nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính chitinase tại thành phố buôn ma thuột

1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của ñề tài
Chitinase là enzyme thủy phân chitin, có vai trò quan trọng trong sản xuất
các sản phẩm từ chitin như N-acetyl-D-glucosamine, Oligo N-acetyl-D-
glucosamine, glucosamine. Oligo N-acetyl-D-glucosamine ñược biết ñến như
một loại thuốc quý, một loại thuốc ña hiệu quan trọng trong y học, là nguyên liệu
ñiều chế một số dược phẩm quý chữa trị các bệnh: viêm khớp, bệnh viêm phổi,
viêm sưng dạ dày, chống nhiễm trùng … Ngoài ra, Oligo N-acetyl-D-
glucosamine còn có khả năng chống khối u, kháng nấm và kháng vi khuẩn.
Chính vì vậy, nghiên cứu về chitinase là vấn ñề ñã và ñang ñược quan tâm nhiều
của các nhà khoa học từ trước ñến nay.
Enzyme chitinase có thể ñược tách chiết từ nhiều nguồn khác nhau như
ñộng vật, thực vật và vi sinh vật. Quy trình thu nhận chitinase từ ñộng vật, thực
vật khá phức tạp, không thể tiến hành tự ñộng hóa, giá thành chế phẩm cao và
cũng không thể ñáp ứng nhu cầu thực tế. Trong khi ñó vi sinh vật có thể nói là
nguồn quý giá và vô tận ñể thu nhận enzyme chitinase.
Đặc biệt cùng với xu hướng phát triển một nền nông nghiệp sạch, bền
vững thì các loại phân bón - thuốc bảo vệ thực vật hữu cơ hoặc có nguồn gốc
sinh học ñang ñược ñề cao nghiên cứu và phát triển. Những nhóm vi sinh vật có
khả năng tạo chitinase rất ñược quan tâm. Chúng vừa có khả năng phân giải
nguồn chitin tự nhiên bổ sung dinh dưỡng cho cây trồng; vừa có tính ñối kháng
với các loài nấm gây bệnh cây trồng, gây mục gỗ, nhờ hoạt chất kháng sinh và
ñặc biệt là hệ enzyme thủy phân, trong ñó có chitinase.
Như vậy, việc nghiên cứu các ñối tượng vi sinh vật có khả năng tạo
chitinase có hoạt tính cao là một bước ñi hữu ích trong nghiên cứu, sản xuất và
ứng dụng chitinase trong ñời sống. Trên cơ sở ñó, chúng tôi tiến hành nghiên
cứu ñề tài “Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt
tính chitinase tại thành phố Buôn Ma Thuột”.

2
2. Mục tiêu ñề tài
1. Tuyển chọn ñược các chủng xạ khuẩn có khả năng tạo chitinase cao.
2. Xác ñịnh các yếu tố ảnh hưởng ñến việc sản sinh và hoạt tính enzyme
chitinase từ các chủng xạ khuẩn tuyển chọn.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
- Ý nghĩa khoa học
+ Khai thác và bảo tồn nguồn gen quí của một nhóm vi sinh vật có khả năng
phân giải chitin, hợp chất phức tạp thành những chất ñơn giản, dễ sử dụng cho
các ñối tượng sinh vật hay phục vụ nghiên cứu khoa học.
- Ý nghĩa thực tiễn
+ Góp phần khai thác tiềm năng ứng dụng của các chủng xạ khuẩn trên hệ
thống canh tác ở Đắk Lắk.

3
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Enzyme vi sinh vật
Enzyme là protein có hoạt tính xúc tác. Các enzyme xúc tác cho hầu hết
các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống, ñảm bảo cho các quá trình
chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc ñộ nhịp nhàng cân ñối,
theo những hướng xác ñịnh. Như vậy, enzyme ñảm bảo cho sự trao ñổi thường
xuyên giữa cơ thể sống và môi trường ngoài, nghĩa là bảo ñảm ñiều kiện tiên
quyết cho sự tồn tại của cơ thể sống.
Enzyme có trong tất cả các cơ thể ñộng vật, thực vật và vi sinh vật. Sau khi
ñược tổng hợp enzyme có thể ñược tiết ra ngoài tế bào tồn tại trong các dịch của cơ
thể, dịch môi trường ñược gọi là enzyme ngoại bào (extracellular enzyme) hoặc giữ
lại bên trong tế bào gọi là enzyme nội bào (intracellular enzyme). Sự phân bố
enzyme không ñồng ñều giữa các loài, các tế bào mô và cơ quan khác nhau.
Trong các nguồn nguyên liệu ñể tách enzyme, vi sinh vật là nguồn nguyên
liệu thích hợp nhất ñể sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp.
Dùng vi sinh vật ñể thu nhận enzyme có những lợi ích chính như sau:
- Có thể chủ ñộng về nguồn nguyên liệu.
- Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn, khoảng 16 - 100 giờ. Do ñó có
thể thu hoạch hàng trăm lần trong một năm.
- Điều khiển sự tổng hợp enzyme ñể tăng lượng enzyme ñược tổng hợp
hoặc tổng hợp ñịnh hướng enzyme dễ dàng hơn các nguồn nguyên liệu khác.
- Giá thành thấp vì môi trường nuôi cấy vi sinh vật tương ñối ñơn giản rẻ tiền.
Tuy nhiên, ñiều ñáng lưu ý là một số vi sinh vật có khả năng sinh ñộc tố,
vì vậy cần có biện pháp xử lý thích hợp.
Khả năng tổng hợp enzyme của vi sinh vật chịu sự tác ñộng của nhiều yếu
tố khác nhau, trong ñó ñặc ñiểm chủng giống có tính quyết ñịnh. Ngoài ra, ñiều

kiện môi trường, trước hết là thành phần môi trường nuôi cấy cũng có vai trò
ñáng kể.

4
Để lựa chọn vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme mạnh có thể
tiến hành phân lập từ môi trường tự nhiên, gây ñột biến các chủng ñã ñược lựa
chọn hoặc cấy chuyển gen ñể nâng cao khả năng thu nhận enzyme hoặc tổng hợp
enzyme có ñịnh hướng.
Môi trường dinh dưỡng phải ñảm bảo những nhu cầu tối thiểu cho sự sinh
trưởng của vi sinh vật và sinh tổng hợp enzyme. Trong môi trường cần có các
chất chứa C, N, H, O và các chất vô cơ khác như mangan, canxi, fotfo, lưu
huỳnh, sắt, kali và một số chất khác [2], [16].
1.2. Đại cương về chitinase
Chitinase hay poly β-1,4 (2-acetamido-2-deoxy) - D - glucozid
glucanohydrolase, thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme thủy
phân chitin thành chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết
1,4 β-glucoside trong chitin. Mã số của chitinase EC 3.2.1.14 [23]. Chitinase
thuộc lớp 3 tổ 2 nhóm 1 số thứ tự là 14.
1.2.1. Phân loại chitinase
1.2.1.1. Phân loại theo phản ứng cắt
Chitinase ñược chia làm 2 phân nhóm chính:
- Endochitinase (EC 3.2.1.14) là nhóm enzyme phân cắt nội mạch chitin
một cách ngẫu nhiên tạo các ñoạn oligosaccharide.
- Exo chitinase ñược chia làm 2 phân nhóm:
+ Chitobiosidase = chitobiase (EC 3.2.1.29) xúc tác sự tạo thành liên tục
Diacetylchitibiose của sợi chitin.
+ β-1,4-N-acetylglucosaminidase (EC 3.2.1.30) tiếp tục phân cắt các
oligomer trên thành N-acetyl-D-glucosamine [24].
1.2.1.2. Phân loại theo cấu trúc phân tử
Chitinase ñược xếp vào hai họ Glycohydrolase:

