Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactobacillus ứng dụng trong tạo chế phẩm vi sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi

LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành tốt đƣợc khóa luận tốt nghiệp tại trƣờng đại học Lâm
Nghiệp Xuân Mai – Chƣơng Mỹ - Hà Nội tôi xin chân thành cảm ơn:
Quý thầy (cô) trƣờng đại học Lâm Nghiệp , ban giám hiệu nhà trƣờng đã
tận tình giảng dậy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi về vật chất lẫn tinh thần
trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Gia đình và những ngƣời thân, bạn bè đã giúp đỡ về mọi mặt để tơi hồn
thành đƣợc khóa luận tốt nghiệp này.
Đặc biệt tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Bùi Văn Thắng và Th.S
Nguyễn Thị Hồng Nhung tại viện Công Nghệ Sinh Học trƣờng đại học Lâm
Nghiệp, đã dành nhiều thời gian q báu, tận tình hƣớng dẫn tơi trong suốt thời
gian thực hiện và hồn thành khóa luận tốt nghiệp.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng, do thời gian có hạn và trình độ chun mơn
cịn hạn chế, bản thân mới bƣớc đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học,
nên đề tài không tránh khỏi những thiếu sót. Kính mong q thầy, cơ giáo và
bạn bè đồng nghiệp quan tâm góp ý để đề tài đƣợc hồn thiện hơn.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2018
Sinh viên thực hiện
Đinh Thị Hồng

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ i
MỤC LỤC ............................................................................................................. ii
DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT ............................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................................... v
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................... vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 2
1.1. Tổng quan về probiotic .................................................................................. 2
1.1.1.Lịch sử nghiên cứu probiotic ....................................................................... 2
1.1.2.Vi sinh vật đƣợc sử dụng làm probiotic ....................................................... 3
1.1.3. Đặc điểm chung của vi sinh vật probiotic ................................................... 5
1.1.4. Cơ chế tác động chung của probiotic .......................................................... 8
1.1.5. Vai trò của probiotic đối với vật ni ....................................................... 10
1.1.6. Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới và Việt Nam .... 11
1.2. Tổng quan về Lactobacilus .......................................................................... 14
Chƣơng 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU .................................................................................................... 18
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................... 18
2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 18
2.3. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 18
2.4. Môi trƣờng nghiên cứu................................................................................. 19
2.5. Các phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................... 19
2.5.1. Phân lập các chủng vi sinh vật hữu ích ..................................................... 19
2.5.2. Phƣơng pháp định lƣợng axit lactic theo Therner..................................... 20
2.5.3. Xác định mật độ TB bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc........................... 20
2.5.4. Tuyển chọn các chủng có đặc tính probiotic............................................. 21
2.5.5. Xác định đặc tính sinh lý sinh hóa của các chủng vi sinh vật................... 24

ii


2.5.6. Khảo sát ảnh hƣởng của các nhân tố đến sinh trƣởng của chủng vi khuẩn
lactic. ................................................................................................................... 26
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ ..................................................................................... 28
3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn. ....................................................................... 28
3.2.Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng làm chế phẩm vi sinh ............................. 30

3.2.1. Khả năng sinh axit lactic của các chủng vi khuẩn. ................................... 30
3.2.2. Khả năng đối kháng với các vi khuẩn kiểm định. ..................................... 31
3.2.3. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào ............................................... 33
3.2.4. Khảo sát khả năng chịu pH dạ dày ............................................................ 35
3.2.5. Khả năng chịu muối mật ........................................................................... 36
3.3. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn
tuyển chọn ........................................................................................................... 37
3.4. Ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy đến sự sinh trƣởng của chủng vi khuẩn tuyển
chọn ..................................................................................................................... 39
3.4.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy ............................................................. 39
3.4.2. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy .................................................. 40
3.4.3.Ảnh hƣởng của nguồn Cacbon ................................................................... 41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO

iii


DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
C
CFU

Cacbon
Colony forming unit (mật độ tế bào)

CMC

Carboxymethyl cellulose

cs

cộng sự

ĐC

Đối chứng

DNA

Deoxyribonucleic acid

FAO

Food and Agriculture Organization of the United Nations
Tổ chức Lƣơng thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc

FAO

Food and Agriculture Organization of the United Nations.
Tổ chức Lƣơng thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc

G-

Gram âm

G+

Gram dƣơng

Ký hiệu

Chú thích

LAB

Lactic Acid Bacteria (Vi khuẩn lactic)

MRS

Man, Rogosa and Sharpe

OD
RNA

Optical Density (Mật độ quang)
Ribose nucleic acid

Stt

Số thứ tự

TB

Tế bào

WHO

World Health Organization
Tổ chức Y tế Thế giới

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tóm tắt một số thơng tin của một vài sản phẩm probiotic có mặt trên
thị trƣờng ............................................................................................................. 14
Bảng 1.2. Phân loại Lactobacillus....................................................................... 15
Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và một số đặc điểm sinh học ............... 29
các chủng vi sinh vật hữu ích .............................................................................. 29
Bảng 3.2 Khả năng sinh axit lactic của các chủng .............................................. 30
Bảng 3.3. Khả năng kháng vi khuẩn kiểm định của các chủng lactic ................ 31
Bảng 3.4 Khả năng sinh enzym ngoại bào của các chủng .................................. 33
Bảng 3.5. Tỷ lệ sống sót của chủng vi khuẩn LT7 và C2 ở các độ pH khác nhau....35
Bảng 3.6. Tỷ lệ sống sót của chủng vi khuẩn LT7 và C2 ở các nồng độ muối mật
khác nhau ............................................................................................................. 36
Bảng 3.7. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn .............................. 37
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh trƣởng (OD600) .....39
Bảng 3.9: Ảnh hƣởng pH ban đầu đến khả năng sinh trƣởng (OD600) ............... 40
Bảng 3.10: Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trƣởng của hai
chủng vi khuẩn (OD600) ....................................................................................... 41

v


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh tế bào Lactobacillus. ........................................................... 16
Hình 3.1. Khả năng kháng Ecoli của các chủng lactic........................................ 32
Hình 3.2.Khả năng kháng Salmonella của các chủng lactic ............................... 32
Hình 3.3.Khả năng kháng Shigella của các chủng lactic .................................... 32

