Nghiên cứu nhân giống in vitro phi điệp tím hòa bình (dendrobium anosmum linld ) bằng kỹ thuật nuôi cấy lát mỏng

LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian đƣợc học tập và nghiên cứu tại Viện Công nghệ sinh học
Lâm nghiệp - Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp với sự hƣớng dẫn nhiệt tình, đầy tâm
huyết của các thầy, các cô đã giúp cho em có thêm đƣợc những kiến thức mới và
những kinh nghiệm quý báu trong cuộc sống. Đƣợc sự đồng ý của ban lãnh đạo
Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp – Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp và giáo
viên hƣớng dẫn em xin đƣợc thực hiện đề tài “Nghiên cứu nhân giống in vitro
Phi điệp tím Hịa Bình (Dendrobium anosmum Linld.) bằng kỹ thuật ni cấy lát
mỏng”.
Có đƣợc kết quả hiện tại trƣớc hết em xin đƣợc gửi lời cảm ơn sâu sắc tới
cô giáo Th.s Nguyễn Thị Thơ và TS. Khuất Thị Hải Ninh đã tận tâm hƣớng dẫn
chỉ bảo, động viên em và truyền đạt cho em những kiến thức vô cùng quý giá
trong quãng thời gian học tập. Em xin cảm ơn cô Th.s Nguyễn Thị Thơ, cô đã
giúp đỡ và chỉ bảo tận tình cho em rất nhiều khơng chỉ về kiến thức mà cịn về
những kinh nghiệm trong công việc và trong cuộc sống. Bên cạnh đó, em cũng
xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, các cơ và tồn bộ cán bộ viên chức tại bộ môn
Tài nguyên thực vật rừng đã giúp đỡ, tạo điều kiện và đóng góp ý kiến quý báu
để quá trình thực hiện nghiên cứu của em thuận lợi.
Em xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã ln sát cánh bên em.
Trong q trình thực hiện đề tài còn nhiều hạn chế về kinh nghiệm của bản thân
nên khơng thể tránh đƣợc những sai sót nên em rất mong nhân đƣợc những lời
nhận xét và đóng góp của các thầy, các cơ để đề tài của em đƣợc hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2019
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Hảo

i


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ i
MỤC LỤC ............................................................................................................. ii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................................... v
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................... vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU....................................... 2
1.1. Giới thiệu về Phi điệp tím Hịa Bình (Dendrobium anosmum Lindl.) ........ 2
1.1.1. Vị trí phân loại ............................................................................................ 2
1.1.2. Đặc điểm hình thái: ..................................................................................... 3
1.1.3. Đặc điểm sinh học của Phi điệp tím............................................................ 3
1.1.4. Phân bố ........................................................................................................ 4
1.1.5. Một số điều kiện sinh thái ........................................................................... 4
1.1.6. Giá trị sử dụng ............................................................................................. 6
1.1.7. Phƣơng pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào: .................................................... 6
1.1.8. Những nghiên cứu về nhân giống in vitro chi Dendrobium: ...................... 8
1.1.9. Những nghiên cứu về nhân giống bằng phƣơng pháp cắt lát mỏng ......... 12
1.1.10. Những nghiên cứu về nhân giống bằng phƣơng pháp cắt lát mỏng chi
Dendrobium ......................................................................................................... 15
CHƢƠNG 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..... 20
2.1. Mục tiêu........................................................................................................ 20
2.2. Nội dung ....................................................................................................... 20
2.2.1. Nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu sạch in vitro ............................................... 20
2.2.2. Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi lan Phi điệp tím từ lát mỏng .............. 20
2.2.3. Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi lan Phi điệp tím ............................ 20
2.3. Vật liệu nghiên cứu, địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm:..................... 20
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................... 20
ii

2.3.2. Địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm: .................................................. 20
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu:............................................................................. 21
2.4.1. Phƣơng pháp tạo mẫu sạch lan Phi điệp tím Hịa Bình ............................ 21
2.4.2. Phƣơng pháp tái sinh chồi từ lát cắt mỏng ................................................ 21
2.4.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến
khả năng nhân nhanh chồi ................................................................................... 23
2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu............................................................................ 24
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 25
3.1. Kết quả tạo mẫu sạch ................................................................................... 25
3.2. Kết quả tái sinh chồi từ lát cắt mỏng............................................................ 26
3.2.1. Kết quả ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng tái sinh
chồi……. ............................................................................................................. 26
3.2.2. Kết quả ảnh hƣởng của thời gian chiếu sáng đến khả năng tái sinh chồi . 28
3.3. Kết quả ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng nhân nhanh
chồi Phi điệp tím Hịa Bình ................................................................................. 30
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................... 33
4.1. Kết luận ........................................................................................................ 33
4.2. Tồn tại........................................................................................................... 33
4.3. Kiến nghị ...................................................................................................... 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO

iii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
STT Ký hiệu

Giải thích

1

MS

Murasighe và Skoog (1962)

2

IBA

3 - Indole butyric acid

3

NAA

Α - Naphthaleneacetic acid

4

Kinetin

6 – furfuryl aminopurine

5

BAP

6 – Benzyl aminopurine

6

2,4 - D

2,4 – Dichlorophenoxyacetic acid

7

TDZ

Thidiazuron

8

CTTN

Công thức thí nghiệm

9

PLBs

Protocom – like bodies

10

tTCL

traverse thin cell layer (lớp cắt mỏng theo chiều ngang)

11

lTCL

Longitudinal thin cell layre (lớp mỏng tế bào cắt theo chiều doc)

12

IAA

3 – indole acetic acid

13

KC

Knudson C, 1965

14

CW

Nƣớc dừa

15

2ip

N6- (2-isopentyl) adenine

16

WPM

Woody Plant Medium

17

tTCL_L

Lát cắt mỏng ngang lá

18

tTCL- R

Lát cát mỏng ngang rễ

19

tTCL - C

Lát cát mỏng ngang cuống

20

GA3

Gibberellin A3

21

RE

Robert Ernst, 1979

22

VW

Vacin and Went, 1949

23

MVW

modified Vacin and Went

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm và thống kê kết quả nghiên cứu ........................... 21
Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm và biểu thu thập số liệu về ảnh hƣởng của các chất
điều hòa sinh trƣởng tới khả tái sinh chồi từ lát mỏng lan Phi điệp tím Hịa
Bình ................................................................................................................. 22
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm về ảnh hƣởng của thời gian chiếu sáng đến khả
năng tái sinh chồi Phi điệp tím ........................................................................ 23
Bảng 2.4: Bố trí thí nghiệm về ảnh hƣởng của các chất điều hòa sinh trƣởng tới

khả năng nhân nhanh chồi từ lát mỏng lan Phi Điệp Tím Hịa Bình ................ 23
Bảng 3.1. Kết quả tạo mẫu sạch từ chồi Phi điệp tím ...................................... 25
Bảng 3.2. Kết quả ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng lên khả năng tái
sinh chồi Phi điệp tím ...................................................................................... 27
Bảng 3.3. Kết quả ảnh hƣởng của thời gian chiếu sáng đến khả năng tái sinh
chồi Phi điệp tím .............................................................................................. 29
Bảng 3.4. Kết quả nhân nhanh chồi Phi điệp tím Hịa Bình............................. 30

v


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Ảnh lan Phi điệp tím Hịa Bình ............................................................. 2
Hình 3.1. Chồi lan Phi điệp tím Hịa bình tái sinh trên mơi trƣờng vào mẫu ..... 26
Hình 3.2. Chồi tái sinh trên mơi trƣờng: ............................................................. 28
Hình 3.3. Chồi Phi điệp tím Hịa bình tái sinh trong điều kiện ánh sáng ........... 30
Hình 3.4. Chồi Phi điệp tím Hịa Bình sau 8 tuần ni cấy trên mơi trƣờng nhân
nhanh chồi ........................................................................................................... 32