- Họ Glycohydrolase 18

5
Là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180 chi ñược tìm thấy ở hầu hết các
loài thuộc Eukaryote, Prokaryote và Virus. Họ này bao gồm chủ yếu là chitinase,
ngoài ra còn có các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase và N-
acetylglucosaminidase.
Các chitinase thuộc họ glycohydrolase 18 ñược tổng hợp từ Aeromonas
hydrophila, Bacillus circularis, Tricoderma harzianum, Aphanocladium album,
Serratia marcescens…
Chitinase họ glycohdrolase 18 giữ nguyên cấu hình anomer tại vị trí phân
cắt nhờ cơ chế nghịch chuyển ñôi. Đến nay cấu trúc không gian ba chiều của một
vài enzyme thuộc họ này ñã ñược xác ñịnh như chitinase A của Serratia
marcescens, chitinase của Hevea brasiliensis, β-N-acetylglucosaminidase của
Flavobacterium menigoseptium và Streptomyces plicatus. Mặc dù ba protein này
ít tương ñồng với nhau về trình tự axit amin nhưng chúng ñều có cấu trúc xác
ñịnh gồm 8 sợi xoắn α và β cuộn tròn.
- Họ Glycohydrolase 19
Họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật, ngoài ra còn có
ở các xạ khuẩn như Streptomyces griceus, vi khuẩn như Haemophilus
influenzae…
Họ Glycohydrolase 19 bao gồm những chitinase thuộc nhóm I, II, IV,…
Chitnase thuộc họ 19 có cấu trúc hình cầu với các vòng α thông qua cơ
chế nghịch chuyển cấu hình anomer tại vị trí phân cắt. Đây là ñiểm khác biệt
chính so với họ Glycohydrolase 18 [24].
1.2.1.3. Phân loại theo trình tự amino axit
Dựa vào trình tự ñầu amin, sự ñịnh vị của enzyme, ñiểm ñẳng ñiện, peptit
nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại chitinase thành 5 nhóm:
- Nhóm I: gồm những ñồng phân trong phân tử có ñầu N giàu cystein nối
với tâm xúc tác thông qua một ñoạn giàu glycin hoặc prolin ở ñầu cacboxyl C

(peptit nhận biết). Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng ñối với sự gắn kết
enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt tính xúc tác. Nhóm 1 còn có

6
thể chia thành 2 nhóm: Ia hoặc Ib tùy thuộc vào enzyme thuộc tính axit hay
bazơ. Chitinase có ở thực vật thường ñịnh vị ở vị trí không bào.
- Nhóm II: gồm những ñồng phân trong phân tử chỉ có tâm xúc tác thiếu
ñầu cystein ở ñầu N và peptit nhận biết ở ñầu C, có trình tự amino axit tương tự
như trình tự chitinase nhóm I. Chitinase nhóm II có ở xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm,
thực vật và chúng ñược cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài.
- Nhóm III: có trình tự amino axit hoàn toàn khác với trình tự amino axit ở
nhóm I và nhóm II.
- Nhóm IV: gồm những ñồng phân chitinase, 41% - 47% trình tự amino
axit có ở tâm xúc tác của chúng giống với trình tự chủ yếu có ở cây 2 lá mầm,
amino axit ở nhóm I. Phân tử cũng có ñoạn giàu cystein nhưng kích thước phân
tử nhỏ hơn ñáng kể so với chitinase ở nhóm I.
- Nhóm V: Dựa trên cơ sở dữ liệu về trình tự người ta nhận thấy vùng gắn
với chitin (vùng giàu cystein) có thể ñã giảm ñi nhiều lần trong quá trình tiến hóa
gặp ở thực vật bậc cao.
1.2.2. Cấu trúc của chitinase
1.2.2.1. Cấu trúc phân tử
Nhiều enzyme phân cắt carbonhydrat ñược phát hiện có cấu trúc chia
vùng tương tự nhau. Blaak và cộng sự [21] tiến hành phân tích chitinase của thực
vật, nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn và ñã xác ñịnh ñược những vùng riêng biệt trong
cấu trúc của chitinase. Các chitinase của thực vật như: cây thuốc lá, ñậu, củ cải
ñường chỉ chứa duy nhất một trung tâm xúc tác. Chitinase của nấm men bao
gồm 4 vùng: trình tự báo hiệu, trung tâm xúc tác, vùng giàu serin/ threonin và
trung tâm gắn chitin ở ñầu C. Vùng giàu serin/ threonin hoạt tính như một chất
nhận tham gia trong sự glycosyl hóa nguyên tử oxy.
Bên cạnh ñó Wantanabe và cộng sự [20] ghi nhận loài Bacillus circulans

có chitinase A1 chứa tâm gắn chitin ở ñầu C, tâm xúc tác ở ñầu N và một vùng
chức năng thứ ba là vùng fipronectin kiểu III, nếu loại bỏ vùng này thì không

7
ảnh hưởng ñến sự gắn kết enzyme và cơ chất nhưng khả năng xúc tác của
enzyme thì bị giảm ñi.
1.2.2.2. Cấu trúc không gian của chitinase
- Cấu trúc không gian của chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18
Tâm của chitinase thuộc họ này tạo thành từ 8 thùy tròn α và β. Thùy số 8
cuộn vào bên trong cấu hình nhộng với vòng xoắn thể hiện như một chiếc nhẫn
hướng ra ngoài.

Hình 1.1. Mô hình cấu trúc không gian của chitinase ở
cây cao su Hevea brasiliensis
- Cấu trúc không gian của chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19
Cấu trúc không gian của chitinase thuộc họ này là phức hợp của cấu trúc
bậc 2, bao gồm 10 ñoạn helical và 1 phiến β ba sợi. Phân tích protein cho thấy có
nhiều nhóm tương tác kỵ nước bảo vệ tâm protein của cấu trúc bậc 3 [24].
1.2.3. Cơ chế tác dụng của chitinase
Chitinase xúc tác cho phản ứng thuỷ phân liên kết 1,4-β-glycozid trong
phân tử chitin, phân cắt dọc theo mạch carbon và sản phẩm chủ yếu là chitibiose
và chitotriose. Những chất này sau ñó lại tiếp tục bị phân cắt thành những
monomer là các N -acetyl -D -glucosamine [29].
Quá trình phân cắt tóm tắt như sau:
Chitinase Chitobiase
Chitin  chitobiose,chitotriose  N-acetyl-D glucosamin

8
Có hai cơ chế cho sự thuỷ phân: cơ chế giữ lại cấu tử β anomer trong sản
phẩm và cơ chế nghịch chuyển từ dạng β sang dạng α.

