Phân lập và tuyển chọn một số chủng bacillus thuringiensis có độc tính cao đối với côn trùng hại cây trồng

LỜI CẢM ƠN
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Ths. Nguyễn Thị Thu Hằng – Bộ
môn Giống và Công nghệ Sinh học – Khoa Lâm học – Trường Đại học Lâm
nghiệp đã tận tình trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tơi trong q trình thực
hiện khóa luận này.
Tôi xin gởi lời cảm ơn đến thầy cô giáo trường Đại học Lâm nghiệp đã
giảng dạy cho tôi những nền tảng kiến thức vững chắc để có thể tiếp thu tốt
hơn những kiến thức khoa học mới và tạo cho tôi cơ hội học hỏi quý giá này.
Cùng với lịng biết ơn sâu sắc gứi tới tồn thể các thầy, cô và các anh,
chị trong Bộ môn Giống và Cơng nghệ sinh học, gia đình, bạn bè, những
người đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập.
Hà Nội, tháng 5 năm 2010
Sinh viên

Trần Văn Tiến


ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, khơng khí với độ ẩm cao là
điều kiện thuận lợi cho các lồi sâu hại cây Nơng - Lâm nghiệp phát triển.
Khi muốn bảo vệ năng suất cây trồng, ngƣời nơng dân thƣờng sử dụng
thuốc hố học với nồng độ cao để phun ngay sau khi dịch sâu hại bùng phát.
Đối với cây lâm nghiệp, mỗi khi dịch xuất hiện ở vƣờn ƣơm, các cánh rừng
trồng thì số lƣợng hố chất phải dùng là rất lớn. Trung bình mỗi ha cây trồng
phải phun từ 5 – 7 kg thuốc. Điều đó quả thực là một vấn đề nghiêm trọng địi
hỏi các nhà khoa học nói chung và các nhà bảo vệ thực vật nói riêng cần
nghiên cứu và xem xét một cách đầy đủ, bởi thuốc hoá học tuy dập tắt đƣợc
nạn dịch nhanh nhƣng cũng là con dao hai lƣỡi, sẽ trực tiếp phá huỷ môi
trƣờng sống ở khu sản xuất đó, ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sức khoẻ của con
ngƣời, làm giảm số lƣợng sinh vật có lợi cho con ngƣời nhƣ chim chóc, tơm,
cá, những ký sinh thiên địch nhƣ bọ rùa, ong ký sinh…

Trong khi đó việc sử dụng thuốc trừ sâu sinh học có nguồn gốc từ vi
khuẩn, vi nấm, virus, côn trùng, thảo mộc đã đƣợc chứng minh rất an toàn đối
với ngƣời và gia súc, không gây ô nhiễm môi trƣờng, không giết chết thiên
địch sâu hại và sinh vật có ích, có thể duy trì cân bằng sinh thái, khơng ảnh
hƣởng đến chất lƣợng nơng, lâm sản...
Thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bacillus thuringiensis (đƣợc tiêu thụ
nhiều nhất trong số các loại thuốc trừ sâu sinh học) vẫn chƣa phổ biến.
Nguyên nhân là do thói quen sử dụng thuốc trừ sâu hố học đã ăn sâu vào
tiềm thức ngƣời nơng dân nƣớc ta; thuốc trừ sâu sinh học sản suất trong nƣớc
có hiệu lực chƣa cao, tính ổn định cịn thấp; thuốc trừ sâu sinh học nhập ngoại
thì có giá thành cao; việc sử dụng thuốc trừ sâu hoá học vừa tiết kiệm hơn về
chi phí, vừa đạt đƣợc hiệu quả tiêu diệt sâu nhanh hơn…
Trong công nghiệp sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh, yếu tố giống vi sinh
vật giữ vai trò quyết định năng suất, chất lƣợng, sản lƣợng và giá thành sản
1


phẩm nên công tác phân lập, tuyển chọn và bảo quản chủng giống có ý nghĩa
rất quan trọng. Vì vậy, cần tiếp tục phát triển hƣớng nghiên cứu phân lập,
tuyển chọn, ứng dụng, phân loại, nâng cao độc tính diệt sâu cũng nhƣ thúc
đẩy sử dụng thuốc trừ sâu Bt trong Nông – Lâm nghiệp.
Xuất phát từ thực tế trên, tôi tiến hành đề tà nghiên cứu “Phân lập và
tuyển chọn một số chủng Bacillus thuringiensis có độc tính cao đối với
côn trùng hại cây trồng”

2


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thuringiensis
Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thuringiensis (Bt) ra đời và
phát triển cùng với sự phát triển khoa học kỹ thuật của nhân loại, Bt đƣợc
nghiên cứu và ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác nhau [21], [6].
Năm 1901, Ishiwatari Shigetane - nhà sinh vật học ngƣời Nhật - khi
đang thực hiện một cuộc điều tra nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh Sotto gây
chết đột ngột, giết chết nhiều quần thể tằm, đã phân lập đƣợc một loại vi
khuẩn (chính là Bacillus thuringiensis) là nguyên nhân gây bệnh, và ông đã
đặt tên loại vi khuẩn đó là Bacillus sotto. Đây chính là lần đầu tiên con ngƣời
phát hiện ra vi khuẩn Bt.
Đến năm 1911, Ernst Berliner - nhà sinh vật học ngƣời Đức - đã phân
lập đƣợc vi khuẩn giết hại mối Mediterranean flour. Ơng phát hiện ra đây
chính là lồi vi khuẩn mà Ishiwatari Shigetane đã công bố, đặt tên lại cho loài
vi khuẩn này là Bacillus thuringiensis (hay Bt), xuất phát từ địa danh Thurigia
là một thị trấn nhỏ ở Đức, nơi đã phát hiện ra con mối đó.
Năm 1915, Ernst Berliner tiếp tục đƣa ra báo cáo về một loại độc tố có
bản chất là protein đƣợc Bt sản sinh ra trong cơ thể, theo ơng đó chính là
ngun nhân khiến các con mối bị giết hại. Tuy nhiên, tác dụng và cơ chế
hoạt động của loại protein này vẫn chƣa đƣợc khám phá.
Năm 1920, những ngƣời nông dân ở các trang trại lớn tại các nƣớc phát
triển bắt đầu sử dụng sinh khối vi khuẩn Bt phun cho cây trồng nhƣ một loại
thuốc phòng trừ sâu bệnh. Đặc biệt là nƣớc Pháp, đã sớm bắt đầu chế tạo các
loại thuốc có nguồn gốc từ bào tử và xác của Bt, gọi là Sporine.
Năm 1956, Hannay, Fitz-James và Angus đã nghiên cứu và phát hiện ra
tác nhân chính quyết định khả năng tiêu diệt mối và sâu bọ của Bt là các phân
tử protein đƣợc sản sinh trong cơ thể vi khuẩn Bt, từ đó mở ra hƣớng nghiên
3