vi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Phi điệp tím Hịa Bình có tên gọi khác là giã hạc hay giả hạc thuộc chi
hoàng thảo có tên khoa học là Dendrobium anosmum Lindl. Phi điệp tím Hịa
Bình là giống lan q của rừng nhiệt đới đƣợc nhiều ngƣời chơi lan ƣa chuộng
không chỉ bởi khuôn bơng đẹp, cây sai hoa mà cịn đẹp về cả màu sắc lẫn hình
dáng. Cánh hoa tao nhã, trên cánh có phủ lơng mịn và có ánh kim, trên lƣỡi
thƣờng có hai mắt tím đậm, nhất là bộ phận mơi hoa có cấu trúc phức tạp và độc
đáo. Phi điệp tím Hịa Bình có hƣơng thơm đặc biệt, dễ chịu, thoang thoảng mà

hầu nhƣ khơng có loại hƣơng liệu nhân tạo nào sánh đƣợc. Phi điệp tím Hịa
Bình đặc trƣng riêng so với các loại Phi điệp có nơi phân bố khác về hình dạng,
màu sắc hoa. Hoa Phi điệp tím hịa bình sẽ có cánh hoa to hơn, có màu đậm hơn
và có hƣơng thơm đặc biệt hơn hoa Phi điệp ở khu vực phân bố khác. Ngoài giá
trị làm cảnh, Phi điệp tím Hịa Bình cịn có giá trị làm thuốc để điều trị nhiều
bệnh về da, suy nhƣợc thần kinh và tăng cƣờng sức đề kháng cho cơ thể. Vì vậy,
Phi điệp tím Hịa Bình mang lại hiệu quả kinh tế cao [13], [17].
Lan Phi điệp nói riêng và các loại lan thân thịng nói chung khách rất ƣa
chuộng nhƣng khi mua họ cần rõ mặt hoa nhƣ thế nào? Vì thực tế, mặt hoa của
lan rất đa dạng. Vì vậy, với phƣơng pháp gieo hạt khơng thể đảm bảo cây giống
có mặt hoa giống nhƣ cây mẹ. Vì vậy cần thiết phải nhân giống vơ tính. Tuy
nhiên, nhân vơ tính bằng cách nhân kei lại có hạn chế về nguồn mẫu ban đầu.
Phƣơng pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào có thể giải quyết vấn đề này.
Chính vì những lý do trên, tơi lựa chọn thực hiện đề tài “Nghiên cứu
nhân giống in vitro Phi điệp tím Hịa Bình (Dendrobium anosmum Linld.)
bằng kỹ thuật ni cấy lát mỏng”.

1


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1.Giới thiệu về Phi điệp tím Hịa Bình (Dendrobium anosmum Lindl.)
1.1.1. Vị trí phân loại
Phi Điệp tím Hịa Bình (Dendrobium anosmum Lindl.) thuộc:
Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Monocotyledoneae
Phân lớp: Liliidae
Bộ: Orchidales
Họ: Orchidaceae

Chi: Dendrobium

Nguồn:
Hình 1.1. Ảnh lan Phi điệp tím Hịa Bình

2


1.1.2. Đặc điểm hình thái:
Thân: Phi điệp tím Hịa Bình thuộc dạng thân thịng, thân có thể dài tới 2
m bng rũ xuống. Phi đệp tím Hịa Bình mọc thành từng cụm, thuộc nhóm đa
thân và thân có giả hành. Gỉa hành chứa diệp lục, dự trữ nƣớc và chất dinh
dƣỡng cần thiết cho sự phát triển của giả hành mới và duy trì sự sống. Thân chia
thành nhiều đốt, mỗi đốt chứa một mắt ngủ. Độ dài đốt phụ thuộc vào độ tuổi
của cây, môi trƣờng… Màu sắc thân Phi điệp tím Hịa Bình rất đa dạng từ màu
xanh, chấm tím và tím tùy từng giai đoạn, đƣờng kính thân có thể tới 1,5 cm khi
vào mùa nghỉ. Thân già các đời trƣớc thì thƣờng khơ teo, màu nâu tím hoặc
vàng nhƣ rơm, bóng [13], [17].
Lá: Lá đơn mọc cách, xếp so le, mọng nƣớc, dài 10 -15 cm, rộng từ 3 -4
cm. Mép lá nguyên, hệ gân song song, đầu lá nhon [17].
Rễ: Phi điệp tím Hịa Bình thuộc loại rễ bì sinh, đƣờng kính nhỏ khoảng
1,5 – 2 mm, có hình trụ. Rễ rất dài, chóp rễ có màu xanh [17].
Hoa: Hoa Phi đệp tím khơng những mọc trên những giả hành mới mà còn
mọc trên các giả hành cũ. Hoa Phi điệp tím Hịa Bình thƣởng nở vào cuối xuân –
đầu hè (tháng 4 – 6 dƣơng lịch), hoa to tới 10 cm, mọc từ 1 – 3 chiếc ở các đốt
đã rụng lá. Trên cánh có phủ lơng mịn và có ánh kim, trên lƣỡi thƣờng có hai
mắt tím đậm. Hoa có hƣơng thơm ngào ngạt và lâu tàn (2 – 3 tuần lễ). Nhiều hoa
trên phát hoa, một cây nếu mạnh khỏe có thể ra tới 50 – 70 hoa [13], [17].
Quả: Quả của Hồng thảo Phi điệp tím Hịa Bình thuộc loại quả nang, nở
ra theo 3 – 6 đƣờng nứt dọc. Khi chín quả nở ra, các mảnh vỏ cịn dính lại với

nhau ở phía đỉnh và phía gốc. Bên trong chứa rất nhiều hạt, khi chín hạt có màu
vàng. Hạt cấu tạo bởi một phơi chƣa phân hóa, chứa đầy khơng khí. Hạt rất
nhiều và nhỏ, tồn bộ hạt trong một quả nặng chỉ bằng một phần mƣời mg, rất
nhẹ nên dễ phát tán nhờ gió [17].
1.1.3. Đặc điểm sinh học của Phi điệp tím
Thân: Là cây đa thân, có thân giả hay giả hành chứa diệp lục, là cơ quan
dự trữ nƣớc và các chất dinh dƣỡng để duy trì sự sống lâu hơn loài đơn thân.
3


Cấu tạo của giả hành gồm nhiều mô mềm chứa đầy dịch nhầy, phía ngồi có lớp
biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ để tránh sự mất nƣớc do mặt trời
hun nóng. Củ giả hành có màu xanh bóng, cùng với lá nó cũng làm nhiệm vụ
quang hợp [17].
Lá: Là cơ quan cung cấp dinh dƣỡng bằng quang hợp. Lá thƣờng rụng
vào mùa thu, đông khi cây đã thắt ngon và bƣớc vào mùa nghỉ [17].
Rễ: Rễ Phi Điệp Tím Hịa Bình thuộc rễ bì sinh, xung quanh rễ thật đƣợc
bao bọc bởi một lớp mô xốp giúp cây dễ dàng hút nƣớc, muối khoáng và ngăn
chặn ánh sáng mặt trời gay gắt. Chóp rễ có màu xanh lá cây, ở phần rễ có các
sắc lạp khơng bị ngăn bởi mơ xốp nên có thể giúp cây quang hợp [13].
Hoa: Bên trong hoa có cột nhị nhụy nằm chính giữa hoa, mang phần đực
ở phía trên và phần cái ở phía trƣớc mặt. Nhị gồm hai phần bao phấn và hốc
phấn. Bao phấn nằm ở cột nhị nhụy cịn hốc phấn thì lõm lại mang khối phấn và
thƣờng song song với bao phấn. Khối phấn gồm tồn bộ hạt phấn dính lại với
nhau, rất cứng [13].
1.1.4. Phân bố
Phi điệp tím có xuất xứ ở nhiều nơi đặc biệt là Đông Nam Á nhƣ: Lào,
Campuchia, Thái Lan [17].
Tại Việt Nam có ở các tỉnh nhƣ Cao Bằng, Hịa Bình, Phú Thọ, Thanh
Hóa, Tây Ninh…Tuy nhiên, tùy vào xuất xứ mà Phi điệp tím mang đặc trƣng