Ngoài ra ñể khảo sát sự phân cắt người ta sử dụng N-acetyl
chitoolygosaccharide thường ñược thuỷ phân bên trong trên một vài vị trí xác
ñịnh hoặc một cách ngẫu nhiên.
1.2.4. Đặc tính cơ bản của hệ chitinase
- Khối lượng phân tử
Chitinase ñược tìm thấy ở thực vật bậc cao hoặc tảo biển có trọng lượng
phân tử khoảng 30 kDa. Ở các loài thân mềm, ñộng vật có xương, trọng lượng
phân tử của chitinase khoảng 40-90 kDa, hoặc cao hơn khoảng 120 kDa. Trọng
lượng phân tử của chitinase thu nhận từ xạ khuẩn và vi khuẩn có khoảng biến
ñộng từ 30-120 kDa [24].
- Điểm ñẳng ñiện
Chitinase ở thực vật bậc cao và tảo có giá trị ñiểm ñẳng ñiện pI thay ñổi từ
3,0-10,0. Ở côn trùng, giáp xác, thân mềm và cá pI từ 4.7-9.3 và ở vi sinh vật từ
3,5-8,8 [29].
- Ảnh hưởng của nhiệt ñộ
Nhiệt ñộ tối ưu cho hệ chitinase ở hầu hết vi sinh vật là 40
0
C. Ngoại trừ
Aspergilus niger có khả năng tổng hợp chitinase hoạt ñộng trên cơ chất
glycochitin có nhiệt ñộ tối ưu là 50
0
C [29].
Tuy nhiên, tùy theo nguồn gốc thu nhận mà chitinase có thể có những giá
trị nhiệt ñộ tối ưu khác nhau.
- Ảnh hưởng của pH
Giá trị pH tối ưu (pH
opt
) ở thực vật bậc cao và tảo ñạt giá trị từ 4-9 của các
chitinase. Hệ chitinase ở ñộng vật là 4,8 – 7,5; ở vi sinh vật là 3,5 – 8,0.

9
pH
opt
của chitinase có thể phụ thuộc vào cơ chất ñược sử dụng. Chitinase
ñã ñược nghiên cứu có pH
opt
khoảng 5,0 khi cơ chất là chitin; pH
opt
của chitinase
khi cơ chất này là glycolchitin nằm trong khoảng pH kiềm yếu. Hoạt tính của
chitinase sẽ nhanh chóng bị ức chế bởi pH < 4,5 [24].
- Chất hoạt hóa và chất ức chế
+ Allosamidin
Allosamidin ức chế cạnh tranh với chitinase. Chất này có cấu tạo tương tự
dạng trung gian của cơ chất, có vòng oxazoline. Vòng này có thể ở giữa carbonyl
oxygen của nhóm N-acetyl và C
1
của N-acetylglucosamine trong quá trình thủy phân.
|
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của allosamidin và dẫn xuất của allosamidin

(demethylallosamidin và dimethylallosamidin)
Allosamidin và những dẫn xuất của nó chỉ ức chế chitinase ñược tổng hợp
từ tằm, tôm he và một số vi sinh vật như Piromyces communis, Streptomyces sp.
và Streptomyces olivaceoviridis. Gần ñây Allosamidin ñược phát hiện có khả
năng gắn kết và ức chế các chitinase thực vật (ña số thuộc họ Glycohydrolase
18). Allosamidin ức chế chitinase H ở cây củ cải với ID
50
(liều lượng 50% chất
ức chế) là 44.7µm.

Chitinase ñược tạo ra bởi Streptomyces sp. có khả năng tổng hợp hai loại
chitinase, một loại nhạy cảm Allosamidin và loại có tính ñề kháng. Như vậy,
Allosamidin và dẫn xuất của nó chỉ ức chế các chitinase thuộc họ
Glycohydrolase 18, không ức chế các enzyme thuộc họ Glycohydrolase 19 [13].
+ Styloguanidin

10
Styloguanidin là chất ức chế chitinase ñược tách chế từ loài hải miên
Stylotella aurantium. Tính ñặc hiệu, tính bền vững trong tự nhiên của những hợp
chất này vẫn chưa ñược biết rõ [24].
+ Các ion kim loại
Các ion kim loại Hg
2+
, Ag
+
là những chất ức chế ñối với chitinase. Các ion
Cu
2+
, có hai dạng chitinase, một bị ức chế và một ñược tăng cường nhờ Cu
2+

ñược tìm thấy ở một số loài cá và vi sinh vật.
+ Các chất khác
Dipeptit CI-4[cyclo-(L-Arg-D-Pro)] là một sản phẩm tự nhiên ñược tổng
hợp từ vi khuẩn nước mặn Pseudomonas IZ208. CI-4 ức chế việc phân tách tế
bào Sacchromyces cerevisiae. Về cơ chế, CI-4 ức chế chitinase họ 18 và có cấu
trúc giống chất trung gian phản ứng. Chất ức chế chitinase họ 18 có ảnh hưởng
ñến chu trình sống của nhiều loại nấm và ngăn cản sự truyền kí sinh trùng sốt rét
(Plasmodium falciparum) từ vật chủ ñến côn trùng.
Argifin và argadin là 2-peptid ức chế glycosidehydrolase, có thể ức chế

chitinase từ nồng ñộ nM - µM. Các peptide này gắn trực tiếp lên các gốc ở tâm
của enzyme và chiếm các vị trí -1, +1, +2. Mặc dù những chất ức chế này là
peptit nhưng chúng có nhiều nhánh bên bất thường như acetyl hay vòng thơm.
Huyết thanh Allbumin, ngược lại có vai trò làm tăng hoạt ñộng của
chitinase nhưng sự ảnh hưởng này chỉ rõ ràng sau 2-3 giờ ñầu của phản ứng.
1.2.5. Nguồn thu nhận chitinase
Chitinase hiện diện ở hầu hết các giới sinh vật. Đến nay ñã có nhiều
nghiên cứu của các nha khoa học trên thế giới về chitinase ở vi sinh vật, thực vật,
ñộng vật.
- Vi sinh vật
Vi khuẩn sản sinh chitinase nhằm ñáp ứng nhu cầu dinh dưỡng. Chúng
thường tổng hợp nhiều loại chitinase ñể có thể phân cắt ñược nhiều loại chitin ña
dạng trong sinh giới.