cứu mới của các nhà khoa học về tác nhân, cơ chế diệt sâu và di truyền của

Bt.
Từ năm 1958, các chế phẩm thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt bắt đầu
đƣợc sử dụng rộng rãi ở Mỹ, Anh, Đức… Tới năm 1961, Bt đƣợc đánh giá là
một loại thuốc trừ sâu thân thiện với con ngƣời và môi trƣờng trong chiến
lƣợc phát triển nông nghiệp của tổ chức bảo vệ môi trƣờng EPA
(Environmental Protection Agency) của Mỹ. Năm 1977, đã có 13 lồi vi
khuẩn Bt đƣợc phát hiện và công bố. Các nghiên cứu và khám phá về phổ
kháng của Bt cho thấy Bt không chỉ gây độc duy nhất với một giai đoạn nhất
định của các con ấu trùng của bộ cánh vảy, mà còn gây độc cả với ấu trùng
của bộ cánh cứng.
Từ năm 1980 trở đi, ý thức của con ngƣời với vấn đề môi trƣờng sống
tăng cao, khả năng kháng độc của sâu bệnh với các loại thuốc hoá học kể cả
các loại cực độc nhƣ DDT và 666… ngày càng gia tăng. Đồng thời, con ngƣời
cũng phát hiện đƣợc lƣợng tồn dƣ các hố chất phịng trừ sâu hại đƣợc tích
luỹ và gia tăng dần trong môi trƣờng sống gây ảnh hƣởng nghiêm trọng tới hệ
sinh thái và sức khoẻ con ngƣời. Để giải quyết những vấn đề đó, các chế
phẩm thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi bởi
tinh thể độc do Bt tiết ra có bản chất là một loại protein, dễ dàng bị phân huỷ
nhanh chóng trong mơi trƣờng, khơng ảnh hƣởng đến sức khoẻ con ngƣời, vật
nuôi...
Ngày nay, các nhà khoa học đã phát hiện ra hơn 1000 sự biến dạng của
độc tố trong cơ thể Bt. Bên cạnh đó, sự phát triển nhanh chóng của sinh học
phân tử giúp các nhà khoa học ứng dụng công nghệ GMO (Genetically
Modifie Organisms) trong chuyển gen điều khiển sự sản sinh độc tố của Bt
vào cơ thể của cây trồng, giúp cây trồng chuyển gen có thể tiết độc tố diệt sâu
ăn lá hoặc đục thân. Ngô và lúa là hai giống cây trồng đầu tiên đƣợc chuyển
gen Bt do tổ chức EPA của Mỹ thực hiện năm 1995. Cho tới hiện nay, công

4

nghệ GMO chuyển gen kháng sâu đã ứng dụng thành công cho nhiều loại cây
trồng khác nhƣ: Khoai tây, bông, khoai lang, đậu... [7], [6].
1.2. Đại cƣơng về vi khuẩn Bacillus thuringiensis
1.2.1. Đặc điểm hình thái của Bacillus thuringiensis
Bacillus thuringiensis là vi khuẩn đất, gram (+), hơ hấp hiếu khí hoặc
hiếu khí khơng bắt buộc. Tế bào hình que, kích thƣớc khoảng 3 - 6µm, có
tiêm mao phủ mỏng, có khả năng di động, tế bào đứng đơn độc hoặc xếp
thành chuỗi.
Bacillus thuringiensis có khả năng sinh nội bào tử và tinh thể độc. Bào
tử hình trứng với kích thƣớc khoảng 1,5 – 2 µm. Tinh thể độc có kích thƣớc
khoảng 0,6 x 0,02 µm và có nhiều hình dạng nhƣ hình ơ van, hình lập
phƣơng, hình sao, hình trứng, hình kim... Khi tế bào sinh dƣỡng bị phá vỡ, nội
bào tử và thể vùi đƣợc giải phóng (xem Hình 1.1) . Giống nhƣ bào tử của các
loại vi khuẩn khác thuộc chi Bacillus, bào tử của Bt rất bền, có khả năng
kháng lại nhiệt, bức xạ, hố chất cao. Có thể quan sát thấy bào tử, tinh thể
độc, tế bào sinh dƣỡng của Bt dƣới kính hiển vi điện tử, kính hiển vi quang
học [5], [8].
1.2.2. Đặc tính sinh hóa của Bacillus thuringiensis
Bacillus thuringiensis sinh trƣởng tối ƣu ở nhiệt độ 28 – 30oC, pH từ
6,8 đến 7,2. Trong q trình sinh trƣởng, vi khuẩn chuyển hố thành phần
đƣờng của mơi trƣờng thành acid acetic, lactic, pyruvic… Sau đó những chất
này lại đƣợc cơ thể sử dụng tiếp. Do đó pH của mơi trƣờng lúc đầu thì tăng
(pha logarit), về sau thì giảm. Khả năng sinh bào tử của Bacillus thuringiensis
phụ thuộc vào nhiều yếu tố mà đặc biệt là các yếu tố dinh dƣỡng. Vi khuẩn có
khả năng nitrit hố, khơng có khả năng lên men đƣờng arabinoza, xiloza,
manitol và phát triển yếu trong mơi trƣờng kị khí [8], [1].

5

Hình 1.1: Hình ảnh về vi khuẩn Bacillus thuringiensis
1.2.3. Các độc tố của Bacillus thuringiensis
Bacillus thuringiensis có khả năng tạo 4 loại độc tố:
+ Ngoại độc tố α (α - exotoxin)
+ Ngoại độc tố β ( β - exotoxin)
+ Ngoại độc tố γ (γ - exotoxin)
+ Nội độc tố δ (δ - endotoxin)
Trong 4 loại độc tố, nội độc tố δ có tác dụng mạnh nhất đến nhiều loại
cơn trùng và đƣợc ứng dụng rộng rãi trong bảo vệ thực vật nhƣ một loại thuốc
sâu không độc hại với môi trƣờng, con ngƣời và động vật [4], [6].
1.2.3.1. Ngoại độc tố α
Ngoại độc tố α đƣợc phát hiện giữa những năm 1950 từ vi khuẩn
Bacillus thuringiensis vanenlesti bởi C. Toumaroff. Ngoại độc tố α cịn gọi là
enzyme Leucintinase, có hoạt tính phospholipase - tác động chủ yếu lên gốc
phospholipit của màng tế bào sâu, giúp cho vi khuẩn gây bệnh dễ xâm nhập
vào các xoang trong cơ thể côn trùng. Do vậy, enzyme Leucintinase đã trực
tiếp tham gia vào việc tấn công, gây tổn thƣơng tế bào ở thành ruột.
Ngoại độc tố α có trọng lƣợng phân tử thấp, tan tốt trong nƣớc, hoạt
động ở pH từ 6,6 đến 7,2 và khơng bền nhiệt nên cịn đƣợc gọi là ngoại độc tố
6