riêng. Đặc biệt, Phi điệp tím Hịa Bình có hình dạng, màu sắc, hƣơng thơm và vẻ
đẹp độc đáo riêng biệt so với phi điệp khác bởi cánh hoa to hơn, màu sắc và
hƣơng thơm đặc biệt [17].
1.1.5. Một số điều kiện sinh thái
1.1.5.1. Ánh sáng
Phi điệp tím là cây ƣa sáng nên có thể trồng nơi có nhiều ánh sáng nhƣng
khơng nên phơi dƣới thời tiết nắng nóng cả ngày, dễ có thể bị cháy lá non. Tốt
nhất nên có thêm một lớp lƣới che bảo vệ cây, giúp cây hấp thụ đủ lƣợng ánh
sáng cần thiết mỗi ngày. Cây trồng không nên ở chỗ râm quá, cây sẽ quặt quẹo,
4


lá xanh sẫm, thân lá còi nhỏ. Nhất là vào mùa đơng, nếu thiếu nắng cây khó lịng
ra hoa.
1.1.5.2. Nhiệt độ
Lan Phi điệp tím chịu nóng và chịu lạnh rất tốt. vào mùa nóng cây có thẻ
chịu đƣợc nhiệt độ lên đến 38 độ C, còn vào mùa lạnh cây có thể chịu đƣợc
nhiệt độ xuống thấp đến mức 3,3 độ C. Tuy nhiên, vào mùa đông nếu nhiệt độ
không lạnh dƣới 15-16 độ C kéo dài trong khoảng 4-6 tuần lễ thì giả hạc khó
lịng ra nụ.
1.1.5.3. Độ ẩm và độ thơng thống
Phi điệp tím cũng cần nhiều độ ẩm vào thời điểm các thân non phát triển.
Độ ẩm thơng thƣờng khoảng 60 – 70%. Lồi này cũng thích sống trong điều
kiện thống gió vậy nên ghép vào dớn bảng, ghép gỗ rất thích hợp, dáng cây
thịng xuống, bng hoa rất đẹp và lại an tồn, thống, đỡ sợ úng, nấm
1.1.5.4. Lượng nước
Nƣớc là điều kiện cần thiết cho sự phát triển của lan, việc tƣới nƣớc đúng
cách sẽ giúp cây sinh trƣởng ổn định và ra hoa đều. Vào mùa hè khi lan ra mầm
non và mọc mạnh cần tƣới 2-3 lần một tuần. Vào mùa thu, khi cây đã ngừng
tăng trƣởng, nên tƣới nƣớc thƣa đi, mỗi tuần chỉ cần tƣới 1 lần cho thân cây khỏi

bị teo lại. Vào mùa đông, đây là thời gian lan chuẩn bị để ra hoa, ngừng hẳn việc
tƣới nƣớc. Nếu độ ẩm quá thấp nên phun sƣơng mỗi tháng 1-2 lần.
1.1.5.5. Dinh dưỡng
Phi điệp tím cũng yêu cầu một lƣợng dinh dƣỡng nhất định để sinh
trƣởng và phát triển. Các thành phần dinh dƣỡng nhƣ: N –P – K và các nguyên
tố trung và vi lƣợng. Sử dụng phân NPK tỷ lê: 10-30-20 nồng độ 3g/l định kỳ 1
tuần một lần. Khoảng 2 tháng trƣớc khi phi điệp tím ra hoa, phun NPK 15-20-25
nồng độ 2g/l 1 tuần một lần, đến khi hoa tàn thì dừng bón phân

5


1.1.6. Giá trị sử dụng
1.1.6.1. Giá trị thẩm mỹ
Lan Phi điệp tím Hịa Bình đƣợc mệnh danh là món trang sức đẹp nhất mà
thiên nhiên ƣu đãi ban tặng cho lồi ngƣời. Màu sắc hoa quyến rũ, trên cánh có
phủ lơng mịn và có ánh kim, trên lƣỡi thƣờng có hai mặt tím đậm với hƣơng
thơm ngào ngạt và lâu tàn (2 – 3 tuần lễ). Thân cao khỏe và rất siêng hoa, một
giả hành một lúc có thể cho rất nhiều phát hoa. Chính vì lẽ đó, Phi điệp tím Hịa
Bình thƣờng đƣợc con ngƣời dùng để thƣởng lãm vẻ đẹp hay làm cảnh, trang trí,
làm đẹp khơng gian sống [13], [17].
1.1.6.2. Giá trị kinh tế
Khác với các dòng lan phi điệp khác, Phi điệp tím Hịa Bình mang lại giá
trị kinh tế khá cao bởi sự đẹp lạ và độc đáo của nó. Phi điệp tím Hịa Bình đã
chiếm một vị trí quan trọng điểm tơ trong các trong các hội nghị, đám cƣới, bàn
tiệc hay trang trí cơ dâu … [2].
Phi điệp tím Hịa Bình đƣợc khai thác và bán với giá khá cao. Năm 2017,
giá lan phi điệp tím phổ biến trong khoảng từ 1,2 triệu cho đến 1,5 triệu thậm chí
bán với giá 1,8 triệu/kg phi điệp tím. Năm 2019 giá lan Phi điệp tím tính theo kg
vào khoảng 6-7 triệu/kg.

Ngồi ra, lan Phi điệp tím Hịa Bình cịn đƣợc dùng để chiết suất tinh dầu
thơm dùng trong cơng nghiệp hóa mỹ phẩm (nƣớc hoa) mang lại giá trị kinh tế
cho con ngƣời [2].
1.1.6.3. Giá trị y học
Ngoài giá trị làm cảnh, lan Phi điệp tím Hịa Bình cịn có giá trị làm thuốc
mà ít ai biết đƣợc trong điều trị nhiều bệnh về da, suy nhƣợc cơ thể, suy nhƣợc
thần kinh, đau họng, thiểu năng sinh dục nam giới, và tăng cƣờng sức đề kháng
cho cơ thể….
1.1.7. Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào:
1.1.7.1. Giới thiệu về kĩ thuật lớp mỏng tế bào:

