương thế giới (FAO) xếp sắn là cây lương thực quan trọng ở các
nước đang phát triển sau lúa gạo, ngô và lúa mì. Tinh bột sắn là một thành phần
quan trọng trong chế độ ăn của hơn một tỷ người trên thế giới [17].
Ở Việt Nam, cây sắn được xác định là lồi cây nhiên liệu sinh học thích
hợp duy nhất trong thời gian tới. Ngoài ra, sắn đã trở thành một trong 10 mặt
hàng xuất khẩu quan trọng của Việt Nam với kim ngạch năm 2012 đạt tới 1,2 tỷ
USD (FAO, 2013) [18]. Tuy nhiên, năng xuất và sản lượng sắn của nước ta còn
ở mức thấp, chất lượng tinh bột trong sắn cũng không cao do canh tác không
đúng kỹ thuật, khả năng kháng virus và sâu bệnh thấp, diện tích trồng khơng quy
mơ, tập chung. Do vậy, chúng ta cần tạo ra giống sắn mới cho năng xuất và chất
lượng cao đáp ứng đủ nhu cầu thực tế [21].
Ngày nay trong công tác chọn tạo giống sắn, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào được
áp dụng để nhân nhanh, tạo giống sạch bệnh và kỹ thuật di truyền, chuyển gen tạo
giống mới mang các đặc tính mong muốn một cách nhanh chóng và hiệu quả được
nghiên cứu [20]. Tạo mơ sẹo phơi hóa là khâu quan trọng để tạo vật liệu phục vụ
chuyển gen vào sắn. Mô sẹo phôi hóa đã được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu như
tạo giống sạch bệnh, nghiên cứu chuyển gen và bảo quản nguồn gen. Tạo mơ sẹo phơi
hóa có ý nghĩa quan trọng cho nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen của các giống sắn,
làm cơ sở tiến tới chuyển gen (tổng hợp tinh bột, gen kháng virus,...) nâng cao năng
xuất, hàm lượng tinh bột phục vụ sản xuất nhiên liệu sinh học [29].
Việc sử dụng một số các chất kích thích sinh trưởng đã nâng cao hiệu quả rõ
rệt vì nó kích thích sự phân chia tế bào của mơ phân sinh thượng tầng để hình thành
mơ sẹo (callus) [11]. Các chất thuộc nhóm auxin đều có hiệu quả trong việc cảm ứng
để duy trì mơ hoặc để cảm ứng mơ sẹo có khả năng sinh phơi. Tuy nhiên các chất
khác nhau (2,4-D, NAA, picloram…) và được sử dụng ở những nồng độ khác nhau
thì hiệu quả tạo mơ sẹo khơng giống nhau trên các giống sắn. Chúng có thể kích thích
cũng có thể ức chế q trình tạo mơ sẹo [16]. Trong một nghiên cứu tạo mô sẹo của

E. Sofiari và cộng sự, 2,4D cho kết quả cao hơn so với NAA trên giống
TMS90853[16]. Ông cho rằng nên sử dụng 2,4D để tạo mơ sẹo trong q trình ni


cấy. Trong khi đó Jiu Liu và cộng sự lại sử dụng piclroram cho q trình tạo mơ sẹo
và mơ sẹo phơi hóa và cho kết quả khá tốt trên giông TMS 60444 [24]. Các giống sắn
ở Việt Nam rất đa dạng và có nhiều giống tốt nhưng q trình nghiên cứu về sắn liên
quan tới tạo mô sẹo hay chuyển gen cịn rất nhiều khó khăn, hạn chế [1].
Do vậy vấn đề đặt ra hiện nay là cần tìm ra loại auxin cho hiệu quả tạo mô
sẹo, mô sẹo phơi hóa cao nhất phục vụ chuyển gen trên các giống sắn Việt Nam.
Xuất phát từ thực tiễn trên tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của
một số chất thuộc nhóm auxin đến khả năng tạo mơ sẹo phơi hóa phục vụ
chuyển gen của một số giống sắn (Manihot esculenta Crantz)”.
1.2. Mục đích và mục tiêu nghiên cứu
1.2.1. Mục đích
- Khảo sát ảnh hưởng của NAA, 2,4D và picloram đến khả năng tạo mô sẹo
của giống sắn KM98 – 7 và giống TMS60444.
1.2.2. Yêu cầu
- Xác định ảnh hưởng của NAA, 2,4D và picloram đến sự hình thành mô
sẹo ở giống sắn KM98 – 7 và TMS60444
- Xác định ảnh hưởng của NAA, 2,4D và picloram đến sự hình thành mơ
sẹo phơi hóa ở giống sắn KM98 – 7 và TMS60444
1.3. Ý nghĩa của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
- Thành công của nghiên cứu tạo tiền đề cho việc chuyển các gen phù hợp
cần thiết với mục đích khác nhau vào cây sắn Việt Nam.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Xây dựng được quy trình tạo mơ sẹo phơi hố phục vụ chuyển gen hiệu quả
Tạo tiền đề và nguyên liệu cho các quá trình chuyển gen sắn ở Việt Nam.

