Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ trong nước thải nhà máy bia

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này tôi đã nhận đƣợc sự
giúp đỡ tận tình của thầy cơ giáo, bạn bè và gia đình rất nhiều. Để có đƣợc kết
quả nhƣ hơm nay, tơi xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn
Nhƣ Ngọc và TS. Trần Thị Thu Lan đã dành nhiều thời gian hƣớng dẫn tận tình,
cung cấp nhiều kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi cho tơi trong suốt q trình
thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo, anh chị tại Viện Công nghệ sinh
học Lâm Nghiệp –Trƣờng Đại Học Lâm Nghiệp đã tạo điều kiện giúp đỡ, chỉ
bảo tận tình tơi trong suốt q trình nghiên cứu.
Tơi cũng xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tơi để hồn
thành đề tài này.
Một lần nữa, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả mọi ngƣời!
Hà nội, ngày 14 tháng 5 năm 2018
Sinh viên thực hiện

Ngô Thúy Quỳnh


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1........................................................................................................... 2
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ............................................................. 2
1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ bia trên thế giới và việt nam ...................... 2
1.1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ bia trên thế giới ........................................ 2

1.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ bia ở Việt Nam......................................... 3
1.2. Quy Trình Sản xuất bia .................................................................................. 5
1.3. Đặc tính của nƣớc thải nhà máy bia ............................................................... 7
1.3.1. Các chỉ tiêu đánh giá độ nhiễm bẩn của nƣớc thải ..................................... 7
1.3.2. Các phƣơng pháp xử lý nƣớc thải ............................................................... 8
1.4. Các vi sinh vật ứng dụng khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ trong
nƣớc thải .............................................................................................................. 12
1.5. Các chất hữu cơ và các enzyme vi sinh vật phân giải .................................. 13
1.5.1. Tinh bột và enzyme amylase ..................................................................... 14
1.5.2. Cellulose và enzyme cellulose .................................................................. 15
1.5.3. Các chất protein và enzyme protease ........................................................ 16
CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..... 19
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................... 19
2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 19
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 19
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................... 19


2.3.2. Hóa Chất .................................................................................................... 19
2.3.3. Các trang thiết bị - dụng cụ ....................................................................... 19
2.3.4. Phƣơng pháp tiến hành .............................................................................. 22
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 30
3.1. Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật từ nƣớc thải nhà máy sản xuất bia ....... 30
3.2. Kết quả xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào phân giải các hợp chất
hữu cơ .................................................................................................................. 33
3.3. Kết quả xác định đặc tính sinh hóa của các chủng vi sinh vật ..................... 36
3.3.1. Kết quả nhuộm gram quan sát đặc điểm hình thái tế bào ......................... 36
3.3.2. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng vi khuẩn. .......................... 39
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................... 44
4.1. Kết luận ........................................................................................................ 44

4.2. Kiến nghị ...................................................................................................... 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT

VSV: Vi sinh vật
COD: Chemical Oxygen Demand
BOD: Biochemical Oxygen Demand
TSS: Total Suspended Solid
LB: Môi trƣờng LB broth
DS: Dissolved Solid
DO: Dissolved Oxygen


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Các thông số của nƣớc thải sản xuất bia .............................................. 8
Bảng 2.1: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm ................................................ 20
Bảng 2.2: Mơi trƣờng ni cấy vi sinh vật ......................................................... 20
Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái các chủng vi sinh vật ........................................... 30
Bảng 3.2: Đƣờng kính vịng phân giải cơ chất của các chủng vi sinh vật .......... 33
Bảng 3.3: Các đặc điểm sinh hóa của 4 chủng vi sinh vật .................................. 43


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 1: Tỉ trọng tiêu thụ bia theo khu vực năm 2011 ...................................... 3


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Sản lƣợng tiêu thụ bia từ năm 2010 - 2016........................................... 4

Hình 1.2: Quy trình sản xuất bia ........................................................................... 5
Hình 1.3. Sự chuyển amine ................................................................................. 17
Hình 1.4 Sơ đồ phân huỷ protein ở bên ngoài và bên trong tế bào vi khuẩn và
những cách biến đổi axit amin tiếp theo. ............................................................ 17
Hình 3.1: Vịng phân giải của tinh bột của chủng vi sinh vật. ............................ 34
Hình 3.2: Vòng phân giải protein của chủng vi sinh vật. ................................. 35
Hình 3.3: Vịng phân giải cellulose của chủng vi sinh vật................................. 35
Hình 3.4: Hình thái khuẩn lạc (A) và hình dạng tế bào (B) của chủng 22.B2... 37
Hình 3.5: Hình thái khuẩn lạc (A) và hình dạng tế bào (B) của chủng M .......... 37
Hình 3.6: Hình thái khuẩn lạc (A) và hình dạng tế bào (B) của chủng B1......... 38
Hình 3.7: Hình thái khuẩn lạc (A) và hình dạng tế bào (B) của chủng CL2 ..... 38
Hình 3.8: Khả năng lên men đƣờng Saccharose của 4 chủng vi sinh vật .......... 39
Hình 3.9: Khả năng lên men đƣờng Glucose của 4 chủng vi sinh vật ................ 39
Hình 3.10: Khả năng lên men đƣờng lactose của 4 chủng vi sinh vật ................ 39
Hình 3.11: Phản ứng MR của 4 chủng vi sinh vật ............................................. 40
Hình 3.12: Phản ứng VP của 4 chủng vi sinh vật. .............................................. 41
Hình 3.13: Phản ứng khả năng phân giải Urease ................................................ 41
Hình 3.14: Khả năng khử của Nitrate ................................................................. 42