6


Phƣơng pháp cấy lát mỏng tế bào (TCL) (Jaime, 2003), có nguồn gốc
cách đây gần 30 năm với việc khảo sát sự sinh trƣởng phát triển ở hoa, rễ, cành
và phôi soma trên cây thuốc lá [7].
Lớp mỏng tế bào là những mẫu cấy có kích thƣớc nhỏ, đƣợc cắt ra từ các
cơ quan thực vật nhƣ thân, lá, rễ, hoa, các bộ phận của hoa…Có hai loại lớp
mỏng tế bào:
- Nếu cắt theo chiều dọc (lTCL: longitudinal thin cell layer) ta đƣợc mẫu
cấy chỉ bao gồm 1 loại tế bào nhƣ lớp đơn của tế bào biểu bì hoặc một vài
lớp của tế bào vỏ.
- Nếu cắt theo chiều ngang (tTCL: transverse thin cell layer) ta đƣợc mẫu
cấy bao gồm nhiều loại tế bào nhƣ biểu mô, vỏ, vùng thƣợng tầng, mô
mạch cũng nhƣ nhu mô…
Sự phát triển và biệt hóa của các tế bào thực vật đều bị chi phối bởi
chƣơng trình điều khiển sự biệt hóa và phát sinh hình thái của cơ thể thực
vật. Nếu cắt mô thành những lớp mỏng chừng vài lớp tế bào và đặt vào
mơi trƣờng ni cấy thích hợp thì chúng có thể thốt khỏi sự ức chế và có

khả năng phát sinh hình thái một cách độc lập thơng qua sự tái lập trình
các thơng tin di truyền trong tế bào [7].
1.1.7.2. Ƣu điểm của kĩ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào:
Mẫu cấy tiếp xúc trực tiếp với môi trƣờng và diện tích tiếp xúc của mẫu
với mơi trƣờng lớn nên mẫu dễ dàng hấp thu các chất dinh dƣỡng từ môi trƣờng
[11].
Dễ định vị cho vùng phản ứng do chỉ có 1 loại lớp mỏng tế bào.
Lƣợng hormone nội sinh trong mẫu thấp vì thế các chất điều hòa sinh
trƣởng thực vật dễ tác động lên mẫu.
Hệ thống TCL có sự hình thành nhiều loại cấu trúc, có những cấu trúc
mới.

7


Mẫu ni cấy đồng nhất và nhanh chóng đáp ứng các phản ứng. Từ đó,
rút ngắn thời gian nghiên cứu và chƣơng trình biệt hóa riêng biệt tùy vào mục
tiêu và mục đích nghiên cứu.
Phơi và các cơ quan sơ khởi đƣợc hình thành ở tần số cao (là do số lƣợng
tế bào đƣợc cảm ứng phát sinh hình thái cao).
Nâng cao năng suất chuyển gen thực vật, tiềm năng tái sinh cao và mở
rộng ra cho các lồi khó tái sinh góp phần cải thiện giống thực vật.
Tạo ra thực vật hồn chỉnh, ít bị biến đổi.
Khơng xảy ra sự tƣơng tác giữa các cơ quan và giữa cơ quan với toàn bộ
cơ thể thực vật [11].
1.1.8. Những nghiên cứu về nhân giống in vitro chi Dendrobium:
1.1.8.1. Trên thế giới:
Urvashi Sharma và cộng sự (2006) đã xây dựng quy trình nhân giống vơ
tính Dendrobium microbulbon A. Rich đƣợc kết luận nhƣ sau: Môi trƣờng cơ
bản Murashige và Skoog (MS) đƣợc bổ sung với các nồng độ khác nhau của

auxin và cytokinin có thể sử dụng một mình hoặc kết hợp để tạo cảm ứng, nhân,
kéo dài và tạo rễ của chồi in vitro. Môi trƣờng MS đƣợc tăng cƣờng với 3%
sucrose, 7,5 mg/l (IAA) và 20 mg/l (BAP) bắt đầu xuất hiện chồi nách. Môi
trƣờng MS với 2,0 mg/l BAP tạo ra số lƣợng chồi tối đa (39 chồi),và sự phát
triển của chồi. Chồi in vitro đƣợc bắt nguồn từ Knop với vitamin và muối sắt.
Trong q trình thích nghi, 60% số cây con đã sống sót sau khi đƣợc đƣa ra khỏi
điều kiện in vitro.
M. Maridass và cộng sự (2010) đã xây dựng quy trình nhân giống in vitro
Dendrobium nanum Hook. F từ chồi thân rễ thu đƣợc kết quả sau: Tỷ lệ cảm
ứng mô sẹo tối đa thu đƣợc trên mơi trƣờng MS với 2,0 µM/l NAA và 1,2 µM/l
kinetin. Hiệu quả tối đa của cảm ứng chồi (15,78 ± 0,37mm) đƣợc quan sát thấy
trên môi trƣờng cơ bản đƣợc bổ sung 0,5 µM/l BAP. Khi đƣa ra mơi trƣờng
sống tự nhiên của chúng có 85% tỷ lệ sống sau 3 tháng.

8


Sana Asghar và cộng sự (2011) đã nghiên cứu nhân giống in vitro loài lan
Dendrobium nobile var. Emma white đƣa ra kết luận nhƣ sau: Môi trƣờng MS
đƣợc bổ sung 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 và 3,0 mg/l của BAP và Kinetin, nƣớc dừa
(CW) ở mức 50 , 100, 150, 200, 250 và 300 ml. Ở mức 2 mg/l BAP số lƣợng
chồi tối đa (4,33), trọng lƣợng tƣơi và khô (752,5 và 52,99 mg), tại 1,5 mg/l Kin
có chiều dài chồi cao nhất (4,18 cm). Nồng độ BAP, Kin (3.0 mg/l) và nƣớc dừa
(300 ml) cao hơn dẫn đến vàng, chồi hoại tử và tăng trƣởng kém. Hai chất auxin
đƣợc sử dụng là IBA và NAA ở các nồng độ khác nhau (0,5, 1,0, 1,5, 2.0, 2.5 và
3.0 mg/l) trên môi trƣờng MS. Ta thấy, IBA ở mức 2 mg/l tăng tỷ lệ ra rễ
(97,5%) số rễ (4,70) và chiều dài rễ (3,47 cm) hiệu quả hơn NAA. Nồng độ IBA
và NAA cao hơn 3.0 mg/l cho thấy kết quả ra rễ kém.
A N Pyati và cộng sự (2002) đã nghiêm cứu thành cơng quy trình nhân
giống in vitro của Dendrobium macrostachyum Lindl đƣợc kết luận nhƣ sau:

Môi trƣờng nuôi cấy cơ bản MS đƣợc bổ sung thêm BAP (2,22, 4,44 và 8,88
µM), Kinetin (2,32, 4,65 và 9,29 µM), và nƣớc dừa (5,10 và 15%) riêng lẻ hoặc
kết hợp với 2,69 µM NAA. Mơ sẹo đƣợc tạo ra trực tiếp từ mơi trƣờng có bổ
sung BAP, Kinetin, nƣớc dừa. Số chồi tối ƣu 6 chồi/mẫu và mô sẹo đƣợc tạo ra
trên môi trƣờng bổ sung 15% nƣớc dừa. Chồi rễ phát triển trung bình 5 rễ/chồi.
S. S. Riva và cộng sự (2016) đã nghiên cứu quy trình tái sinh và nhân
nhanh in vitro của Dendrobium bensoniae đƣợc kết luận nhƣ sau: Tái sinh trên
mơi trƣờng MS có bổ sung 2 mg/l BAP là tốt nhất, tốt hơn nồng độ khác của
BAP và BAP + IBA trong nghiên cứu. Số lƣợng chồi và lá cao nhất tại 1,0 mg /l
BAP + 1,5 mg /l IBA đƣợc bổ sung vào môi trƣờng MS. Đối với rễ, 0,5 mg /l
BAP + 1,0 mg /l IBA đƣợc tìm thấy là hiệu quả nhất. Các cây con có rễ tốt đã
đƣợc thích nghi thành cơng dƣới độ ẩm 70-80% .Sau khoảng thời gian trồng, có
85% cây con sống sót.
1.1.7.2. Tai Việt Nam
Nguyễn Văn Việt (2017) đã nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy in vitro thành
công trong vi nhân giống lan Hoàng Thảo kèn (Dendrobium lituiflorum Lindley)