11
Chitinase ñược tìm thấy trong vi khuẩn như Chrombacterium, Klebsiella,
Pseudomonas, Clostridium, Vibrio, Aeromonas….
Các chủng nấm Trichoderma, Gliocladium, Calvatia…và ñặc biệt là các
nấm lớn như Lycoperdon, Corinus… có hàm lượng chitinase cao.
Chitinase của nấm có nhiều chức năng. Tương tự như ở vi khuẩn,
chitinase của nấm cũng ñóng vai trò quan trọng về mặt dinh dưỡng nhưng khác
là hoạt tính của chúng rất linh ñộng trong quá trình sinh trưởng và phát sinh hình
thái của nấm. Nguyên nhân, vì chitin là thành phần chính của vách tế bào nấm.
Chitinase của Trichoderma còn giữ vai trò quan trọng trong hoạt tính kí sinh của
nấm nhằm ñối kháng lại các nấm gây hại ở thực vật.
- Thực vật
Chitinase tham gia vào cơ chế tự vệ của thực vật nhằm chống lại các nấm
kí sinh hoặc các loại côn trùng như chitinase tách chiết từ cây cần tây có khả
năng ức chế sự phát triển của sợi nấm.
Một số thực vật bậc cao có khả năng tạo chitinase như như cao su (Heave

Brasiliensis), thuốc lá (Nicotiana sp), lúa mạch (Hodeum vulgare), cà rốt (Dacus
carota), hạt ñậu nành (Glycine max)…Một số loài tảo biển cũng là nguồn cung
cấp chitinase.
- Động vật
Từ một số ñộng vật nguyên sinh hoặc từ các mô, các tuyến khác nhau
trong hệ tiêu hóa của nhiều ñộng vật không xương như ruột khoang, giun tròn,
thân mềm, chân ñốt có thể thu nhận ñược chitinase. Đối với ñộng vật có xương
sống chitinase ñược tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày của các loài cá, lưỡng cư,
bò sát ăn sâu bọ, từ dịch dạ dày của chim thú ăn sâu bọ.
Ngoài ra chitinase còn ñược thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn trong
suốt quá trình phát triển và dịch chiết biểu bì của các loài chân ñốt trong giai
ñoạn thay vỏ, lột da. Chitinase ñã giúp côn trùng tiêu hóa lớp vỏ ngoài trong giai
ñoạn thay vỏ, lột da [24], [23], [27], [29].

12
1.2.6. Ứng dụng của chitinase
1.2.6.1. Trong nông nghiệp
Chitinase ức chế nấm bệnh côn trùng, chân ñốt bao gồm nhiều loại côn
trùng gây bệnh hại. Nấm chứa chitin bị ức chế bởi chitinase bao gồm: Fusarium,
Gliocladium, Rhizotinia, Trichoderma, Ustilago, Erysiphe, Botrytis, Sclerotium,
và Alternaria,… Côn trùng chứa chitin bị kìm hãm bởi chitinase bao gồm
Epidoptera, Trichoplusia (sâu cải), Orthoptera bao gồm châu chấu, Hemiptera
bao gồm bọ xít ở lúa.
Người ta có thể sử dụng chitinase như một tác nhân kiểm soát sinh học an
toàn và dễ phân hủy thay cho thuốc trừ sâu hóa học. Chtinase tinh sạch ñược
thực hiện bằng cách cho enzyme tiếp xúc với nấm hay côn trùng. Chitinase tinh
khiết có thể ñược sử dụng như một dung dịch và có nồng ñộ xác ñịnh (50-
100ppm) và ñược ứng dụng trong thuốc xịt hay một dịch ñặc chitinase tinh khiết
cùng hiện diện với chất mang gắn với nó (methylcellulose, gumArabic) ñược sử
dụng như là một loại thuốc bột [21].

1.2.6.2. Trong y dược
- Tổng hợp chitoolygosaccharide
Hiện nay hoạt tính sinh học của các chitoolygosaccharide ngày càng ñược
nghiên cứu sâu. Trong y học người ta sử dụng các oligomer chitohexaose và
chitoheptataose làm tác nhân kháng ung thư. Chitinase của Vibrio algjnolyticus
phân cắt huyền phù chitin thành chitopentaose và tritotriose.
N,N-diacetylchitobioase ñược sử dụng rộng rãi làm nguyên liệu khởi ñầu
cho việc sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học. Chitinase thu nhận từ S.
griseus có khả năng thủy phân chitin huyền phù thành chitobiose tiếp tục ñược
cải biến hóa học thành một dẫn xuất disacchaside mới 2-acetamido-2-Deoxy-D
allopyranosse. Đây là chất trung gian ñể tổng hợp nên những chất ức chế
enzyme.

13
Ngược lại có thể sử dụng chitinase của Bacillus ñể tổng hợp chitobiose
nhờ sự kết nối N-acetyl- D-glucosamine với dẫn xuất ñường oxalozin.
- Chuẩn ñoán các bệnh truyền nhiễm do vi nấm bằng chitinase
Các loài nấm chính liên quan ñến các bệnh cơ hội ở các bệnh nhân AIDS
là Candidosis, Cryptococcosis (nấm men), Histoplasmosis, coccidioimucosis
(nấm lưỡng hình). Những nguồn kháng nguyên của nấm (mannan của
Candidosis, glucuronoxylomanan có trong nấm men) có thể hoạt tính như là một
nhân tố ngăn chặn tế bào T trong sự phát triển của AIDS. Một lượng nhỏ kháng
nguyên của nấm có thể kích thích phản ứng miễn dịch, nhưng sự thừa thãi kháng
nguyên có thể gây ra tác ñộng ngược lên tính miễn dịch của tế bào. Do ñó, ñiều
cần thiết là việc ñiều trị phải ñược tiến hành một cách nhanh chóng và có hiệu
quả trước khi những tình trạng trên có ñiều kiện lan rộng.
Nhiều phương pháp chẩn ñoán bệnh nấm ñược dề xuất như ELISA, sự
ngưng kết kháng thể, mẫu dò phân tử… ñể phát hiện ñặc hiệu các nấm gây bệnh
trong các dịch cơ thể nhưng giá thành quá cao. Những bất lợi chung ở những
phương pháp hiện ñược sử dụng là khó áp dụng ñối với mẫu dịch cơ thể bởi vì

khó cố ñịnh ñược các mẫu này. Các phương pháp nhuộm như GMS (Grocott
methanamine AgNO
3
staining) dùng nhuộm cố ñịnh các tiêu bản nấm nhưng
không có tính ñặc hiệu cao và sử dụng các thiết bị ñắt tiền.
Chitin hiện diện nhiều trong hầu hết vách các tế bào nấm gây bệnh, ít nhất
là một giai ñoạn trong quá trình sống của nấm hay ở nấm men thì hiện diện trong
vết chồi. Do ñó cần một phương pháp nhuộm chitin ñặc biệt cho nấm tạo cơ sở
cho một phương pháp chuẩn ñoán nhanh chóng hiệu quả các loài nấm gây bệnh.
Hiện nay các nhà khoa học ñã ñề nghị một phương pháp chuẩn ñoán mới
các bệnh truyền nhiễm do nấm bằng cách sử dụng chitinase ñã ñược phân lập tạo
dòng từ Vibrio parahemolyticus (ñặt tên chitinase VP1) nó kết hợp chặt chẽ với
chition và có thể sử dụng như một mẫu dò trong việc chuẩn ñoán với ñộ nhạy