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan chung về cây sắn
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Sắn thuộc họ Euphobiaceae, phân họ Crtonoideae, tơng Manihoteae, chi
Manihot, lồi M. Esculenta, tên khoa học là Manihot Esculenta Crantz. Sắn còn
được gọi với tên tiếng anh là cassava [25]. Ở Việt Nam, sắn hay cịn được gọi là cây
khoai mì, cây củ mì…
Chi Manihot bao gồm những cây có hoa, hạt kín, có hai lá mầm, họ thầu dầu.
Năm 1776 Crantz công bố một sự mơ tả lồi với tên Manihot esculenta. Ơng dùng
lại tên lồi M. esculenta và khơng cịn phân biệt giữa sắn đắng và sắn ngọt. Chi
Manihot thuộc họ thầu dầu, có tới hơn 300 chi và 8000 lồi hầu hết là cây nhiệt đới.
Chi Manihot thuộc nhóm Manihotae. Tất cả các lồi trong chi đều có số lượng
nhiễm sắc thể 2n= 36. Rogers và Appan đã xây dựng một bảng phân loại cho 98
lồi, phân thành 17 nhóm [29]. Sự nhận dạng các lồi và các nhóm dựa vào sự phân
tích nhiều mặt của nhiều đặc điểm hình thái ở các bộ phận trên mặt đất. Nhờ vào
bảng phân loại trên người ta đã lập được một bảng nhận dạng các lồi trong chi [7].
Sắn có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới của châu Mỹ La tinh và được trồng cách đây
khoảng 5000 năm. Cây sắn đựơc du nhập vào Việt Nam khoảng giữa thế kỷ 18 [19].
Sắn được canh tác phổ biến tại hầu hết các tỉnh của Việt Nam. Trong đó, diện tích sắn
trồng nhiều nhất ở vùng Đông Nam Bộ, vùng Tây Nguyên, vùng núi và trung du phía
bắc, vùng ven biển nam Trung Bộ và vùng ven biển bắc Trung Bộ [3].
2.1.2. Đặc điểm thực vật học
Cây sắn cao 2–3 m, lá khía thành nhiều thùy, rễ ngang phát triển thành củ và
tích luỹ tinh bột. Thời gian sinh trưởng của sắn từ 6 đến 12 tháng, có nơi tới 18
tháng, tùy giống. Vụ trồng, địa bàn trồng và mục đích sử dụng, nhiệt độ sinh trưởng
20-30oC [2]. Hoa sắn thuộc loại hoa chùm, đơn tính, có cuống dài mọc ra từ chỗ
phân cành, ngọn thân. Quả sắn có kích thước từ 1-1,5 cm, một quả thường có 3 hạt.
hạt sắn nặng từ 95-136 mg, màu nâu đen. Nhiệt độ thích hợp cho hạt sắn nảy mầm

là từ 25- 30oC [19]. Sắn dễ trồng, hợp nhiều loại đất, vốn đầu tư thấp, hợp khả năng
kinh tế với nhiều hộ gia đình nơng dân nghèo, thiếu lao động tận dụng đất để lấy
ngắn nuôi dài. Sắn đạt năng suất cao và lợi nhuận khá nếu biết dùng giống tốt và
trồng đúng quy trình canh tác sắn bền vững [3].


Bên cạnh đó, sắn cũng có một số nhược điểm như trồng sắn làm kiệt đất, củ
sắn nghèo đạm và vitamin, có độc tố HCN trong sắn củ tươi, chế biến sắn gây ô
nhiễm môi trường [3].
2.1.3. Đặc điểm một số giống sắn nghiên cứu
Giống KM98 – 7
Giống KM98 – 7 được cung cấp bởi trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Cây Có
Củ - Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.
Giống này là con lai chọn lọc của tổ hợp lai SM 1717 có mẹ là CM321-188,
(polycross) có nguồn gốc từ CIAT/Colombia. Giống đã được Bộ Nông nghiệp và
phát triển nông thôn cho phép đặc cách công nhận giống ngày 02 tháng 10 năm
2008, số 216/QĐ-TT-CLT.
Giống KM98-7 sinh trưởng ở Miền Bắc của Việt Nam từ 7 – 10 tháng, thân
nâu đỏ, cuống lá nhỏ, chia thùy sâu. Cuống lá và phiến lá màu xanh, ruột củ trắng,
vỏ củ màu nâu. Năng xuất đạt 25 – 45 tấn/ha. Giống được nhiều nông dân miền Bắc
chấp nhận và nhân nhanh trong sản xuất. Tính đến năm 2008 đã có trên 500 ha được
phát triển trong sản xuất.
Giống TMS 60444
TMS 60444 là giống sắn mơ hình được nhập từ CIAT. Các nghiên cứu trên
thế giới đã cho thấy đây là giống sắn có khả năng tạo mơ sẹo phơi hóa chất lượng
nhất và đã được chuyển gen thành cơng. Vì vậy, chúng tơi sử dụng giống sắn này
làm giống mơ hình để đánh giá chất lượng mô sẹo của các giống Việt Nam được
nghiên cứu.
TMS 60444 được thừa nhận vào ngày 01-06-1988. Chiều cao đạt được của
giống khi thu hoạch khoảng 215 cm. Lá trung tâm có dạng hình ngọn giáo. Cuống