khơng bền nhiệt, tác động đặc hiệu đến các lồi nhƣ: ong cắn lá, sâu thuộc bộ
cánh cứng, cánh vẩy...[3], [9].
1.2.3.2. Ngoại độc tố β
Do Hall và Arkavc phát hiện năm 1959 khi nuôi ấu trùng muỗi bằng
thức ăn chứa Bt. Đây là một độc tố bền nhiệt có bản chất là nucleotide. Khi
xử lý ở 120oC trong 15 phút vẫn giữ đƣợc hoạt tính. Cơ chế tác động của
ngoại độc tố β là cạnh tranh ATP với các enzyme ARN polymerase, dẫn đến

kìm hãm hoạt động của enzyme, ngừng tổng hợp ARN, gây rối loạn sinh tổng
hợp protein. Mặt khác, khi ngoại độc tố β cộng hƣởng tác động với nội độc tố
δ có thể khiến cơn trùng chết nhanh chóng.
Ngoại độc tố β gây độc cho nhiều loại côn trùng thuộc bộ cánh cứng,
hai cánh, đặc biệt khi côn trùng ở giai đoạn ấu trùng, sâu non. Ngoại độc tố β
gây cản trở sự lột xác của côn trùng. Nếu đƣợc sử dụng ở nồng độ cao, độc tố
β cịn tiêu diệt cả trứng cơn trùng [8].
1.2.3.3. Ngoại độc tố γ
Ngoại độc tố γ là một phospholipase, có bản chất là mạch peptide ngắn
và một số axit amin tự do. Độc tố này tan tốt trong nƣớc, mẫn cảm với khơng
khí, ánh sáng, nhiệt độ và ơxi nên ít hữu dụng trong thực tế đồng ruộng. Cơ
chế tác dụng của ngoại độc tố γ cũng tƣơng tự nhƣ ngoại độc tố α [10].
1.2.3.4. Nội độc tố δ
Nội độc tố δ đƣợc hình thành trong khoảng 3h của pha cân bằng. Tinh
thể này bền nhiệt (tới 80oC), không tan trong nƣớc, dung môi hữu cơ nhƣng
tan tốt trong môi trƣờng có pH kiềm. Mỗi tế bào Bt có thể sinh ra một hoặc
hai tinh thể độc. Khối lƣợng tinh thể độc chiếm tới 30% khối lƣợng tế bào
mang nó.
δ – endotoxin còn đƣợc gọi là protein tinh thể độc do nó tồn tại dạng
tinh thể cùng với nhiều protein tinh thể khác nhờ cầu nối disufua và liên kết kị
nƣớc. Về bản chất độc tố này là một protein với 1180 gốc axit amin trong đó
chủ yếu gồm các loại nhƣ glutmic, asparaginic những axit amin này chịu trách
7


nhiệm cho đặc tính điểm đẳng điện thấp của tinh thể. Cystein tuy chiếm tỷ lệ
thấp hơn nhƣng nó góp phần quan trọng trong việc giữ vững cấu trúc tinh thể,
làm tinh thể khơng có khả năng hồ tan. Ngồi ra, trong tinh thể còn tạp lẫn
một số hydrocacbon với tỷ lệ khoảng 5,6%. Về thành phần nguyên tố, toxin
chứa chủ yếu các nguyên tố C, H, O, N, S. Các nguyên tố Ca, Mg, Si, Fe

chiếm tỷ lệ nhỏ hơn. Ni, Ti, Zn, Mn, Cu… chiếm tỷ lệ rất nhỏ, cịn P hầu nhƣ
khơng có [11], [13], [6].
1.2.4. Tính đa dạng của Bt
Cho đến nay các nhà khoa học đã phân lập, phân loại đƣợc một số
lƣợng lớn các chủng Bt dựa theo các đặc điểm sau:
- Khả năng hình thành enzyme leucitinase.
- Cấu trúc tinh thể, khả năng gây độc.
- Đặc tính huyết thanh học (kháng huyết thanh tiêm mao H).
- Phản ứng ngƣng kết của các tế bào sinh dƣỡng với các kháng huyết
thanh.
Phƣơng pháp phân loại theo đặc tính huyết thanh là phổ biến. Theo
phƣơng pháp này, dựa vào 50 type huyết thanh chuẩn ngƣời ta đã chia các
chủng Bt đã phân lập đƣợc ra làm 63 loài phụ (subspecies) [14], [1], [6]. Một
số type huyết thanh và các chủng đại diện tƣơng ứng (xem Bảng 1.1).

8


Bảng 1.1: Một số type huyết thanh và các chủng đại diện tƣơng ứng
Type huyết

Chủng đại

thanh

diện

1

B. thuringiensis

Viết tắt

THU

Ngƣời nghiên cứu

Bliner

(1915);

Heimpel&

Angus (1958)
3a, 3b

B. kurstaki

KUR

De Barjac & Lemill (1970)

4a, 4b

B. sotto

SOT

Ishiwata (1905); Heimpel
& Angus (1958)

5a, 5b

B. candensis

CAN

De Barjac & Bonnefoi (1972)

8b, 8d

B. nigeriensis

NIG

Weiser

and

prasertphon

(1984)
14

B. israelensis

ISR

De Barjac & Cs (1992)

30

B. medellin

MED

Orduz & Cs (1992)

33

B. leesis

LEE

Lee & Cs (1944)

46

B. chanpaisis

CHA

Chainpaisang (1994)

48

B. balearica

BAL

Iriate Garcia (1995)

49

B. muju

MUJ

Park (1995)

50

B. navarrersis

NAV

Iriate Garcia

Gần đây, nhờ sự phát triển mạnh của công nghệ gen, các nhà khoa học
đã giải mã đƣợc hầu hết các gen mã hóa cho tinh thể độc. Từ cơ sở đó, một
phƣơng pháp phân loại khác đã đƣợc đƣa ra: phƣơng pháp phân loại dựa vào
lớp gen Cry. Với phƣơng pháp này, các nhà khoa học đã đƣa ra 20 lớp gen
với các đặc điểm protein tinh thể độc, type huyết thanh, cơn trùng đích khác
nhau.

9


1.3. Các yếu tố hình thành tinh thể độc
Bao gồm tất cả các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng, phát triển của vi