Hình 3.4.khả năng sinh enzym ngoại bào của chủng vi khuẩn lactic ................. 34
Hình 3.5. Hình thái khuẩn lạc và tiêu bản nhuộm gram của chủng LT7 ............ 38
Hình 3.6. Hình thái khuẩn lạc và tiêu bản nhuộm gram của chủng C2 .............. 38
Hình 3.7. Đồ thị ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự tạo thành sinh khối của 2 chủng
Lactobacillus. ...................................................................................................... 39
Hình 3.8. Đồ thị ảnh hƣởng của pH ban đầu đến sự tạo thành sinh khối của 2
chủng Lactobacillus. ........................................................................................... 40
Hình 3.9. Đồ thị ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến sự tạo thành sinh khối của 2
chủng Lactobacillus. ........................................................................................... 42

vi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ xƣa đến nay, chăn nuôi gia súc, gia cầm là một trong những ngành kinh
tế mũi nhọn của nƣớc ta. Do đó, vấn đề dịch bệnh, năng suất và chất lƣợng của
sản phẩm thịt luôn đƣợc đặt lên hàng đầu. Trong các bệnh thƣờng gặp ở động
vật thì bệnh về đƣờng ruột là một trong những bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng
nhất. Trong đó, tiêu chảy là một hội chứng rất hay gặp và gây thiệt hại nặng nề
cho nhà chăn ni. Có rất nhiều biện pháp đã đƣợc áp dụng để phòng và trị tiêu
chảy, trong đó việc dùng kháng sinh đã và đang là lựa chọn hàng đầu của ngƣời
chăn nuôi. Dù biện pháp này có hiệu quả cao, nhƣng gần đây có nhiều lo ngại về
hàm lƣợng kháng sinh tồn dƣ trong sản phẩm sau thu hoạch đã ảnh hƣởng xấu
đến sức khỏe ngƣời tiêu thụ. Việc lạm dụng kháng sinh quá mức còn gây ra
nguy cơ kháng kháng sinh của các chủng gây bệnh, ảnh hƣởng khó khăn cho
việc điều trị và kiểm sốt dịch bệnh. Chính vì những lí do đó mà các phƣơng
pháp phòng và trị bệnh bằng liệu pháp sinh học ngày càng đƣợc ƣa chuộng nhƣ
vacxin, chất tăng cƣờng hệ miễn dịch, chế phẩm vi sinh,…Trong đó, chế phẩm
vi sinh đƣợc xem là một phƣơng pháp có nhiều ƣu điểm vƣợt trội, hiệu quả lâu
dài và an toàn sinh học. Nó khơng chỉ giúp phịng chống bệnh tật thơng qua việc

đối kháng trực tiếp với vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột đặc biệt là E. coli hoặc
gián tiếp thông qua sự kích thích hệ miễn dịch của vật ni, duy trì vi sinh vật
có lợi mà cịn giúp vật ni sinh trƣởng và phát triển tốt. Hiện nay, có rất nhiều
thƣơng hiệu chế phẩm sinh học đang lƣu hành trên thị trƣờng Việt Nam. Các
chế phẩm này chủ yếu có nguồn gốc nhập ngoại hoặc sản xuất trong nƣớc. Các
chủng vi sinh vật đƣợc sử dụng chủ yếu thuộc nhóm Bacillus sp., Lactobacillus
sp., Nitrosomonas sp., Nitrobacter sp.,…
Trong số đó, vi khuẩn Lactobacillus đƣợc xem là một trong những đối
tƣợng giàu tiềm năng để tạo chế phẩm vi sinh. Do Lactobacillus khơng chỉ có
khả năng tồn trong đƣờng tiêu hóa mà cịn có thể sinh chất kháng khuẩn kìm
hãm vi sinh vật gây bệnh. Ngồi ra, nhóm vi khuẩn này cịn có thể chuyển hóa
các chất khó tiêu thành chất dễ tiêu làm cải thiện dinh dƣỡng, kích thích tiêu hóa
1


thức ăn và giúp vật nuôi tăng trọng nhanh. Đặc biệt, chế phẩm vi sinh từ
Lactobacillus dễ bảo quản và khơng gây hại cho ngƣời và động vật. Chính vì
vậy tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn chủng
vi khuẩn Lactobacillus ứng dụng trong tạo chế phẩm vi sinh bổ sung vào thức
ăn chăn nuôi”.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về probiotic
1.1.1.Lịch sử nghiên cứu probiotic
Lịch sử nghiên cứu probiotic bắt đầu trong những năm cuối thế kỷ 19, khi
các nhà vi sinh vật học phát hiện ra sự khác biệt giữa hệ vi sinh vật trong ống
tiêu hóa của ngƣời bệnh và ngƣời khỏe mạnh. Hệ vi sinh vật có ích trong hệ

thống ống tiêu hóa đƣợc gọi là probiotic.
Năm 1870, khi nghiên cứu tại sao những ngƣời nông dân Bungary có sức
khỏe tốt, nhà sinh lý học ngƣời Nga Eli Metchnikoff đã đƣa ra thuật ngữ
“probiotic” có nguồn gốc từ Hy Lạp, theo nghĩa đen là “vì cuộc sống” để chỉ
những vi sinh vật đã đƣợc chứng minh có ảnh hƣởng tốt đến sức khỏe của ngƣời
và động vật [24].
Năm 1925, Beach là ngƣời đầu tiên có những nghiên cứu thực nghiệm về
thức ăn có chứa “Lactobacillus acidophilus” [20].
Năm 1968, King đã nghiên cứu thành cơng việc kích thích sự tăng trƣởng
của heo bằng thức ăn có bổ sung L. acidophilus [29].
Khái niệm này sau đó đƣợc làm rõ hơn bởi Fuller (1989). Probiotic là “một
chất bổ trợ thức ăn chứa vi sinh vật sống có ảnh hƣởng có lợi đến vật chủ bằng
việc cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh vật ruột của nó” [26].
Năm 2001, Schrezenmeir và DeVrese định nghĩa: “Probiotic là lƣợng vi
sinh vật sống xác định với số lƣợng thích hợp đƣợc chuẩn bị trong các sản phẩm,
có tác dụng biến đổi tích cực hệ vi sinh vật đƣờng ruột và ảnh hƣởng tốt đến sức
khỏe vật chủ [37].
Theo định nghĩa của FAO/WHO năm 2002: “Probiotic đó là những vi sinh
vật sống đƣợc kiểm sốt chặt chẽ, với lƣợng thích hợp mang lại lợi ích cho vật
chủ”. Đây là định nghĩa đƣợc chấp nhận nhiều hơn cả [25].
Ngày nay, các chế phẩm probiotic đƣợc sử dụng khá hiệu quả trong chăn
nuôi, đặc biệt là trong nuôi trồng thủy sản, trồng trọt, trong bảo vệ sức khỏe con
ngƣời và bảo vệ môi trƣờng.
2