lá màu xanh xen kẽ với một ít màu đỏ.Lá trưởng thành có màu xanh đậm và xẻ
thành 5 thùy lá. Rễ củ có màu trắng.
2.1.4. Thành phần dinh dưỡng và giá trị sử dụng
Sắn là cây lương thực quan trọng trong cơ cấu nông nghiệp sau lúa, ngô và
đậu tương [3]. Một số thành phần dinh dưỡng trong củ sắn:
- Hydrat cacbon: chiếm 88-91% trọng lượng khô của củ sắn, trong đó:
+ Tinh bột: 84-87%
+ Đường tổng số: 4% (Saccaarose 71%, glucose 13%, fructose 9%, mantose 5%)
- Ngồi ra sắn cịn chứa một số chất khác với hàm lượng thấp: protein, chất
béo, một số chất khoáng (P, K, Mg,...) và một số Vitamin (B1, B2,...)


Sắn là cây trồng có nhiều cơng dụng trong chế biến công nghiệp, thức ăn gia súc
và lương thực thực phẩm như bột ngọt, rượu cồn, mì ăn liền, gluco, xiro, bánh kẹo,
mạch nha, kỹ nghệ chất dính (hồ vải, dán gỗ), bún, miến, mì ống, mì sợi, bột khoai,
bánh tráng, hạt trân châu (tapioca), phụ gia thực phẩm, phụ gia dược phẩm [7]. Hiện
tại, sản phẩm sắn ngày càng thông dụng trong buôn bán, trao đổi thương mại quốc tế.
2.1.4. Tình hình sản xuất và tiêu thụ
2.1.4.1. Trên thế giới
Hiện nay, sắn được trồng trên hơn 100 quốc gia trên tồn thế giới với các
quy mơ canh tác rất khác nhau. Sản lượng sắn toàn thế giới trong nhiều năm trở lại
đây duy trì tương đối ổn định ở mức sản lượng trên 200 triệu tấn [18].
Bảng 2.1. Diản tích, năng suảt và sản lảảng sản cảa thả giải tả năm 2000-2011
Năm
2000
2001
2002
2003
2004
2005

2006
2007
2008
2009
2010
2011

Diện tích (triệu ha)
17,00
17,04
17,22
17,72
18,31
18,42
18,56
18,42
18,39
18,76
18,46
19,64

Năng suất (tấn/ha)
103,8
106,9
170,1
107,8
110
111,7
120,6
122,8

126,2
125
124,3
128,4

Sản lượng (triệu tấn)
176,53
182,23
184,58
191,12
201,41
205,89
223,85
226,3
232,14
234,55
229,54
252,2

(FAO, 2013) [18]
Diện tích, năng suất và sản lượng sắn trên thế giới có chiều hướng gia tăng từ
năm 2000 đến nay. Năm có sản lượng sắn cao nhất là năm 2011, đạt 252,2 triệu tấn
tăng 42,8% (FAO, 2013) [18]. Nguyên nhân của sự gia tăng này là do ngành chế biến
công nghiệp nhiên liệu sinh học ethanol sử dụng sắn làm nguyên liệu đầu vào tại các
quốc gia Đông Nam Á. Tại Thái Lan, Việt Nam và Indonesia, sắn trở thành một loại
cây công nghiệp hàng năm quan trọng và được thu mua để chế biến thành các sản
phẩm xuất khẩu [21].
2.1.4.2. Việt Nam
Ở Việt Nam, sắn là cây lương thực quan trọng đứng hàng thứ ba sau lúa và
ngơ. Cây sắn hiện nay đã chuyển đổi vai trị từ cây lương thực, thực phẩm thành cây

cơng nghiệp hàng hóa có lợi thế cạnh tranh cao. Sản xuất sắn là nguồn thu nhập
quan trọng của các hộ nơng dân nghèo do sắn dễ trồng, ít kén đất, ít vốn đầu tư, phù
hợp sinh thái và điều kiện kinh tế nơng hộ [4].
Bảng 2.2. Diản tích, sản lảảng và năng suảt trảng sản cảa Viảt Nam qua các năm
2000-2013
Năm
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
2011
2012
2013

Diện tích
(nghìn ha)
237,6
292,3
337
371,9
388,6

425,5
475,2
495,5
555,7
508,8
496,1
558,5
550
560

Năng suất
(tấn/ha)
8,36
12,01
13,17
14,28
14,98
15,78
16,38
16,53
16,91
16,82
17,18
17,72
17,77
17,60

Sản lượng
(triệu tấn)
1,99

3,51
4,44
5,31
5,28
6,72
7,78
8,19
9,40
8,56
8,52
9,9
9,7
9,4

(Tổng cổc thổng kê, 2013) [9]
Năng suất sấn cấa Viất Nam hiấn nay đấng khoấng thấ 10 trong sấ các quấc
gia năng suất cao. Theo thấng kê cấa Tấng cấc Hấi quan, diấn tích trấng sấn cấa cấ
nấấc có 560000ha, vấi tấng sấn lấấng đất gấn 9,4 triấu tấn (2013). Trong tấng sấn
lấấng thu đấấc, 30% sấn lấấng phấc vấ nhu cấu tiêu dùng trong nấấc làm lấấng
thấc, chấ biấn thấc ăn chăn nuôi, công nghiấp dấấc phấm, làm nguyên liấu sấn
xuất xăng sinh hấc, cấn công nghiấp... 70% đấấc xuất khấu dấấi dấng tinh bất hoấc
sấn lát khơ. Năm 2013, cấ nấấc có 6 nhà máy sấn xuất nhiêu liấu sinh hấc sấ dấng
nguyên liấu là sấn lát khô đi vào hoất đấng, gấn 100 nhà máy chấ biấn tinh bất sấn
và hàng trăm cấ sấ chấ biấn thấ công... (Tấng cấc thấng kê, 2013) [9].


