Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn trong phế thải chăn nuôi gà

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP
VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC
----------o0o----------

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ
CHỦNG VI KHUẨN TRONG PHẾ THẢI CHĂN NUÔI GÀ
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ NGÀNH: 7420201

Giáo viên hướng dẫn
Sinh viên thực hiện
Mã sinh viên
Lớp
Khóa

: ThS. Nguyễn Thị Minh Hằng
: Hoàng Thị Lệ
: 1453070020
: K59B – CNSH
: 2014 - 2018

Hà Nội, 2018


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt q trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp cá nhân tôi đã nhận
đƣợc rất nhiều sự động viên khích lệ, giúp đỡ cùng với sự hƣớng dẫn tận tình
và chu đáo của các cơ, chú, anh chị và cán bộ phịng thí nghiệm Bộ mơn Cơng
nghệ Vi sinh Hóa sinh, thuộc Viện cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trƣờng
Đại học Lâm nghiệp Việt Nam.

Nhân dịp này tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới Th.S Nguyễn Thị
Minh Hằng – GV Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trƣờng Đại học
Lâm nghiệp Việt Nam đã tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ tơi hồn thành
báo cáo Luận văn tốt nghiệp.
Tôi cũng chân thành cảm ơn tập thể cán bộ, công nhân viên Viện Công
nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam đã quan
tâm và tạo điều kiện thuận lợi để tơi có thể hồn thành báo cáo một cách tốt
nhất.
Cuối cùng tơi xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè đã tạo điều kiện,
động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện.
Hà Nội ngày 11 tháng 05 năm 2018
Chữ ký GVHD

Sinh viên

Nguyễn Thị Minh Hằng

Hoàng Thị Lệ


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
CFU

Clony Forming Unit

LB

Lysogeny Broth

VK

Vi khuẩn

MPT

Mẫu phế thải

VKMPT

Vi khuẩn mẫu phế thải

KLTN

Khóa luận tốt nghiệp

PTN

Phịng thí nghiệm


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG BIỂU
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 8
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .................................. 9
1.1. Giới thiệu về vi khuẩn ................................................................................ 9
1.1.1. Vị trí phân loại và sự phân bố ................................................................. 9

1.1.2. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn .......................................................... 11
1.2. Phân loại và ứng dụng của vi khuẩn ........................................................ 20
1.2.1. Phân loại ................................................................................................ 20
1.2.2. Ứng dụng ............................................................................................... 21
CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ................................................................................................ 22
2.1. Nguyên liệu .............................................................................................. 22
2.1.1. Mẫu phế thải chăn nuôi gà .................................................................... 22
2.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................ 22
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất................................................................. 22
2.2. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................. 23
2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 23
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu......................................................................... 23
2.4.1. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn từ phế thải chăn nuôi gà ................... 23
2.4.2. Phƣơng pháp đếm số lƣợng khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch ................... 24
2.4.3. Phƣơng pháp thuần khiết và bảo quản giống ........................................ 25
2.4.4. Phƣơng pháp lên men vi khuẩn ............................................................. 25
2.4.5. Xác định hoạt tính enzyme của vi khuẩn bằng phƣơng pháp khuếch tán
trên đĩa thạch ................................................................................................... 25


2.4.6. Xác định khả năng lên men các loại đƣờng .......................................... 26
2.4.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu..................................................................... 27
2.5. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
......................................................................................................................... 27
2.5.1. Quan sát khuẩn lạc của vi khuẩn ........................................................... 27
2.5.2. Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn bằng phƣơng pháp nhuộm Gram . 27
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 30
3.1. Phân lập thuần khiết và lƣu trữ vi khuẩn ................................................. 30
3.1.1. Phân lập vi khuẩn từ phế thải chăn nuôi gà .......................................... 30

3.1.2. Thuần khiết và bảo quản giống ............................................................. 31
3.2 Xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng VK phân lập đƣợc 32
3.2.1. Xác định hoạt tính của các loại enzyme amylase ................................. 32
3.2.2. Xác định hoạt tính của enzyme cellulose .............................................. 34
3.2.3. Hoạt tính enzyme protease .................................................................... 35
3.2.4. So sánh hoạt tính enzyme ngoại bào của 4 chủng VK từ phế thải gà... 35
3.2. Quan sát hình dạng tế bào của 4 chủng đƣợc chọn.................................. 39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 3.1: Kết quả phân lập VK từ các mẫu phế thải chăn nuôi gà ................ 30
Bảng 3.2: Hình thái, màu sắc của một số chủng phan lập đƣợc ..................... 32
Bảng 3.3: Hoạt tính enzyme amylase.............................................................. 33
Bảng 3.4: Hoạt tính enzyme cellulase ............................................................. 34
Bảng 3.5: Hoạt tính enzyme protease ............................................................. 35
Bảng 3.6: Ảnh hƣởng của pH ban đầu đến mật độ của 4 chủng vi khuẩn...... 38
Bảng 3.7:Đặc điểm hình thái của 4 chủng VK đƣợc tuyển chọn ................... 39


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1:Các hình dạng chính của vi khuẩn ................................................... 11
Hình 1.2: Cấu tạo của vi khuẩn ....................................................................... 15
Hình 3.1: Khuẩn lạc vi khuẩn tổng số............................................................. 31
Hình 3.2: Vịng phân giải enzyme amylase .................................................... 33
Hình 3.3: Vịng phân giải enzyme cellulase ................................................... 34
Hình 3.4: Vịng phân giải enzyme protease .................................................... 35
Hình 3.5: Hoạt tính enzyme ngoại bào của 4 chủng VK ................................ 36
Hình 3.6:Phản ứng phân giải đƣờng Fructose ................................................ 37

Hình 3.7: Phản ứng phân giải đƣờng Glucose ................................................ 37
Hình 3.8: Phản ứng phân giải đƣờng Lactose ................................................. 37
Hình 3.9: Ảnh hƣởng của pH ban đầu đến mật độ của vi khuẩn .................... 38


ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là nƣớc nông nghiệp, trong thời kỳ đổi mới ngành chăn ni
có những bƣớc phát triển nhanh chóng, mơ hình trang trại chăn ni tập trung
đƣợc nhân rộng trong tồn quốc. Mỗi năm cả nƣớc có khoảng 60 triệu tấn
chất thải vật ni, trong đó chỉ có khoảng 50% đƣợc xử lý, số cịn lại đƣợc sử
dụng trực tiếp bón cho cây trồng hoặc làm thức ăn cho cá. Do chỉ tập trung
đầu tƣ để nâng cao năng suất và chất lƣợng vật nuôi, phần nhiều các trang trại
chƣa chú trọng đến cơng tác kiểm sốt, quản lý chất thải nên làm phát sinh
dịch bệnh, tác động xấu đến sức khỏe cộng đồng và ảnh hƣởng trực tiếp đến
việc phát triển bền vững của ngành chăn ni. Tại nhiều địa phƣơng ngƣời
dân cịn coi chất thải chăn ni là phân bón, khơng quan tâm đến việc xử lý
hoặc nếu có cũng chỉ ủ đống để chờ bón cho cây trồng theo mùa vụ. Đây là
một trong các nguyên nhân gây ô nhiễm môi trƣờng và lây truyền các dịch
bệnh cho ngƣời, vật nuôi và cây trồng.
Vi sinh vật tồn tại trong nguồn phế thải với số lƣợng rất lớn gồm cả vi
sinh vật có lợi và vi sinh vật có hại cũng chính là những ngun nhân gây ra
hiện tƣợng ô nhiễm môi trƣờng và các bệnh gây hại cho vật ni. Vi khuẩn là
lồi có số lƣợng nhiều nhất và là lồi phổ biến có nhiều ứng dụng nhất nên tôi
đã chọn đề tài:“Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số
chủng vi khuẩn trong phế thải chăn nuôi gà”, nhằm mục đích có thêm
những cơ sở khoa học cần thiết về các chủng VSV trong phế thải chăn ni
gà, từ đó làm cơ sở để phát triển những hƣớng nghiên cứu chuẩn đốn bệnh
hoặc xử lý phế thải trong chăn ni gia cầm.

8

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Giới thiệu về vi khuẩn
1.1.1. Vị trí phân loại và sự phân bố
Vi khuẩn (tiếng Anh và tiếng La Tinh là bacterium, số nhiều bacteria)
đơi khi cịn đƣợc gọi là vi trùng, là một nhóm (giới hoặc vực) vi sinh vật nhân
sơ đơn bào có kích thƣớc rất nhỏ; một số thuộc loại ký sinh trùng. Vi khuẩn là
một nhóm sinh vật đơn bào, có kích thƣớc nhỏ (kích thƣớc hiển vi) và thƣờng
có cấu trúc tế bào đơn giản khơng có nhân, bộ khung tế bào (cytoskeleton) và
các bào quan nhƣ ty thể và lục lạp. Cấu trúc tế bào của vi khuẩn đƣợc miêu tả
chi tiết trong mục sinh vật nhân sơ vì vi khuẩn là sinh vật nhân sơ, khác với
các sinh vật có cấu trúc tế bào phức tạp hơn gọi là sinh vật nhân chuẩn.
Vi khuẩn là nhóm hiện diện đơng đảo nhất trong sinh giới. Chúng hiện
diện khắp nơi trong đất, nƣớc, chất thải phóng xạ, suối nƣớc nóng, [1] và ở
dạng cộng sinh và ký sinh với các sinh vật khác, và đƣợc biết là phát triển
mạnh mẽ trong các tàu khơng gian có ngƣời lái.[2] Nhiều tác nhân gây bệnh
(pathogen) là vi khuẩn. Hầu hết vi khuẩn có kích thƣớc nhỏ, thƣờng chỉ
khoảng 0.5-5.0 μm, mặc dù có lồi có đƣờng kính đến 0,3mm
(Thiomargarita). Chúng thƣờng có vách tế bào, nhƣ ở tế bào thực vật và nấm,
nhƣng với thành phần cấu tạo rất khác biệt (peptidoglycan). Nhiều vi khuẩn di
chuyển bằng tiên mao (flagellum) có cấu trúc khác với tiên mao của các nhóm
khác.
Có khoảng 40 triệu tế bào vi khuẩn trong một gram đất và hàng triệu tế
bào trong một mm nƣớc ngọt. Ƣớc tính có khoảng 5×1030 vi khuẩn trên Trái
Đất,[3] tạo thành một lƣợng sinh khối vƣợt hơn tất cả động vật và thực vật.[4]
Vi khuẩn có vai trị quan trọng trong tái chế chất dinh dƣỡng nhƣ cố định nitơ
từ khí quyển và gây thối rữa sinh vật khác. Trong vùng dinh dƣỡng quanh
cách mạch nhiệt dịch và lỗ phun lạnh, vi khuẩn cung cấp những chất dinh
dƣỡng cần thiết cho sự sống bằng cách biến đổi các hợp chất hòa tan nhƣ