ĐẶT VẤN ĐỀ
Sự phát triển của kinh tế dẫn đến thu nhập ngƣời dân ngày càng cao, nhu
cầu sử dụng các loại thức uống giải khát cũng nhƣ bia ngày càng tăng. Trong
những năm qua các nhà máy sản xuất bia đƣợc đầu tƣ xây dựng ngày càng nhiều
nhằm đáp ứng nhu cầu tiêu dùng. Thị trƣờng càng mở rộng thì nhu cầu tiêu thụ
bia càng lớn. Sự xuất hiện của các nhà máy sản xuất bia dẫn tới các loại chất thải
đƣợc thải ra trong quy trình sản xuất cũng không ngừng tăng lên gây ô nhiễm
môi trƣờng và cũng là vấn đề cấp bách của xã hội. Vì vậy việc nghiên cứu, thiết
kế hệ thông xử lý trong nƣớc thải bia là một nhu cầu cần thiết để bảo vệ mơi
trƣờng. Dựa trên tính chất nƣớc thải nhà máy sản xuất chứa hàm lƣợng các hợp

chất hữu cơ cao chủ yếu nhƣ tinh bột, cellulose, hemicellulose … là các chất dễ
phân hủy, chuyển hóa sinh học. Có rất nhiều các biện pháp xử lý, dựa vào tinh
chất của nƣớc thải là yếu tố cơ sở để việc để đƣa biện pháp sinh học vào xử lý
hiệu quả mà khơng tốn chi phí cao. Chính vì thế mà việc tìm ra các chủng vi
sinh vật trong nƣớc thải của của nhà máy sản xuất bia có khả năng phân giải các
hợp chất hữu cơ đƣợc con ngƣời ngày càng đƣợc quan tâm. Cũng là tiền đề để
đƣa vi sinh vật vào xử lý bằng phƣơng pháp sinh học và ứng dụng sản xuất các
chế phẩm vi sinh góp phần đƣa các vi sinh vật vào xử lý nguồn nƣớc thải bị ơ
nhiễm, giúp cho nguồn nƣớc chở về tính chất ban đầu của chúng, không gây ô
nhiễm môi trƣờng.
Trên cơ sở đó, mà tơi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân lập, tuyển
chọn các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ trong
nước thải nhà máy bia ”.

1


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ bia trên thế giới và việt nam
1.1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ bia trên thế giới
Bia là loại nƣớc giải khát đã sản xuất từ rất lâu đời trên thế giới. Từ thời
cổ đại, bia đã đƣợc chế biến từ lúc mạch nhƣng phải đến thế kỷ 19, khi Louis
Pasteur thành công trong những nghiên cứu về vi sinh vật và Christian Hansen
(ngƣời Đan Mạch) phân lập đƣợc nấm men và áp dụng vào sản xuất bia thì bia
mới thực sự trở thành một thứ đồ uống hảo hạng, đƣợc nhiều ngƣời khắp nơi
trên thế giới ƣa chuộng. Ƣớc tính sản lƣợng bia năm 2005 đạt 153 tỷ lít/năm.
Sản lƣợng bia thế giới trong một thập kỷ tăng 35,6%. Có sản lƣợng lớn và luôn
phát triển là Trung Quốc, kế đến là Nga và Brazil. Trong khi đó năm 2001, Mỹ
là nƣớc dẫn đầu sản lƣợng bia thế giới với 23.300 triệu lít, đến năm 2011 giảm

sản lƣợng cịn 22.546 triệu lít đứng vị trí thứ hai. Việt Nam, Ukraina và Trung
Quốc có mức tăng trƣởng cao trong mƣời năm qua, lần lƣợt là 240,4%, 132,9%
và 118% [15, 21].
Trong năm 2011, mức tiêu thụ bia tồn cầu đạt 188,78 tỉ lít, tăng 3,8% so với
năm 2010. Trong đó, lƣợng tiêu thụ của Châu Á đứng đầu thế giới ở mức 66,2 tỉ lít,
tiếp đó là thị trƣờng truyền thống Châu Âu 51,2 tỉ lít. Khu vực Trung Đơng là khu
vực tiêu thụ ít nhất, chỉ đạt 1,4 tỉ lít dù dân số bằng ½ so với Châu Âu. Các khu vực
Mĩ La Tinh, Bắc Mĩ, Châu Phi và Châu Đại Dƣơng đạt 30,8; 26,1; 10,8 và 2,2 tỉ
lít. Tổng thu nhập của thị trƣờng bia năm 2011 đạt 500,24 tỉ đô la Mĩ. Mức tiêu thụ
bia ở các châu lục khác nhau đƣợc thể hiện trên biểu đổ 1.

2


Series1, Châu Đại
Dương, 1.17%,
1%

Series1,
Trung Đông,
0.75%, 1%
Series1, Bắc Mĩ,
13.85%, 14%

Series1, Châu Phi,
5.70%, 6%

Series1,
Châu Á,
35.06%,

35%

Series1, Mĩ La Tinh,
16.31%, 16%

Châu Á

Châu Âu

Mĩ La Tinh

Bắc Mĩ

Series1, Châu Âu,
Châu Phi 27.15%,
Trung Đông
27% Châu Đại Dương

Biểu đồ 1: Tỉ trọng tiêu thụ bia theo khu vực năm 2011
Lƣợng tiêu thụ bia ở Châu Á ghi nhận một mức tăng lớn 8.4% so với năm
2010. Châu Mĩ La Tinh và Châu Phi cũng tăng nhanh trong năm 2011 với mức
tăng hàng năm 3.7% và 6.9%. Sự tăng trƣởng của Châu Mĩ La Tinh tăng 3.5%
so với 2010. Tại Châu Phi, sự tăng trƣởng chủ yếu là Nam Phi, với mức tăng
hàng năm đạt 2.5%. Mức tiêu thụ hàng năm tại Châu Âu tăng 0.4%, lần đầu tiên
trong 4 năm. Bắc Mĩ, do khủng hoảng kinh tế, giảm đi 1,2% so với 2010.
Vào cuối năm 2017, thị trƣờng bia của khu vực Châu Á càng ngày càng phát
triển nhƣ Trung Quốc, Nhật Bản... Theo thông tin mới nhất Việt Nam đã chính
thức lọt vào Top 10 thị trƣờng lớn nhất thế giới xét về dung lƣợng bia tiêu thụ.
Dự kiến với mức tăng trƣởng kinh tế nhƣ hiện nay, mức sống của ngƣời
dân trên thế giới ngày càng cao thì cơng nghiệp sản xuất bia sẽ phát triển mạnh,