9


thu đƣợc kết quả: Sát khuẩn bề mặt quả lan bằng ethanol 70% trong 1 phút, khử
trùng bằng dung dịch Hgcl2 0,1% trong 12 phút và nuôi cấy trên môi trƣờng
Knops, cho tỷ lện mẫu sạch là 86,7%, tỷ lệ mẫu phát sinh thể chồi (protocom) là
76,7%, với thời gian phát sinh chồi 5 tuần. Cảm úng tạo đa chồi trên môi trƣờng
BAP 0,8 mg/ml, Kinetin 0,3 mg/ml, MAA 0,1mg/ml, dịch chiết khoai tây
100ml/l, nƣớc dừa 100ml/l, sucrose 30g/l, agar 5g/l cho hệ số nhân chồi cao nhất
10,3 sau 5 tuần nuôi cấy. Chồi ra rễ 100% với số rễ trung bình 4,8 rễ/cây và
chiều dài rễ trung bình 3,6 cm khi nuôi trên môi trƣờng Knops bổ sung IBA 0,2
mg/l, NAA o,3 mg/l, dịch chiết khoai tây 100ml/l, sucrose 20g/l sau 5 tuần ni
cấy. Cây con hồn chỉnh đƣợc huấn luyện và chuyển ra trồng trên giá thể dớn

trắng, xử lý giá thể 2 ngày trong nƣớc, cho tỷ lệ sống 89%.
Nguyễn Quỳnh Trang và cộng sự (2013) đã xây dụng thành cơng quy trình
tạo cây con bằng kỹ thuật ni cấy in vitro lan Phi Điệp Tím (Dendrobium
anosmum) từ nguồn vật liệu ban đầu là quả Lan Phi điệp tím đƣợc kết quả nhƣ
sau: Quả lan đƣợc khử trùng bề mặt bằng HgCl2 0,1% trong 7 phút và khử trùng
bằng NaOCl 5% trong 15 phút cho tỷ lệ mẫu sạch đạt và lỷ lệ mẫu sạch tái sinh
cao nhất. Mơi trƣờng Knuds có bổ sung 0,3 mg/l NAA + 0,3 mg/l BAP cho hệ số
nhân nhanh thể chồi đạt 5,8 lần/3 tuần, chất lƣợng thể chồi tốt. Sau 4 tuần, công
thức bổ sung 30g/l sucrose + 0,5 mg/l GA3 + 0,1 mg/l Kinetin chồi tăng trƣởng tốt
nhất (2,45 cm), chất lƣợng chồi tốt. Công thức bổ sung 0,5 mg/l IBA và công thức
0,3 mg/l IBA +0,1 mg/l NAA cho tỷ lệ chồi ra rễ đạt trên 3 rễ/chồi, chất lƣợng rễ
tốt. Khi cây có chiều cao > 4 cm, có 3 – 4 rễ ta đem bình cây ra huấn luyện ở điều
kiện tự nhiên 1 tuần, rửa sạch thạch, đƣa cây ra trồng trên giá thể.
Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Thị Lý Anh (2013) đã nghiên cứu nhân giống in
vitro loài lan bản địa Dendrobium nobile lindl (Thạch Hộc) và đƣa ra kết luận:
Nguyên liệu sử dụng thích hợp là quả lan 5 tháng tuổi, môi trƣờng gieo hạt là
MS + (100ml nƣớc dừa + 10g sucrose + 6,0g agar)/lít mơi trƣờng. Trong nhân in
vitro kinh điển, mơi trƣờng nhân nhanh protocorm tối ƣu là KC+ (100ml nƣớc
dùa + 10g sucrose + 6,0g agar)/lít, nhân nhanh cụm chồi tốt nhất là MS+ (100ml
nƣớc dừa + 10g sucrose + 6,0g agar)/lít. Trong nhân in vitro cải tiến: ni cấy
10


lỏng lắc nút bơng và lỏng lắc màng thống khí đã tăng hệ số nhân protocorm đạt
1,9 và 2,3 lần so với nhân in vitro kinh điển. Nuôi cấy đặc thống khí giúp giảm
25% lƣợng saccharose bổ sung vào mơi trƣờng và tăng hệ số nhân protocorm
lên gấp 1,4 lần so với nuôi cấy kinh điển. Nhân nhanh cụm chồi bằng kỹ thuật
bioreactor giảm 1/2 thời gian nhân giống.
Nguyễn Thị Lý Sơn và cộng sự (2014) đã xây dựng môi trƣờng nhân
giống in vitro Lan Dendrobium officinle Kimura et Migo (Thạch hộc Thiết Bì)

kết quả chỉ ra nhƣ sau: Nhân giống bằng gieo hạt trên môi trƣờng (VW+ 10g
sucrose + 6g agar + 100ml nƣớc dừa)/lít mơi trƣờng, nhân nhanh cụm chồi tốt
nhất trên môi trƣờng (MS + 100ml nƣớc dừa + 20g sucrose + 6g agar + 60g
chuối chín)/lít mơi trƣờng. Nhân giống vơ tính thơng qua ni cấy đoạn thân
mang mắt ngủ sử dụng đoạn thân in vitro mang 2 mắt ngủ và nuôi cấy trên môi
trƣờng (MS + 20g sucrose + 10% nƣớc dừa + 0,5 mg/l BA + 0,5mg/l NAA + 6g
agar)/lít mơi trƣờng.
Vũ Kim Dung và cộng sự (2016) đã xây dựng thành công quy trình nhân
giống lan Hồng Thảo Ý thảo ba màu (Dendrobium gratiosissimun Reichenb.f)
bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro kết quả nghiên cứu cho thấy: Sát khuẩn bề mặt
quả lan bằng ethanol 70% trong 2 phút, khử trùng bằng dung dịch Hgcl2 0,1%
trong 10 phút và nuôi cấy trên môi trƣờng MS bổ sung sucrose 30g/l cho tỷ lệ
mẫu sạch là 96,67% tỷ lệ mẫu phát sinh protocom 90% với thời gian phát sinh
chồi 20 ngày. Cảm ứng tạo đa chồi trên môi trƣờng BAP 0,5 mg/l, NAA 0,3
mg/l, Kinetin 0,3 mg/l, dịch chiết khoai tây 100mg/l, nƣớc dừa 100mg/l, sucrose
30g/l, cho hệ số nhân chồi và tỷ lệ mẫu tái sinh chồi cao nhất (9,53 và 96,67%)
sau 4 tuần nuôi cấy. Chồi ra rễ 93,33% và chiều dài rễ trung bình 3,22 cm khi
ni cấy trên mơi trƣờng MS bổ sung IBA 0,2 mg/l, NAA 0,3 mg/l, dịch chiết
khoai tây 100 ml/l, sucrose 20g/l sau 5 tuần nuôi cấy.
Vũ Thanh Sắc và cộng sự đã xây dựng quy trình nghiên cứu nhân giống in
vitro lan Hoàng Thảo Trám Trắng (Dendrobium anosmum var. alba) đƣợc kết
luận nhƣ sau: Nguyên liệu sử dụng cho nuôi cấy là protocom và cây con sau
11


gieo hạt. Các thí nghiệm đƣợc tiến hành trên mơi trƣờng rắn. Cây con in vitro
đƣợc cấy trên môi trƣờng khống thích hợp có bổ sung 20 g/l sucrose, 10g/l
agar, chất kích thích sinh trƣởng và các chất hữu cơ. Mơi trƣờng thích hợp cho
nhân nhanh và sinh trƣởng là ½ MS + 20 g/l sucrose + 10g/l agar + 1,5 mg/l
kinetin + 120 g/l chối xanh nghiền + 10% nƣớc dừa + 1 g/l than hoạt tính. Cụm