hydro sulfua và metan thành năng lƣợng, chúng có thể phát triển mạnh ở nơi
9


sâu nhất trên Trái Đất là rãnh Mariana.[5][6] Các nghiên cứu khác liên quan
cũng chỉ ra rằng chúng có thể sống bên trong các đá ở độ sâu 1900 feet bên
dƣới đáy biển và cách ngoài khơi bờ biển tây bắc Hoa Kỳ 8500.[5][7]
Vi khuẩn đầu tiên đƣợc quan sát bởi Antony van Leeuwenhoek năm
1683 bằng kính hiển vi một trịng do ơng tự thiết kế. Tên "vi khuẩn" đƣợc đề
nghị sau đó khá lâu bởi Christian Gottfried Ehrenberg vào năm 1828, xuất
phát từ chữ βακτηριον trong tiếng Hy Lạp có nghĩa là "cái que nhỏ". Louis
Pasteur (1822-1895) và Robert Koch (1843-1910) miêu tả vai trò của vi
khuẩn là các thể mang và gây ra bệnh hay tác nhân gây bệnh.an đầu vi khuẩn
hay vi trùng (microbe) đƣợc coi là các loại nấm có kích thƣớc hiển vi (gọi là
schizomycetes), ngoại trừ
các loại vi khuẩn lam (cyanobacteria) quang hợp, đƣợc coi là một nhóm
tảo (gọi là cyanophyta hay tảo lam). Phải đến khi có những nghiên cứu về cấu
trúc tế bào thì vi khuẩn mới đƣợc nhìn nhận là một nhóm riêng khác với các
sinh vật khác. Vào năm 1956 Hebert Copeland phân chúng vào một giới
(kingdom) riêng là Mychota, sau đó đƣợc đổi tên thành Sinh vật khởi sinh
(Monera), Sinh vật nhân sơ (Prokaryota), hay Vi khuẩn (Bacteria). Trong thập
niên 1960, khái niệm này đƣợc xem xét lại và vi khuẩn (bây giờ gồm cả
cyanbacteria) đƣợc xem nhƣ là một trong hai nhóm chính của sinh giới, cùng
với sinh vật nhân chuẩn. Sinh vật nhân chuẩn đƣợc đa số cho là đã tiến hóa từ
vi khuẩn, và sau đó cho rằng từ một nhóm vi khuẩn hợp lại.
Sự ra đời của phân loại học phân tử đã làm lung lay quan điểm này.
Năm 1977, Carl Woese chia sinh vật nhân sơ thành 2 nhóm dựa trên trình tự
16S rRNA, gọi là vực Vi khuẩn chính thức (Eubacteria) và Vi khuẩn cổ
Archaebacteria. Ơng lý luận rằng hai nhóm này, cùng với sinh vật nhân
chuẩn, tiến hóa độc lập với nhau và vào năm 1990 nhấn mạnh thêm quan

điểm này bằng cách đƣa ra hệ phân loại 3 vực (three-domain system), bao
gồm Vi khuẩn (Bacteria), Vi khuẩn cổ (Archaea) và Sinh vật nhân chuẩn
(Eucarya). Quan điểm này đƣợc chấp nhận rộng rãi giữa các nhà sinh học
10


phân tử nhƣng cũng bị chỉ trích bởi một số khác, cho rằng ơng đã quan trọng
hóa vài khác biệt di truyền và rằng cả vi khuẩn cổ và sinh vật nhân chuẩn có
lẽ đều phát triển từ vi khuẩn chính thức.
1.1.2. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn
1.1.2.1. Đặc điểm hình thái

Hình 1.1:Các hình dạng chính của vi khuẩn
-

Cầu khuẩn 1, 2, 3, 4, 5
-

Trực khuẩn 6, 7, 8, 9

-

Xoắn khuẩn 10,11,12

Vi khuẩn có nhiều hình dạng khác nhau. Các tế bào vi khuẩn chỉ bằng
1/10 tế bào của sinh vật nhân chuẩn và dài khoảng 0,5–5,0 micromet. Tuy
nhiên, một vài lồi nhƣ Thiomargarita namibiensis và Epulopiscium
fishelsoni lại có kích chiều dài đến nửa mm và có thể nhìn thấy bằng mắt
thƣờng; E. fishelsoni đạt 0,7 mm. Những vi khuẩn nhỏ nhất là các thành viên
thuộc chi Mycoplasma, chúng có kích thƣớc chỉ 0,3 micromet, nhỏ bằng với

virus lớn nhất. Một số vi khuẩn thậm chí có thể nhỏ hơn, nhƣng các vi khuẩn
siêu nhỏ này chƣa đƣợc nghiên cứu kỹ.
Vi khuẩn có nhiều hình thái khác nhau: hình cầu, hình que, hình xoắn,
hình dấu phẩy, hình sợi ... Kích thƣớc thay đổi tuỳ theo các loại hình và trong
một loại hình kích thƣớc cũng khác nhau. So với virus, kích thƣớc của vi

11


khuẩn lớn hơn nhiều, có thể quan sát vi khuẩn dƣới kính hiển vi quang học.
Dựa vào loại hình có thể chia ra một số nhóm sau:
Cầu khuẩn (Coccus - từ tiếng Hy Lạp Kokkos - hạt quả)
Cầu khuân là loại vi khuẩn có hình cầu. Nhƣng có nhiều loại khơng hẳn
hình cầu thí dụ nhƣ hình ngọn nến nhƣ phế cầu khuẩn - Diplococcus
pneumoniae hoặc hạt cà phê (lậu cầu khuẩn Neisseria gonorrhoeae).
Kích thƣớc của vi khuẩn thƣờng thay đổi trong khoảng 0,5 (1μ = 10-3
mm). Tuỳ theo từng lồi mà chúng có những dạng khác nhau.
Đặc tính chung của cầu khuẩn:
- Tế bào hình cầu có thể đứng riêng rẽ hay liên kết với nhau.
- Có nhiều lồi có khả năng gây bệnh cho ngƣời và gia súc
- Khơng có cơ quan di động.
- Khơng tạo thành bào tử.
Giống Monococcus
Thƣờng đứng riêng lẻ từng tế bào một, đa số chúng thuộc loại hoại
sinh. Thƣờng thấy chúng sống trong đất, nƣớc và trong khơng khí (Thí dụ nhƣ
Micrococcus agilis, M. roseus, M. luteus)
Giống Diplococcus
(Từ tiếng Hy Lạp - Diplos - thành đôi) phân cách theo một mặt phẳng
xác định và dính nhau thành từng đơi một. Trong số này có một số có khả
năng gây bệnh nhƣ giống Neisseria - Lậu cầu khuẩn N meningitidis

gonorrhoeae - Não mô cầu khuẩn).
Giống Tetracoccus
Thƣờng liên kết với nhau thành từng nhóm 4 tế bào một. Chúng thƣờng
gây bệnh cho ngƣời và một số có thể gây bệnh cho động vật.
Giống Streptococcus
Từ tiếng Hy Lạp (Streptos - chuỗi) chúng phân cách theo một mặt
phẳng xác định và dính với nhau thành từng chuỗi một dài. Thí dụ nhƣ
Streptococcus lactic. Strep-pyogenes.
12