sản lƣợng tiêu thụ bia tiếp tục tăng cao trong những năm tới.
1.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ bia ở Việt Nam
Bia đƣợc đƣa vào Việt Nam từ năm nhƣ vậy Bia Việt Nam đã có lịch sử
hơn 100 năm. Hiện nay, do nhu cầu của thị trƣờng, chỉ trong một thời gian ngắn,
ngành sản xuất bia có những bƣớc phát triển mạnh mẽ. Do tác động của nhiều
yếu tố nhƣ tốc độ tăng trƣởng GDP, tốc độ tăng dân sơ, tốc độ đơ thị hóa, tốc
1890 cùng với sự xuất hiện của nhà máy Bia Sài Gòn và nhà máy Bia Hà Nội,
độ đầu tƣ.. Mà ngành công nghiệp bia phát triển với tốc độ tăng trƣởng khá cao.
Chẳng hạn nhƣ năm 2003, sản lƣợng bia đạt 1290 triệu lít, tăng 20,7% [21].
3


Theo thống kê hiện nay, cả nƣớc có khoảng trên 320 nhà máy bia và các
cơ sở sản xuất bia với tổng năng lực sản xuất đạt trên 800 triệu lít/năm. Sự phát
triển thị trƣờng tiêu thụ bia ở việt nam ngày càng tăng với con số lên tới hơn
2,41 tỷ lít đối với năm 2010 và phát triển theo chiều tăng đến năm 2016 là 37,9
tỷ. Dƣới đây là bẳng số liệu sản lƣợng tiêu thụ bia bia tăng đều theo các năm
(hình 1.1)

Hình 1.1: Sản lƣợng tiêu thụ bia từ năm 2010 - 2016
Do mức sống ngày càng cao thị trƣờng tiêu thụ bia theo đầu ngƣời rất cao
do thói quen ng, chính vì thế mà thị trƣờng tiêu thụ bia càng mở rộng và tăng
theo các năm. Hiện tại thì có 10 loại bia đƣợc tiêu thụ nhiều nhất ở việt nam
điểm hình nhƣ bia Sài Gịn, Bia Hà Nội, Bia Tiger, Bia Habeco…. Đƣợc phân
bố dẫn đầu các thị trƣờng tiêu thụ từ khu vực miền Bắc cho đến khu vực miền
Nam, các thành phố lớn [15, 21].
Theo báo cáo của Hiệp hội Bia - rƣợu - nƣớc giải khát Việt Nam, năm
2017 lƣợng bia các loại tiêu thụ trên cả nƣớc đạt hơn 4 tỉ lít, tăng 6% so với năm
2016. Con số này đã sát mục tiêu đạt 4,1 tỉ lít bia vào năm 2020 trong quy hoạch
phát triển ngành bia, rƣợu, nƣớc giải khát VN do Bộ Công thƣơng phê duyệt.

Với dân số 93,7 triệu ngƣời hiện nay, ƣớc tính mỗi ngƣời dân Việt Nam uống
gần 43 lít bia/năm. Dự báo mức tiêu thụ này sẽ còn tiếp tục gia tăng theo các
năm tiếp theo.
4


1.2. Quy Trình Sản xuất bia
Quy trình sản xuất bia gồm có các giai đoạn chính:

Hình 1.2: Quy trình sản xuất bia
Các bƣớc chính trong một q trình sản xuất bia đó là: đƣờng hóa, lọc,
đun sơi, lên men, ủ phụ, lọc và chiết [18,24].
 Đƣờng hóa là một quá trình trộn lẫn ngũ cốc đã ngiền (thƣờng là ngũ
cốc đã trải qua q trình malt hóa) và đun nóng hỗn hợp này và chờ ở các vọng
nhiệt độ nhất định để các enzymes trong malt phá vỡ tinh bột trong ngũ cốc
thành đƣờng mà chủ yếu là maltose.
5


 Lọc là một quá trình phân tách chất chiết thu đƣợc trong q trình
đƣờng hóa ra khỏi bã ngũ cốc (bã bia). Quá trình lọc gồm 2 giai đoạn: Dịch lọc
đầu thu đƣợc chất chiết mà chƣa có sự pha loãng bã bia và dịch lọc sau chất
chiết đƣợc tận thu bằng cách rửa bã bia với nƣớc nóng.
 Đun sơi: q trình đun sơi chất chiết thu đƣợc gọi là dịch nha, nhằm
giúp dịch nha trở nên vô trùng, tránh sự nhiễm khuẩn.
 Làm lạnh nha: Quá trình lọc hoa, dịch nha đƣợc hạ lạnh xuống nhiệt độ
lên men trƣớc khi tiếp giống nấm men.
 Lên men: quá trình lên men đƣợc thực hiện trong các tank lên men và đƣợc
bắt đầu ngay khi nấm men đƣợc định lƣợng vào dịch nha lạnh. Trong suốt quá trình
này nấm men chuyển hóa các loại đƣờng trong dịch nha thành cồn và CO2.