1.1.2.Vi sinh vật được sử dụng làm probiotic
Gồm nhiều nhóm khác nhau nhƣ vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc.
Tuy nhiên, vì những đặc tính ƣu việt của vi khuẩn lactic phù hợp với việc tạo
chế phẩm probiotic cho ngƣời cũng nhƣ vật nuôi nên thành phần của hầu hết các

chế phẩm probiotic hiện nay chủ yếu là các chủng lactic.
Một số nhóm vi sinh vật probiotic thƣờng gặp
 Nhóm vi khuẩn lactic: Theo Lee, Nomoto, Salminen (1999), một số
loại chế phẩm probiotic đƣợc biết đến nhiều nhất với các chủng LAB, trong đó
chủ yếu là những lồi thuộc chi Lactobacillus và Streptococcus nhƣ L.
acidophilus, L. casei, L. plantarum, L. bulgaricus, L. kefir, L. delbruckii, L.
sporogenes, Bifidobacterium breve, Bifidus bacteria, Streptococcus faecalis,…
[30].
Những chủng này đều có thể chịu đựng nhiệt độ cũng nhƣ các tác động
trong quá trình sản xuất thuốc, không tƣơng tác với các thành phần bổ sung
thêm trong chế phẩm nhƣ vitamin, acid amin, acid béo, đƣờng và đặc biệt là
fructoligosaccharide, là một tá dƣợc đƣợc dùng phổ biến trong hầu hết các chế
phẩm probiotic.
Các chế phẩm probiotic có thể sử dụng chỉ một chủng LAB (nhƣ L.
acidophilus hay L. sprorogenes,…) hoặc kết hợp nhiều chủng LAB (L.
acidophilus, L. sprorogenes, L. kefir, Streptococcus faecalis,…). Sử dụng chế
phẩm probiotic.
Các chế phẩm probiotic có thể sử dụng chỉ một chủng LAB (nhƣ L.
acidophilus hay L. sprorogenes,…) hoặc kết hợp nhiều chủng LAB (L.
acidophilus, L. sprorogenes, L. kefir, Streptococcus faecalis,…). Sử dụng chế
phẩm probiotic – lactic là liệu pháp rất tốt cho các trƣờng hợp rối loạn đƣờng
tiêu hóa, giúp duy trì hệ vi sinh vật có lợi cho hệ tiêu hóa, ngăn ngừa tiêu chảy
hữu hiệu và nhiều trƣờng hợp bệnh khác nhờ những tác dụng trong cơ thể ngƣời
[12, 37].
 Bacillus subtilis (B. subtilis) là vi khuẩn ứng dụng làm probiotic từ rất
sớm. Chúng đƣợc sử dụng qua đƣờng uống để phòng và chữa các rối loạn tiêu
3


hóa nhƣ tiêu chảy sau khi dùng kháng sinh. B. subtilis có tác dụng hồi phục hệ

vi sinh vật tự nhiên trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời sau khi dùng kháng sinh kéo
dài. Các chế phẩm B. subtilis đƣợc bán ở hầu hết các nƣớc Châu Âu, mặc dù
ngƣời ta còn chƣa biết nhiều về cơ chế tác dụng của chúng. Bào tử của B.subtilis
có thể vƣợt qua rào chắn đƣờng tiêu hóa, một phần bào tử nảy mầm trong ruột
non và sinh sôi trong đƣờng ruột. Một số tác dụng lâm sàng của B.subtilis đã
đƣợc biết nhƣ làm tác nhân kích thích miễn dịch trong một số bệnh [31].
 Bacillus clausii thuộc giống Bacillus, G+, không di động, nuôi cấy dễ
dàng với các môi trƣờng dinh dƣỡng thông dụng, có khả năng sinh bào tử giúp
vi khuẩn tồn tại trong điều kiện khắc nghiệt. Bào tử của B.clausii có thể qua dạ
dày với tỉ lệ sống sót cao, có thể sống đƣợc trong môi trƣờng dịch vị với pH = 2
ít nhất l2 giờ. Chúng đề kháng rất tốt với nhiều loại kháng sinh. Vì thế, có thể
dùng chung trong thời gian điều trị kháng sinh [17].
Khi vào ruột non, bào tử B. clausii sẽ nảy mầm và tiếp tục sinh sơi nảy nở
trong ruột. Nhờ đó lấp đầy lại đƣợc khoảng trống rối loạn hệ vi khuẩn trong
đƣờng ruột. Đồng thời sự sinh trƣởng của B. claussi sẽ tái lập đƣợc điều kiện kị
khí, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển trở lại của các vi khuẩn có lợi ở
đƣờng ruột nhƣ (Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacteroides) đã bị rối loạn vì
các nguyên nhân khác nhau.
B. clausii thƣờng đƣợc dùng tạo chế phẩm probiotic cho ngƣời nhƣ chế
phẩm Enterogermina ở dạng lỏng. Bào tử đƣợc bào chế dƣới dạng hỗn dịch
không màu, không mùi, không vị trong từng ống nhựa nhỏ nên tiện lợi khi sử
dụng, đặc biệt là cho trẻ em.
 Nấm men: đƣợc sử dụng làm probotic nhƣ Saccharomyces cerevisiae, S.
boulardii. Trong các chế phẩm probiotic tạo ra sinh khối chứa acid amin, các
vitamin nhóm B, hấp thu độc tố và bài thải ra ngoài. Chúng chuyển hóa glucose
thành acid pyruvic là cơ chất cho các vi sinh vật có lợi hoạt động và sinh sản.
Ngồi ra, chúng cịn tiết enzyme tiêu hóa nhƣ amylase, protease,…[15]
S. boulardii: Đƣợc dùng nhƣ probiotic từ năm 1950. Là thành phần chính
của một số chế phẩm probiotic nhƣ ultralevure (Pháp), Florastor, Bioflora
4

(Pháp). Tác động hiệu quả trong điều trị tiêu chảy nhiễm trùng cấp. Ngừa tiêu
chảy do kháng sinh và trị liệu phối hợp trong nhiễm trùng H. pylori. S. boulardii
tác động thông qua cơ chế:
+ Tiết enzyme proteinase làm giảm độc tố do Clostridium difficile, sản sinh
phosphatase làm bất hoạt các nội độc tố do E. coli tiết ra.
+ Tăng lƣợng kháng thể IgA, tăng các men lactase, sucrase, maltase, và
naminopeptidase, tăng hấp thu ở ngƣời tiêu chảy, duy trì các acid béo chuỗi
ngắn cần thiết cho việc hấp thu nƣớc và chất điện giải.
+ Ngồi ra, chúng cịn tác dụng giảm viêm ở đƣờng ruột do kích thích tế bào T.
 Nấm mốc: trong chế phẩm probiotic có vai trò tạo sinh khối chứa nhiều
acid amin, sản xuất enzyme amylase, protease nhằm tăng khả năng tiêu hóa thức
ăn ở động vật nuôi [15].
1.1.3. Đặc điểm chung của vi sinh vật probiotic
Vi sinh vật probiotic khi đƣợc bổ sung vào cơ thể qua đƣờng tiêu hóa,
chúng tác động thơng qua một số cơ chế khác nhau. Tuy nhiên, để có thể tác
động lên hệ tiêu hóa vật chủ thì trƣớc hết chúng phải có khả năng sống sót ở
điều kiện khắc nghiệt trong đƣờng tiêu hóa. Điển hình là các điều kiện nhƣ: pH
thấp, acid mật, kháng sinh,…
 Chịu pH thấp
Các nhà khoa học đã chứng minh, các probiotic phải trải qua các q trình
tiêu hóa khắc nghiệt hơn 90 phút trƣớc khi đƣợc giải phóng từ dạ dày vào ruột.
Tuy nhiên, các q trình tiêu hóa có thời gian xảy ra lâu hơn nên vi sinh vật
probiotic phải chống lại đƣợc các điều kiện áp lực của dạ dày với pH thấp đến
khoảng 1,5. Do đó, các chủng đƣợc chọn lọc để sử dụng nhƣ trong chế phẩm
probiotic cần phải chịu đƣợc mơi trƣờng pH thấp ít nhất 90 phút. Sống sót ở pH
2,0 trong 2 giờ và nồng độ acid 1000 mg/l đƣợc xem nhƣ là khả năng chống đỡ
đối với acid tối ƣu đối với các chủng probiotic [5].
Tiếp đến, chúng phải gắn vào biểu mô và phát triển đƣợc trong ruột trƣớc