Giống Sarcina
Từ tiếng Hy Lạp Saricio - gói hàng. Phân cách theo 3 mặt phẳng trực
giao với nhau, tạo thành những khối từ 8 - 16 tế bào (hoặc nhiều hơn nữa).
Trong khơng khí chúng ta thƣờng gặp một số lồi nhƣ Sarcinalutea, Sarcina
auratiaca. Chúng thƣờng nhiễm vào các mơi trƣờng để trong phịng thí
nghiệm và tạo thành màu vàng.
Giống Staphilococcus
Từ tiếng Hy Lạp Staphile - chùm nho. Thƣờng chúng liên kết với nhau
thành những đám trông nhƣ chùm nho. Chúng phân cách theo một mặt phẳng
bất kỳ và sau đó dính lại với nhau thành từng đám nhƣ hình chùm nho. Bên
cạnh các lồi hoại sinh cịn có một số loài gây bệnh ở ngƣời và động vật
(Staph. Curcreus, Staph. Emidermidis ...)
Trực khuẩn
Là tên chung chỉ tất cả các vi khuẩn có hình que. Kích thƣớc của chúng
thƣờng từ 0,5 - 1,0 x 1 - 4 μ.
Thƣờng gặp các loài trực khuẩn sau đây:
Bacillus (Viết tắt là Bac): trực khuẩn gram dƣơng, sinh bào tử. Chiều
ngang của bào tử khơng vƣợt q chiều ngang của tế bào. Vì thế khi tạo thành
bào tử tế bào khơng thay đổi hình dạng chúng thƣờng thuộc lồi hiếu khí hoặc

kị khí khơng bắt buộc.
Bacterium (viết tắt là Bact)
Trực khuẩn gram âm không sinh bào tử. Thƣờng có tiên mao mọc xung
quanh tế bào ngƣời ta gọi là chu mao. Các giống Salmonella, Shigella,
Erwina, Serratia đều có hình thái giống Bacterium.

Pseudomonas (viết tắt là Ps)
`Trực khuẩn gram âm, khơng sinh bào tử, có một tiên mao (hoặc một
chùm tiên mao) ở một đầu. Chúng thƣờng sinh ra sắc tố. Các giống
Xanthomonas.

Photobacterium,

Azotomonas,
13

Aeromonas,

Zymononas,


Protaminobacter,
Methanomonas,

Alginomonas,

Mycoplazma,

Hydroginomonas,

Halobacterium,

Carloxydomonas,

Acetobater,

Nitrosomonas, Nitrobacter đều có hình thái giống Pseudomonas.
Corynebacterium
Khơng sinh bào tử, hình dạng và kích thƣớc thay đổi khá nhiều. Khi
nhuộm màu tế bào thƣờng tạo thành các đoạn nhỏ bắt màu khác nhau. Trực
khuẩn bạch cầu (Corynebacterium diphtheriae) có bắt màu ở hai đầu làm tế
bào có hình dạng giống quả tạ. Một số khác có hình thái giống
Corynebacterium

gồm

có

Listeria,

Erysipelothric,

Microbacterium,

Cellulomonas, Arthrobacter.
Clostridium (Viết tắt là Cl, tiếng Hy Lạp Kloster - con thoi)
Thƣờng là trực khuẩn gram dƣơng. Kích thƣớc thƣờng vào khoảng 0,4
- 1 x3- 8
Sinh bào tử, chiều ngang của bào tử thƣờng lớn hơn chiều ngang của tế
bào, do đó làm tế bào có hình thoi hay hình dùi trống.

Chúng thƣờng thuộc loại kỵ khí bắt buộc, có nhiều lồi có ích. Thí dụ
nhƣ các lồi cố định nitơ. Một số lồi khác gây bệnh. Thí dụ vi khuẩn uốn ván
... Cl. Botulium
Phẩy khuẩn
Là tên chung chỉ các vi khuẩn hình que uốn cong giống nhƣ dấu phẩy.
Giống điển hình là giống Vibro (Từ chữ La tinh Vibrare - dao động nhanh).
Một số giống phẩy khuẩn có khả năng phân giải xenluloza (Cellvibrio,
Cellfalcicula) hoặc có khả năng khử sunfat (Desulfovibrio).
Xoắn khuẩn
Spirillum - Từ chữ Spira - Hình cong, xoắn gồm tất cả các vi khuẩn có
hai vịng xoắn trở lên. Là loại gram dƣơng, di động đƣợc nhờ có một hay
nhiều tiên mao mọc ở đỉnh.
Đa số chúng thuộc loại hoại sinh, một số rất ít có khả năng gây bệnh
(SP. Minus) có kích thƣớc thay đổi 0,5 - 3,0 - 5 - 40μ.
14


1.1.2.2. Cấu tạo tế bào vi khuẩn

Hình 1.2: Cấu tạo của vi khuẩn
Thành tế bào
Thành tế bào là lớp ngoài cùng bao bọc vi khuẩn, giữ cho chúng có
hình dạng nhất định, chiếm 15 - 30% trọng lƣợng khô của tế bào. Thành tế
bào có những chức năng sinh lý rất quan trọng nhƣ duy trì hình thái tế bào và
áp suất thẩm thấu bên trong tế bào, bảo vệ tế bào trƣớc những tác nhân vật lý,
hoá học của mơi trƣờng, thực hiện việc tích điện ở bề mặt tế bào. Thành tế
bào chính là nơi bám của Phage và chứa nội độc tố của một số vi khuẩn có
độc tố. Có một số vi khuẩn khơng có thành tế bào (Micoplasma), một số
trƣờng hợp vi khuẩn bị phá vỡ thành tế bào mà vẫn sống (Protoplast ...)
Thành phần hoá học của thành tế bào vi khuẩn rất phức tạp, bao gồm

nhiều hợp chất khác nhau nhƣ Peptidoglycan, Polisaccarit, Protein,
Lipoprotein, Axit tecoic, Lipoit v.v.... Dựa vào tính chất hố học của thành tế
bào và tính chất bắt màu của nó, ngƣời ta chia ra làm 2 loại Gram + và Gram . Với cùng một phƣơng pháp nhuộm nhƣ nhau, trong đó có hai loại thuốc
nhuộm Cristal Violet màu tím và Fushsin màu hồng, vi khuẩn gram + bắt màu
tím, vi khuẩn gram - bắt màu hồng. Nguyên nhân là do cấu tạo thành tế bào
của hai loại khác nhau. Ngồi hai loại trên, cịn có loại gram biến đổi (gram
variable) có khả năng biến đổi từ gram + sang gram - và ngƣợc lại. Sau đây là
sơ đồ cấu tạo của thành tế bào vi khuẩn E.coli.