khuẩn Bacillus thuringiensis nhƣ: nhiệt độ, nguồn C, N, P... Điều kiện tối ƣu
cho Bt sinh trƣởng là 28 – 30oC. Nếu nhiệt độ là 15oC thì bào tử khơng hình
thành và số lƣợng tinh thể độc cũng giảm đi đáng kể. Nguồn dinh dƣỡng C,
N, P ảnh hƣởng mạnh đến sự hình thành tinh thể độc. Một số acid amin nhƣ
leucin, isoleucin gây ức chế quá trình sinh trƣởng của vi khuẩn nên giảm
lƣợng tinh thể độc. Các yếu tố cản trở sự trao đổi acid acetic cũng làm ức chế
sự hình thành bào tử, tinh thể độc. Các chủng đột biến mất khả năng sinh
protease ngoại bào thì khơng có khả năng sinh tinh thể độc và bào tử [15],
[16].
1.4. Cơ chế tác động của tinh thể độc lên cơn trùng
1.4.1. Q trình hoạt hố tinh thể độc
Theo Angus (1907), protein tinh thể độc của Bt hoạt động trên tế bào
biểu mô ruột giữa của côn trùng ở pH kiềm. Tinh thể tan vào môi trƣờng kiềm
của ruột giải phóng ra protein tinh thể, chất này sau đó bị phân cắt bởi
protease. Kết quả là từ một protein 135 kDa bị mất đi một nửa để còn lại phần
lõi xấp xỉ 60 kDa bền với protease. Những thí nghiệm chỉ ra rằng protein 135
kDa chƣa bị cắt bởi protease khơng có khả năng gây độc với cơn trùng gọi là
“protoxin” cịn lõi 60 kDa gây độc vời cơn trùng gọi là “toxin”. Q trình
biến đổi từ tinh thể độc protoxin thành toxin đƣợc gọi là q trình hoạt hố
tinh thể độc.
Q trình hoạt hố tinh thể độc gồm hai giai đoạn: Giai đoạn một liên
quan tới sự giải phóng protoxin từ tinh thể độc. Giai đoạn này diễn ra do sự
cắt đứt các liên kết disulfua (nối giữa các phân tử protein) trong môi trƣờng
bởi các nhân tố khử disulfua. Giai đoạn hai là sự tiêu hoá protoxin thành
toxin. Năm 1990 Choma và cs báo cáo rằng để biến phân tử protoxin CryIAc
135 kDa thành lõi toxin 60 kDa phải trải qua bảy bƣớc mà ở mỗi bƣớc phân
tử protoxin sẽ bị mất đi một mảnh khoảng 10 kDa, trong quá trình này sự cắt
10

bỏ diễn ra không theo một trật tự nào. Tuy nhiên, đến nay cơ chế của sự cắt
bỏ để biến protoxin 135 kDa thành toxin 60 kDa vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ,
và các nhà khoa học vẫn chƣa xác định đƣợc protoxin bị cắt từ cả hai đầu C
và N hay bị cắt tuần tự từ đầu C [17], [1].
1.4.2. Cơ chế hoạt động của toxin trên tế bào biểu mơ ruột giữa cơn trùng
Những nghiên cứu về hình thái sau khi bị chết bởi Bt của côn trùng cho
thấy ruột của côn trùng bị tổn thƣơng. Cụ thể là do hình thành các lỗ hổng
trên các tế bào biểu mô, dẫn đến gây rối loạn hoạt động hấp thụ dinh dƣỡng
của ruột. Có ba mơ hình giải thích cơ chế hoạt động của toxin nhƣ sau:
- Mơ hình 1, thƣờng đƣợc gọi là mơ hình “dung giải hồ tan thẩm thấu
keo” bao gồm sự tổng hợp các lỗ không đặc trƣng bởi phân tử độc tố. Khi độc
tố liên kết với các receptor trên màng sẽ hình thành một phức hệ. Phức hệ này
tạo nên một lỗ xuyên qua màng tế bào biểu mô cho phép sự qua lại tự do của
nhiều phân tử với kích thƣớc khác nhau dẫn đến gây rối loạn chức năng của
ruột [10], [14].
- Mơ hình 2, cho rằng lỗ hổng đƣợc hình thành bởi độc tố Bt là đặc trƣng rất
cao đối với ion K+. Thuyết này đƣợc đƣa ra từ bằng chứng là sự vận chuyển
axit amin phụ thuộc K+ bị ức chế bởi độc tố tinh thể. Cụ thể, những lỗ này dễ
cho K+ đi vào, sau đó làm giảm gradient điện thế màng làm rối loạn sự vận
chuyển amino axit trong cơ thể sâu [14], [17].
- Mơ hình 3, cho rằng độc tố Bt hoạt động trên nhiều kênh hiện có của
tế bào biểu mơ ruột. Sự có mặt của các độc tố dẫn đến các kênh cho phép K +
tràn vào khơng giới hạn từ đó làm ức chế sự hấp thụ axit amin [19].
1.4.3. Tác động chọn lọc của độc tố vi khuẩn Bt lên côn trùng
Sở dĩ độc tố do Bt tiết ra có tác động chọn lọc lên côn trùng bởi tinh thể
độc sau khi xâm nhập vào ruột cơn trùng, để có thể gây chết cho vật chủ thì
phải đƣợc hoạt hố thành toxin và toxin phải gắn đƣợc lên tế bào biểu mô
ruột. Tuy nhiên, q trình hoạt hố tinh thể độc phụ thuộc rất nhiều vào pH
ruột và hệ enzyme. Nếu pH < 8 thì hầu hết các tinh thể độc khơng giải phóng
11

ra protoxin. Mặt khác khi pH phù hợp (pH > 8) nhƣng hệ enzyme khơng phù
hợp thì toxin cũng khơng đƣợc tạo ra. Một điều nữa, khi tinh thể độc đã đƣợc
hoạt hố thành toxin nhƣng những toxin này khơng bám đƣợc lên màng tế bào
biểu mô ruột, độc tố vơ tác dụng. Ví dụ: sâu xám hại rau có pH ruột là 9,5 và
có khả năng hoạt hố tinh thể độc nhƣng khơng bị tiêu diệt, chúng hồn tồn
khoẻ mạnh khi đƣợc nuôi với thức ăn chứa chế phẩm Bt vì trên màng ruột của
chúng khơng chứa các thụ thể để toxin của Bt bám vào [12]. Hình ảnh về quá
trình xâm nhập và gây độc của Bt (xem Hình 1.2).

Hình 1.2: Quá trình xâm nhập và gây độc của Bt
1.5. Ƣu nhƣợc điểm của thuốc trừ sâu Bt
* Ƣu điểm
- Không gây độc hại cho ngƣời và các động vật máu nóng vì pH đƣờng
ruột của các đối tƣờng này thấp khơng thể hoạt hố đƣợc tinh thể độc.
- Tác động lên côn trùng một cách chọn lọc nên trong nhiều trƣờng hợp
ngƣời ta có thể sử dụng những chủng Bt xác định để tiêu diệt côn trùng đích
mà khơng ảnh hƣởng đến cơn trùng vơ hại khác.
- Chế phẩm Bt không ô nhiễm môi trƣờng nhƣ các loại thuốc trừ sâu
hố học. Đồng thời nó khơng tác động xấu lên chất lƣợng nông sản [21], [2].

12


* Nhƣợc điểm
- Chế phẩm Bt khơng có khả năng diệt côn trùng bên trong thực vật
(thân, rễ...)
- Độc tố Bt lắng đọng nhanh trong nƣớc và dễ dàng bị hấp thụ bởi các
hoạt chất hoá học làm cho lƣợng độc tố đến đƣợc côn trùng giảm đi.