Hình 2.1. Biảu đả sản lảảng trảng sản cảa Viảt Nam tả năm 2000 - 2013
(Tổng cổc thổng kê, 2013) [9]
Nhìn vào hình 2.1 có thấ thấy: sấn lấấng sấn có xu hấấng tăng dấn và ấn
đấnh giai đoấn tấ năm 2000 đấn 2008, giấm mấnh trong 2 năm sau đó. Tấ năm

2011 sấn lấấng tăng mấnh trấ lấi và dấn ấn đấnh mấc dù có giấm nhấng khơng
đáng kấ.
Sấn là mất hàng xuất khấu hấn tấ USD mấi năm, năm 2013 xuất khấu sấn
và sấn phấm thu vấ 1,1 tấ USD vấi 3,1 triấu tấn. Trong đó sấn xuất khấu 1,5 triấu
tấn, trấ giá 385,5 triấu USD, giấm 32,9% vấ lấấng và giấm 31,2% vấ trấ giá so vấi
năm 2012. Viất Nam xuất khấu sấn và sấn phấm chấ biấn tấ sấn sang 5 thấ trấấng
chính trên thấ giấi, trong đó Trung Quấc vấn là thấ trấấng xuất khấu chính, vấi 2,6
triấu tấn. Ngồi ra, Viất Nam cịn xuất khấu sấn và sấn phấm sang thấ trấấng khác
nhấ Hàn Quấc, Philippin, Đài Loan, Malaixia, Nhất Bấn vấi lấấng xuất đất lấn lấất
237,6 nghìn tấn, 62,8 nghìn tấn, 41,3 nghìn tấn, 28,8 nghìn tấn và 8,9 nghìn tấn
(Tấng cấc thấng kê, 2013) [9]. Có đấấc nhấng kất quấ này là do nhiấu yấu tấ,
nhấng quan trấng hấn cấ là trong sấn xuất ngấấi trấng sấn đã chấn giấng mấi và áp
dấng các biấn pháp kấ thuất. Tuy nhiên, trong sấn xuất sấn hiấn nay cũng còn gấp


nhiấu khó khăn nhấ: diấn tích sấn bấ thu hấp do cấnh tranh bấi các cây trấng khác;
năng suất sấn còn thấp hấn so vấi tiấm năng cấa cây sấn (45 – 50 tấn/ha) [4].
Như vậy, nếu như diện tích sắn của Việt Nam khó có khả năng gia tăng trong những
năm tới do sự cạnh tranh của các loại cây khác cũng như do quy hoạch sử dụng đất thì
chúng ta vẫn cịn triển vọng tăng trưởng sản lượng nhờ gia tăng năng suất nếu được
đầu tư đúng hướng về công tác chọn tạo giống và kỹ thuật canh tác sắn bền vững.
2.1.5. Nhu cầu sắn cho nhiên liệu sinh học
Tinh bột sắn góp phần giải quyết vấn đề an ninh lương thực tồn cầu, là
nguồn ngun liệu có giá trị cho các ngành cơng nghiệp: thực phẩm, hóa chất, dược
phẩm, dệt may, sản xuất giấy và đặc biệt là nguồn nhiên liệu sinh học [12]. Tồn
cầu hóa nền kinh tế và tăng giá xăng dầu đã mở ra cơ hội mới cho tinh bột sắn, trở
thành nguồn nguyên liệu thay thế cho nhiều ngành công nghiệp khác nhau.
Tại Đông Nam Á, sắn được sử dụng làm ethanol làm nhiên liệu sinh học phục
vụ giao thông vận tải [29]. Từ 1 tấn sắn với hàm lượng tinh bột 30% có thể sản xuất
ra khoảng 280 lít ethanol 96% [13]. Trong nhiều trường hợp, khí hậu trở thành nhân

tố quyết định cho việc lựa chọn cây trồng tiềm năng cho sản xuất nhiên liệu sinh học
[15]. Điều này giải thích lý do tại sao Mỹ sử dụng nguồn tinh bột ngô. Canada, Úc và
New Zealand chủ yếu sử dụng tinh bột từ bột mì. Châu Âu sử dụng tinh bột từ khoai
tây và ngơ. Vùng có khí hậu nhiệt đới như Brazil và các nước Châu Á sử dụng nguồn
tinh bột từ sắn và các cây trồng khác [23, 27, 37]. Brazil là nước tiên phong về nhiên
liệu sinh học với lịch sử sản xuất trong 40 năm qua và cho đến nay đã hoàn toàn tự
cung cấp nhiên liệu trong nước. Có 5 quốc gia đã phát triển nhiên liệu sinh học
chương trình quy mơ lớn là Hoa Kỳ, Brazil, Trung Quốc, Ấn Độ và Pháp (Bảng 2.3).
Trên thế giới, 17 quốc gia đã phát triển nhiên liệu sinh học. Sắn sử dụng làm nhiên
liệu sinh học có lợi thế cao ở nhiều nước châu Á đặc biệt là ở Việt Nam.
Bảng 2.3. Các quảc gia phát triản nhiên liảu sinh hảc vải quy mô lản
STT
1
2
3
4
5