14
cao ñể nhận diện một cách ñặc hiệu các vách tế bào nấm hay những vết chồi
nấm men trong những lát cắt mẫu mô bệnh.
- Chế phẩm thuốc mới chitinase và các dược chất kháng nấm
Hiện nay các nhà khoa học ñề nghị sử dụng chitinase với các tác nhân
kháng nấm có thể chấp nhận khác nhằm bổ trợ cho hoạt tính nội sinh của
chitnase. Các tác nhân bao gồm:
- Amphotericin b và những phức chất có cấu trúc tượng tự nystatin và
pyramicin.
- 5-flourocytosin và các dẫn xuất azol như fluconazol, ketoconazol,
itraconazol, miconazol….
- Allylamine–thiocarbamate như tolnaftat, terbinafin, Griseofulvin, acid
undecylenic, bezoic…
Chitinase có thể phát huy hiệu quả của các tác nhân kháng nấm ở liều
lượng không gây tác dụng phụ cho bệnh nhân. Ngoài ra việc kết hợp giữa các
chitinase và laminarinase ñược ghi nhận là hữu hiệu hơn trong việc tấn công vào

vách tế bào nấm (so với chỉ dùng chitinase).
Các nhà khoa học ñã thử nghiệm hoạt tính kháng nấm của chtinase tái tổ
hợp trong cơ thể chuột và thỏ bị nhiễm các lạo nấm khác nhau thuộc nhóm
Aspergillus, Candida.
1.3. Đại cương về xạ khuẩn
1.3.1. Giới thiệu chung về xạ khuẩn
1.3.1.1. Sự phân bố và ý nghĩa của xạ khuẩn trong tự nhiên
Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong ñất, trong nước ao hồ,
một phần trong bùn và trong các chất hữu cơ khác, thậm chí trong cả cơ chất mà
vi khuẩn và nấm mốc không phát triển ñược. Xạ khuẩn có nhiều nhất trong lớp
ñất bề mặt, số lượng xạ khuẩn trong ñất không chỉ phụ thuộc vào loại ñất mà còn
phụ thuộc vào mức ñộ canh tác của ñất và khả năng bao phủ của thực vật. Đất
giàu dinh dưỡng và lớp ñất bề mặt (40cm) thường có số lượng xạ khuẩn lớn. Số
ñơn vị hình thành khuẩn lạc (CPU) của xạ khuẩn trong 1g ñất canh tác thường

15
ñạt tới hàng triệu mầm xạ khuẩn, trong ñất hoang hóa chỉ khoảng 10000 –
100000. Số lượng xạ khuẩn trong ñất cũng thay ñổi theo thời gian trong năm.
Xạ khuẩn cũng thường sống trên các cây chết, rơm rạ, thường hoại sinh
nhưng có thể kí sinh ở thân cây, ở củ và rễ cây. Một số nghiên cứu cũng cho thấy
sự có mặt của xạ khuẩn trong trầm tích biển như các loài Actinomyces halophia,
Actinomyces mortivalis và Actinomyces iraquensis, Actinomyces như
Actinomyces antibioticus (MU106, MU 107) Actinomyces rimosus (MU114)
hoặc trong các mẫu nước và bùn ao nuôi trồng thủy sản ñặc biệt là lớp bùn nơi
xác các hợp chất hữu cơ lắng ñọng nhiều.
Xạ khuẩn ñược nghiên cứu một cách sâu sắc vì chúng có ý nghĩa quan
trọng trong tự nhiên, tích cực tham gia vào các quá trình chuyển hóa nhiều hợp
chất trong ñất, trong nước, chúng có vai trò rất quan trọng trong chu trình tuần
hoàn vật chất. Chúng sử dụng axit humic và các chất hữu cơ khó phân giải khác
trong ñất. Bên cạnh ñó, chúng còn sản sinh nhiều sản phẩm trao ñổi chất quan

trọng nên ñược dùng ñể sản xuất nhiều loại enzyme như protease, amilase,
celulase, glucoiomerase; chitinase …; các vitamin và các acid hữu cơ. Người ta
hi vọng rằng có thể sử dụng một số loại xạ khuẩn ñể chế biến một số loại thực
phẩm thay cho nấm mốc, vì nhiều nấm mốc có thể sinh ñộc tố aflatoxin. Một ñặc
ñiểm quan trọng của xạ khuẩn là là khả năng sinh chất kháng sinh. Nhiều nghiên
cứu trên thế giới cho thấy có tới trên 70% xạ khuẩn phân lập từ thiên nhiên có
khả năng này. Trong số khoảng 8000 chất kháng sinh hiện ñã ñược biết ñến trên
thế giới thì trên 80% ñược tạo từ xạ khuẩn. Một số xạ khuẩn (thuộc chi Frankia)
có thể tạo nốt sần trên rễ một số cây không thuộc bộ ñậu và có khả năng cố ñịnh
nitơ không khí thành dạng dễ sử dụng cho cây. Tuy nhiên, bên cạnh những xạ
khuẩn có ích thì một số ít xạ khuẩn kỵ khí hoặc vi hiếu khí có thể gây bệnh cho
người, cho ñộng vật và cho cây trồng. Chúng sống trên rễ cây hoặc củ và gây
bệnh, nhất là vùng ñất kiềm, ñất cát khi thời tiết khô hạn, làm cho củ lở loét, sần
sùi ngay từ ngoài ñộng ruộng [4], [5], [11], [17], [32].
1.3.1.2. Vị trí của xạ khuẩn trong sinh giới

16
Trước ñây, vị trí phân loại của xạ khuẩn luôn là câu hỏi gây nhiều tranh
luận giữa các nhà Vi sinh vật học, do nó có những ñặc ñiểm vừa giống Vi khuẩn
vừa giống Nấm. Trước thế kỷ 19, xạ khuẩn ñược xếp vào nhóm nấm. Tuy nhiên,
ñến nay, khi ñã nghiên cứu sâu hơn người ta ñã tìm ra các bằng chứng về mối
liên hệ giữa xạ khuẩn và vi khuẩn như:
- Một số xạ khuẩn như các loài thuộc chi Actinomyces và Nocardia rất
giống với các loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và Corynebacterium.
- Xạ khuẩn giống vi khuẩn ở chỗ không có nhân thật, chúng chỉ chứa
nhiễm sắc chất phân bố dọc theo các sợi hoặc các tế bào.
- Đường kính của sợi xạ khuẩn và bào tử giống với ở vi khuẩn. Đồng thời
sợi xạ khuẩn thường không chứa vách ngăn.
- Xạ khuẩn là ñích tấn công của các thực khuẩn thể giống như vi khuẩn,
trong khi ñó, nấm không bị tấn công bởi thực khuẩn thể.