- Khi độc tố rơi xuống đất dễ bị vi sinh vật phân giải; trong điều kiện
bị chiếu sáng và dƣới tác động của một số nhân tố môi trƣờng khác độc tố Bt
rất dễ bị mất hoạt tính.
- Hiệu quả chƣa thật cao do diễn biến chậm khi gặp điều kiện thời tiết
bất lợi thì khó đạt kết quả tốt.
- Khó cân đong ngoài đồng ruộng, thời gian bảo quản ngắn thƣờng từ 1
– 2 năm ở điều kiện lạnh khô.
- Giá thành cao [5], [6] ,[1].
1.6. Ảnh hƣởng của thuốc trừ sâu Bt đến con ngƣời, động vật và thực vật
1.6.1. Ảnh hƣởng của chế phẩm Bt đến sức khoẻ con ngƣời
Khi các chế phẩm Bt đƣợc ra đời và ứng dụng rộng rãi, nảy sinh cho
con ngƣời một mối lo ngại do khi sử dụng Bt phần lớn sử dụng bình xịt thuốc
hoặc vãi, vì thế mà Bt dễ dàng tiếp xúc với da của ngƣời nông dân, giả thiết
đặt ra là ngƣời phun một lƣợng thuốc đáng kể có thể gây ngộ độc. Ngồi ra
cịn có thể gây phát tán bào tử. Tuy vậy, nhiều báo cáo nghiên cứu đã cho
thấy khơng hề có sự kích ứng đối với da của con ngƣời cũng nhƣ không xuất
hiện những ảnh hƣởng không tốt đối với sức khoẻ của con ngƣời [20], [18].
Trƣớc khi đƣợc đƣa ra thị trƣờng, các chế phẩm và cây trồng mang gen
Bt phải trải qua rất nhiều thử nghiệm quản lý nghiêm ngặt trong đó bao gồm
các nghiên cứu về độc tính và khả năng gây dị ứng. Cục Bảo vệ Môi trƣờng
Hoa kỳ (US Environmental Protectin Agency US-EPA) đã triển khai những
đánh giá độc tố và thậm chí các protein Bt đã đƣợc thử ở liều lƣợng cao hơn.
Theo Extension Toxicology Network (Extoxnet), các dự án về thông tin thuốc
trừ sâu ở một số trƣờng đại học của Hoa kỳ cho thấy “Kết quả cuộc thử
nghiệm trên 18 ngƣời mỗi ngày ăn 1 gram Bt thƣơng mại trong vòng 5 ngày,
trong các ngày khác nhau… khơng gây ra chứng bệnh gì. Những ngƣời ăn 1
13


gram Bt/ngày trong 3 ngày liên tục hồn tồn khơng bị ngộ độc hay nhiễm

bệnh”. Hơn nữa, ở mức phân tử protein nhanh chóng bị phân hủy bởi dịch vị
dạ dày (trong điều kiện phịng thí nghiệm) [Extoxnet, 1996].
Nhiều thí nghiệm trên con ngƣời với những ngƣời tình nguyện đƣợc
thực hiện bởi tổ chức y tế thế giới (WHO) và tổ chức môi trƣờng thế giới
(UNEP), kết quả thu đƣợc cho thấy: mặc dù những ngƣời tình nguyện thƣờng
xuyên ăn và hít vào một lƣợng lớn chế phẩm Bt và Btk, nhƣng không hề thấy
bất kỳ một biểu hiện bất thƣờng nào xảy ra trên cơ thể con ngƣời. Từ những
nghiên cứu cụ thể của các tổ chức uy tín trên thế giới, các nhà khoa học đã
công nhận Bt và cơng nghệ Bt hồn tồn vơ hại với con ngƣời và sức khoẻ
cộng đồng.
Năm 1995, chƣơng trình “Các vấn đề hợp tác quốc tế cho sự quản lý
chất hoá học” (IOMC) hợp tác giữa các tổ chức UNEP, ILO, The Foof and
Agriculture Organization of the United Nations, WHO nhằm thúc đẩy hợp tác
phát triển kinh tế, chia sẻ và phối hợp trong các chính sách chung nhằm quản
lý chất thải có ảnh hƣởng nguy hại tới đời sống của con ngƣời. Chƣơng trình
đã khuyến khích việc phát triển sử dụng Bt thay cho các loại thuốc trừ sâu hại
hoá học kinh điển khác.
1.6.2. Ảnh hƣởng của vi khuẩn Bt tới các loài động vật
Tinh thể độc do Bt sản sinh chủ yếu tiêu diệt các loại ấu trùng gây hại
đối với côn trùng nhƣ các loại côn trùng thuộc bộ cánh cứng, cánh vảy, các
loại mối mọt, muỗi gây bệnh… Các loại tinh thể độc của Bt có tính đặc hiệu
nhất định đối với các loài nhất định và ngay cả một lồi thì cũng chỉ gây độc ở
một giai đoạn sinh trƣởng nhất định đó là giai đoạn sâu non hay ấu trùng, theo
ngun tắc chìa khố và ổ khoá. Các tác nhân gây độc của Bt chỉ có thể gây
hại khi tác động với thụ thể phù hợp trên cơ thể ấu trùng, đối với các loại
protein khơng phù hợp khác thì sự khơng khớp đƣợc với loại protein của vật
chủ làm cho độc tố không phát huy đƣợc tác dụng. Thêm vào đó, mơi trƣờng
khác nhau trong thành ruột ở các loại sinh vật khác nhau và trong giai đoạn
sinh trƣởng khác nhau cũng là yếu tố to lớn quyết định tính chuyên biệt của
protein độc tố.

14


Trong lịch sử nghiên cứu về vi khuẩn Bt trên thế giới, nhiều nghiên cứu
trên các loài động vật hoang dã đã đƣợc thực hiện: Năm 1989, Bendell đã tiến
hành các nghiên cứu theo dõi tác động của Bt tới quần thể các lồi động vật
có vú nhỏ ở một số khu rừng gần trang trại sản xuất nông nghiệp ở Canada.
Kết quả thu đƣợc khơng hề có sự biến đổi số lƣợng quần thể này kể cả các
loài thuộc bộ gặm nhấm, họ chuột đồng là những sinh vật thƣờng xuyên ăn cỏ
ven rừng và trong cánh đồng…
Beavers và cộng sự, 1989; Lattin và cộng sự, 1990; Beavers, 1991 đã tiến
hành những nghiên cứu trên các loài chim trên thế giới: Các loài chim đƣợc chọn
nghiên cứu đƣợc xử lý bằng chế phẩm Bt và theo dõi, tính tốn sự biến động
trong quần thể. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng khơng hề có sự biểu hiện của
bệnh trên chim, khơng có sự suy giảm số lƣợng cá thể chim trong quần thể.
Nhiều nghiên cứu khác của các nhà khoa học thuộc các quốc gia tiên
tiến trên thế giới cũng đã tiến hành nhằm điều tra ảnh hƣởng của chế phẩm Bt
và cây trồng mang gen Bt đối với các lồi sinh vật đất và các lồi cơn trùng
khác đƣợc xem là có ích trong nơng nghiệp. Kết quả phân tích trong một thời
gian dài đã cho thấy Bt và công nghệ sử dụng cây trồng chuyển gen Bt không
gây ra ảnh hƣởng bất lợi không chỉ đối với các sinh vật đất có ích mà cịn với
các sinh vật đất khơng phải là đích tấn cơng của chúng, thậm chí ngay cả khi
các sinh vật này đƣợc xử lý Bt với liều lƣợng cao hơn nhiều so với thực tế có
thể xảy ra trong điều kiện trồng trọt mà con ngƣời có thể đƣa vào. Từ đó cho
thấy khơng có sự thay đổi nào trong quần thể vi sinh vật đất giữa các cánh
đồng sử dụng thuốc trừ sâu Bt và cánh đồng không sử dụng [Donegan và
cộng sự, 1995].
Các cuộc thử nghiệm của Extoxnet năm 1996 đƣợc tiến hành trên chó,
chuột, chuột lang, thỏ, cá, ếch, kỳ giông và chim… Cho thấy: protein Bt
không gây ra ảnh hƣởng xấu hay biến đổi số lƣợng quần thể. Cũng cần nhấn