cây ni cấy gồm 5 cây sẽ thích hợp cho sự sinh trƣởng của cây con in vitro.
1.1.9. Những nghiên cứu về nhân giống bằng phương pháp cắt lát mỏng
1.1.9.1. Trên thế giới
Nararatn Wattanapan và cộng sự (2018) đã đã xây dựng quy trình nhân
giống Lan Paphiopedilum callosum var. sublaeve (họ phong lan) bằng lát mỏng
ngang (tTCL) đƣợc rút ra kết luận sau: Nuôi cấy hạt giống 2 tuần trong nƣớc cất
trƣớc khi chuyển sang môi trƣờng MS là điều kiện tối ƣu để thúc đẩy hạt nảy
mầm trong ống nghiệm. Các lớp tế bào mỏng ngang (tTCL) đƣợc nuôi cấy trên
môi trƣờng rắn MVW chứa 1,0 mg/l TDZ trong 8 tuần cung cấp tỷ lệ protocorm
– like bodies (PLBs) đƣợc tái sinh cao nhất (46,67 ± 6,67), sự hình thành chồi
(40,00 ± 5,16), sự hình thành rễ (30,00 ± 12,38) và tỷ lệ sống (70,00 ± 4,47).
Các cây trồng thích nghi trong nhà kính tăng trƣởng tốt với tỷ lệ sống 80%.
Ravindra B. Malabadi và cộng sự (2008) đã xây dựng quy trình vi nhân
giống của Eria dalzelli (Dalz.) Lindl bằng lát mỏng tế bào đƣợc kết luận sau:
Protocom – like bodies (PLBs) quan sát thấy khi cắt lát mỏng ngang chóp chồi
và đƣợc nơi cấy trên mơi trƣờng Mitra et al (1976) mơi trƣờng cơ bản có bổ
sung 9,08 µM TDZ cho tỷ lệ sống cao nhất của protocom – like bodies là 96%,
tạo ra chồi khỏe với 2 -3 lá. Rễ đƣợc tạo ra trên môi trƣờng cơ bản bổ sung với
11,42 µM IAA.Cây con sinh trƣởng bình thƣờng với tỷ lệ sống 96%.
Shivani Vyas và cộng sự (2010) đã nghiên cứu quy trình ảnh hƣởng của
nƣớc (CW) dừa đến vi nhân giống Cymbidium Sleeping Nymph thông qua
protocom – like bodies (PLBs) bằng lớp mỏng tế bào đƣợc kết quả: Cắt lớp
mỏng ngang tế bào (tTCL) của Cymbidium Sleeping Nymph trong 2 giai đoạn
PLBs (30 ngày và 60 ngày tuổi) và đƣợc bổ sung nƣớc dừa. Với 5% nƣớc dừa
12


đƣợc bổ sung vào môi trƣờng KC tạo ra 5 protocom – like bodies (PLBs) trên
mỗi tTCL của 30 ngày tuổi PLBs đạt tỷ lệ là 83%. Một tỷ lệ thấp các tTCL đƣợc
quan sát thấy trong 60 ngày của PLBs. Tỷ lệ tái sinh chồi cao đáng kể thu đƣợc

từ các PLBs đƣợc hình thành trên 1 - 10% CW từ các tTCL của PLBs trong 30
ngày tuổi so với PLBs trên mơi trƣờng KC (khơng có CW). Các PLBs cảm ứng
đƣợc tái sinh thành cây con có rễ mềm và những cây con này đã đƣợc chuyển
đến điều kiện nhà kính có tỷ lệ sống gần 100%.
1.1.9.2. Tại Việt Nam
Nguyễn Văn Việt (2017) đã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng trong
nhân giống in vitro của Chirysanthemum indicum và đƣa ra kết luận: Khử trùng
bằng dung dịch HgCl2 trong 6 phút và cấy trên môi trƣờng MS có bổ sung 0,5
mg/l BAP, 0,2 mg/l NAA, 30g/l đƣờng, 7 g/l agar. Mẫu ni cấy có tỷ lệ sống
đạt 81%, chồi đƣợc tạo ra sau 4 tuần nuôi cấy. Mô sẹo đƣợc cảm ứng và tái sinh
chồi trên môi trƣờng MS với 0,5 mg/l BAP, 0,2 mg/l kinetin, 0,2 mg/l NAA đã
thu đƣợc với 82,2% và 80% tƣơng úng. Trung bình sau 20 ngày chồi đƣợc tạo
ra. Trên mơi trƣờng MS có bổ sung 0,5 mg/l BAP, 0,2 mg/l kinetin , 0,1 mg/l
NAA tạo đa chồi đạt 4,31 và chiều dài dài chồi 4,91 cm. Chồi tạo ra xanh và
khỏe mạnh. Tỷ lệ ra rễ cao nhất là 97,78% thu đƣợc trên môi trƣờng MS với 0,2
mg/l IBA, 0,3 mg/l NAA và chiều dài chồi là 6,97 cm sau 4 tuần nuôi cấy.
Nguyễn Thị Thúy Diễm (2015) đã xây dựng quy trình nhân giống cây Đại
Hồng Mơn (Anthurium andreanum L.) bằng phƣơng pháp nuôi cấy lớp mỏng tế
bào đƣợc đƣa ra nhƣ sau: Các mẫu cấy của cây Đại hồng môn in vitro bao gồm
lá non, cuống lá và đoạn thân đƣợc ni cấy trong mơi trƣờng MS có bổ sung 15
% nƣớc dừa, 30 g/l đƣờng, 7 g/l agar và các chất điều hòa sinh trƣởng nhƣ BA,
TDZ, 2,4 – D, NAA ở các nồng độ khác nhau. Mơi trƣờng thích hợp tạo mơ sẹo
từ lá là MS bổ sung 0,5 mg/l BA với 0,1 mg/l 2,4- D, cuống lá là MS bổ sung
0,5 mg/l 2,4-D với 0,5 mg/l TDZ, đoạn thân là MS bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D với
1,0 mg/l TDZ. Môi trƣờng để tạo chồi là MS bổ sung 0,5 mg/l NAA với 1,0
mg/l TDZ, môi trƣờng nhân chồi là MS bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D với 0,2 mg/l

13

TDZ đạt 17,4 chồi. Môi trƣờng tạo rễ là MS bổ sung 15 mg/l Putrescine. Thuần
dƣỡng cây Đại hồng môn in vitro với giá thể tro trấu + mụn dừa (1:1) cho tỷ lệ
sống cao.
Vũ Thị Hiền và cộng sự (2015) đã ứng dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy
lớp mỏng tế bào trong nghiên cứu quá trình phát sinh hình thái của cây Sâm
Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro đƣợc đƣa ra nhƣ sau:
Mẫu đƣợc nuôi cấy trên mơi trƣờng MS có bổ sung 30 g/l sucrose, 8 g/l agar,
các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật (NAA, 2,4-D, BAP và TDZ riêng lẻ hoặc
kết hợp). Sau 10 tuần nuôi cấy, mẫu lá tTCL_L, mẫu thân rễ tTCL_R đều cho sự
phát sinh phôi, mô sẹo, rễ, trong khi mẫu cuống lá tTCL_C chỉ cho sự phát sinh
mơ sẹo và rễ. Trong đó, tỷ lệ phát sinh phôi cao nhất (89,6%), tỷ lệ phát sinh mô
sẹo cao nhất (91 - 98,8%), tỷ lệ phát sinh rễ cao nhất (98,8%) đã đƣợc ghi nhận
tƣơng ứng khi mẫu lá tTCL_L đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng bổ sung 2,0 mg/l
NAA và đƣợc đặt dƣới điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày, lá tTCL_L, cuống lá
tTCL_C, lTCL_C, thân rễ tTCL_R đƣợc ni cấy trên mơi trƣờng có bổ sung
2,4-D kết hợp với BAP dƣới điều kiện chiếu sáng giờ/ngày, điều kiện tối hồn
tồn, mơi trƣờng có bổ sung 1,0 mg/l NAA đặt trong điều kiện tối hoàn toàn.
Điều kiện chiếu sáng có tác động đáng kể lên khả năng phát sinh hình thái của
mẫu cấy. Việc sử dụng đèn huỳnh quang chiếu sáng 16 giờ/ngày phù hợp cho
khả năng phát sinh phơi của mẫu cấy, những phơi thu đƣợc có dạng hình cầu,
hình tim, hình thủy lơi và cả dạng lá mầm. Ngƣợc lại, điều kiện tối lại kích thích
sự hình thành rễ và mô sẹo tốt hơn. Rễ thu đƣợc có màu trắng đục, có phân
nhánh, trong khi mơ sẹo lại xốp và có màu vàng nhạt.
Bùi Văn Lệ và Trần Nguyên Vũ (2003) đã úng dụng thành công kỹ thuật
nuôi cấy lát mỏng tế bào trên cây điều (Anacardium cccidentale L.) kết luận nhƣ
sau: Môi trƣờng nuôi cấy là MS có bổ sung vitamin, 30g/l sucrose, 7 g/l agar, 2
mg/l glycine, 100 mg/l m – Inositol. Khử trùng bằng dung dịch Tween 20 nồng
độ 3% trong 3 phút, sau đó khử trùng bằng Hgcl 2 trong 20 phút, tráng nƣớc cất 3
- 4 lần. Tỷ lệ nảy mầm là 96%. Cắt lát mỏng vùng đốt thân cho sự tạo chồi tốt và
khơng dùng than hoạt tính hay chất chống oxy hóa. Nồng độ BAP thích hợp tạo