- Xạ khuẩn thường nhạy cảm với các kháng sinh có tác dụng lên vi khuẩn,
nhưng lại thường kháng với những kháng sinh tác dụng lên nấm như các polyen.
- Xạ khuẩn không chứa chitin, chất có mặt trong sợi và bào tử của nhiều
nấm, mà không có ở vi khuẩn. Đồng thời giống như phần lớn vi khuẩn, xạ khuẩn
không chứa cellulose.
- Tương tự với vi khuẩn, xạ khuẩn nhạy cảm với phản ứng axit của môi
trường, ñặc ñiểm này không có ở nấm.
- Các ñặc ñiểm về sợi và nang bào tử kín (sporangium) của chi Actinoplanes
cho thấy có thể chi này là cầu nối giữa vi khuẩn và các nấm bậc thấp.
Từ những ñặc ñiểm trên, nên xạ khuẩn ñược xếp vào nhóm vi khuẩn thật
Eubacteria.
Xạ khuẩn thuộc về nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), lớp Actinobacteria,
bộ Actinomycetales, bao gồm 10 dưới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài. Hiện nay,
478 loài ñã ñược công bố thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc tất cả
các chi còn lại và ñược xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm [4], [5].


17
1.3.2. Hình thái, kích thước và cấu tạo của xạ khuẩn
1.3.2.1. Đặc ñiểm hình thái của xạ khuẩn
Trên môi trường ñặc, xạ khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc khô, có
bề mặt khô nhám. Kích thước khuẩn lạc thay ñổi tùy từng loài và ñiều kiện môi
trường. Khuẩn lạc xạ khuẩn không trơn ướt như ở vi khuẩn, nấm men, có các
nếp tỏa ra theo hình phóng xạ vì vậy mới có tên gọi là xạ khuẩn (actinomycetes,
tiếng Hi Lạp: Aktis là “tia”, mykes là “nấm”). Khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc.
Mặt khuẩn lạc xù xì, có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo.
Khuẩn lạc của xạ khuẩn không thể lẫn với khuẩn lạc của nấm mốc vì khuẩn ty
của xạ khuẩn thường mảnh hơn của nấm mốc (khuẩn ty cơ chất 0,8 µm; khuẩn ty
khí sinh 1,14 µm) ñường kính khuẩn ty nấm thường lớn hơn khoảng 10 lần so
với ñường kính khuẩn ty của xạ khuẩn.

Đa số xạ khuẩn có cấu tạo dạng sợi, các sợi kết với nhau tạo khuẩn lạc có
nhiều màu sắc khác nhau: trắng, vàng, nâu, tím, xám
Xạ khuẩn có hệ khuẩn ty phát triển tốt, khuẩn ty không có vách ngăn và
không tự ñứt ñoạn, bắt màu gram dương, háo khí, hoại sinh, không hình thành
nha bào, không có lông và giáp mô, ña hình thái như dạng hình chùy, dạng phân
nhánh hay dạng sợi dài gọi là khuẩn ty (hipha) hay phân nhánh chùm, thành bó
gọi là khuẩn ty thể (mycelium). Kích thước và khối lượng khuẩn ty thể thường
không ổn ñịnh, chúng phụ thuộc vào từng loại ñiều kiện môi trường nuôi cấy.
Các khuẩn ty non và các khuẩn ty có mang bào tử thường lớn hơn khuẩn ty già
và không mang bào tử.
Khuẩn lạc xạ khuẩn có những vòng tròn ñồng tâm cách nhau một khoảng
nhất ñịnh, nguyên nhân là do xạ khuẩn sinh ra các chất ức chế sinh trưởng, khi
sợi mọc qua vùng này chúng sinh trưởng yếu ñi, qua ñược vùng có chất ưc chế
chúng lại sinh trưởng mạnh thành vòng tiếp theo, vòng này lại sinh ra chất ức
chế sinh trưởng khiến khuẩn ty lại phát triển yếu ñi. Cứ thế tạo thành khuẩn lạc
có các dạng vòng tròn ñồng tâm.

18
Khuẩn lạc xạ khuẩn thường có 3 lớp gồm lớp vỏ ngoài là các sợi bền
chặt, lớp trong tương ñối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Khuẩn ty trong
mỗi lớp có hoạt tính sinh học khác nhau. Các sản phẩm trong quá trình trao
ñổi chất như chất kháng sinh, ñộc tố, enzyme, vitamin, axit hữu cơ ñược
tích lũy trong mỗi lớp khác nhau. Khuẩn lạc của xạ khuẩn có mầu sắc khác
nhau như ñỏ, da cam, vàng, lam, tím tùy thuộc vào loại xạ khuẩn và ñiều
kiện ngoại cảnh. Có loại xạ khuẩn tạo sắc tố tan trong môi trường nuôi cấy,
thường gặp các loại mang màu: xanh, tím, ñỏ, da cam, vàng, lục, nâu và ñôi
khi màu ñen [5], [11], [17].
1.3.2.2. Cấu tạo tế bào
Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram dương, toàn bộ
cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính là thành tế bào, màng sinh

chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập.
Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác
dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp: lớp
ngoài cùng dày khoảng 60-120A
0
, khi già có thể ñạt tới 150-200A
0
; lớp giữa rắn
chắc, dày khoảng 50A
0
; lớp trong dày khoảng 50A
0
. Các lớp này chủ yếu cấu
tạo từ các lớp copeptide bao gồm các gốc N-axetyl glucozamine liên kết với N-
axetyl muramic bởi các liên kết 1,4-glucozit. Khi xử lý bằng lyzozyme, các liên
kết 1,4-glucozid bị cắt ñứt, thành tế bào bị phá huỷ tạo thành thể sinh chất
(protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá huỷ khi xử lý tế bào với hỗn hợp este
chlorofom và các dung môi hoà tan lipid khác.
Màng sinh chất xạ khuẩn dày, khoảng 50nm, có cấu trúc tương tự màng tế
bào chất của vi khuẩn. Chức năng chủ yếu của màng sinh chất là ñiều hòa sự hấp
thu các chất dinh dưỡng vào tế bào, ngoài ra nó còn tham gia vào quá trình hình
thành bào tử. Trong quá trình hình thành bào tử, màng sinh chất ăn sâu vào phía
trong khuẩn ty, tạo thành một cái gờ hình vành khăn theo mặt cắt, sau ñó hình

19
vành khăn phát triển sâu vào phía trong trung tâm và dần dần liền lại với nhau
gồm hai lớp, dày khoảng 25nm.
Tế bào chất của xạ khuẩn cũng không khác gì mấy so với tế bào chất của
vi khuẩn. Đặc ñiểm này làm cho người ta tưởng nhầm xạ khuẩn là cùng loại với
vi khuẩn.

