Phân lập và xác định đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn thuộc chi bacillus

LỜI CẢM ƠN
Đề tài “Phân lập và xác định đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn
thuộc chi Bacillus” là nội dung em chọn nghiên cứu và làm luận văn tốt nghiệp
sau thời gian 4 năm học tại trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam. Trong q
trình đó, em đã nghiên cứu và hồn thiện khóa luận nhờ có sự giúp đỡ rất nhiều
từ nhà trƣờng và các thầy cô.
Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm
nghiệp đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để em thực tập tại Viện.
Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô ở Viện Công Nghệ Sinh học Lâm
nghiệp, trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam nhiệt tình trong việc truyền đạt
vốn kiến thức quý báu giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian học tập tại trƣờng.
Em xin chân thành cảm ơn cô Ths. Nguyễn Thị Thu Hằng đã trực tiếp chỉ
bảo và hƣớng dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu giúp em hồn thành bài
khóa luận này.
Mặc dù bài khóa luận khơng tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận
đƣợc những ý kiến đóng góp quý báu của quý thầy cơ và các bạn học cùng lớp
giúp bài khóa luận hồn thiện hơn.
Lời sau cùng, em xin kính chúc q thầy cô trong Viện Công Nghệ Sinh
học Lâm nghiệp, trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam sức khỏe, niềm tin,
vững bƣớc dìu dắt chúng em trƣởng thành.
n

1t

n

n m

Sinh viên thực hiện

Bùi Thu Huyền

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ i
MỤC LỤC ............................................................................................................. ii
D NH MỤC BẢNG ............................................................................................ iv
D NH MỤC H NH .............................................................................................. v
DANH MỤC VIẾT TẮT ..................................................................................... vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
PHẦN I. TỔNG QUAN ........................................................................................ 2
1.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn Bacillus ........................................................... 2
1.2. Sơ lƣợc về vi khuẩn Bacillus subtilis ............................................................. 3
1.2.1. Lịch sử phát hiện ......................................................................................... 3
1.2.2. Đặc điểm phân loại và phân bố trong tự nhiên ........................................... 3
1.2.3. Đặc điểm hình thái ...................................................................................... 4
1.2.4. Ứng dụng của Bacillus subtilis ................................................................... 5
1.2.5. Tình hình nghiên cứu về Bacillus subtilis ................................................... 5
1.3. Sơ lƣợc về vi khuẩn Bacillus licheniformis ................................................... 8
1.3.1. Đặc điểm sinh học và phân bố trong tự nhiên............................................. 8
1.3.2. Ứng dụng của Bacillus licheniformis .......................................................... 8
PHẦN II. MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..... 10
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................... 10
2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 10
2.3. Nguyên liệu .................................................................................................. 10
2.3.1. Nguồn vi sinh vật ...................................................................................... 10
2.3.2. Hóa chất..................................................................................................... 10
2.3.3. Thiết bị sử dụng......................................................................................... 10
2.3.4. Môi trƣờng nghiên cứu.............................................................................. 11

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 12
2.4.1. Phƣơng pháp phân lập và làm thuần vi sinh vật [2].................................. 12
2.4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn [2] ................. 12
ii


2.4.3. Xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn [2]............................ 14
2.4.4. Xác định khả năng sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn trong mơi
trƣờng kỵ khí [2] ................................................................................................. 16
2.4.5. Xác định khả năng đồng hóa nguồn carbon [34] ...................................... 17
2.4.6. Xác định khả năng chịu NaCl [34]............................................................ 17
2.4.7. Xác định khả năng chịu nhiệt [34] ............................................................ 17
2.4.8. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn ................................................................ 18
2.5. Phƣơng pháp thu thập và xử lý số liệu ......................................................... 18
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 19
3.1. Phân lập và sàng lọc sơ bộ các chủng Bacillus ............................................ 19
3.2. Xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn .................................... 22
3.3. Xác định khả năng sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn trong mơi trƣờng
kỵ khí ................................................................................................................... 25
3.4. Xác định khả năng đồng hóa nguồn carbon ................................................ 26
3.5. Xác định khả năng chịu NaCl ...................................................................... 28
3.6. Xác định khả năng chịu nhiệt ....................................................................... 29
3.7. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn ................................................................... 30
PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................... 31
4.1. Kết luận ........................................................................................................ 31
4.2. Kiến nghị ...................................................................................................... 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO

iii

D NH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Công thức môi trƣờng LB .................................................................. 11
Bảng 2.2: Công thức môi trƣờng xác định khả năng đồng hóa nguồn carbon ... 11
Bảng 2.3: Cơng thức mơi trƣờng xác định hoạt tính enzyme ............................. 12
Bảng 3.1. Tổng hợp các đặc điểm hình thái khuẩn lạc và một số đặc điểm sinh
học của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc......................................................... 19
Bảng 3.2. Hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn đã phân lập .................... 22
Bảng 3.3. Hoạt tính protease của các chủng vi khuẩn phân lập.......................... 23
Bảng 3.4. Hoạt tính amylase của các chủng vi khuẩnđã phân lập ...................... 23
Bảng 3.5: Khả năng sinh trƣởng và phát triển trong mơi trƣờng kỵ khí của các
chủng vi khuẩn phân lập ..................................................................................... 25
Bảng 3.6. Khả năng đồng hóa nguồn carbon ...................................................... 26
Bảng 3.7. Khả năng chịu muối của các chủng vi khuẩn ..................................... 28
Bảng 3.8. Khả năng phát triển ở nhiệt độ khác nhau .......................................... 29
Bảng 3.9: Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng vi khuẩn đã
tuyển chọn ........................................................................................................... 30