 Ủ chín bia: Khi các loại đƣờng đƣợc sử dụng gần hết trong quá trình lên men
bia, quá trình lên men chậm dần và nấm men bắt đầu lắng xuống đáy tank.
 Lọc bia: Quá trình loại bỏ nấm men, cặn, giúp ổn định hƣơng, vị bia và
mang đến cho bia sự trong sáng màu sắc bia.
 Chiết chai là q trình rót bia vào chai, keg, lon hoặc các đồ chứa khác
có dung tích lớn hơn.
Ở các giai đoạn của quá trình sản xuất bia, nƣớc sạch từ bên ngoài đi theo
đƣờng ống vào bên trong qua các q trình nấu – đƣờng hóa, lên men, các giai
đoạn thành phẩm. Các giai đoạn này, nƣớc thừa đƣợc đƣa ra ngoài đi theo
đƣờng ống đến bể xử lý. Nƣớc thải từ các quy trình sản xuất bia bao gồm nƣớc
lẫn theo bã man và bột sau khi lấy dịch cịn sót lại, nƣớc rửa các thiết bị lọc, nồi
nấu, thùng lên men, nƣớc nồi hơi, nƣớc rửa chai, từ hệ thống làm lạnh đi theo
đƣờng ống ra mơi trƣờng bên ngồi. Nƣớc thải của các cơng đoạn sảm xuất bia
có chứa hàm lƣợng cao giàu các chất hydroccacbon, cellulose, hemixenlulose,
pentose trong vỏ trấu, các mảnh hạt và bột,… cùng với xác hoa, một ít tanin, các
chất đắng, chất màu. Ngồi nƣớc thải đó cịn chứa các chất dinh dƣỡng giàu
protein của các xác men, các chất khoáng, vitamin cùng với cặn bia.
6


1.3. Đặc tính của nƣớc thải nhà máy bia
1.3.1. Các chỉ tiêu đánh giá độ nhiễm bẩn của nước thải
Do đặc thù về công nghệ nên trong sản xuất lƣợng bia tiêu hao cao và
nƣớc thải phát sinh nhiều. Với cơng nghệ thơng thƣờng, để sản xuất 1 lít bia cần
sử dụng khoảng 4 -11 lít nƣớc. Trong đó, 2/3 lƣợng nƣớc dùng quy trình cơng
nghệ và 1/3 cịn lại dùng cho hoạt động vệ sinh. Từ những nguồn phát sinh trên,
nƣớc thải từ nhà máy sản xuất bia rất giàu chất hữu cơ rất cao, do đó là các chỉ
số BOD, COD, SS tƣơng đối lớn. Do đó nƣớc thải nếu không đƣợc xử lý sẽ làm
mùi hôi thối, lắng cặn, giảm nồng độ oxy hòa tan trong nguồn nƣớc [7,16].
Các thông đánh giá mức chất lƣợng nƣớc thải bao gồm:

pH: Chỉ số pH < 7 thì nƣớc có mơi trƣờng axít; pH > 7 thì nƣớc có mơi
trƣờng kiềm, khi biết chỉ số Ph thì sẽ có phƣơng pháp xử lý nƣớc thải khác nhau.
Độ đục: Đánh giá độ bẩn trong nƣớc thải, ngồi ra nƣớc đục cịn ngăn cản
quá trình chiếu sán của mặt trời xuống đáy làm giảm q trình quang hợp và
nồng độ oxy hịa tan trong nƣớc.
Mùi: Các chất thải bị phân hủy có chứ NH3, các hợp chất hữu cơ có chứa
lƣu huỳnh.
SS (solid solved – chất rắn lơ lửng)
Chất rắn lơ lửng nói riêng và tổng chất rắn nói chung có ảnh hƣởng đến
chất lƣợng nƣớc trên nhiều phƣơng diện. Hàm lƣợng chất rắn hoà tan trong nƣớc
thấp làm hạn chế sự sinh trƣởng hoặc ngăn cản sự sống của thuỷ sinh. Hàm
lƣợng chất rắn hồ tan trong nƣớc cao thƣờng có vị.
DO (dyssolved oxygen – ơxy hồ tan trong nƣớc)
Ơxy có mặt trong nƣớc một mặt đƣợc hịa tan từ ơxy trong khơng khí, một
mặt đƣợc sinh ra từ các phản ứng tổng hợp quang hoá của tảo và các thực vật
sống trong nƣớc. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự hịa tan ơxy vào nƣớc là nhiệt độ,
áp suất khí quyển, dịng chảy, địa điểm, địa hình. COD là tiêu chuẩn quan trọng
để đánh giá mức độ ô nhiễm của nƣớc (nƣớc thải, nƣớc mặt, nƣớc sinh hoạt) vì

7


nó cho biết hàm lƣợng chất hữu cơ có trong nƣớc là bao nhiêu. Hàm lƣợng COD
trong nƣớc cao thì chứng tỏ nguồn nƣớc có nhiều chất hữu cơ gây ô nhiễm.
BOD (Biochemical oxygen Demand): Nhu cầu ôxy sinh hoá
BOD là lƣợng ôxy cần cho vi sinh vật tiêu thụ để ơxy hố sinh học các chất
hữu cơ trong bóng tối ở điều kiện tiêu chuẩn về nhiệt độ và thời gian. Nhƣ vậy
BOD phản ánh lƣợng các chất hữu cơ dễ bị phân huỷ sinh học có trong mẫu nƣớc.
Sau đây là các thông chỉ tiêu đánh giá độ ô nhiễm của nƣớc thải bia (bảng 1.1).
Bảng 1.1: Các thông số của nƣớc thải sản xuất bia