15


Vỏ nhầy (Capsul)
Nhiều loại vi khuẩn bên ngoài thành tế bào cịn có một lớp vỏ dày hay
lớp dịch nhày. Kích thƣớc của lớp vỏ nhày khác nhau tuỳ theo loài vi khuẩn.
Ở vi khuẩn Azotobacter chroococum khi phát triển trên mơi trƣờng giàu
hydrat cacbon có thể hình thành lớp vỏ nhày dày hơn chính bản thân tế bào.
Vỏ nhầy có tác dụng bảo vệ vi khuẩn tránh tác dụng thực bào của bạch
cầu. Chính vì thế mà ở một số vi khuẩn gây bệnh chỉ khi có lớp vỏ nhày mới
có khả năng gây bệnh. Khi mất lớp vỏ nhày, lập tức bị bạch cầu tiêu diệt khi
xâm nhập vào cơ thể chủ. Vi khuẩn có vỏ nhày tạo thành khuẩn lạc trơn bóng
khi mọc trên mơi trƣờng thạch gọi là dạng S, ngƣợc lại dạng R có khuẩn lạc
xù xì.
Vỏ nhầy cịn là một nơi dự trữ các chất dinh dƣỡng. Khi ni cấy vi
khuẩn có vỏ nhày trên môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng, lớp vỏ nhày bị tiêu biến
dần do bị sử dụng làm chất dinh dƣỡng.
Ở một số vi khuẩn vỏ nhầy đƣợc dùng để bám vào giá thể. Các chất
trong vỏ nhày là do thành tế bào tiết ra, thành phần của nó tuỳ thuộc vào loại
vi khuẩn. Đa số trƣờng hợp vỏ nhày đƣợc cấu tạo bởi polysaccarit, đơi khi có
cấu tạo bởi polypeptit. Thành phần hố học của vỏ nhày quyết định tính

kháng nguyên của vi khuẩn.
Màng tế bào chất (Cell membran)
Màng tế bào chất còn gọi là màng nguyên sinh chất là một lớp màng
nằm dƣới thành tế bào, có độ dày khoảng 4 - 5 nm, chiếm 10 - 15% trọng
lƣợng tế bào vi khuẩn.
Màng tế bào chất có nhiều chức năng quan trọng: Duy trì áp suất thẩm
thấu của tế bào, đảm bảo việc chủ động tích luỹ chất dinh dƣỡng và thải các
sản phẩm trao đổi chất ra khỏi tế bào. Màng tế bào chất là nơi sinh tổng hợp
một số thành phần của tế bào, đặc biệt là thành phần của thành tế bào và vỏ
nhày, là nơi chứa một số men quan trọng nhƣ Permeaza, ATP-aza v.v... Màng

16


tế bào chất cịn là nơi tiến hành q trình hô hấp và quang hợp (ở vi khuẩn
quang dƣỡng).
Thành phần hoá học của màng tế bào chất đơn giản hơn của thành tế
bào nhiều. Bao gồm photpholipit và protein và protein sắp xếp thành 3 lớp:
lớp giữa là photpholipit bao gồm hai lớp phân mồi phân tử gồm 1 đầu chứa
gốc photphat háo nƣớc và một đầu chứa hydratcacbon, đầu háo nƣớc của hai
lớp phân tử photpholipit quay ra ngoài, ở đây chứa các men vận chuyển
Pecmeaza. Hai lớp ngoài và trong và Protein.
Màng tế bào chất còn là nơi gắn của nhiễm sắc thể. Ngồi hai thành
phần chính trên, màng tế bào chất còn chứa một số chất khác nhƣ
hydratcacbon, glycolipit, v.v...
Tế bào chất (Cytoplast)
Tế bào chất là thành phần chính của tế bào vi khuẩn, đó là một khối
chất keo bán lỏng chứa 80 - 90% nƣớc, còn lại là protein, hydratcacbon, lipit,
axit nucleic v.v... Hệ keo có tính chất dị thể, trạng thái phân tán, ln ln
biến đổi phụ thuộc vào điều kiện mơi trƣờng. Khi cịn non tế bào chất có cấu

tạo đồng chất, bắt màu giống nhau. Khi già do xuất hiện không bào và các thể
ẩn nhập, tế bào chất có trạng thái lổn nhổn, bắt màu không đều. Tế bào chất là
nơi chứa có cơ quan quan trọng của tế bào nhƣ: nhân tế bào, Mezoxom,
Riboxom và các hạt khác.
Mezoxom
Mezoxom là một thể hình cầu trong giống nhƣ cái bong bóng gồm
nhiều lớp màng cuộn lại với nhau, có đƣờng kính khoảng 250 nm. Mezoxom
chỉ xuất hiện khi tế bào phân chia, nó có vai trị quan trọng trong việc phân
chia tế bào và hình thành vách ngăn ngang. Ở nhiều lồi vi khuẩn, Mezoxom
là một thành phần của màng tế bào chất phát triển ăn sâu vào tế bào chất. Một
số enzym phân huỷ chất kháng sinh nhƣ Penixilinaza đƣợc sinh ra từ
Mexozom.

17


Riboxom
Riboxom là nơi tổng hợp protein của tế bào, chứa chủ yếu là ARN và
protein.
Ngồi ra có chứa một ít lipit, và một số chất khống. Riboxom có
đƣờng kính khoảng 200A, cấu tạo bởi 2 tiểu thể - 1 lớn, 1 nhỏ. Tiểu thể lớn có
hằng số lắng là 50S, tiểu thể nhỏ 30S (1S = 1-13 cm/giây)
Mỗi tế bào vi khuẩn có trên 1000 riboxom, trong thời kỳ phát triển
mạnh của nó, số lƣợng riboxom tăng lên. Khơng phải tất cả các riboxom đều
ở trạng thái hoạt động. Chỉ khoảng 5 - 10% riboxom tham gia vào quá trình
tổng hợp protein. Chúng liên kết nhau thành một chuỗi gọi là polyxom nhờ
sợi ARN thơng tin.
Trong q trình tổng hợp protein, các riboxom trƣợt dọc theo sợi ARN
thông tin nhƣ kiểu đọc thông tin. Qua mỗi bƣớc đọc, một axit amin lại đƣợc
gắn thêm vào chuỗi polypeptit.