Điểm giống nhau cơ bản giữa xạ khuẩn và vi khuẩn là nhân không có cấu
trúc ñiển hình. Khi còn non, toàn bộ tế bào chỉ có một nhiễm sắc thể sau ñó hình
thành nhiều hạt rải rác trong toàn bộ hệ khuẩn ty (gọi là hạt cromatin).
Các thể ẩn nhập nằm trong tế bào chất của xạ khuẩn, gồm có các hạt
polyphotphat (hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm Soudan III), các hạt
polysaccarit (bắt màu với dung dịch Lugol) [5], [17].
1.3.3. Sinh sản
Xạ khuẩn sinh sản sinh dưỡng bằng bào tử. Bào tử ñược hình thành trên
nhánh phân hóa từ khuẩn ty khí sinh gọi là cuống sinh bào tử, ñược hình thành
theo kiểu kết ñoạn (fragmentation) hoặc cắt khúc (segmentation).
- Kiểu kết ñoạn: hạt cromatin phân chia phân bố ñồng ñều dọc theo cuống
sinh bào tử. Sau ñó tế bào tập trung bao bọc quanh mỗi hạt cromatin gọi là tiền
bào tử. Tiền bào tử hình thành màng tạo thành màng nằm trong cuống sinh bào
tử. Bào tử thường có hình cầu hoặc ô van, ñược giải phóng khi màng cuống sinh
bào tử bị phân giải hoặc bị tách ra.
- Kiểu cắt khúc: hạt cromatin phân chia phân bố ñồng ñều dọc theo cuống sinh
bào tử. Sau ñó giữa các hạt hình thành vách ngăn ngang, mỗi phần ñều có tế bào chất.
Bào tử hình thành theo cách này thường có hình viên trụ hoặc hình que.
Bào tử xạ khuẩn ñược bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu protein
với ñộ dày khoảng 300-400 A
0
chia 3 lớp. Các lớp này tránh cho bào tử khỏi
những tác ñộng bất lợi của ñiều kiện ngoại cảnh như nhiệt ñộ, pH…Hình dạng,

20
kích thước chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là những tính trạng tương ñối
ổn ñịnh và là ñặc ñiểm quan trọng dùng trong phân loại xạ khuẩn.
Ngoài ra, xạ khuẩn còn sinh sản bằng khuẩn ty. Các ñoạn khuẩn ty gãy ra
môi trường phát triển thành hệ khuẩn ty [5], [17].

Hình 1.3. Một số dạng bào tử ở xạ khuẩn
1.4. Tình hình nghiên cứu chitinase trong và ngoài nước
1.4.1. Ngoài nước
Trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về chitinase.
Anke và Terwisscha van Scheltinga (1995) nghiên cứu sự thủy phân
chitin bằng chitinase thực vật, chứng minh chitinase có vai trò quan trọng
trong hệ thống bảo vệ chống lại sự xâm nhiễm của nấm bệnh và stress [18].
Năm 1998, Wen-Chi Hou và cộng sự nghiên cứu hoạt ñộng của chitinase
thu nhận từ khoai lang có pH tối ưu là 5, nhiệt ñộ tối ưu là 25
0
C [31].
Năm 2002, Kyoung Ja Kim và cộng sự nghiên cứu tách chiết và tinh
sạch chitinase từ Streptomyces sp M20.
Chitinase thu nhận từ dịch môi trường
nuôi cấy Streptomyces sp M20, ñược kết tủa bởi (NH
4
)
2
SO

4
và lọc gel

21
Sephadex G – 100, thu ñược chitinase có khối lượng lớn nhất là 20 kDa, có
pH
opt
là 5 và nhiệt ñộ tối ưu là 30
o
C [25].
Năm 2004, Neetu Dahiya và cộng sự nghiên cứu tinh sạch và xác ñịnh
hoạt tính của chitinase từ Enterobacteria sp. NRG4.
Chitinase thu nhận từ
dịch môi trường nuôi cấy
Enterobacteria sp. NRG4,
kết tủa bởi (NH
4
)
2
SO
4
và
lọc gel Sephadex G – 200 thì thu ñược chitinase có pH
opt
là 5.5 và nhiệt ñộ tối
ưu là 45
o
C [20].
M. H. El-Katatny và cộng sự
(2000)

, nghiên cứu sản xuất chitinase và
1,3-glucanase từ Tricoderma harzianum, tổng hợp chitinase có hoạt tính cao
nhất ở 7 ngày nuôi cấy, nhiệt ñộ tối ưu là 30
0
C, pH tối ưu là 6 [26].
1.4.2. Trong nước
Ở Việt Nam, cùng với sự phát triển của nhiều ngành công nghệ sinh học,
việc thu nhận, tách chiết, ñánh giá hoạt tính enzyme cũng ñược nghiên cứu.
Nhóm sinh viên Nguyễn Thị Hồng Thương và cộng sự (2003), trường Đại
học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG Tp Hồ Chí Minh ñã tiến hành nghiên cứu và
chỉ ra rằng hoạt tính chitinase trong dịch chiết môi trường nuôi cấy nấm mốc khi
ñược cảm ứng bằng chitin từ vách tế bào nấm mốc thì cao hơn khi cảm ứng bằng
chitin từ vỏ tôm. Hoạt tính chitinase tách chiết từ Trichoderma hamatum nuôi
cấy trên môi trường LNM loại bỏ glucose và bổ sung vách tế bào nấm có nhiệt
ñộ tối ưu là 40
o
C biên ñộ nhiệt từ 20 – 70
o
C, pH tối ưu là 4.5 biên ñộ pH là 4.0 –
6.0. Động học thời gian phân cắt enzyme là 5 giờ [14].
Song song với việc nghiên cứu chitinase ở vi sinh vật thì cũng có những
nghiên cứu thu nhận chitinase từ thực vật. Điển hình có công trình của PGS.TS.
Nguyễn Anh Dũng, Nguyễn Quang Nhân ñã nghiên cứu thu nhận, tách chiết và
xác ñịnh tính chất của chitinase từ mủ cao su Hevea brasiliensis (2008),
chitinase tinh sạch từ mủ cao su có nhiệt ñộ tối ưu 55
0
C, pH tối ưu 4,5 [10].
Đặng Trung Thành nghiên cứu thu nhận chitinase từ cây khoai lang
(2008), chitinase thu nhận từ lá có hoạt tính cao nhất và giảm dần ñến cuống lá

22
và dây khoai, chitinase trong lá khoai lang bị tổ thương có hoạt tính cao hơn
trong lá không bị tổn thương. [12].
Nhìn chung các công trình ñều tập trung vào nghiên cứu tách chiết và xác ñịnh
tính chất của chitinase từ các nguồn khác nhau. Để góp phần tham gia vào việc
nghiên cứu chitinase từ vi sinh vật, chúng tôi ñề xuất ñề tài “Nghiên cứu và tuyển
chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính chitinase tại thành phố Buôn Ma Thuột”.