14


chồi là 5mg/l đạt 16 – 17,3 chồi/lát cắt ngang vùng đốt thân và 16,1 chồi/lát cắt
mỏng dọc vùng tử diệp nhƣng ở cùng nồng độ BAP 5 mg/l và 2 mg/l acid
ascorbic lát mỏng tế bao thấp hơn chỉ đạt 5 chồi/lát. Cây con ra rễ tốt ở nồng độ
0,5 mg/l NAA và 1 mg/l IBA , tỷ lệ sống 100%
Trần Nguyên Chất và cộng sự (2017) đã tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng
của 2,4 – D và kiểu cắt lớp mỏng tế bào đến sự hình thành và phát triển mô sẹo
ở cây gấc (Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng) đƣợc kết quả nhƣ sau:
Thân cây Gấc đƣợc cắt lát mỏng ngang và cắt lát mỏng dọc dài 3 – 5 mm và dày
0,5 – 1 mm. Cấy trên môi trƣờng MS có 30 g/l sucrose, 8 g/l agar, 2,4 – D với
nồng độ lần lƣợt là: 0,5, 1,0, 1,5, 2 mg/l. Sau 21 ngày nuôi cấy tất cả các kiểu cắt
lát mỏng đều hình thành mơ sẹo chiếm 100%. Tuy nhiên ở kiểu cắt ngang kết
hợp với nồng độ 2,4 - D ở mức 1,5 mg/l có khả năng hình thành, phát triển và
cho chất lƣợng mơ sẹo tốt nhất.
1.1.10. Những nghiên cứu về nhân giống bằng phương pháp cắt lát mỏng chi
Dendrobium
1.1.9.1 Trên thế giới :
S.Parthibhan (2018) đã nghiên cứu tạo phôi soma từ lớp tế bào mỏng của
Dendrobium aqueum đƣa ra kết quả sau: Các tTCL (dày 0,5 mm) có bổ sung
cytokinin và auxin để tạo mơ sẹo. với 0,5 mg/dm3 zeatin tạo mô sẹo chiếm
41,42% tTCLs. 42,66 phơi soma đƣợc hình thành từ 1,5 mg/dm3 N6- (2isopentyl) adenine (2iP) nhƣng chỉ chiếm 10,33% tế bào. Sự kết hợp của 2iP
(1,5 mg/dm3) và 0,5 mg/dm3 6-benzyladenine tạo 34 phôi soma chiếm14,7%
tTCLs trong khi kết hợp của 2iP và 1,0 mg/dm3 indole-3-butyric acid (IBA) tạo
7,4 phôi soma chiếm 2,33% tTCLs. Bổ sung than hoạt tính, axit amin và chất
chống oxy hóa làm giảm bớt màu nâu ở tất cả các nồng độ đƣợc thử nghiệm
nhƣng phản ứng tạo phôi soma giảm. Việc bổ sung 0,5 mg/dm3
polyvinylpyrrolidone vào 1,5 mg/dm3 2iP và 1,0 mg/dm3 IBA tạo ra 24 phôi
soma trên 19,89% tTCLs cho thấy rằng mô sẹo và phôi soma có thể đƣợc tạo ra

một cách hiệu quả bởi các cytokinin. Các cây con thu đƣợc qua phôi soma
15


khơng cho thấy có biến đổi hình thái và cấu hình cũng xác nhận tính trung thực
di truyền của in vitro có nguồn gốc con cháu có tính đơn hình cao (97,78%).
Peng Zhao và cộng sự (2007) đã tái sinh thành công Dendrobium
candidum Wall Ex Lindl bằng nuôi cấy lát mỏng ngang tế bào đƣợc kết luận
sau: Hệ số tái sinh chồi và số lƣợng chồi phụ thuộc đáng kể vào nồng độ chất
điều hịa sinh trƣởng. Mơi trƣờng ni cấy MS với các chất dinh dƣỡng đa
lƣợng và 2% sucrose, bổ sung 1,2 mg/l NAA và 1,2 mg/l BAP là tối ƣu để tạo
chồi với tỷ lệ tái sinh chồi chiếm 92% và số lƣợng chồi trung bình là 24,5. Sự ra
rễ của chồi thành công trên môi trƣờng MS, các chất dinh dƣỡng đa lƣợng và
2% sucrose, 1mg/l NAA và 1 mg/l IAA với tỷ lệ sống của cây chiếm 95%.
Lucas Roberto Pereia Gomes và cộng sự (2015) đã nghiên cứu phƣơng
pháp nhân giống in vitro cho Brasilidium forbesii (Hook.) bằng lớp mỏng ngang
và dọc (tTCL và lTCL) đƣợc kết quả sau: Lát cắt mỏng protocom 1mm (từ hạt
nảy mầm), đƣợc cấy trên môi trƣờng Woody Plant Medium (WPM) đƣợc bổ
sung với BAP (0,5 – 4 µM). Sự hình thành protocom - like bodies (PLBs) bị ảnh
hƣởng bởi nồng độ BAP và lát cắt dọc (lTCL) trên môi trƣờng chứa 2 µM BAP
tạo ra tỷ lệ cao nhất protocom chiếm (77%) với 22,7 PLBs. Sự phát triển của cây
con là tối ƣu trên môi trƣờng WPM chứa 3,0 g/l than hoạt tính, và axit indole-3butyric khơng cần thiết cho sự ra rễ. Cây tái sinh đã đƣợc thích nghi thành cơng
trong nhà kính sau 16 tuần tỷ lệ sống 100%.
Nitramol Rangsatorn (2009) đã nghiên cứu quy trình nhân giống lan
Dendrobium draconis Rchb.f. bằng cắt mỏng ngang đƣợc kết luận nhƣ sau: Môi
truƣờng nuôi cấy MS đƣợc bổ sung 20 g/l sucrose, nồng độ khác nhau của BAP
và Kinetin, NAA riêng lẻ hoặc kết hợp. Protocom – like bodies (PLBs) từ lát cắt
đã nuôi cấy và phát triển thành chồi trong vòng 6 -7 tuần. Sự kết hợp tối ƣu của
điều hòa sinh trƣởng phát triển tối đa PLBs là 2 mg/l BAp và 1,0 mg/l NAA,
làm tăng 68% cấy đáp ứng với mức trung bình của 11 PLBs mỗi mẫu cấy. Mơi

trƣờng MS có chứa sucrose và nƣớc dừa đƣợc phát triển tốt nhất. Cây con, 6-8
cm đƣợc cấy vào than bùn, dừa trấu với tỷ lệ sống 92% trong một vƣờn ƣơm.
16