khi chúng có thể bắt đầu phát huy vai trò đối với sức khỏe vật chủ.
5


 Chịu muối mật
Acid mật đƣợc coi là chất kháng khuẩn trong đƣờng tiêu hóa, bảo vệ ruột
khỏi sự xâm nhập của các vi sinh vật gây bệnh. Ở hầu hết các sinh vật (bao gồm
ngƣời), quá trình tổng hợp acid mật chủ yếu thông qua sự tiêu thụ cholesterol.
Cơ thể tổng hợp khoảng 8 mg cholesterol một ngày và dùng 4mg cholesterol để
tổng hợp acid mật. Tổng cộng có khoảng 20–30 g acid mật tiết vào ruột mỗi
ngày [26].
Do vậy, khi thức ăn cùng vi sinh vật từ dạ dày chuyển xuống vùng ruột. Tại
đây, chúng chịu sự tác động của acid mật. Khi acid mật đi vào khu vực tá tràng
thì số lƣợng vi sinh vật sẽ giảm. Khả năng chịu đựng acid mật là một trong
những đặc tính cần thiết của vi sinh vật có hoạt tính probiotic [35].
 Chịu kháng sinh
Đƣợc sử dụng phổ biến trong điều trị bệnh đƣờng ruột cho ngƣời cũng nhƣ
vật nuôi. Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích do kháng sinh mang lại thì phƣơng
pháp trị liệu bằng kháng sinh có một số hạn chế nhất định nhƣ: Tác động loại bỏ
không chọn lọc, không phân biệt đƣợc mầm bệnh thật sự và hệ vi sinh vật có lợi
trong đƣờng ruột. Vì thế, phƣơng pháp này đã dẫn đến sự mất cân bằng hệ vi
sinh vật đƣờng ruột và có thể gây ra một số ảnh hƣởng xấu cho vật chủ nhƣ tiêu
chảy, rối loạn tiêu hóa,...
Chính vì vậy, việc sử dụng probiotic thƣờng đƣợc bổ sung cho vật chủ
trong thời gian điều trị bằng kháng sinh để hạn chế sự mất cân bằng hệ vi sinh
vật đƣờng ruột. Do đó, các chủng dùng làm probiotic cần phải có khả năng chịu
đƣợc kháng sinh và phải đảm bảo không chuyển gen đề kháng kháng sinh sang
những vi khuẩn khác có mặt trong đƣờng tiêu hóa, đặc biệt là những vi khuẩn
gây bệnh [4, 14].
 Khả năng bám dính vào tế bào biểu mơ ruột

Các chủng vi sinh vật probiotic chỉ có thể tác động tốt khi chúng có thể
sinh trƣởng và phát triển đƣợc trong đƣờng tiêu hóa. Bên cạnh khả năng sống
sót đƣợc trong đƣờng tiêu hóa thì chúng phải có khả năng bám dính vào thành
biểu mơ ruột để khơng bị rửa trơi ra ngồi cùng với phân [5].
6


Nhờ khả năng bám dính đó mà các chủng probiotic có thể ngăn cản đƣợc
sự khu trú của các vi khuẩn gây bệnh bằng cách giành vị trí bám trên thành ruột
hay trên các bề mặt biểu mô khác. Ngƣời ta đã chứng minh đƣợc khả năng bám
dính và phát triển trên bề mặt ruột của Carnobacterium K1 làm cho chủng này
cạnh tranh vƣợt trội và ngăn cản đƣợc sự lan rộng của các vi khuẩn gây bệnh ở
cá nhƣ V. anguillarum và A. Hydrophila [36].
Do đó, sự kết bám với tế bào biểu mô ruột của các chủng probiotic là một
yêu cầu quan trọng cho việc định cƣ lâu dài và tạo ƣu thế cạnh tranh trong hệ vi
sinh vật đƣờng ruột.
Bên cạnh khả năng sống sót và phát triển đƣợc trong điều kiện khắc nghiệt
của đƣờng tiêu hóa, vi sinh vật probiotic cịn có khả năng sản sinh những chất có
hoạt tính kháng khuẩn nhƣ các axit hữu cơ, bacterioxin, H2O2,…Những chất này
đƣợc sản sinh cùng với quá trình sinh trƣởng và phát triển của chúng trong
đƣờng tiêu hóa, tác động ức chế và tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh, tạo nên sự
cân bằng hệ vi sinh vật đƣờng ruột. Ngoài ra, một số chủng vi sinh vật probiotic
cịn có khả năng sinh nhiều loại enzyme có lợi cho việc tiêu hóa thức ăn, kích
thích tăng trọng, điều hòa hệ miễn dịch vật chủ và tăng khả năng đề kháng cho
vật chủ [5, 30].
Tóm lại, những yêu cầu của probiotic cần đạt đƣợc là [29]:
- An toàn cho ngƣời và động vật, không gây bệnh và không tạo độc tố.
- Có khả năng sống sót trong đƣờng ruột của vật chủ, chịu đƣợc pH thấp ở
dạ dày và muối mật trong đƣờng ruột,…
- Có khả năng bám dính vào tế bào biểu mơ ruột để làm giảm số lƣợng vi

sinh vật gây bệnh.
- Có khả năng ức chế các vi sinh vật gây bệnh nhờ khả năng sinh chất có
hoạt tính kháng khuẩn giúp cân bằng hệ vi sinh vật đƣờng ruột.
- Có lợi cho q trình tiêu hóa của vật chủ nhờ khả năng sinh một số loại
enzyme ngoại bào,…
- Có khả năng tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch và sức đề kháng của vật chủ.
7