mạnh rằng, độc tố cũng hồn tồn khơng gây ảnh hƣởng đến các lồi cơn
trùng có ích hoặc động vật ăn thịt nhƣ ong mật và bọ cánh cứng. Hầu hết các
chế phẩm của Bt nhƣ Bt, Btg, Btt, Btte… qua nghiên cứu đều cho kết quả âm
tính với những tác động bất lợi đến thế giới các loài động vật. Chỉ những loài
15


động vật gây hại chuyên biệt mới bị tác động của Bt, các lồi động vật khơng
phải là đích của Bt thì khơng hề chịu bất kỳ một tác động bất lợi nào từ Bt
[22].
1.6.3. Ảnh hƣởng của vi khuẩn Bt đến các loài thực vật
Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử và khoa học kỹ thuật đã
cho phép con ngƣời chuyển gen mã hóa protein đặc hiệu của Bt vào trong cơ
thể của các loài cây trồng. Kỹ thuật này đã đƣợc áp dụng trong các loại cây
trồng nhƣ Ngô, Lúa, Bông… Tuy nhiên vấn đề đặt ra gây lo ngại cho con
ngƣời ở đây chính là cây trồng mang gen cry cho sản phẩm chất lƣợng nhƣ
thế nào, có ảnh hƣởng tới hệ sinh thái và quần thể cây trồng trên các cánh
đồng không?
Vấn đề này trở thành một chủ đề nóng bỏng khi vào năm 1999, một báo
cáo khoa học đã công bố về ảnh hƣởng có hại của hạt phấn từ cây ngơ mang
gen Bt đến ấu trùng của lồi bƣớm có lợi Monarch. Báo cáo này đƣa ra đã gây
một mối quan tâm đặc biệt và lo ngại về những rủi ro mà thực vật chuyển gen
Bt có thể gây ra đối với sinh vật có ích và sinh vật trung lập trong tự nhiên.
Tuy nhiên, những nghiên cứu trong thời gian gần đây của các nhà khoa
học đã cho thấy loài ngô chuyển gen sản sinh độc tố của Bt gây ảnh hƣởng
không đáng kể đối với quần thể bƣớm Monarch trên cánh đồng. Một chƣơng
trình hợp tác nghiên cứu giữa các nhà khoa học Hoa Kỳ và Canada đã cung
cấp những thơng tin nhằm xây dựng q trình đánh giá rủi ro tiêu chuẩn về
ảnh hƣởng của ngô Bt đối với quần thể bƣớm Monarch. Các nhà khoa học đi
đến kết luận rằng, ở hầu hết các giống lai thƣơng mại thì protein độc tố Bt

xuất hiện với nồng độ thấp hơn nhiều trong hạt phấn và không hề gây ảnh
hƣởng có hại đến các lồi bƣớm trên cánh đồng. Quần thể các lồi sinh vật có
ích và trung lập khác không hề bị suy giảm trên các cánh đồng này [22].
Nhƣ vậy, cây trồng sử dụng công nghệ cấy gen cry (công nghệ GMO)
không hề tác động đến đa dạng sinh học trên các cánh đồng, cũng nhƣ sản
phẩm của cây trồng chuyển gen cry kháng côn trùng không gây tác động nào
đối với các sinh vật sử dụng chúng cũng nhƣ đối với con ngƣời.

16


1.7. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng thuốc trừ sâu Bt
1.7.1. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng thuốc trừ sâu Bt trên thế
giới
Từ khi phát hiện ra vi khuẩn Bt, con ngƣời ngày càng nhận thức đƣợc
rõ hơn về tác dụng và hiệu quả của loại vi khuẩn này. Một loạt các nghiên cứu
cấp quốc tế và các nghiên cấp quốc gia đã và đang đƣợc đề ra nhằm phát triển
công nghệ sử dụng Bt một cách rộng rãi trong cộng đồng với mục đích bảo vệ
mơi trƣờng sống của con ngƣời và mơi trƣờng tự nhiên trong sạch [21], [1].
Năm 1938, chế phẩm Bt đƣợc sản xuất và bán ra đầu tiên từ phịng thí
nghiệm của Pháp. Tiếp sau đó, một loạt các nhà sản suất của các nƣớc khác
trên thế giới sản xuất thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt với các tên thƣơng
phẩm nhƣ: VMP, Pipel, Biobit...Ở Trung Quốc, sản lƣợng thuốc trừ sâu Bt
tăng lên rất nhanh từ 26 tấn năm 1983 lên 260 tấn 1986. Đến năm 1990 sản
lƣợng đạt 900 tấn. Ở Nga từ năm 1987 đã đạt sản lƣợng 6100 tấn/năm, đủ
phục vụ cho 110 ha ruộng. Tại Mỹ, lƣợng chế phẩm Bt đƣợc sử dụng lên tới
hơn 1000 tấn/năm. Ngoài việc ứng dụng để bảo vệ cây trồng, chế phẩm Bt
còn đƣợc nhiều nƣớc sử dụng trong công tác vệ sinh dịch tễ nhƣ diệt trừ các
loại muỗi, ruồi... bảo vệ sức khoẻ con ngƣời.
1.7.2. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng thuốc trừ sâu Bt ở Việt