iv


D NH MỤC H NH
Hình 1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis ..................................................................... 8
Hình 1.2. Vi khuẩn Bacillus licheniformis ........................................................... 9
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn đã phân lập ................... 20
Hình 3.2. Hình dạng các chủng vi khuẩn qua quan sát dƣới kính hiển vi. ......... 20
Hình 3.3. Hoạt tính catalase của chủng vi khuẩn LB2 và LB5........................... 21
Hình 3.4. Hoạt tính cellulase của chủng LB2, LB4 và LB5 ............................... 22
Hình 3.5. Hoạt tính protease của chủng LB2, LB4 và LB5 ................................ 23
Hình 3.6. Hoạt tính amylase của chủng LB2, và LB4 ........................................ 24

Hình 3.6. Khả năng sinh trƣởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí của chủng
LB5 ...................................................................................................................... 25
Hình 3.7. Khả năng lên men một số loại đƣờng và sinh acid làm đổi màu môi
trƣờng ni cấy của chủng LB5 .......................................................................... 27
Hình 3.8. Hoạt tính kháng Bacillus cereus của LB4 ........................................... 30

v


D NH MỤC VIẾT TẮT

CMC

: Carboxylmethyl cellulose

CTV

: Cộng Tác Viên

LB

: Luria Bertani

VK

: Vi Khuẩn

VSV

: Vi Sinh Vật

vi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Chủng vi khuẩn Bacillus phân bố rất rộng trong tự nhiên, chúng tham gia
tích cực vào sự phân hủy vật chất hữu cơ nhờ khả năng sinh nhiều loại enzyme
ngoại bào. Đa số các enzyme này là enzyme thủy phân phân tử hữu cơ lớn nên
vi khuẩn này có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau nhƣ: công nghệ
sản xuất chất tẩy rửa, công nghệ thực phẩm, công nghệ dƣợc phẩm, công nghệ
thuộc da, công nghệ dệt, xử lý nƣớc thải...
Sự đa dạng về loài và sinh thái của Bacillus nên các ứng dụng của chúng
cũng bao trùm nhiều lĩnh vực từ sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống đến
công nghệ lên men hiện đại, mỹ phẩm, xử lý môi trƣờng ô nhiễm, sinh học phân
tử và y-dƣợc học....
Các chủng Bacillus đƣợc sử dụng trong việc tạo ra các vacxin vi
khuẩn. Bacillus subtilis là nguồn chính của các enzyme cơng nghiệp nhƣ
protease và amylase. Các loại men tiêu hóa, chế phẩm phịng bệnh, chế phẩm
cho ăn trong chăn nuôi cũng đƣợc sản xuất với nguồn nguyên liệu chính là các
chủng vi khuẩn Bacillus.
Tuy nhiên, chi Bacillus có rất nhiều lồi vi khuẩn (500 lồi đƣợc tìm thấy)
mà mỗi lồi lại có những đặc điểm sinh học và ứng dụng khác nhau. Vì vậy nên
em làm đề tài “Phân lập và xác định đặc điểm sinh học của một số chủng vi
khuẩn thuộc chi Bacillus”.

1


PHẦN I. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn Bacillus

Phân loại khoa học (Theo phân loại của Bergey năm 1974):
Giới (regnum):

Bacteria

Ngành (divisio):

Firmicutes

Lớp (class):

Bacilli

Bộ (ordo):

Bacillales

Họ (familia):

Bacillaceae

Chi (genus):

Bacillus

Tế bào Bacillus hình que, thẳng hoặc gần thẳng, kích thƣớc 0,3 - 2,2 x 1,2
- 7 µm. Tế bào Bacillus thƣờng xếp thành cặp hay chuỗi, đầu trịn hoặc hơi
vng. Bacillus là vi khuẩn gram dƣơng, hầu hết dƣơng tính catalase. Có khả
năng di động nhờ lông roi. Mỗi tế bào Bacillus chỉ có thể hình thành 1 nội bào
tử có hình oval hoặc hình trụ. Bào tử có khả năng chịu nhiệt, acid. Sự hình thành