Trong bảng 1.1 đƣa ra các chỉ tiêu thông số đánh giá thấy rằng nƣớc thải
sau khi sản xuất bia có các thơng chỉ tiêu cao hơn các chỉ tiêu quy chuẩn việt
nam ở cột B về nƣớc thải ra môi trƣờng bên ngoài, nƣớc thải sau khi sản xuất
gấp từ 6 cho đến 18 lần từng loại tiêu chuẩn quy định, có thể thấy các chỉ tiêu về
nƣớc thải đầu ra của quy sản xuất bia đang bị ơ nhiễm hồn tồn cần đƣợc xử lý
trƣớc khi đƣa nƣớc thải ra ngoài môi trƣờng [14].
1.3.2. Các phương pháp xử lý nước thải
Hiện nay có rất nhiều phƣơng pháp xử lý nƣớc thải khác nhau nhƣng có
thể chia thành 4 phƣơng pháp chính:
- Phƣơng pháp cơ học
- Phƣơng pháp hóa học và lý học
- Phƣơng pháp sinh học
Việc lựa chọn phƣơng pháp nào là tùy thuộc vào đặc tính của từng loại
nƣớc thải và mức độ cần làm sạch. [1,18]
8


1.3.2.1. Phương pháp cơ học
Phƣơng pháp này thƣờng dùng để xử lý sơ bộ, ít khi là q trình kết thúc
của q trình xử lý cơng nghiệp. Phƣơng pháp này dùng để loại bỏ tạp chất
không tan hay tạp chất cơ học trong nƣớc thải. Các tạp chất này có thể là vô cơ
hay hữu cơ.
Các phƣơng pháp thƣờng dùng là: Lọc qua lƣới, lắng, xyclon thủy lực, lọc
cát, ly tâm.
1.3.2.2. Phương pháp hóa học
Cơ sở của phản ứng hóa học là các phản ứng hóa học của các chất bẩn có
trong nƣớc thải và hóa chất cho thêm vào. Những phản ứng diễn ra thƣờng là
phản ứng oxy hóa, trung hòa, keo tụ và nhiều hiện tƣợng vật lý khác. Các
phƣơng pháp ozon hóa có khả năng đạt đƣợc hiệu suất cao do ozon là chất oxy

hóa mạnh, dễ dàng nhƣờng đi oxy nguyên tử.
Thực chất của phƣơng pháp hóa học là nhờ các phản ứng oxy hóa khử mà
các chất bẩn chất độc hại trong nƣớc đƣợc chuyển thành các chất không độc hại, một
phần ở dạng cặn, một phần ở dạng khí. Vì vậy để khử các chất độc hại trong nƣớc
thải thƣờng dùng nhiều phƣơng pháp nối tiếp: oxy hóa khử - lắng cặn- hấp phụ.
1.3.2.3. Phương pháp hóa lý
Cơ sở của phƣơng pháp này trong xử lý nƣớc thải là dựa trên quá trình keo tụ,
hấp phụ, trích ly, tuyển nổi, trao đổi ion, tinh thể hóa, màng bán thấm…
- Keo tụ: Là làm trong và khử màu nƣớc thải bằng cách dùng các chất
keo tụ để liên kết chất bẩn dạng lơ lửng và kết chúng thành các bơng có khích
thƣớc lớn hơn, các bông này khi lắng xuống sẽ khéo theo các chất không tan
trong nƣớc xuống theo.
- Hấp phụ: Là tách các chất bẩn và khí hịa tan khỏi nƣớc thải bằng cách
tập trung các chất đó trên bền mặt chất mang.
- Trích ly: Là tách các chất bẩn hịa tan khỏi nƣớc thải bằng dung môi,
dung môi này không tan trong nƣớc và độ hòa tan của chất bẩn trong dung môi
phải cao hơn trong nƣớc.
9


- Chƣng bay hơi: Chƣng cất nƣớc thải để các chất độc hịa tan trong đó
phải bay hơi theo hơi nƣớc.
- Tuyển nổi: Dùng các tác nhân tuyển nổi để thu hút và kéo các chất bẩn
lên mặt nƣớc, sau đó loại tác nhân tuyển nổi và chất bẩn khỏi nƣớc. Khi tuyển
nổi thƣờng dùng các hạt khí nhỏ, phân tán và bão hòa trong nƣớc thải. Các hạt
chất bẩn có bám bọt khí nhẹ dần sẽ nổi lên.
- Thẩm tích dializ (màng bán thấm): Dùng màng xốp, bán thấm không
cho các hạt keo đi qua để tách ta khỏi nƣớc thải.
1.3.2.4. Phương pháp xử lý sinh học:
Cở sở của phƣơng pháp là dựa vào khả năng hoạt động sống của vi sinh

vật. Chúng sử dụng các hợp chất hữu cơ có trong nƣớc thải làm nguồn dinh
dƣỡng nhƣ C, P, N… Trong quá trình trao đổi chất, vi sinh vật phân hủy và sử
dụng các hợp chất hữu cơ để sinh năng lƣợng phục vụ cho hoạt động sống và
xây dựng tế bào mới làm tăng sinh khối.
Các vi sinh vật quan trọng trong xử lý nƣớc thải sinh học bao gồm nhiều
loại vi sinh vật khác nhau nhƣ vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, nguyên sinh động
vật protozoa, các thể kí sinh và cộng sinh tảo… Chúng có khả năng phân giải
protein, đƣờng, tinh bột, mỡ và còn có thể phân giải cả peptin, hemixenluloce,
lignin và kitin.
Có 3 nhóm phƣơng pháp xử lý nƣớc thải sinh học:
- Phƣơng pháp kị khí (anerobic)
- Phƣơng pháp hiếu khí (aerobic)
- Phƣơng pháp thiếu oxy (anoxic)
Phương pháp xử lý hiếu khí
Phƣơng pháp hiếu khí dùng để loại bỏ các hợp chất hữu cơ dễ bị vi sinh vật phân
hủy ra khỏi nguồn nƣớc. Các chất này đƣợc các vi sinh vật hiếu khí oxy hóa
bằng oxy hịa tan trong nƣớc.
VSV

Chất hữu cơ + O2
Chất hữu cơ + O2 +W

CO2 + H2O + Năng lƣợng
VSV

Tế bào mới.
10


Tế bào mới + O2 → CO2 + H2O + NH3 =>Tổng cộng: Chất hữu cơ + O2

→ CO2 + H2O + NH3
Trong phƣơng pháp hiếu khí, NH3 cũng đƣợc chuyển hóa bằng oxy hóa
khử vi sinh vật tự dƣỡng (q trình nitơrat hóa).
2NH4++ 3 O2
2NO2- + 3 O