Quốc gia
Hoa Kỳ
Brazil
Trung Quốc
Ấn Độ
Pháp

Sản lượng (tỷ lít/năm)
18,4
17,0
3,8
1,9

0,9
(Rogers Appan DJ, 1973) [28]


Ở Việt Nam, cây sắn đã và đang là cây trồng được ưu tiên nghiên cứu phát triển
trong tầm nhìn chiến lược đến năm 2020 của Bộ Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn.
Nghiên cứu và phát triển cây sắn theo hướng sử dụng đất nghèo dinh dưỡng, đất khó
khăn là hướng hỗ trợ chính cho việc thực hiện “Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến
năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025” đã được Thủ tướng Chính phủ phê duyệt tại quyết
định số 177/2007/ QĐ-TT ngày 20 tháng 11 năm 2007 [8].
Theo đề án phát triển, đến năm 2015, Việt Nam cần 4,2 triệu tấn sắn lát để
sản xuất ra 750 triệu lít ethanol. Tám nhà máy nhiên liệu sinh học đã được cấp phép
với nhu cầu tiêu thụ mỗi năm khoảng 1,2 triệu tấn sắn lát. PetroVietnam đã triển
khai công tác đầu tư xây dựng 3 nhà máy sản xuất cồn sinh học đặt tại 3 miền Bắc,
Trung, Nam với công suất mỗi nhà máy là 100.000 m³ cồn/năm tương đương
khoảng 230 nghìn tấn sắn lát khơ/năm hoặc 575 nghìn tấn củ tươi/năm. Ngồi ra,
nhà máy ethanol Đại Tân, huyện Đại Lộc, Quảng Nam do Công ty Cổ phần Đồng
Xanh đầu tư với công suất của nhà máy là 125.000 tấn ethanol/năm, nhà máy cần
300.000 tấn sắn khô mỗi năm [21] (Bảng 2.4).
Bảng 2.4. Tám nhà máy sản xuảt Ethanol và rảảu
tả sản cảa Viảt Nam năm 2010
STT

Tên nhà máy

Cơng suất
(triệu lít /năm)

1

Ethanol Đại Tân

125

2

Ethanol Dung Quất

100

3

Ethanol Bình Phước

100

4

Ethanol Tam Nơng

100

5

Ethanol Tùng Lâm

70

6
7

Alcohol Lam Sơn

25

Alcohol Bình Tây

60

8

Đồng Xanh

70

Tổng cộng

650

(Hoàng Kim Và Nguyễn Văn Bộ, 2011) [21]
Theo đánh giá của bộ Công thương, trong tương lai gần, thị trường tiêu thụ
sắn lát sẽ có cạnh tranh khốc liệt và thiếu hụt nguồn nguyên liệu. Tăng năng suất
cây trồng dựa vào các thành tựu của công nghệ sinh học là một trong những ưu tiên
hàng đầu hiện nay, bao gồm: lai tạo giống, nhân vơ tính, gây đột biến và chuyển


gen. Trong đó, ứng dụng chuyển gen là một chiến lược quan trọng trong việc tạo ra
sản phẩm nông nghiệp chất lượng cao với ưu điểm là phương pháp đơn giản, nhanh
chóng và hiệu quả, tìm ra dịng giống năng suất cao, khả năng chống bệnh [34].
2.2. Auxin và vai trị của auxin trong q trình tạo mơ sẹo

Auxin là một hợp chất tương đối đơn giản, có nhân indole, có cơng thức
ngun là: C10H9O2N, tên của nó là axit β-indol-acetic.

Axit βIndolyaxetic(AIA)

Axit 2,4 diclorophenoxiaxetic(2,4D)

Axit αnaphtylaxetic(αANA)

Auxin là một loại hormon kích thích sinh trưởng, có tác dụng sinh lý đến q
trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện
tượng ưu thế ngọn, tính hướng của thực vật, sự sinh trưởng của quả và tạo quả
không hạt...
Auxin được tổng hợp sử dụng trong nuôi cấy mơ nhưng nó dễ bị biến tính
trong mơi trường ni cấy và nhanh chóng thối biến ở trong mơ. Tuy nhiên những
đặc tính này có thể trở nên hữu dụng bởi vì trong cây, (cùng với cytokinin) sau khi
cảm ứng hình thành mơ sẹo sẽ kích thích sự tạo chồi hoặc phơi khi hàm lượng của
nó trong mơ giảm dần. Chính vì vậy auxin dùng trong ni cấy mơ là dạng auxin
tổng hợp, không phải auxin tự nhiên, nên độ bền cao hơn. Auxin thường được sử
dung phối hợp với các chất điều hồ sinh trưởng khác để kích thích sự phát sinh
hình thái trực tiếp (sự tạo rễ của cành giâm in vitro) và trong nuôi cấy đỉnh sinh
trưởng và chồi. Tuy nhiên, tuỳ theo mục đích thí nghiệm mà người ta có thể sử
dụng các hợp chất giống auxin khác được tổng hợp và nó có những hoạt động hơi
khác với auxin như: NAA, 2,4D, picloram…
2.2.1. NAA (Naphtylaxetic axit)
Cơng thức hóa học: C12H9O2Na; phân tử khối: 186,21 g/mol.