- Có khả năng sống sót cao và giữ đƣợc đặc tính ổn định trong thời gian dài
ở điều kiện thƣờng [4].
- Chế phẩm có chất lƣợng cảm quan tốt.
- Đủ số lƣợng yêu cầu, đạt 108 -109 CFU/g chế phẩm.
- Phù hợp với yêu cầu sản xuất công nghiệp, quy trình ni cấy và sản xuất
đơn giản, chi phí thấp, cách sử dụng đơn giản.
1.1.4. Cơ chế tác động chung của probiotic
Vi sinh vật probiotic khi đƣợc bổ sung vào cơ thể vật chủ, chúng tác động
lên đƣờng tiêu hóa của vật chủ theo những cơ chế nhƣ cạnh tranh và đối kháng
với các vi khuẩn gây bệnh, sản sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn, kích
thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ,…
 Cạnh tranh và đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh
Hệ vi sinh vật ở đƣờng tiêu hóa mất cân bằng do nhiều nguyên nhân khác
nhau, một trong những nguyên nhân chính là do việc sử dụng kháng sinh dài
ngày dẫn đến việc tiêu diệt các vi sinh vật có lợi trong ruột. Để khắc phục điều
này, ngƣời ta thƣờng bổ sung các vi sinh vật có lợi thơng qua sử dụng probiotic.
Các vi sinh vật probiotic sẽ phát triển, chiếm ƣu thế trong đƣờng ruột bằng cách
cạnh tranh về mặt vị trí bám, về hấp thu chất dinh dƣỡng và khối lƣợng các chất
đƣợc sản sinh. Từ đó, ức chế và tiêu diệt đƣợc vi sinh vật gây hại, thiết lập lại sự
cân bằng hệ vi sinh vật đƣờng ruột.
Trong một nghiên cứu cho thấy, khi cung cấp thƣờng xuyên các vi sinh vật

có lợi dƣới dạng sữa lên men hoặc dạng đông khô cho ngƣời và động vật nuôi
với liều lƣợng thích hợp (1,2 tỷ CFU/kg thức ăn/ngày), sự cân bằng của hệ vi
sinh vật đƣờng ruột đƣợc duy trì [7, 13].
 Tác động kháng khuẩn do sản sinh một số chất kháng khuẩn
Probiotic tác động không chỉ thông qua sự phát triển, gia tăng về số lƣợng
cạnh tranh vị trí bám với vi khuẩn gây bệnh, chúng cịn tác động nhờ vào khả
năng sản sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn nhƣ kháng sinh, một số acid
hữu cơ (acid lactic, acid acetic, acid formic, acid béo, …), diacetyl, hydrogen
peroxide, ethanol,… Đặc biệt, nhiều chủng vi sinh vật còn sản xuất bacteriocin
8


và các phân tử có hoạt tính kháng khuẩn [25]. Những chất này có tác dụng ức
chế và tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh ở đƣờng ruột.
 Tăng cƣờng hoạt động chuyển hóa của vi khuẩn đƣờng ruột
Một số chủng vi sinh vật probiotic khi đƣợc bổ sung vào đƣờng tiêu hóa có vai
trị tăng cƣờng hoạt động chuyển hóa của một số chủng vi khuẩn đƣờng ruột khác.
Chẳng hạn nhƣ khi sử dụng L. rhamnosus dƣới dạng sữa lên men, chúng kích thích
hoạt động enzyme và khả năng biến dƣỡng của vi khuẩn đƣờng ruột [34].
 Điều hòa phản ứng miễn dịch
Vi sinh vật probiotic có thể có khả năng điều hịa phản ứng miễn dịch
thơng qua ảnh hƣởng lên lympho bào B. Nhƣ khi cho chuột sử dụng L.
plantarum ATCC 14917 và L. fermentum YIT 0159, chúng sẽ kích thích sự đồng
hóa 3H - thymidine trong tế bào lách ở chuột. Ngoài ra, L. plantarum ATCC
14917 và L. fermentum YIT 0159 cũng có thể tăng cƣờng bổ thể và kháng huyết
thanh ở thỏ. Điều này chứng tỏ chúng kích thích hoạt động trên lympho bào B
của tế bào lách [14].
Ngồi ra, vi sinh vật probiotic cịn tác động lên hệ tiêu hóa của ngƣời cũng
nhƣ vật ni bằng những cơ chế khác, nhƣ đồng hóa lactose trong sữa,... Sự
khơng dung hịa lactose là tình trạng sinh lí xảy ra ở những ngƣời thiếu khả năng

sản xuất enzyme lactase hay β-galactosidase. Lactase cần thiết để đồng hóa
lactose trong sữa, phân giải chúng thành các phân tử đƣờng glucose và galactose
đơn giản. Các cá thể thiếu lactase sẽ không tiêu hóa đƣợc sữa và thƣờng gây ra
những khó khăn trong q trình tiêu hóa, đặc biệt ở trẻ sơ sinh. Triệu chứng
thƣờng thấy là khó chịu ở bụng, tiêu chảy, bị vọp bẻ, đầy hơi, nôn và buồn
nôn,… khi dùng sữa. Một vấn đề khác có liên quan đến việc khơng dung hịa
lactose là tình trạng thiếu canxi do khơng dùng sữa. Ngồi ra, vi khuẩn khu trú
trong ruột kết khơng lên men tiêu hóa đƣợc lactose sẽ sản xuất acid và khí, gây
ra các triệu chứng nhƣ đau bụng, sƣng phù và tiêu chảy [22].
Các dòng probiotic đã đƣợc chứng minh là có thể giải quyết vấn đề khơng
dung hịa đƣợc lactose nhờ khả năng sản xuất lactase và tăng nồng độ βgalactosidase ở ruột non. Do vậy, ngƣời ta cho các bệnh nhân khơng dung hịa
9


đƣợc lactose sử dụng probiotic. Các dòng probiotic sẽ thủy phân lactose trong
sữa uống và lactose sẽ đƣợc đồng hóa, đồng thời canxi cũng đƣợc hấp thu [25].
1.1.5. Vai trò của probiotic đối với vật ni
Probiotic có tác dụng tốt đối với vật nuôi nhƣ gia súc, gia cầm, thủy cầm,
thủy sản [10]. Cụ thể nhƣ sau:
+ Probiotic giúp phát triển hệ vi sinh vật đƣờng ruột bình thƣờng, tăng
cƣờng khả năng tiêu hóa và hấp thu dinh dƣỡng từ các loại thức ăn. Đối với gia
súc dạ cỏ, probiotic còn giúp hệ vi sinh vật dạ cỏ phát triển và hoạt động tốt hơn.
+ Ức chế và có thể tiêu diệt đƣợc các vi sinh vật có hại. Làm tăng sức đề
kháng và khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi đối với vật ni, phịng
chống các dịch bệnh thƣờng gặp, nhất là bệnh phân trắng ở heo con do E. coli.
Nghiên cứu của Phạm Khắc Hiếu và cộng sự (2002) về tác dụng kháng
khuẩn của chế phẩm EM1 (do Nhật Bản sản xuất) cho thấy: chế phẩm này có tác
dụng ức chế E. coli, Salmonella, Klebsiella, Shigella, Proteus, Staphylococcus,
Streptococcus, Clostridium perfringens, Sarcina lutea. Sau khi dùng chế phẩm
EM1 trộn với thức ăn cho heo (khoảng 109 CFU/kg thức ăn), kết quả kiểm tra số