Thể nhân (Nuclear body)
Vi khuẩn thuộc loại procaryotic, bởi vậy cấu tạo nhân rất đơn giản,
chƣa có màng nhân. Thể nhân vi khuẩn chỉ gồm một nhiễm sắc thể hình vịng
do một phân tử AND cấu tạo nên dính một đầu vào màng tế bào chất khơng
có thành phần protein nhƣ nhân tế bào bậc cao. Chiều dài phân tử AND
thƣờng gấp 1000 lần chiều dài tế bào, mang tồn bộ thơng tin di truyền của tế
bào vi khuẩn. Ngoài nhiễm sắc thể, một số vi khuẩn cịn có Plasmic, đó là
những phân tử AND hình vịng kín kích thƣớc nhỏ, mang thơng tin di truyền,
có khả năng sao chép độc lập.
Ở những vi khuẩn kháng thuốc, đặc tính kháng thuốc thƣờng đƣợc quy
định bởi các gen nằm trên các plasmic này.
Các hạt khác trong tế bào
Trong tế bào vi khuẩn ngoài các cấu trúc nói trên cịn có một số hạt mà
số lƣợng và thành phần của nó khơng nhất định. Sự có mặt của chúng phụ
thuộc vào điều kiện môi trƣờng và vào giai đoạn phát triển của vi khuẩn.
18


Nhiều loại hạt có tính chất nhƣ chất dự trữ, đƣợc hình thành khi tế bào tổng
hợp thừa các chất đó và đƣợc tiêu hao khi tế bào cần đến. Các hạt này bao
gồm hạt hydratcacbon, hạt polyphotphat vô cơ, các giọt lipit, lƣu huỳnh, các
tinh thể Ca và các hạt sắc tố. Đặc biệt, trong tế bào của một số vi khuẩn gây
bệnh cho cơn trùng (Bacillus thurigiensis) cịn có các tinh thể diệt cơn trùng
có hình thoi hoặc hình khối. Sự có mặt của các tinh thể này liên quan đến khả
năng gây bệnh côn trùng của vi khuẩn. Ngƣời ta đã lợi dụng đặc tính này
nghiên cứu, sản xuất ra những chế phẩm diệt côn trùng gây hại.
Tiên mao và nhung mao
Tiên mao là những cơ quan di động của vi khuẩn, nhƣng không phải tất
cả các vi khuẩn đều có tiên mao. Tiên mao thƣờng có chiều rộng 10 - 25 μm,
chiều dài thay đổi tuỳ theo loài vi khuẩn. Số lƣợng tiên mao cũng phụ thuộc

vào lồi vi khuẩn. Loại có 1 tiên mao gọi là đơn mao, mọc ra ở một cực của tế
bào, loại có 2 gọi là song mao mọc ra từ một cực tế bào, loại có nhiều gọi là
chùm mao cũng mọc ra từ một cực tế bào, có loại mọc ra từ hai cực của tế
bào. Loại mọc quanh mình thành một vành đai nhƣ chiếc thắt lƣng có lơng
gọi là chu mao.
Các vi sinh vật khác nhau có số lƣợng và sự sắp xếp các tiên mao trên
tế bào khác nhau.
Tiêm mao có bản chất protein, bị phân giải ở nhiệt độ 600C hoặc ở môi
trƣờng axit. Tuỳ theo kiểu tiên mao mà vi khuẩn có các kiểu di động khác
nhau. Loại đơn mao di động theo hình sin, loại chùm mao di động theo kiểu
xốy trơn ốc v.v....
Nhung mao: Khác với tiên mao, nhung mao không phải là cơ quan di
động của vi khuẩn. Chúng là những sợi lông mọc khắp bề mặt của một số vi
khuẩn, làm tăng diện tiếp xúc với thức ăn, ngoài ra còn dùng để bám vào giá
thể. Ở một số vi khuẩn, nhung mao còn đƣợc dùng làm cầu nối nguyên sinh
chất trong quá trình tiếp hợp giữa hai vi khuẩn.

19


Bào tử (Spore)
Bào tử là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn. Khi gặp điều kiện khó
khăn, vi khuẩn có khả năng hình thành bào tử. Bào tử đƣợc hình thành bên
trong tế bào, có khi to hơn kích thƣớc tế bào làm tế bào phình ra so với bình
thƣờng. Ví dụ nhƣ ở Clostridium, khi hình thành bào tử, tế bào hình thành
hình dùi trống hoặc hình thoi. Bào tử có 3 lớp vỏ bọc, những lớp vỏ bọc này
tránh cho bào tử những tác động của môi trƣờng nhƣ: nhiệt độ, pH, tác động
của men, v.v.... Ở nhiệt độ 1000C trong khi các tế bào dinh dƣỡng bị tiêu diệt
thì bào tử Bacillus cereus có thể chịu đƣợc 2,5 phút, Bacillus subtilis thậm chí
chịu đƣợc 180 phút. Bào tử của vi khuẩn gây ngộ độc ở 1800C vẫn sống đƣợc