Nitrosomonas

Nitrobacter

2NO2- + 4H+ + 2 H2O

2NO3-

Tổng cộng: NH4+ +2 O2

VSV

NO3- + H+ + H2O + Năng lƣợng

Điều kiện cần thiết cho quá trình PH= 5,5 – 9,0, oxy hịa tan 0,5 mg/l
Theo phƣơng pháp này các hợp chất trong nƣớc thải đƣợc oxy hóa và
phân hủy theo 3 giai đoạn:
- Oxy hóa các hợp chất hữu cơ:
CxHyOz + (x+y-z) O2 → xCO2 + y/2 H2O
- Pha phát triển của vi sinh vật:
nCxHyOz + nNH3 + (x + y/4-z/2-5) O2 → (C5H7NO2)n + n(-5) CO2 + n(y-4)
/2 H2O
Ở đây CxHyOz là hợp chất hữu cơ và (C5H7NO2)n là tế bào chất. Tất cả
các phản ứng trên đều xảy ra dƣới tác dụng của emzim nội bào hay enzim ngoại

bào do vi sinh vật trong bùn hoạt tính tạo nên.Trong q trình oxy hóa khử các
hợp chất hữu cơ bị phân hủy theo thứ tự là: đƣờng, protein, tinh bột, chất béo,
các chất cao phân tử (xenluloza, lignin...)
Phương pháp thiếu khí (anoxic)
Trong điều kiện thiếu oxy hịa tan việc khử nitrat hóa sẽ sảy ra. Oxy đƣợc
giải phóng từ nitrat sẽ oxy hóa chất hữu cơ và nitơ sẽ tạo thành.
NO3-

VSV

O2 Chất hữu cơ

NO2- + O2
N2 + CO

Q trình kị khí (anaerobic)
Phƣơng pháp xử lý khị khí là một trong các q trình cổ xƣa nhất đƣợc
ứng dụng để xử lý nƣớc thải có độ nhiễm bẩn cao, có khả năng thu hồi năng
11


lƣợng, tạo ra ít bùn, khả năng phân huỷ chất hữu cơ tới 75% và tạo ra khí thải.
Các nghiên cứu cho thấy trong q trình xử lý kị khí có tới 90% chất hữu cơ
trong nƣớc thải biến thành khí sinh học với hàm lƣợng 60 ÷ 70% có thể sử dụng
nhƣ một năng lƣợng tái sinh có giá trị.
1.4. Các vi sinh vật ứng dụng khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ trong
nƣớc thải
Quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ trong nƣớc thải là quá trình sinh
học phức tạp nhờ hoạt động của vi sinh vật. Một lƣợng lớn chất hữu cơ bị phân
giải và làm giảm trọng lƣợng. Trong quá trình này các chất hữu cơ đƣợc phân

giải thành những phần nhỏ hơn, sinh khối của si sinh vật mới đƣợc tạo thành
đồng thời tạo ra các sản phẩm của quá trình trao đổi chất và giải phóng năng
lƣợng, các vi sinh vật đƣợc chia hay nhóm là tự dƣỡng và dị dƣỡng. Các thành
phần vi sinh vật đó là:
Vi khuẩn:
Chủng vi sinh vật cao nhất trong nƣớc thải là vi khuẩn. Thành phần hóa
học của vi khuẩn gồm khoảng 80% nƣớc, 20% chất khơ (trong đó khoảng 90%
hữu cơ và vơ cơ). Công thức tƣơng đối cho các hợp chất hữu cơ của vi khuẩn là
C5H7O2N. Theo cơng thức này thì 53% trọng lƣợng hợp phần hữu cơ là cacbon.
Khi xét cả photpho thì cơng thức chung của tế bào vi khuẩn là C5H87O23N12P.
Các hợp chất vơ cơ gồm có P2O5 (50%), SO3 (15%), Na2O (11%), CaO (9%),
MgO (8%), K2O (6%), Fe2O3 (1%). Tất cả các nguyên tố và hợp chất này vi
khuẩn đều phải lấy từ môi trƣờng nên vi khuẩn có vai trị quan trọng trong
chuyển hóa các chất có trong nƣớc thải. Các nhà máy xử lý nƣớc thải thông
thƣờng dựa trên sự thủy phân hủy sinh học của các chất hữu cơ không độc nhờ
vi khuẩn. Sự phân hủy sinh học này trong điều kiện có oxi có thể đƣợc biểu diễn
theo phƣơng trình :
Các chất thải hữu cơ + O2

CO2 + H2O + H2SO4 + NH4+ + NO3-

(C, O, N, S)

12


Các vi sinh vật hóa dị dƣỡng chiếm ƣu thế vì vi sinh vật dị dƣỡng sử dụng
các hợp chất hữu cơ làm nguồn cacbon và nguồn năng lƣợng để thực hiện các
phản ứng sinh tổng hợp [1,11].
Vi nấm: Vi nấm có tầm quan trọng trong kỹ thuật mơi trƣờng, đó là các