lƣợng E. coli trong 1g phân heo đã giảm 7% ở heo từ 1-21 ngày tuổi, giảm 5,3%
ở heo từ 22-60 ngày tuổi [7]. Làm cho gia súc, gia cầm cái mắn đẻ hơn, tăng
chất lƣợng thịt và tăng năng suất chăn nuôi [10].
Lã Văn Kính (1998), đã tổng hợp các cơng trình nghiên cứu của các tác giả
nƣớc ngoài khi sử dụng các chế phẩm probiotic trên gà đẻ và gà thịt với kết quả
nhƣ sau: Đối với gà đẻ, sản lƣợng trứng tăng 5% ở mức bổ sung 100mg
probiotic/kg thức ăn. Khi bổ sung hỗn hợp L. acidophilus và L. casei (khoảng
106 CFU/kg thức ăn) đã cải thiện số ngày đẻ trứng, hệ số chuyển hóa thức ăn và
chất lƣợng lịng trắng. Đối với gà thịt, tăng trọng cao và tiêu tốn thức ăn thấp
hơn đối chứng. Đặc biệt là hiệu quả sử dụng thức ăn đã cải thiện 2% khi bổ sung
hỗn hợp L. acidophilus và S. faecium (2x109 CFU/kg thức ăn) cho gà thịt [9].
Góp phần cải thiện chất lƣợng nƣớc, chống ô nhiễm môi trƣờng nƣớc, tăng
cƣờng khả năng phân hủy các chất hữu cơ, giảm nồng độ N và P, kích thích sinh
trƣởng của tảo, giảm nguy cơ mắc bệnh và tăng năng suất tôm, cá,….[3,14].
10


Chẳng hạn nhƣ sử dụng chế phẩm chứa B. subtilis, B. licheniformis, B.
polymixa, B. circulans, B. laterosporus đã làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn và
thúc đẩy tăng trƣởng của ấu trùng cá tầm Acipenser nudiventris [21].
Đặc biệt, dùng chế phẩm probiotic hòa vào thức ăn hay nƣớc uống cho vật
nuôi sẽ làm giảm hoặc làm mất mùi hôi thối gây ơ nhiễm chuồng trại chăn ni.
Có thể dùng dạng dịch pha loãng phun trực tiếp lên cơ thể vật ni nhƣ chó,
lợn,…, sẽ mất mùi thối, phun trực tiếp vào bầu vú con cái khi cho con bú sẽ
tránh bị nhiễm khuẩn có hại [10].
Tóm lại, probiotic đã trở thành sản phẩm hữu hiệu, là bạn đồng hành của
ngƣời chăn nuôi, giúp ngƣời chăn nuôi tăng hiệu quả kinh tế trong chăn ni [1,
4].
1.1.6. Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới và Việt Nam
 Trên thế giới

Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh, probiotic bổ sung vào thức ăn chăn
nuôi đang đƣợc phát triển mạnh mẽ trên thế giới do những hiệu qủa to lớn của
nó trong việc tăng năng suất vật ni, nâng cao hiệu qủa sử dụng thức ăn, hạ giá
thành sản xuất và bảo đảm vệ sinh an toàn sản phẩm [26].
Những vi khuẩn, nấm men nhƣ: Lactobacillus acidophillus, Lactobacillus
platarum, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Treptococcus faecium,
Saccharomyce boulardii, Sacchromyces cerevisiae. Đã đƣợc phân lập, nuôi cấy
và bào chế dƣới dạng chế phẩm vi sinh, probiotic, prebiotic bổ sung vào thức ăn
nhằm cải thiện khả năng năng tiêu hóa, hấp thu; nâng cao sức đề kháng và thay
thế sử dụng kháng sinh, hóa dƣợc trong thức ăn chăn ni (Simon, 2001) [32].
Nghiên cứu của Luc Shiming (1980) cho thấy chế phẩm Lactobacillus
đƣợc phân lập từ gà con khỏe mạnh có tác dụng phịng và trị bệnh pullorum
(tiêu chảy cấp tính và ác tính hàng loạt ở gà) [32].
Reverdin (1996) cho rằng Saccharomyces cerevisiae có tác dụng làm nâng
cao chất béo trong sữa dê. Nghiên cứu khác cho thấy sử dụng chế phẩm
probiotic trên gà đẻ làm tăng sản lƣợng trứng 5%. Cải thiện số ngày đẻ trứng, hệ
số chuyển biến thức ăn, trọng lƣợng trứng và chất lƣợng lòng đỏ [36].
11


Nghiên cứu Lema (2001) phối hợp giữa Lactobacillus acidophilus với
Streptocccus faecium, Lactobacillus casei, L. fermentum và L. plantarum trộn
trong thức ăn cho cừu trong thời gian 7 tuần với liều 6x106 CFU/kg thức ăn để
khảo sát sự bài thải E.coli O157: H7. Kết quả cho thấy hỗn hợp Lactobacillus
cidophilus với Streptocccus faecium, Lactobacillus casei, L.fermentum và L.
plantarum đã làm giảm sự bài thải E.coli trong phân [31].
Trong khoảng 20 năm trở lại đây, nhờ ứng dụng những tiến bộ kỹ thuật
trong lĩnh vực sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật giải trình tự axit nucleic
trong nghiên cứu phân loại và định danh các chủng vi sinh vật, công nghệ sản
xuất các sản phẩm probiotic phục vụ chăn nuôi ngày càng trở nên dễ dàng và

phổ biến hơn ở nhiều nƣớc trên thế giới. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu về
sử dụng các sản phẩm probiotic trong chăn nuôi rất khác nhau, đôi khi trái
ngƣợc nhau. Nhiều nghiên cứu bổ sung chế phẩm probiotic trên lợn và gà cho
thấy có đáp ứng tích cực; tăng cƣờng khả năng miễn dịch ở lợn con; tăng tỷ lệ
tiêu hóa các chất dinh dƣỡng; tăng hiệu quả sử dụng thức ăn.... Bên cạnh đó
cũng có nhiều nghiên cứu đã chứng tỏ hiệu quả không rõ rệt của việc bổ sung
các chế phẩm probiotic trên lợn (Breston và cs, 1995): không quan sát thấy ảnh
hƣởng tích cực của probiotic (Lactobacillus) bổ sung trong khẩu phần cho lợn
cái và đực thiến ở giai đoạn lợn choai và vỗ béo [23]; Navas-Sanchez và cs
(1995): khuyến cáo rằng đối với lợn con sau cai sữa không nên sử dụng các chế
phẩm probiotic[33]; Galassi và cs (2001) khơng thấy có sự khác nhau về tỷ lệ
tiêu hóa thức ăn và hiệu quả sử dụng năng lƣợng ở các nhóm lợn thí nghiệm và
đối chứng đƣợc ăn thức ăn có và khơng có bổ sung probiotic... [27].
Có rất nhiều ý kiến khác nhau khi giải thích sự khác biệt của các kết quả
nghiên cứu, nhƣng ý kiến đƣợc nhiều nhà khoa học thống nhất là các chế phẩm
probiotic tạo nên các đáp ứng tích cực ở gia súc và gia cầm chỉ khi nó có đầy đủ
các đặc tính probiotic, sự thiếu một hoặc nhiều các đặc tính của probiotic có thể
là ngun nhân chủ yếu của các đáp ứng âm tính [24].