tới 10 phút. Trong phenol 5% tế bào dinh dƣỡng chết ngay trong khi bào tử có
thể sống đƣợc đến 15 ngày.
1.2. Phân loại và ứng dụng của vi khuẩn
1.2.1. Phân loại
Vi khuẩn có thể có ích hoặc có hại cho mơi trƣờng, và động vật, bao
gồm cả con ngƣời. Vai trò của vi khuẩn trong gây bệnh và truyền bệnh rất
quan trọng. Một số là tác nhân gây bệnh (pathogen) và gây ra bệnh uốn ván
(tetanus), sốt thƣơng hàn (typhoid fever), giang mai (syphilis), tả (cholera),
bệnh lây qua thực phẩm (foodborne illness) và lao (tuberculosis). Nhiễm
khuẩn huyết (sepsis), là hội chứng nhiễm khuẩn toàn cơ thể gây sốc và giãn
mạch, hay nhiễm khuẩn khu trú (localized infection), gây ra bởi các vi khuẩn
nhƣ streptococcus, staphylococcus, hay nhiều lồi Gram âm khác. Một số
nhiễm khuẩn có thể lan rộng ra khắp cơ thể và trở thành toàn thân (systemic).
Ở thực vật, vi khuẩn gây mụn lá (leaf spot), fireblight và héo cây. Các hình
thức lây nhiễm gồm qua tiếp xúc, khơng khí, thực phẩm, nƣớc và cơn trùng.
Ký chủ (host) bị nhiễm khuẩn có thể trị bằng thuốc kháng sinh, đƣợc chia làm
hai nhóm là diệt khuẩn (bacteriocide) và kìm khuẩn (bacteriostasis), với liều
lƣợng mà khi phân tán vào dịch cơ thể có thể tiêu diệt hoặc kìm hãm sự phát
triển của vi khuẩn.
20


1.2.2. Ứng dụng
Các biện pháp khử khuẩn có thể đƣợc thực hiện để ngăn chặn sự lây lan
của vi khuẩn, ví dụ nhƣ chùi da bằng cồn trƣớc khi tiêm. Việc vô khuẩn các
dụng cụ phẫu thuật và nha khoa đƣợc thực hiện để đảm bảo chúng "vô khuẩn"
(sterile) hay không mang vi khuẩn gây bệnh, để ngăn chặn sự nhiễm khuẩn.
Chất tẩy uế đƣợc dùng để diệt vi khuẩn hay các tác nhân gây bệnh để ngăn
chặn sự nhiễm và nguy cơ nhiễm khuẩn.
Trong đất, các vi sinh vật sống trong nốt rễ (rhizosphere) biến nitơ

thành ammoniac bằng các enzyme của chính mình. Một số khác lại dùng phân
tử khí nitơ làm nguồn nitơ (đạm) cho mình, chuyển nitơ thành các hợp chất
của nitơ, quá trình này gọi là quá trình cố định đạm. Nhiều vi khuẩn đƣợc tìm
thấy sống cộng sinh trong cơ thể ngƣời hay các sinh vật khác. Ví dụ nhƣ sự
hiện diện của các vi khuẩn cộng sinh trong ruột già giúp ngăn cản sự phát
triển của các vi sinh vật có hại.
Vi khuẩn có khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ một cách đáng
kinh ngạc. Một số nhóm vi sinh "chuyên hóa" đóng một vai trị rất quan trọng
trong việc hình thành các khống chất từ một số nhóm hợp chất hữu cơ. Ví
dụ, sự phân giải cellulose, một trong những thành phần chiếm đa số trong mô
thực vật, đƣợc thực hiện chủ yếu bởi các vi khuẩn hiếu khí thuộc chi
Cytophaga. Khả năng này cũng đƣợc con ngƣời ứng dụng trong công nghiệp
và trong cải thiện sinh học (bioremediation). Các vi khuẩn có khả năng phân
hủy hydrocarbon trong dầu mỏ thƣờng đƣợc dùng để làm sạch các vết dầu
loang.
Vi khuẩn, cùng với nấm men và nấm mốc, đƣợc dùng để chế biến các
thực phẩm lên men nhƣ phô-mai, dƣa chua, nƣớc tƣơng, dƣa cải bắp
(sauerkraut), giấm, rƣợu, và yoghurt. Sử dụng cơng nghệ sinh học, các vi
khuẩn có thể đƣợc "thiết kế" (bioengineer) để sản xuất thuốc trị bệnh nhƣ
insulin, hay để cải thiện sinh học đối với các chất thải độc hại.

21


CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Mẫu phế thải chăn nuôi gà
Mẫu phế thải chăn nuôi gà đƣợc lấy tại Xuân Mai - Chƣơng Mỹ - Hà
Nội ở các thời điểm chăn nuôi gà khác nhau

2.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu
Các chủng vi khuẩn đƣợc phân lập từ phế thải chăn nuôi gà
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất
 Cân điện tử AL – 300 (Osi, Mỹ)
 Nồi hấp khử trùng Hiclave HV – 85 (Hirayam, Nhật)
 Tủ cấy (Nuaire, Mỹ)
 Kính hiển vi quang học Axio (Zeiss, Đức)
 Tủ ấm ổn nhiệt
 Máy đo pH
 Máy ly tâm 5417R (Eppendorf, Đức)
 Mắc lắc ổn nhiệt
 Ngồi ra cịn có các dụng cụ thí nghiệm nhƣ: bình tam giác, ống
nghiệm, ống eppendorf, đĩa petri, các loại que cấy, …
 Các loại đƣờng: Fructose, maltose, sucrose, glucose, …
 Các loại hóa chất nhƣ: peptone, cao nấm men, NaCl, CMC, casein,
tinh bột, …
 Các loại hóa chất để nhuộm màu: tím tinh thể, lugol, coomasin,
congo red, …

22


2.2. Mục tiêu nghiên cứu
- Phân lập, tuyển chọn và sàng lọc đƣợc các chủng vi khuẩn từ phế thải
chăn ni gà có hoạt tính enzyme.
- Xác định đƣợc khả năng sinh một số enzyme ngoại bào của các chủng
VK phân lập đƣợc.
2.3. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập đƣợc các chủng vi khuẩn từ phế thải chăn nuôi gà ở Xuân
Mai - Chƣơng Mỹ - Hà Nội

- Nghiên cứu và chọn lọc các chủng VK có hoạt tính enzyme ngoại bào
cao.
- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng VK tuyển chọn.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn từ phế thải chăn nuôi gà


Phương pháp lấy mẫu

Thu lấy phần phế thải chăn nuôi gà sau khi đƣợc xử lý, khô, loại bỏ rác
thải sau đó đựng vào túi nilon đã khử trùng.
Bên ngoài túi ghi rõ tên mẫu, ngày lấy và địa điểm lấy
Sau khi lấy về mẫu đƣợc bảo quản ở nơi khơ ráo, thống mát