Nam
Bt đƣợc du nhập vào nƣớc ta từ những thập niên 1970 nhƣng do điều
kiện khách quan về kinh tế mà nƣớc ta chƣa có điều kiện áp dụng cũng nhƣ
quan tâm đến vấn đề này.
Trong vài năm trở lại đây, khi một loạt các vấn đề môi trƣờng trong
nông nghiệp đƣợc khám phá gây nhiều dƣ luận bức xúc, lo ngại cho sức khoẻ
con ngƣời. Việc nghiên cứu và ứng dụng Bt đƣợc xem nhƣ là một cứu cánh
trong lĩnh vực phòng trừ sâu hại. Tuy vậy, việc sử dụng Bt ở nƣớc ta hiện nay
còn khá nhiều hạn chế, cụ thể là trong lĩnh vực triển khai, nƣớc ta còn rất
thiếu các điều kiện, phƣơng tiện để nghiên cứu, có rất ít các nhà khoa học đi
chuyên sâu trong lĩnh vực này. Bên cạnh đó các cơ sở thực nghiệm về cơng
nghệ sinh học của nƣớc ta cịn nhỏ hẹp, số lƣợng ít ỏi, đó là một trong nguyên
17


nhân lớn dẫn đến sự hạn chế trong việc sản xuất và sử dụng các loại thuốc trừ
sâu Bt [21], [16].
Về mặt quản lý, nƣớc ta cịn rất thơ sơ và yếu trong công tác giống,
công tác kiểm định, tàng trữ đến nghiên phát triển, thu thập lai tạo… Mặt
khác, trong phân phối sản phẩm, nƣớc ta lại quá quan tâm đến quảng bá cho
các loại hoá chất bảo vệ thực vật hoá học, do vậy việc quảng bá cho thƣơng
hiệu Bt không đƣợc quan tâm đúng mức. Đồng thời trong công tác khuyến
nông, những hạn chế về tuyên truyền để ngƣời nơng dân nâng cao hiểu biết
cịn yếu kém, ngƣời nơng dân chỉ muốn có hiệu quả tức thời và sử dụng thuận
tiện, chính vì thế mà ít quan tâm đến các chế phẩm Bt.
Tuy nhiên, bƣớc đầu các chuyên gia nƣớc ta thuộc Viện công nghệ sinh
học (Viện Khoa học và công nghệ) đã tiến hành nghiên cứu và sản xuất thành
công nhiều thuốc trừ sâu sinh học Bt đạt hiệu quả cao, hứa hẹn một tƣơng lai
tốt đẹp cho nông sản Việt Nam. Sau đây là bảng thống kê các nghiên cứu và
một số chủng Bt chính đƣợc ứng dụng trong sản xuất chế phẩm ở Việt Nam

(xem Bảng 1.2 và Bảng 1.3).
Bảng 1.2: Một số chủng Bt thƣờng đƣợc ứng dụng trong sản xuất chế
phẩm Bt ở Việt Nam
STT

Tên gọi

Ký hiệu

1
2

Bacillus thuringiensis
Bacillus thuringiensis
subspecies aizawai
Bacillus thuringiensis
subspecies darmstadiensis
Bacillus thuringiensis
subspecies entomocidus
Bacillus thuringiensis
subspecies israelensis
Bacillus thuringiensis
subspecies kurstaki
Bacillus thuringiensis
subspecies konkukian
Bacillus thuringiensis
subspecies tenebrionis
Bacillus thuringiensis
subspecies galleriae

Bt
Bta

3
4
5
6
7
8
9

18

Btd
Bte
Btk
Btko
Btt
Btte
Btg


CHƢƠNG 2
MỤC TIÊU – ĐỐI TƢỢNG - NỘI DUNG – PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

2.1. Mục tiêu nghiên cứu


Mục tiêu chung

Phân lập và chọn lọc đƣợc chủng Bt có độc tính cao trong diệt sâu hại cây
trồng, làm tiền đề cho những nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh trong bảo vệ
thực vật.



Mục tiêu cụ thể
+ Phân lập đƣợc Bt từ đất, côn trùng.

+ Xác định đƣợc một số đặc điểm của các chủng Bt đã phân lập: hình
dạng, màu sắc khuẩn lạc, tế bào, bào tử, tinh thể độc.
+ Thử hoạt lực diệt sâu hại cây trồng của các chủng Bt đã phân lập.
+ Chọn lọc đƣợc chủng Bt có độc lực cao đối với côn trùng hại cây trồng.
+ Tạo một bộ sƣu tập nhỏ về vi khuẩn Bt lƣu trữ tại Trung tâm giống &
CNSH – Đại học Lâm nghiệp.
2.2. Đối tƣợng và giới hạn nghiên cứu
* Đối tƣợng nghiên cứu
Các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis tồn tại trong:
+ 32 mẫu đất thu thập ở khu vực Trƣờng ĐH Lâm nghiệp - Xuân Mai - Chƣơng
Mỹ - Hà Nội.
+ 03 mẫu côn trùng nghi bị vi khuẩn Bacillus thuringiensis xâm nhiễm
* Giới hạn của nghiên cứu
Do điều kiên thí nghiệm, thời gian thực hiện khóa luận có hạn, cũng
nhƣ trình độ bản thân cịn hạn hẹp. Vì vậy, chƣa xác định đƣợc chủng vi
khuẩn Bt đã phân lập thuộc lồi, chi nào và việc xem xét một cách chính xác
sự khác nhau giữa các chủng Bt đã phân lập có sự trùng lặp nhau khơng chỉ là
tƣơng đối. Khóa luận chỉ tập trung vào phân lập đƣợc chủng vi khuẩn Bt có
hoạt lực cao trong việc tiêu diệt cơn trùng gây hại cây trồng.
2.3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu phân lập Bt từ mẫu côn trùng và đất.

19


- Xác định đặc điểm tế bào, bào tử, tinh thể độc.
- Xác định hoạt lực diệt sâu Spodoptera litura và sâu Plutella xylostella của
các chủng Bt đã phân lập.
2.4. Vật liệu và thiết bị
2.4.1. Nguồn vi sinh vật
Nguồn vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) đƣợc phân lập từ hai loại
mẫu:
- Mẫu cơn trùng chết có các triệu trứng nghi là bị chết bởi vi khuẩn Bt (xem
Bảng 2.1), (xem Hình 2.1).
- Các mẫu đất thu thập ở các địa điểm khác nhau trong Trƣờng Đại học Lâm
nghiệp (xem Bảng 2.2), (xem Hình 2.1).

A

B

Hình 2.1: Hình ảnh các nguồn mẫu thu thập vi khuẩn Bt
2.1-A: Hình ảnh mẫu tằm bệnh
2.1-B: Hình ảnh mẫu đất

20


Bảng 2.1: Nguồn thu thập vi khuẩn Bt từ côn trùng
Ký chủ thực vật

Địa điểm thu thập mẫu

Sâu đỏm
Sâu keo

Tình
trạng
Đã chết
Đã chết

Cây đỏm lông
Keo tai tƣợng

Sâu tằm

Đã chết

Cây dâu

Núi Nuốt - ĐHLN
Núi Nuốt - ĐHLN
Cơ sở sản xuất giống
tằm Mai Lĩnh - Hà Nội

TT

Loại sâu

1
2
3

Thời gian thu
thập mẫu
Ngày 21/04/2009
Ngày 02/05/2009
Ngày
26/06/2009

Bảng 2.2: Nguồn thu thập Bt từ các mẫu đất ở khu vực Trƣờng ĐHLN

TT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19

20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32

Ký hiệu
mẫu đất
H
T5
G6
MS1
MS2
MS3
MS4
MS5
MS6
MS7
MS8
MS9
MS10
MS11

MS12
MS13
MS14
MS15
MS16
MS17
MS18
MS19

Địa điểm thu thập mẫu
(Trƣờng ĐHLN)
Khu vực hồ
Nhà T5
Hội trƣờng G6
Vƣờn ƣơm
Vƣờn ƣơm
Khu chòi canh núi Nuốt
Chân núi Nuốt
Khu vƣờn ƣơm núi Nuốt
Khu KTX K13
Khu TH Tin
Khu tập quân sự núi Nuốt
Khu giảng đƣờng G1
Khu chòi canh núi Nuốt
Chân núi Nuốt
Khu tập quân sự núi Nuốt
Đỉnh núi Nuốt
Khu vƣờn ƣơm núi Nuốt
Đỉnh núi Nuốt
Khu vƣờn ƣơm núi Nuốt