23
CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập, tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính chitinase.
2. Nghiên cứu ảnh hưởng của ñiều kiện nuôi cấy ñến hoạt tính chitinase
của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn.
3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố ñến hoạt tính chitinase của
các chủng xạ khuẩn tuyển chọn trong phản ứng xúc tác.
4. Định danh chủng xạ khuẩn tuyển chọn.

2.2. Vật liệu và ñịa ñiểm nghiên cứu
2.2.1. Vật liệu
Đối tượng nghiên cứu
- Các chủng xạ khuẩn ñược phân lập từ các mẫu ñất thu ñược trên ñiạ bàn
thành phố Buôn Ma Thuột.
Hóa chất
Hóa chất sử dụng: KNO
3
, H
2
HPO
4
, MgSO
4
.7H
2
O, NaCl, FeSO
4
.7H
2
O,
chitin, agar, glucose, thuốc thử DNS, N-acetyl-D-glucosamine, NaOH, acid
citric, trinatri citrate, NaH
2
PO
4
, Na
2
HPO
4

.12H
2
O, glycine, HCl, acid acetic, natri
acetate, Na
2
CO
3
.
Thiết bị
Máy li tâm lạnh, nồi cách thủy, nồi hấp, tủ sấy, tủ ấm, máy lắc, máy lắc
gia nhiệt, máy ño OD, máy cất nước, tủ lạnh -24
o
C và 4
o
C, box cấy vô trùng, cân
ñiện tử, kính hiển vi, kính lúp soi nổi, que cấy, ñĩa petri, ống nghiệm
2.2.2. Địa ñiểm nghiên cứu
Thí nghiệm ñược tiến hành nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh
học thực nghiệm, Khoa Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, trường Đại học Tây
Nguyên.

24
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp phân lập và giữ giống các chủng xạ khuẩn có hoạt tính
chitinase
* Chuẩn bị môi trường
MT1 là môi trường Gause cải biến dùng phân lập và giữ giống các chủng
xạ khuẩn có khả năng tạo chitinase.
Thành phần môi trường: Chitin huyền phù 1% 250ml; K
2

HPO
4
0,5g;
MgSO
4
.7H
2
O 0,5g; KNO
3
1,0g; NaCl 0,5g; FeSO
4
,7H
2
O 0,01g; Agar 20g; nước
máy ñến 1000ml; pH 7,2 – 7,4
Khử trùng 1atm, 45 phút.
* Phương pháp thu mẫu
- Mẫu ñất ñược lấy ngẫu nhiên ở ñộ sâu 0-30cm trên các ruộng, vườn tại
Buôn Ma Thuột. Phân tích mẫu ngay sau khi thu mẫu.
* Phương pháp phân lập
- Mẫu ñược nghiền mịn trong cối sứ vô trùng.
- Cân 1 gam mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước muối 0,1% vô
trùng. Lắc trong 5 phút. Thực hiện pha loãng dung dịch mẫu theo hệ số thập
phân từ 10
-1
- 10
-6
. Chọn 4 ñộ pha loãng 10
-3
, 10

-4
, 10
-5
, 10
-6
ñể cấy trải.
- Dùng pipetman vô trùng lấy 0,1 ml dung dịch mẫu ở các ñộ pha loãng
khác nhau vào ñĩa petri chứa môi trường MT1, dàn ñều bằng que gạt thủy tinh.
Mỗi ñộ pha loãng thực hiện 3 ñĩa petri.
- Ủ các ñĩa trên ở ñiều kiện nhiệt ñộ phòng trong 3-7 ngày, chọn các
khuẩn lạc ñặc trưng của xạ khuẩn cấy truyền sang ống nghiệm thạch nghiêng
chứa môi trường MT1. Làm thuần giống bằng phương pháp tạo khuẩn lạc ñơn.
- Quan sát, mô tả hình thái khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn phân lập ñể
nhận diện và xác ñịnh xạ khuẩn.
*Phương pháp giữ giống và bảo quản các chủng xạ khuẩn

25
Các chủng xạ khuẩn sau khi ñược xác ñịnh cấy vào môi trường thạch
nghiêng. Sau 7 ngày, khuẩn ty phát triển tốt sẽ bảo quản ở 4
0
C trong tủ lạnh. Cấy
chuyền ñịnh kỳ các ống giống sau 1- 2 tháng [3], [6], [7], [15].
2.3.2. Phương pháp tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính chitinase cao
2.3.2.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy xạ khuẩn
MT2 là môi trường nuôi cấy xạ khuẩn ñể thu enzyme chitinase.
Thành phần môi trường: chitin huyền phù 1% 250ml; K
2
HPO
4
0,5g;

MgSO
4
.7H
2
O 0,5g; KNO
3
1,0g; NaCl 0,5g; FeSO
4
.7H
2
O 0,01g; nước cất ñến
1000ml; pH 7,2 – 7,4
Khử trùng 1atm, 45 phút.
2.3.2.2. Phương pháp thu dịch enzyme xạ khuẩn
Các chủng xạ khuẩn phân lập ñược nuôi cấy trong môi trường MT2. Sau 7
ngày, ly tâm 7000 vòng/phút, thời gian 15 phút ñể thu dịch enzyme. Xác ñịnh
hoạt tính enzyme chitinase bằng phương pháp ñịnh lượng ñường khử với thuốc
thử DNS (acid dinitrosalycylic).
2.3.2.3. Phương pháp xác ñịnh hoạt tính enzyme chitinase bằng ñịnh lượng
ñường khử với thuốc thử DNS
* Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên sự thủy phân cơ chất chitin huyền phù 1% bằng
enzyme chitinase và phản ứng tạo màu giữa ñường khử với thuốc thử 3,5-acid
ñinitrosalycylic. Enzyme chitinase sau phản ứng thủy phân chitin sẽ tạo ra một
lượng ñường khử N-acetyl-D-glucosamin. Đường khử sẽ phản ứng với thuốc thử
acid 3,5-ñinitrosalycylic (màu vàng) tạo thành phức màu ñỏ cam. Cường ñộ màu
của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng ñộ ñường khử trong một phạm vi nhất
ñịnh. Định lượng sản phẩm quá trình phân giải chitin bằng máy ño quang phổ ở
bước sóng 540nm. Dựa theo ñồ thị ñường chuẩn của N-acetyl-D-glucosmin tinh
khiết với thuốc thử acid 3,5-ñinitrosalycylic sẽ tính ñược hàm lượng ñường khử

của mẫu nghiên cứu.