Phương pháp phân lập vi khuẩn theo Koch

Chuẩn bị bình nón có dung tích 250ml chứa 9ml nƣớc cất vô trùng
Khử trùng cối chày, để nguội. Cân 1g mẫu cho vào cối chày sứ và
nghiền nát mẫu. Dùng tồn bộ nƣớc ở bình 1 để chuyển tồn bộ mẫu sang
bình 2. Lắc 5 phút, để lắng 30 giây rồi pha loãng mẫu: Dùng pipetman hút
1ml dịch pha loãng cho sang ống nghiệm mới chứa 9ml nƣớc cất vơ trùng,
trộn đều dịch ta đƣợc độ pha lỗng 10-1, tiếp tục pha loãng tới nồng độ 10-2,
10-3, 10-4, 10-5, …Chọn 3 nồng độ pha lỗng thích hợp nhất (liên tiếp nhau),
dùng pipetman hút 0,1ml dịch pha loãng cấy trải trên đĩa petri có chƣa mơi
trƣờng LB. Ghi rõ ngày cấy, nồng độ, tên mẫu, …, bọc kín đĩa sau đó chuyển
vào tủ ấm ni ở nhiệt độ 300C, sau 24 giờ theo dõi sự hình thành khuẩn lạc.
23

Dựa vào hình thái khuẩn lạc, màu sắc để phân lập sơ bộ từng chủng vi khuẩn.
Dùng que cấy móc, cấy ria riêng rẽ từng chủng trên môi trƣờng LB để tinh
sạch. Nuôi trong 24 giờ trong tủ ấm để theo dõi sự hình thành khuẩn lạc.
2.4.2. Phƣơng pháp đếm số lƣợng khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch
Sau khi nuôi cấy ở nhiệt độ và thời gian thích hợp, đếm số lƣợng khuẩn
lạc mọc trong mỗi đĩa Petri, để từ đó tính số lƣợng tế bào trong 1 g đất.
* Cách đếm:
Đếm số khuẩn lạc bằng cách úp sấp đĩa Petri, trên mặt đáy phía ngồi
của đĩa, dùng bút viết kính đánh dấu các khuẩn lạc đã đƣợc đếm. Nếu số
lƣợng khuẩn lạc nhiều, dùng bút chia mặt đáy thành các phần và đếm số
khuẩn lạc trong từng phần sau đó cộng lại.
Khơng đếm các đĩa khuẩn lạc mọc q dày không thể đếm đƣợc hoặc
các đĩa bị nhiễm ảnh hƣởng đến sự phát triển của xạ khuẩn.
* Cách tính kết quả:
Theo lý thuyết: 1 khuẩn lạc đƣợc hình thành từ 1 tế bào. Tuy
nhiên trên thực tế khó có thể xác định đƣợc chính xác là một khuẩn lạc có thể
đƣợc hình thành từ 1 hay nhiều tế bào. Vì vậy để tính tổng số tế bào có trong
1 đơn vị thể tích, ngƣời ta thƣờng dùng thuật ngữ “đơn vị hình thành khuẩn
lạc trong 1 đơn vị thể tích” (CFU - Colony Forming Unit).
Nhƣ vậy từ số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch có thể suy ra số lƣợng tế
bào (CFU) có trong 1 g đất theo cơng thức sau:
CFU/g = A x 1/K x 1/V
Trong đó:
A: Số lƣợng khuẩn lạc trung bình mọc trên các đĩa thạch có cùng
độ pha lỗng.
V: Thể tích dịch đất pha lỗng đƣợc cấy gạt trên đĩa thạch.
K: Độ pha loãng của dịch đất đƣợc cấy trên thạch.

24

Số CFU/1 đĩa Petri đƣợc coi là tốt để tính tổng số CFU/1 g đất nếu
khi cấy 0,1 ml dịch đất pha lỗng trên mơi trƣờng đếm đƣợc từ 30 - 300 khuẩn
lạc/1 đĩa.
2.4.3. Phƣơng pháp thuần khiết và bảo quản giống
Sau khi đã cấy chuyển 3 lần các chủng VK phân lập đƣợc bằng phƣơng
pháp cấy ziczac trên đĩa petri có chứa mơi trƣờng LB, khuẩn lạc đã riêng rã
và đƣợc thuần khiết ta tiến hành cấy giữ giống. Sử dụng các mẫu trong đĩa
petri đã đƣợc tinh sạch, không nhiễm bất kỳ một loại VSV nào khác bằng
phƣơng pháp cấy vạch, các khuẩn lạc đồng nhất về hình dạng, màu sắc thì sử
dụng que cấy gạt lấy một ít khuẩn lạc của vi khuẩn cấy ziczac trên ống thạch
nghiêng chứa mơi trƣờng LB, nhét kín miệng ống nghiệm bằng nút bông vô
trùng, ghi rõ ngày , tên chủng, … Chuyển vào tủ ấm ở 300C nuôi trong 1
ngày, lấy ống giống ra kiểm tra và loại bỏ các ống nhiễm, giữ và bảo quản
những ống đã tinh sạch trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40C để sử dụng cho các thí
nghiệm sau
2.4.4. Phƣơng pháp lên men vi khuẩn
Từ ống thạch nghiêng giống đƣợc hoạt hóa trên đĩa petri chứa mơi
trƣờng LB, sau đó đƣợc cấy sang các bình nón có dung tích 250ml chứa 30ml
mơi trƣờng LB lỏng, ni trên máy lắc với tốc độ 200 vịng/phút ở nhiệt độ
28-300C trong 1 ngày. Thu dịch lên men, ly tâm 2 lần với vân tốc 6000
vòng/phút ở 40C
2.4.5. Xác định hoạt tính enzyme của vi khuẩn bằng phƣơng pháp
khuếch tán trên đĩa thạch
Nguyên tắc: Trong quá trình sống vi khuẩn thực hiện trao đổi chất với
môi trƣờng nuôi cấy và sẽ tiết ra môi trƣờng các loại enzyme ngoại bào. Dựa
vào đặc điểm đó, để chọn lọc đƣợc các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh
enzyme ngoại bào có thể dựa theo sự xuất hiện vịng phân giải xung quanh lỗ
thạch khơng có khả năng bắt màu thuốc nhuộm.

25