12


 Ở Việt Nam
Ở nƣớc ta hiện nay, việc nghiên cứu sản xuất probiotic còn rất mới mẻ và
bắt đầu đƣợc quan tâm trong khoảng một thập kỷ gần đây. Lê Thanh Bình và cs
(1999) đã sản xuất chế phẩm PRO99 gồm hai chủng vi khuẩn lactic và nuôi thử
nghiệm trên gà Broiler cho thấy quần thể vi sinh vật đƣờng ruột thay đổi theo
chiều hƣớng tích cực, các vi khuẩn lactic tăng, E.coli giảm rõ rệt ở nhóm gà
đƣợc ăn thức ăn có thức ăn bổ sung PRO99 [2].
Phạm Ngọc Lan và cs (2003) đã phân lập đƣợc hai trong số 789 chủng vi

khuẩn lactic trong ruột gà. Bằng các phƣơng pháp nghiên cứu sinh học phân tử,
nhóm tác giả đã xác định đƣợc các chủng CH123 và CH156 có những tính chất
probiotic gần với Lactobacillus agillis và Lactobacillus salivarius (có khả năng
đề kháng đƣợc với 40% axit mật; sinh trƣởng đƣợc ở môi trƣờng pH = 4,0 và
nồng độ NaCl = 6%, có hoạt tính kháng với Salmonella, E.coli) có khả năng sử
dụng nhƣ nguồn probiotic ứng dụng trong chăn nuôi [10].
Nguyễn La Anh và cs (2003) đã phân lập đƣợc chủng vi khuẩn lactic BC
5.1 từ nƣớc bắp cải muối chua và đã xác định đƣợc rằng chủng vi khuẩn này có
tính chất probiotic và có thể sử dụng trong chế biến thực phẩm Biochie dạng
dung dịch có tác dụng cải thiện mơi trƣờng nƣớc ni tơm, cá [1].
Những chế phẩm mới có cơng dụng trong chăn ni gia cầm, gia súc, thủy
sản. Đó là các cơng trình nghiên cứu nhƣ: Men vi sinh NN1 ứng dụng trong
chăn nuôi gia súc, gia cầm BIO I, BIO II, ứng dụng trong thủy sản…
Nghiên cứu phân lập tuyển chọn vsv probiotics thuần túy Việt Nam thƣờng
dừng lại ở quy mơ phịng thí nghiệm, chƣa có quy trình phù hợp có thể áp dụng
đại trà ra ngịai sản xuất; những thử nghiệm trên gia súc khá đơn giản, số lƣợng
gia súc ít, khơng đủ số lần lặp lại, chỉ tiêu theo dõi chƣa phong phú do đó kết
luận về tính hiệu qủa của sản phẩm có tính thuyết phục chƣa cao. Các nhà
nghiên cứu không chia sẻ kiến thức khoa học mà họ ln giữ bí mật cơng nghệ
riêng của mình. Do đó ƣu thế của tính kế thừa bị hạn chế [5].
Sau đây là thông tin một số sản phẩm probiotic có mặt trên thị trƣờng:
13


Bảng 1.1 Tóm tắt một số thơng tin của một vài sản phẩm probiotic
có mặt trên thị trƣờng
Sản phẩm
BioGuard
E.lac
BioSix

Lactacids
Adepro
Lactizym
Ferment
Lacto-Sacc

Nƣớc sản xuất
Việt Nam
Hàn Quốc
Việt Nam
Việt Nam
Việt Nam
Việt Nam
Trung Quốc
Mỹ

Vi sinh vật sử dụng và mật độ (CFU/g)
Vi khuẩn lactic Bacillus Nấm men
107
2 x 107
4 x 107
105
105
107
107
6 x 105
109
2,5 x 108
4,6 x 106

1.2. Tổng quan về Lactobacilus
Giống Lactobacillus có dạng hình que, thƣờng tồn tại từng tế bào riêng rẽ
hay dạng chuỗi, kích thƣớc tế bào dao động từ 0,5-1,2 x 1-10 µm, tế bào không
di động, G+, không sinh bào tử. Chúng là dạng kị khí khơng bắt buộc, có thể
tăng trƣởng ở nhiệt độ từ 50C – 530C và tăng trƣởng tối thích từ 300C đến 400C.
Chúng có thể sống ở pH nhỏ hơn 5. Nhu cầu dinh dƣỡng của Lactobacillus rất
phức tạp cần phải có nguồn cacbonhydrat, acid amin, peptit, các este của acid
béo, dẫn xuất của các acid nucleic, vitamin và khống chất. Giống Lactobacillus
khơng tổng hợp đƣợc porphyrinold nên khơng có các hoạt tính hoạt động phụ
thuộc nhân heme, do đó hoạt tính catalase âm tính. Tuy nhiên, có một vài chủng
có thể sử dụng porphyrinold từ mơi trƣờng nên có hoạt tính catalase dƣơng tính,
có cytochrom và có thể khử đƣợc nitrat [6, 43].
Lactobacillus có thể sử dụng glucose để lên men đồng hình (sản phẩm cuối
cùng có hơn 85% là acid lactic) hay lên men dị hình (sản phẩm cuối cùng gồm acid
lactic, CO2, etanol). Sự hiện diện của oxy hay các tác nhân oxy hố khác nhƣ acetat
có thể tạo thành lactat. Một số chất nhƣ citrat, malat, tartrat, quinolat, nitrat,
nitrit,… cũng đƣợc chúng sử dụng nhƣ nguồn năng lƣợng trong quá trình trao đổi
chất hoặc đóng vai trị nhƣ chất nhận electron. Lactobacillus bao gồm 25 lồi đƣợc
chia thành 3 nhóm chính dựa vào sản phẩm cuối cùng tạo thành là [32]:
14


- Nhóm I: lên men đồng hình bắt buộc.
- Nhóm II: lên men dị hình tuỳ ý.
- Nhóm III: lên men dị hình bắt buộc.
Bảng 1.2. Phân loại Lactobacillus
Đặc điểm

Nhóm I

Nhóm II

Nhóm III

- Lên men pentose

-

+

+

- Tạo CO2 từ glucose

-

+

+

- Tạo CO2 từ gluconat

-

+

+

- FDP aldolase

-

+

+

Một vài đại diện

L. acidophilus L.

L. casei

L. brevis

delbrueckii

L. cuvatus

L. buchneri

L. helveticus

L. plantarum

L.