NAA là chất kích thích sinh trưởng được tổng hợp bằng con đường hóa học,
thuộc nhóm chất auxin nên nó có đầy đủ các tính chất và tác dụng sinh lý của nhóm

chất này. Đặc biệt là khả năng cảm ứng, tạo mơ sẹo.
2.2.2. 2,4-D (axit 2,4,5-dichlorophenoxyacetic)
Cơng thức hóa học: C8H6Cl 12O3; phân tử khối: 221,04 g/mol.
2,4-D là một chất kích thích sinh trưởng ở thực vật, thường được sử dụng
phối hợp với cytokinin để cảm ứng tạo mô sẹo và huyền phù tế bào và nó sẽ được
thay thế bởi IBA hay NAA để kích thích sự phát sinh hình thái. IBA và NAA là loại
auxin thích hợp trong nuôi cấy chồi.
2.2.3. Picloram ( axit 4 - amino-3, 5,6 - trichloro-2 – Acid)
Cơng thức hóa học: C6H3Cl 3N 2O2; phân tử khối: 241,46 g/mol.
Picloram thường được sử dụng để cảm ứng và duy trì mơ sẹo hoặc huyền
phù tế bào của các loại cây lá rộng hoặc để cảm ứng sự tạo mơ sẹo có khả năng sinh
phơi. Picloram có hiệu quả đối với biên độ các kiểu di truyền rộng hơn. Chỉ trong
một số rất ít trường hợp cá biệt, loại auxin này được dùng trong nuôi cấy đỉnh sinh
trưởng và nuôi cấy đoạn thân và được dùng vi nng rt thp (0,012 ữ 0,4 àM)
khi phi hợp với một cytokinin.
2.3. Tình hình nghiên cứu chuyển gen sắn
2.3.1. Trên thế giới
Bản chất của cây trồng chuyển gen là sự biến đổi vật chất di truyền, tiếp
nhận thêm những gen mới, kết quả là xuất hiện những tính trạng mới dưới sự tác
động của môi trường. Thông qua phương pháp chuyển gen cho phép nhà chọn
giống tích hợp được các gen có lợi vào một lồi, một sản phẩm cây trồng nhất định,
đây là phương thức tạo ra các tính trạng ưu việt mới cho cây trồng trên cơ sở kết
hợp với phương pháp chọn tạo truyền thống [34].
Chuyển gen sắn đã và đang được nghiên cứu rộng rãi trên toàn thế giới. Việc
đưa các gen quan tâm vào cây sắn đã và đang tạo ra những cây sắn mang đặc điểm
nông học quan tâm như khả năng kháng bệnh virut, kháng côn trùng, cải thiện
thành phần dinh dưỡng, biến đổi và tăng chuyển hóa tổng hợp tinh bột, giảm hàm
lượng cyanogenic trong củ sắn [30].
Trên thế giới các cơng trình nghiên cứu về chuyển gen sắn được tiến hành từ
những năm cuối thế kỉ 20 [28]. Năm 1996, những quy trình chuyển gen sắn đầu tiên

đã được báo cáo độc lập cùng một lúc bởi hai nhóm nghiên cứu khác nhau. Li và
cộng sự đã chuyển gen vào lá mầm sắn sau đó tạo chồi, từ chồi đã được chuyển gen


tái sinh thành cây hồn chỉnh [22]. Trong quy trình chuyển gen của Schöpke,
chuyển gen dựa trên việc thực hiện một quy trình để tạo ra các cụm tế bào được gọi
là mơ sẹo phơi hóa, gen mục tiêu sẽ được chuyển vào mơ sẹo phơi hóa, sau đó tái
sinh chúng thành cây hồn chỉnh từ phơi trưởng thành [31]. Đây là một mốc quan
trọng đánh dấu trong quá trình chọn tạo giống sắn bằng phương pháp phân tử. Sau
nhiều năm phát triển, công nghệ chuyển gen đã từng bước trưởng thành và tiến bộ
đáng kể , đã xác nhận được gen chức năng và giống chuyển gen.
Trong chuyển gen, chuyển gen sắn thường chuyển gen trung gian nhờ vi
khuẩn agrobacterium hoặc dùng súng bắn gen. Các mẫu thường sử dụng để chuyển
gen là lá mầm soma hoặc mô sẹo phơi hóa [24].