Khu vƣờn ƣơm núi Nuốt
Chân núi Nuốt
Khu vƣờn ƣơm núi Nuốt

Loại hình đất

Thảm thực vật

Đất thịt trung bình
Đất thịt trung bình
Đất thịt trung bình
Đất thịt nhẹ
Đất thịt trung bình
Đất thịt trung bình
Đất thịt trung bình
Đất thịt trung bình
Đất thịt trung bình
Đất thịt trung bình
Đất thịt nhẹ
Đất thịt trung bình
Đất thịt trung bình
Đất thịt trung bình
Đất thịt trung bình
Đất thịt trung bình
Đất thịt trung bình
Đất thịt trung bình
Đất thịt trung bình
Đất thịt trung bình
Đất thịt trung bình
Đất thịt trung bình

MS20
MS21
MS22
MS23
MS24
MS25
MS26
MS27
MS28
MS29

Đỉnh núi Nuốt
Khu vƣờn ƣơm núi Nuốt
Đỉnh núi Nuốt
Chân núi Nuốt
Khu KTX K13
Khu Bể nƣớc
Khu Nghĩa trang
Khu KTX K12
Khu KTX K11
Thƣ viện cũ

Đất thịt trung bình
Đất thịt trung bình
Đất thịt trung bình
Đất thịt trung bình
Đất thịt trung bình
Đất thịt nhẹ
Đất thịt trung bình

Đất thịt trung bình
Đất cát pha
Đất thịt trung bình

Long não
Đa lá bóng
Re hƣơng
Sấu
Cau bụng
Sƣa
Dẻ cau
Cẩm lai vú
Tơ hạp
Keo lá tràm
Rừng keo
Long não
Rừng keo
Rẻ cau
Re hƣơng
Thông
Hoa sữa
Rừng trẩu
Xoan ta
Lát hoa
Thông
Khu vực ƣơm
keo
Thông
Cẩm lai vú
Re hƣơng

Gội gác
Nhội
Trẩu
Lim xẹt
Keo Lá Tràm
Trẩu
Tếch

21


2.4.2. Sâu thí nghiệm
- Sâu ăn lá dƣa chuột, dƣa hấu Spodoptera litura Fabricius họ Noctuidae
thuộc bộ cánh vẩy (Lepidoptera) thu thập ở các ruộng dƣa của bà con nông
dân khu vực Nam Phƣơng Tiến, Chƣơng Mỹ, Hà Nội (xem Hình 2.2).
- Sâu ăn lá cải bắp và su hào Plutella xylostella Linnaeus họ Noctuidae
thuộc bộ cánh vẩy (Lepidoptera) thu thập tại các ruộng rau của bà con nông
dân khu vực Xuân Mai, Chƣơng Mỹ, Hà Nội (xem Hình 2.2).

A

B

Hình 2.2: Hình ảnh về sâu thử hoạt tính
2.2 - A:Hình ảnh về sâu hại dƣa chuột, dƣa hấu
2.2 - B: Hình ảnh về sâu hại cải bắp và su hào
2.4.3. Hóa chất
- Pepton

- Bột đậu tƣơng

- Thịt bị

- Nƣớc mắm

- Cao nấm men

- Cồn

- Glucose

- Thuốc nhuộm fuchsin

- Bột ngô

- Agar

- Một số chất khoáng nhƣ: FeSO4, MgSO4, , ZnSO4...
22


2.4.4. Thiết bị - dụng cụ
* Thiết bị
- Box cấy vô trùng

- Máy ổn nhiệt

- Tủ nuôi vi sinh vật hiếu khí

- Máy lắc ni vi sinh vật

- Tủ sấy

- Kính hiển vi quang học Olympus

- Tủ lạnh

- Cân phân tích, cân điện tử

- Nồi hấp khử trùng

- Máy đo pH

* Dụng cụ
- Các dụng cụ thuỷ tinh nhƣ ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác, pipet, ống
đong, cốc đong, đèn cồn, que cấy khuẩn, que gạt khuẩn, lam kính, lamen...
2.4.5. Các loại môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu
* Môi trƣờng phân lập
- Môi trƣờng phân lập đặc :
Thành phần

g/l

Thịt bị

100g

Pepton:

10 g

Axetat natri:

35 g

Agar:

16 g

Nƣớc cất:

1000 ml

pH

7

Hố chất sau khi pha, chuẩn pH đƣợc đem khi khử trùng, để nguội đến
khoảng 600C đƣợc rót vào các đĩa petri, bọc giấy parafilm, để ở 24 giờ ở điều
kiện thƣờng xem có nhiễm khơng, những đĩa thạch khơng bị nhiễm mới sử dụng.
- Mơi trƣờng phân lập lỏng:
Thành phần

g/l

Thịt bị

100g

Pepton:

10 g

Axetat natri:

35 g

Nƣớc cất:

1000 ml

pH

7

23


Hồ tan hố chất, chuẩn pH, phân đều vào các bình tam giác dung tích
100ml (mỗi bình 30ml). Khử trùng môi trƣờng ở 121 0C trong 20 phút. Để sau
24h ở điều kiện thƣờng, kiểm tra độ tiệt trùng, không bị nhiễm mới lấy ra sử
dụng.
* Môi trƣờng nhân giống
- Mơi trƣờng nhân giống cấp 1:
Thành phần

(g/l)

Thịt bị

:

100g

Pepton

:

10 g

CaCl2

:

0,01 g

KH2PO4.7H2O :

0,02 g

ZnSO4.7H2O

:

0,001 g

Glucose

:

10 g

Nƣớc cất

:

1000 ml

pH

:

7

Hồ tan hố chất, chuẩn pH, phân đều vào các bình tam giác dung tích
250ml (mỗi bình 100ml). Khử trùng mơi trƣờng ở 1210C trong 20 phút. Để sau
24h ở điều kiện thƣờng, kiểm tra độ tiệt trùng, không bị nhiễm mới lấy ra sử
dụng.
- Môi trƣờng nhân giống cấp 2:
Làm theo công thức của mơi trƣờng nhân giống cấp 1, đựng trong các các
bình tam giác dung tích 250ml (mỗi bình 100ml).
* Mơi trƣờng giữ giống
Thành phần

(g/l)

Pepton

:

5g

Glucose

:

10 g

Cao nấm men

:

3g

Agar

:

16 g

Nƣớc cất

:

1000 ml

pH

7

24