L. salivarius

L. sake

fermentun
L. reuteri

Ghi chú:

- : Khơng có khả năng
+ : có khả năng

Một điều đáng chú ý là việc xác định chính xác các lồi của giống
Lactobacillus khơng chỉ dựa vào đặc điểm sinh lý, Pot và cộng sự (1994) đã
cung cấp một số phƣơng pháp xác định Lactobacillus nhƣ phân tích thành phần
DNA hay RNA (bằng lai phân tử hay giải trình tự), rRNA là đích của các mẫu
dị DNA đƣợc sử dụng để xác định các loài [38]. Ngƣời ta cũng sử dụng phƣơng
pháp điện di SDS –PAGE toàn bộ protein của tế bào dƣới những điều kiện
chuẩn để xác định chính xác các lồi. Một số lồi thuộc chi Lactobacillus
thƣờng sử dụng để tạo chế phẩm probiotic cho ngƣời nhƣ: L. acidophilus, L.
bulgaricus, L. casei, L. kefir, L. delbruckii, L. sporogenes,…

15


Hình 1.1. Hình ảnh tế bào Lactobacillus.
Lactobacillus gắn liền với quá trình sản xuất đồ ăn và thức ăn chăn ni,
chủ yếu là chúng góp phần bảo vệ ngun liệu thơ khỏi acid hóa, chúng cũng
làm tăng hƣơng vị và tham gia kết cấu sản phẩm. Môi trƣờng sống tự nhiên của
Lactobacillus rất rộng, từ các sản phẩm sữa, thịt, rau, củ, quả lên men đến
khoang miệng, hệ tiêu hóa và hệ sinh dục của con ngƣời và động vật.
Lactobacillus đƣợc công nhận là một loại vi khuẩn tốt cho sức khỏe có trong
đƣờng tiêu hóa ở con ngƣời. Những đặc tính và chức năng này đều có ý nghĩa
cho việc ứng dụng sản xuất probiotic [22].

Quá trình trao đổi chất của Lactobacilus có vai trị quan trọng trong khả
năng chữa bệnh. Với những hoạt tính đáng chú ý sau [14]:
a. Phân giải các hợp chất hữu cơ
- Phân giải protein
Lactobacillus sản sinh ra enzym proteinase phân giải protein thành các
polypeptide mạch ngắn. Hoạt tính này của vi khuẩn giúp cho protein đƣợc cơ
thể vật chủ tiêu hóa dễ dàng. Vì vậy, các chế phẩm từ hoạt động lên men của
Lactobacilus đƣợc đáng giá là nguồn dinh dƣỡng có giá trị cao cho các đối
tƣợng: trẻ sơ sinh, ngƣời đang dƣỡng bệnh, ngƣời già hay gia súc non.
- Phân giải lipid
Nhờ có enzym lipase, Lactobacilus có khả năng phân cắt chất béo ở dạng
triglyceride thành các axit béo và glycerol. Điều này có ý nghĩa về mặt dinh
dƣỡng đối với ngƣời và vật nuôi.
16


- Phân giải đƣờng lactose
Lactobacillus mang enzym beta-galactosidase, glycolase và lactic
dehyrogenase có tác dụng chuyển hóa đƣờng lactose thành axit lactic. Đây là
một axit hữu cơ có những đặc tính sinh học quan trọng.
b. Sản xuất bacteriocin và các cơ chất kháng khuẩn
Bacteriocin là protein hay hợp chất protein do vi khuẩn sản xuất có hoạt
tính diệt khuẩn trực tiếp. Cơ chất này giúp vi khuẩn Lactobacilus thể hiện hoạt
tính ức chế đối với các vi sinh vật gây thối trong hệ tiêu hóa nhờ vào những sản
phẩm trao đổi chất nhƣ: H2O2, CO2, và diacetyl.
c. Khả năng tồn tại trong đƣờng tiêu hóa
Trong các điều kiện invitro, nhiều chủng Lactobacilus đã đƣợc tuyển chọn
với khả năng tồn tại ở trong điều kiện bất lợi của đƣờng ruột động vật thủy sản
nhƣ: môi trƣờng axit HCl ở dạ dày, môi trƣờng kiềm của ruột, lyzozyme, dịch
tụy, dịch mật. khả năng tồn tại trong các điều kiện khắc nghiệt của đƣờng tiêu

hóa giúp cho vi sinh vật probiotic có thể cạnh tranh đƣợc vị trí bám dính, các
nguồn dinh dƣỡng, và năng lƣợng với các vi khuẩn gây hại.
d. Khả năng chịu mặn
Khả năng chịu mặn của Lactobacilus có vai trị quan trọng vì đây là yếu tố
đầu tiên quyết định sự tồn tại của probiotic trong môi trƣờng nƣớc biển. Khả
năng chịu mặn là đặc tính quý khi sử dụng các chủng này làm chế phẩm cho
nuôi trồng thủy sản ở các vùng khác nhau.

17


Chƣơng 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập đƣợc chủng vi khuẩn Lactobacillus có một số đặc tính probiotic
để ứng dụng tạo chế phẩm vi sinh bổ sung trong thức ăn chăn nuôi.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập một số chủng vi khuẩn Lactobacillus từ các nguồn thực phẩm lên
men.
- Tuyển chọn các chủng có đặc tính probiotic:
+ Có khả năng sinh axit lactic cao.
+ Có khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh.
+ Có khả năng sinh enzyme ngoại bào: amylase, protease, cellulase.
+ Có khả năng chịu pH thấp và muối mật.
- Nghiên cứu các đặc tính sinh lí, sinh hóa của các chủng tuyển chọn đƣợc.
- Nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy đến sự sinh trƣởng của chủng vi
khuẩn tuyển chọn.
2.3. Vật liệu nghiên cứu
Các mẫu thực phẩm lên men (nƣớc dƣa cà, nƣớc dƣa chua, nƣớc măng
chua) đƣợc mua tại khu vực Xuân Mai, Chƣơng Mỹ, Hà Nội.

Các chủng vi khuẩn kiểm định: Ecoli, Samonella, Shigella nằm trong bộ
sƣu tập giống vi sinh vật của Bộ mơn Cơng nghệ Vi sinh – Hóa sinh, Viện Cơng
nghệ Sinh học Lâm nghiệp.
Các thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phịng thí nghiệm 215 và 216, Viện
Cơng nghệ Sinh học , trƣờng Đại học Lâm nghiệp.
 Vật liệu nghiên cứu
- Thiết bị: tủ sấy, máy hấp tiệt trùng (autoclave), tủ lạnh, cân điện tử, máy lắc
(vortex), lị vi sóng, kính hiển vi, đèn cực tím,…
- Dụng cụ: đĩa petri, ống nghiệm, giá để ống nghiệm, que cấy, đèn cồn, giấy
đo pH, bình tam giác, bacher, micropipette, đũa khuấy thủy tinh, ống đong, que
18