2.3.1.1. Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens được sử dụng như một vector tự nhiên để mang
các gen ngoại lai vào mô tế bào thực vật [6]. Khi xâm nhiễm vào tế bào, chúng gắn
đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến sự rối loạn các chất
sinh trưởng nội sinh, tạo ra khối u (trường hợp A. tumefaciens). Khả năng chuyển
gen này đã được khai thác để chuyển gen ngoại lai vào bộ máy di truyền của tế bào
thực vật theo ý muốn [5, 26].
Với mục đích chung là làm tăng năng xuất và sản lượng sắn, rất nhiều các
cơng trình nghiên cứu chuyển gen sắn nhờ vi khuẩn A. tumefaciens được công bố
thành công trong những năm gần đây như kháng virus [36], cải thiện hàm lượng
tinh bột [35], giảm lượng cyanogen [33], kháng thuốc trừ cỏ [30],... Cải thiện dựa
trên những đặc điểm này sẽ là xu hướng chính trong chọn lọc giống sắn nhờ kỹ
thuật sinh học phân tử trong tương lai [24]. Năm 2004, một cơng trình nghiên cứu
chuyển gen kháng virus khảm sắn (geminiviruses) đã được công bố. Chellappan đã

tiến hành tách chiết gen AC1 từ chính tác nhân gây bệnh là virus khảm sắn châu
Phi. Sau đó ơng tiến hành chuyển gen này vào giống TMS60444. Giống sắn này sau
khi được chuyển gen AC1 đã có khả năng kháng được geminiviruses[14]. Sắn là
cây trồng có hàm lượng cyanogen rất cao, thường thì chỉ có thể làm giảm hàm
lượng sau khi chế biến, hiện nay cũng có thể giảm bằng cách ức chế tổng hợp
cyanogen. Năm 2007, Mayague đã công bố chuyển gen thành công giúp giảm hàm
lượng độc tố cyanogen trong sắn bằng cách tăng thúc đẩy cyanogen bay hơi nhanh
chóng [37]. Bệnh khảm virus trên cây sắn rất phổ biến ở châu Phi gây ảnh hưởng
không nhỏ tới năng xuất, chất lượng sắn. Với mong muốn khắc phục tình trạng này,
cơng trình nghiên cứu chuyển gen kháng với virus (geminiviruse) gây bệnh khảm
trên sắn đã được tiến hành. Vanderschuren đã chuyển gen có chứa cấu trúc kẹp tóc
của RNAs. Cấu trúc đã tạo một mối liên quan giữa sự biểu hiện của RNA nhỏ và
khả năng miễn dịch với bệnh khảm virus. Phương pháp này mở ra hướng phân lập
virus với cấu trúc kẹp tóc bổ sung [36].
Trung tâm Nơng nghiệp nhiệt đới quốc tế (CIAT) cũng đã tập trung nghiên
cứu chuyển gene vào sắn thông qua Agrobacterium tumefaciens. Họ đã thực hiện
chuyển gen đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể như chuyển gen kháng côn trùng
Erinnyis ello trú ngụ trong cây sắn, và tạo ra các giống kháng được thuốc trừ cỏ như
Basta, gần đây họ đã nghiên cứu phát triển các giống sắn với thành phần tinh bột
khác nhau [30]. Năm 2006 các nhà khoa học Mỹ đã thành công trong việc chuyển


gen glgC làm tăng khả năng tổng hợp tinh bột trong sắn [35]. glgC là gen mã hóa
cho enzym ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) giúp tăng cường hoạt động
tổng hợp tinh bột ở sắn. Cây chuyển gen thể hiện gen glgC có AGPase hoạt động
cao hơn 70% so với cây đối chứng khi khảo nghiệm trong điều kiện tối ưu cho các
giống sắn khi khơng có vi khuẩn AGPase hoạt động [35].
Hiện nay, nhiều kỹ thuật chuyển gen khác nhau vào tế bào nhưng chuyển gen
thơng qua vi khuẩn A. tumefaciens có nhiều ưu điểm như hiệu quả chuyển gen cao,
yêu cầu trang thiết bị đơn giản, số lượng bản sao thấp và ổn định ở thế hệ con cháu. Do

đó, đây là phương pháp sử dụng rộng rãi nhất cho kỹ thuật di truyền sắn [24].
2.3.1.2. Chuyển gen thông qua nguồn ngun liệu mơ sẹo phơi hóa
Chuyển gen vào phơi soma gặp nhiều trở ngại và khó khăn đặc biệt là tần số
cây con tái sinh thấp [11], tỉ lệ tạo thể khảm cao [31]. Chuyển gen thông qua mô sẹo
phôi hóa sẽ khắc phục được tình trạng này, hạn chế được thời gian công sức mà
hiệu quả chuyển gen lại cao hơn [39].
Năm 1998, Gonzalez và cộng sự đã thành cơng trong việc chuyển gen vào
mơ sẹo phơi hóa giống TMS 60444 [20], đánh dấu một bước tiến mới cho việc áp
dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học trên đối tượng cây sắn. Sau gần 5 năm phát
triển kể từ khi phương pháp chuyển gen từ mô sẹo phôi hóa vào giống TMS60444
được giới thiệu, phương pháp chuyển gen qua Agrobacterium từ mơ sẹo phơi hóa đã
được tiến hành thành cơng ở một số phịng thí nghiệm [24].
Phương pháp chuyển gen sắn từ mơ sẹo phơi hóa ngày càng phổ biến, từ năm
2005 đã được sử dụng thường xuyên trong phịng thí nghiệm tạo sắn chuyển gen
kháng virus khảm [11, 38]. Năm 2009, quy trình chuyển gen vào cây sắn từ mơ sẹo
phơi hóa và tái sinh thành cây hoàn chỉnh của Bull và cộng sự đã cho thấy cụ thể
các giai đoạn khác nhau trong quy trình, họ cũng đưa ra một số cải tiến góp phần
hồn thiện quy trình chuyển gen hiện nay [29].
Chuyển gen vào sắn nhờ vi khuẩn A. tumefaciens từ mơ sẹo phơi hóa, việc
chuyển gen trở lên dễ dàng do mô sẹo phôi hóa có thể tăng sinh tạo ra số lượng
lớn trong thời gian ngắn. Đặc biệt chuyển gen từ những tế bào đang phân chia
nên khi biến nạp vi khuẩn sẽ dễ dàng xâm nhập vào tế bào thực vật nên hiệu quả
chuyển gen sẽ cao hơn và khả năng tái sinh tạo cây hồn chỉnh cũng cao hơn mơ
sẹo thơng thường. Vì vậy mà ngày nay phương pháp này được sử dụng rất phổ
biến và thành công [39].


Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, việc sử dụng các gen chức
năng và kỹ thuật di truyền để giải quyết các vấn đề liên quan đến chọn tạo các giống
sắn đóng một vai trị quan trọng trong việc thúc đẩy trồng sắn và ứng dụng trên tồn

thế giới. Cho đến nay, cải thiện đặc điểm nơng học của sắn đạt được bằng công
nghệ biến đổi gen như kháng virus, cải thiện chất lượng dinh dưỡng, giảm lượng
cyanogen, cải thiện sinh khối, tăng hàm lượng protein... Cải thiện dựa trên những
đặc điểm này sẽ là xu hướng chính trong chọn lọc giống sắn nhờ kỹ thuật sinh học
phân tử trong tương lai [24].
2.3.2. Tại Việt Nam
Ở Việt Nam, tình hình chuyển gen trên cây sắn mới ở giai đoạn bước đầu.
Năm 2008, bước đầu biến nạp thành công gen Bar – gen kháng thuốc diệt cỏ
Phosphinonothricin (PPT) vào chồi non cây sắn bằng phương pháp bắn gen [1]. Tỉ
lệ chồi non chuyển gen thu nhận được là 20%. Chồi non sau khi được kiểm tra bằng
phương pháp PCR với mồi đặc hiệu cho thấy sự xuất hiện của gen bar trong các
mẫu DNA của bộ gen sắn [1]. Tuy nhiên cần phải thực hiện thêm nhiều nghiên cứu
khác như trồng thử nghiệm, lai phân tích tính trạng, quan sát…để cho ra một dịng
sắn mới, hồn chỉnh.Các trung tâm nghiên cứu lớn ở Việt Nam như: Viện Công
nghệ sinh học, viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Di truyền Nơng nghiệp… đã có những
nghiên cứu ban đầu về ni cấy mô và chuyển gen trên cây sắn.


Phần 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Giống sắn KM98 – 7 và giống TMS 60444

Hình 3.1. Cây sản trong ảng nghiảm
Vật liệu nghiên cứu: Chồi mọc ra từ mắt ngủ trên đoạn thân cây sắn
3.2. Môi trường nuôi cấy
Bảng 3.1. Các môi trảảng sả dảng trong q trình nghiên cảu
STT

Mơi trường

1

MS
CAM

2
3
4
5

CIM
DKW
MMS

Hormone
bổ sung
BAP 10mg/L
Bổ sung auxin với
hàm hượng nhất định

3.3. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất
Dụng cụ
- Đĩa petri vô trùng, 90 mm
- Pipet 25mL, vô trùng
- Ống Eppendorf (1.5 mL)

Mục đích
Tạo và nhân vật liệu khởi đầu
Tạo mô sẹo

Tạo mô sẹo
Tạo và nhân mô sẹo phơi hóa


- Parafilm, cling film
- Đầu lọc xi-lanh vô trùng (0.22 µm)
- Đầu côn vô trùng 1 ml
- Panh, dao, kéo, thìa xúc
- Micropipette
Trang thiết bị
- Nồi khử trùng
- pH mét
- Cân điện tử chính xác
-

Buồng ni cây kiểm sốt điều kiện môi trường (28°C, 16 giờ sáng/8 giờ tối)
Bốc cấy vơ trùng với đèn cồn
Tủ lạnh (4°C)
Kính hiển vi

- Thanh khuấy từ
- Máy vortex
Hóa chất
- Các muối đa lượng và vi lượng, các vitamins, đường, agar, các chất điều hòa
sinh trưởng, các kháng sinh, …vv
3.4. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu: Phịng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ tế bào
thực vật thuộc viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam
Thời gian tiến hành: 12/2013 đến 05/2014
3.5. Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của auxin (NAA, 2,4-D, picloram)
tới khả năng tạo mô sẹo
- Nội dung 2: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của auxin (NAA, 2,4-D, picloram)
tới khả năng tạo mơ sẹo phơi hóa
3.6. Phương pháp nghiên cứu
Cách thức tiến hành:
Tạo vật liệu khởi đầu
Từ hom sắn ngoài thực nghiệm, trồng trên nền đất sẽ mọc ra các chồi, khi
chồi dài khoảng 20 cm thì ngắt lấy chồi và tiến hành vào mẫu sau 2 tuần cấy chuyển
sang môi trường MS.