nấm dị dƣỡng, hầu hết các vi nấm là vi hiếu khí bắt buộc.Chúng có khả năng
sinh trƣởng ở điều kiện nhiệt độ thấp và có thể chịu đƣợc điều kiện pH tƣơng
đối thấp, pH tối ƣu cho các nấm là 5-6 mặc dù giới hạn pH là 2-9. Nấm có nhu
cầu nitơ thấp, chỉ bằng nửa nhu cầu của vi khuẩn. Khả năng sống ở pH thấp
và điều kiện hạn chế về nguồn nitơ và đi cùng với khả năng phân giải
cellulose của chúng. Đặc điểm này khiến chúng trở nên quan trọng trong phân
giải chất thải công ghiệp, chẳng hạn từ các nhà máy sản xuất gỗ, giấy…
Động vật nguyên sinh:
Động vật nguyên sinh là các cá thể đơn bào có khả năng di động. Đa số
động vật nguyên sinh là dị dƣỡng hiếu khí, một số là kỵ khí. Protozoa thƣờng
lớn hơn vi khuẩn và có khả năng thực khuẩn, dùng chúng làm nguồn năng
lƣợng. Trong các quá trình xử lý chất thải bằng phƣơng pháp sinh học, protoza
thƣờng lớn hơn vi khuẩn và có khả nằn thực khuẩn, dùng chúng làm nguồn năng
lƣợng. Trong các quá trình xử lý nƣớc thải bằng phƣơng pháp sinh học,
Protozoa hoạt động nhƣ một yếu tố làm sạch dòng chảy do tiêu thụ vi khuẩn và
các chất hữu cơ.
Tảo, vi khuẩn lam:
Tảo và vi khuẩn lam là sinh vật đơn bào, tự dƣỡng. Chúng có vai trị quan
trọng đối với xử lý sinh học bởi hai lý do:
- Trong ao hồ chúng quang hợp tạo ra oxi cần thiếtcho hệ sinh thái nƣớc.
- Ở các bể oxi hóa hiếu khí hay hiếu khí khơng bắt buộc thì tảo cũng cần
cung cấp oxi cho các vi khuẩn hiếu khí dị dƣỡng.
1.5. Các chất hữu cơ và các enzyme vi sinh vật phân giải
Quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ trong tự nhiên là q trình hóa
sinh phức tạp. Nhờ hoạt động sống của vi sinh vật, một lƣợng lớn hợp chất hữu
13


cơ bị phân giải. Trong quá trình phân hủy các vi sinh vật tiết ra các enzym ngoại
bào và các hợp chất hữu cơ nhƣ xenlulose, tinh bột, protein…đƣợc phân giải

thành những phần nhỏ nhƣ các axit hữu cơ, peptit, các đƣờng đơn, các axit
amin…đồng thời sinh khối vi sinh vật đƣợc tạo thành và các sản phẩm cuối cùng
của quá trình trao đổi chất là CO2, CH4, H2O. Các hợp chất hữu cơ trong tự
nhiên chủ yếu là xenlulose, hemi- xenlulose, tinh bột, protein…ƣu tiên các sinh
vật có hoạt tính amylase, cellulose, protease [1,19].
1.5.1. Tinh bột và enzyme amylase
Tinh bột là polysaccarit dự trữ của thực vật, chủ yếu có trong hạt, phổ
biến ở các loại lúa mỳ, khoai tây, sắn, gạo… Phân tử tinh bột có cơng thức cấu
tạo là C6H10O5.
- Amylose có chứa liên kết -1,4-glucozit. Phân tử cấu tạo dạng chuỗi
không phân nhánh, dài khoảng 300-1000 gốc glucose, xoắn theo kiểu lò xo, cấu
trúc xoắn đƣợc giữ vững nhờ liên kết hydro đƣợc tạo thành giữa các nhóm -OH
tự do. Amylase tạo thành màu xanh khi kết hợp với iốt.
- Amylopectin có chứa cả liên kết -1,4-glucozit và -1,6-glucozit. Cấu
trúc phân tử của nó bao gồm một nhánh trung tâm (chứa liên kiết 1,4-glucozit),
từ nhánh này phát ra các nhánh phụ có chiều dài khoảng vài chục gốc glucose..
Enzym amylase. Trong tự nhiên có rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng
tổng hợp amylase xúc tác cho quá trình thuỷ phân tinh bột, glycogen… thành
các phân tử có khối lƣợng nhỏ hơn nhƣ: oligosaccarit, glucose, maltose…
Amylase có ba loại:
- -amylase(amylo-1,4-dextrinase) có khả năng phân giải các liên kết 1,4-glucozit trong chuỗi polysaccarit thành các dextrin phân tử thấp, nhƣng lại
không phân giải đƣợc liên kết -1,6-glucozit và một số các liên kết -1,4glucozit ở gần chỗ phân nhánh. Dƣới tác dụng của -amylase, tinh bột bị giảm
khối lƣợng phân tử mạnh, đồng thời gây giảm tính nhớt, mất khả năng tạo màu
với iốt.
14


- -amylase (amylo-1,4glucozidase) có khả năng phân giải liên kết -1,4glucozit nhƣng khơng có khả năng phân giải liên kết -1,6-glucozit. Sản phẩm
cuối cùng là maltose và glucose.
- -amylase (amylo-1,6-dextrinase) có khả năng phân giải các liên kết 1,6-glucozit, giúp thuỷ phân tinh bột thành các dextrin, glucose và maltose.

Hầu hết các vi khuẩn đều có khả năng sinh amylase nhƣ: Aspergillus
oryzae, Bacillus subtilis, Bacillus diastaticus, Aerobacillus macerans. Trong đó
Bacillus là một trong những nhóm đƣợc xét là có khả năng sinh amylaza mạnh.
Hầu hết các chế phẩm xử lý ơ nhiễm đều có thành các lồi thuộc chi Bacillus.[1]
1.5.2. Cellulose và enzyme cellulose
Cellulose là thành phần chính có trong lớp vỏ của tế bào thực vật. Công
thức cấu tạo chung của xenlulose là (C6H10O5)n. Khác với tinh bột, hợp chất cao
phân tử này đƣợc cấu tạo từ hàng trăm, hàng nghìn gốc -1,4-glucose liên kết
với nhau bằng liên kết -1,4-glucozit tại vị trí C1 của phân tử glucose này với vị
trí C4 của phân tử glucose kế tiếp [6].
CMC (Cacboxymethyl cellulose) đƣợc tạo thành khi cho alcalixenlulose
tác dụng với axit cloaxetic hoặc muối natri cloaxetat cho nên CMC có thể tồn tại
ở hai dạng H hoặc Na. Dạng H - CMC không tan trong nƣớc, rƣợu, axeton
nhƣng tan trong dung dịch kiềm cũng nhƣ trong các hệ dung môi dùng để hoà
tan cellulose.
Cellulose: Hàng loạt vi khuẩn và nấm có khả năng phân giải cellulose một
cách tự nhiên nhờ hoạt động phối hợp của một tập hợp các enzyme Cellulose. Ở
một số vi khuẩn hoạt tính cellulose thƣờng gặp trong một số phức hệ nhiều
enzyme.
- Endoglucanase (CMC-ase) có khả năng cắt đứt các liên kết bên trong
phân tử cellulose làm giảm nhanh chiều dài chuỗi và làm tăng các nhóm khử.
Chúng thuỷ phân liên kết -1,4-glucozit một cách tuỳ tiện và giải phóng