1.1.9.2. Tại Việt Nam
Phạm Văn Lộc, Lê Thị Hoài Thƣơng (2016) đã xây dựng thành cơng quy
trình nhân giống in vitro Lan Hoàng Thảo Kèn (Dendrobiumm lituiflorun Lindl)
bao gồm phát sinh PLBs từ chồi, tái sinh chồi, tạo rễ. Chồi in vitro đƣợc nuôi
cấy trên môi trƣờng MS bổ sung TDZ ở các nồng độ khác nhau để phát sinh
protocorm like bodies (PLBs). Ở nồng độ TDZ 2,0 mg/l cho tỷ lệ phát sinh
PLBs cao nhất. Chồi phát sinh tốt nhất trên mơi trƣờng MS có bổ sung TDZ
1,5mg/l. Mơi trƣờng MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l thích hợp để tạo rễ in vitro
Đặng Thị Thắm và cộng sự (2017) đã nghiên cứu thành công vi nhân
giống Lan Nhất điểm hoàng (Dendrobium heterocarpum Lindl.). Kết quả nghiên
cứu cho thấy, mơi trƣờng thích hợp cho sự hình thành PLBs là MS bổ sung 2
mg/l BAP và 1,0 mgl/l NAA (7,11 PLBs/mẫu, 68,9% mẫu tạo PLBs) hoặc môi
trƣờng MS bổ sung 1 mg/l TDZ với 0,5 mg/l NAA (7,29 PLBs/mẫu, 75,53%
mẫu tạo PLBs). Trên môi trƣờng nuôi cấy MS bổ sung 1,5 mg/l BA (20,47
chồi/mẫu, chiều cao chồi 1,96 cm) và mơi trƣờng ni cấy MS bổ sung 60 g
chuối chín/lít (22,40 chồi/mẫu, chiều cao chồi 2 cm) đều phù hợp cho sự sinh
trƣởng và phát triển của chồi nuôi cấy. Mơi trƣờng thích hợp cho sự tạo rễ in
vitro là: 1/2 MS bổ sung 0,5 mg/l NAA (4,4 rễ/chồi, chiều dài rễ 3,12 cm,
95,56% chồi ra rễ). Sau 60 ngày chuyển cây con in vitro ra ngoài vƣờn ƣơm, kết
quả thí nghiệm cho thấy giá thể thích hợp nhất là giá thể dớn (5 rễ/mẫu, chiều
dài rễ 3,4 cm, tỉ lệ sống 97,78%)
Nguyễn Thị Lài và cộng sự (2018) đã nghiên cứu nhân giống thành cơng
Lan Hồng Thảo Nghệ Tâm (Dendrobium loddigesii Rolfe) đƣợc kết quả nhƣ
sau: Nguyên liệu ban đầu là lát cắt mỏng theo chiều ngang (tTCL - traverse thin
cell layer) của chồi in vitro. Kết quả cho thấy, môi trƣờng gây hiệu ứng tối ƣu để

sản sinh protocorm - like bodies là môi trƣờng VW + 20 g/l sucrose + 10% nƣớc
dừa + 7 g/l agar + 1,5 mg/l BAP (tạo ra 30,1 protocorm - like bodies/lát mỏng
sau 6 tuần nuôi cấy). Cụm protocorm - like bodies đƣợc cấy lên môi trƣờng VW
+ 20 g/l sucrose + 10% nƣớc dừa + 7 g/l agar + 1,0 g/l than hoạt tính + 2 g/l
17


peptone + 1,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l IBA + 30 g/l dịch nghiền bí ngơ + 1 g/l tảo
Spirulina cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất, đạt 16,82 chồi/mẫu sau 8 tuần nuôi
cấy. Môi trƣờng cấy chồi in vitro để tạo cây con hoàn chỉnh VW + 20 g/l
sucrose + 10% nƣớc dừa + 7 g/l agar + 1,0 g/l than hoạt tính + 1,0 mg/l IBA là
thích hợp nhất với số rễ đƣợc hình thành là 7,3 rễ/cây sau 6 tuần nuôi cấy.
Nguyễn Thành Tùng (2010) đã áp dụng thành công phƣơng pháp nuôi cấy
lát mỏng tế bào trong nhân giống in vitro cây Lan Hoàng Thảo Thân Gãy
(Dendrobium aduncum) đƣợc kết quả: Nguyên liệu ban đầu là lát cắt mỏng đoạn
thân theo chiều ngang (tTCL – traverse thin cell layer) của chồi in vitro. Các
tTCL đƣợc cảm ứng tạo protocom – like bodies (PLBs) trên môi trƣờng cơ bản
½ MS có bổ sung riêng lẻ BAP hay bổ sung kết hợp BAP Và NAA. Môi trƣờng
tối ƣu cảm ứng protocom – like bodies là môi trƣờng ½ MS có bổ sung 0,5 mg/l
BAP cho 29,85 protocom – like bodies/lát mỏng sau 8 tuần nuôi cấy. Cụm
protocom – like bodies đƣợc cấy lên mơi trƣờng MS có bổ sung TDZ, Kinetin,
MAA riêng lẻ hay kết hợp để tái sinh chồi. Môi trƣờng MS bổ sung 3 mg/l
Kinetin kết hợp với 0,1 mg/l NAA cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất đạt 5,67
chồi/mẫu. Chồi in vitro đƣợc cấy lên mơi trƣờng MS có bổ sung NAA để cảm
ứng tạo rễ. Nồng độ MAA 2,0 mg/l là thích hợp nhất cho việc tạo rễ in vitro với
kết quả 9,18 rễ/chồi. Cây con in vitro tái sinh đầy đủ đƣợc huấn luyện và trồng
lên gia thể, sau 6 tuần lỷ lệ sống đạt 90%.
Huỳnh Hữu Đức và cộng sự (2017) đã xây dựng thành cơng quy trình
nhân nhanh giống lan Dendrobium Caesar White bằng kỹ thuật nuôi cấy lớp
mỏng tế bào và đƣa ra kết quả: Môi trƣờng nuôi cấy bổ sung BAP kết hợp 2,4-D

hay bổ sung riêng lẻ TDZ kích thích tái sinh chồi trong ni cấy lớp mỏng chồi
lan. Môi trƣờng nuôi cấy bổ sung TDZ 0,1 mg/l thích hợp cho q trình tái sinh
chồi từ lớp mỏng chồi lan với 2,8 chồi/mẫu và tỉ lệ mẫu tạo chồi là 79,36%. Môi
trƣờng nuôi cấy bổ sung BA 3,0 mg/l tốt hơn so với môi trƣờng bổ sung BAP
1,0 mg/l kết hợp với NAA 0,5 mg/l đối với sự nhân chồi của cụm chồi từ lát
mỏng. Kết quả tổng hợp quá trình tái sinh chồi từ lớp mỏng và nhân chồi cho
18


thấy mẫu lát mỏng khi nuôi cấy trên môi trƣờng có TDZ 2,0 mg/l và tiếp tục
nhân chồi trên mơi trƣờng có BA 3,0 mg/l kết hợp với NAA 0,5 mg/l tạo đƣợc
số chồi/mẫu cao nhất là 21,13.

19