15


xenlodextrin, cellobiose và glucose. Giúp phân giải mạnh các cellulose hồ tan
nhất là dạng xenluloza vơ định hình và hoạt động chủ yếu ở vùng kết tinh.
- Exoglucanase (exo-1,4--D glucan-exolobiohydrolase) có khả năng tấn
cơng chuỗi cellulose từ đầu khơng khử và giải phóng chủ yếu ra cellobiose, đơi

khi là glucose. Enzym này không phân giải cellulose kết tinh cũng nhƣ cellulose
hoà tan khác, chúng tác dụng yếu lên CMC nhƣng hoạt động mạnh lên cellulose vơ
định hình hoặc cellulose đã phân giải một phần nhƣ cellodextrin.
- -1,4-glucozidase(cellobiase) có khả năng thuỷ phân mạnh cellobiose
hay các cellodextrin hoà tan trong nƣớc giải phóng glucoza. Hoạt tính giảm của
chúng giảm dần theo chiều dài của chính sự tích luỹ các chất cảm ứng của
enzyme cellulose.
Các loại vi khuẩn sinh Cellulose chủ yếu thuộc hiếu khí nhƣ:
Achromobacter, Pseudomonas, Cellulomonas, Vibrio, Cellvibrio, Bacillus,
Cytophaga, Angiococcus, Polyangium, Sporocytophaga, Sorangium, Archangium,
Promyxo bacterium... Nấm sợi sinh xenlulaza nhiều hơn vi khuẩn. Chúng tiết
vào môi trƣờng hệ enzym đầy đủ hơn nên thủy phân hồn tồn cơ chất cellulose.
Ví dụ một số chủng đã đƣợc nghiên cứu nhƣ: Trichoderma reesei, T. viride,
Fusariumsolani,

Penicillium

pinophinum,

Phanerochate

chrysosporium,

Sporotrichum pulverulentum và Sclerolium rolfsii.
1.5.3. Các chất protein và enzyme protease
Protein là những phân tử sinh học hay đại phân tử, chứa một hoặc nhiều
mạch dài của các nhóm axit amin.
Một số vi khuẩn và nấm, đặc biệt là các vi sinh vật gây bệnh, vi sinh vật
làm hƣ hỏng thực phẩm và vi sinh vật đất, có thể sử dụng các protein làm nguồn
carbon và năng lƣợng. Nhiều vi sinh vật khác phân giải protein và acid amin chỉ

khi vắng mặt các nguồn C nhƣ glucose và lipid. Chúng tiết ra enzyme protease
thuỷ phân các protein và polipeptit thành acid amin; các acid amin đƣợc vận
chuyển vào tế bào và đƣợc phân giải [7,9].

16


Hình 1.3. Sự chuyển amine
Trên đây là 1 ví dụ phổ biến của sự chuyển amin. Nhóm α-amino của
17ung17ne đƣợc chuyển sang chất nhận α-ketoglutarat tạo thành pyruvate và
glutamate. Pyruvate có thể đƣợc chuyển hóa trong chu trình acid tricarboxylic
hoặc đƣợc 17ung trong sinh tổng hợp.
 Các vi sinh vật có khả năng phân giải protein như nấm men, nấm mốc, vi
khuẩn
Vi khuẩn Gồm các lồi thuộc hiếu khí, kị khí, sinh bào tử hoặc khơng
sinh bào tử.
Các cơ thể chứa protein là chủ yếu. Đối với đa số vi sinh vật thì một cơ
thể chết là cơ chất tốt nhất. Các protein của sinh vật chết vị tấn công và phân
huỷ rất nhanh bởi nhiều vi khuẩn và nấm. Các enzym phân huỷ protein (các
protease), do vi khuẩn và nấm tiết ra, thuỷ phân protein thành các oligopeptit và
các axit amin. Nhƣ vậy chúng cũng đƣợc dùng làm nguồn năng lƣợng.

Hình 1.4 Sơ đồ phân huỷ protein ở bên ngoài và bên trong tế bào vi khuẩn
và những cách biến đổi axit amin tiếp theo.
17


Các protease là những enzym phân huỷ liên kết peptit. Trƣớc hết cần phân
biệt protease nội bào và protease ngoại bào. Loại đầu tiên thực hiện những chức
năng của trao đổi chất trong tế bào, còn loại sau phục vụ cho sự phân huỷ các

protease ngoại bào. Các protease ngoại bào đƣợc tiết vào môi trƣờng và phục vụ
cho việc phân huỷ protein. Protease ngoại bào đƣợc nhiều vi khuẩn và nấm sinh
ra, nhƣng không phải là mọi vi sinh vật đều có khả năng này [1,13].
Tham gia vào sự phân huỷ protein có vơ số nấm và vi khuẩn, trong số đó
có Bacillus cereus var mycoides, các Pseudomonas, Proteus vulgaris vv.

18