nội bào tử khơng bị ngăn cản bởi sự tiếp xúc khơng khí [30].
Các lồi thuộc chi Bacillus đặc trƣng cho trực khuẩn sinh bào tử vẫn giữ
nguyên hình que khi mang bào tử, trong một số trƣờng hợp chỉ hơi phình to lên một
chút. Tùy theo từng lồi Bacillus, bào tử có thể nằm giữa, gần cuối, hoặc ở cuối.
Đặc điểm phân bố: Nhờ khả năng sinh bào tử nên Bacillus có thể tồn tại
trong thời gian rất dài dƣới các điều kiện khác nhau. Chúng rất phổ biến trong tự
nhiên nên có thể phân lập từ nhiều nguồn khác nhau nhƣ đất, nƣớc, khơng khí,
phân, trầm tích biển, thức ăn, sữa, lớp mùn,...chủ yếu là đất nơi mà chúng đóng
vai trị quan trọng trong chu kỳ carbon và nito [30].
Hầu hết các loài thuộc chi Bacillus là những sinh vật hóa dị dƣỡng, thu
năng lƣợng nhờ sự oxi hóa các hợp chất hữu cơ nhƣ đƣờng, amino acid, acid
hữu cơ,....
Phần lớn các loài thuộc chi Bacillus là vi khuẩn hiếu khí hoặc kị khí tùy
tiện, nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu từ 30-45oC, một số chịu nhiệt với nhiệt độ sinh
trƣởng tối ƣu lên tới 65oC, hoặc ƣa lạnh (5oC-25oC). Các loài thuộc chi Bacillus
2


sinh trƣởng trong khoảng pH rộng từ 2-11. Nhờ có phổ chịu đựng pH, nhiệt độ
và muối rộng nên Bacillus có thể tồn tại ở điều kiện bất lợi trong thời gian dài
[5].
Trong phịng thí nghiệm, dƣới điều kiện sinh trƣởng tối ƣu, Bacillus có
thời gian thế hệ là 25 phút [5].
1.2. Sơ lƣợc về vi khuẩn Bacillus subtilis
1.2.1. Lịch sử phát hiện
Bacillus subtilis đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion
Erenberg và tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”. Gần 30
năm sau, Casimir Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium”. Năm
1872, Ferdimand Cohn xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vng và đặt
tên là Bacillus subtilis [1,5].

Năm 1941, Bacillus subtilis đƣợc phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y
học Nazi của Đức. Lúc đầu, chúng đƣợc dùng chủ yếu để phòng bệnh lị cho các
binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Năm 1949 – 1957, Henry và cộng sự tách đƣợc
các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Gần đây, Bacillus subtilis đã đƣợc
nghiên cứu, sử dụng rộng rãi trên thế giới. Từ đó, thuật ngữ “Subtilis therapy” ra
đời. Bacillus subtilis đƣợc sử dụng ngày càng phổ biến và đƣợc xem nhƣ sinh
vật phòng và trị các bệnh về rối loạn đƣờng tiêu hóa, các chứng viêm ruột, viêm
đại tràng, tiêu chảy….[5]
Ngày nay, Bacillus subtilis đã và đang đƣợc nghiên cứu rộng rãi với nhiều
tiềm năng và ứng dụng hiệu quả trong chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi
trƣờng….[1]
1.2.2. Đặc điểm phân loại và phân bố trong tự nhiên
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy
nghi. Chúng phân bố hầu hết trong môi trƣờng tự nhiên, phần lớn cƣ trú trong
đất và rơm rạ, cỏ khô nên đƣợc gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông thƣờng đất
trồng trọt có khoảng 106 – 107 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dƣỡng ở vùng sa
mạc, đất hoang thì sự hiện diện của chúng rất hiếm. Ngồi ra, chúng cịn có mặt
3


trong các nguyên liệu sản xuất nhƣ bột mì (trong bột mì vi khuẩn Bacillus
subtilis chiếm 75 – 79% vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo, trong các thực phẩm nhƣ
mắm, tƣơng, chao… Bacillus subtilis đóng vai trị đáng kể về mặt có lợi cũng
nhƣ mặt gây hại trong quá trình biến đổi sinh học [8,10].
Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon
trong khi một số loài khác nhƣ Bacillus sphaericus, Bacillus cereus cần các hợp
chất hữu cơ là vitamin và amino acid cho sự sinh trƣởng. Đặc biệt các loài nhƣ
Bacillus popilliae, Bacillus lentimobus có nhu cầu dinh dƣỡng phức tạp, chúng
khơng phát triển trong môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn thông thƣờng nhƣ: Nutrient
Agar (NA), Nutrient Broth (NB) [5,12].

Năm 1993, giáo sƣ Richard Losik và cộng sự thuộc Đại học Havard ở
Boston (Mỹ) và Jose Gonzalez-Pastor của Trung tâm công nghệ sinh học quốc
gia ở Madrid (Tây Ban Nha) đã công bố đƣợc lồi Bacillus subtilis có tập tính
ăn thịt đồng loại. Chúng dùng cách này nhƣ một phƣơng pháp đơn giản để thốt
khỏi những trƣờng hợp có đời sống giới hạn nhƣ dinh dƣỡng trong môi trƣờng
đã cạn kiệt. Một cách đơn giản là các cá thể khỏe mạnh tiêu diệt những cá thể
xung quanh cả khác loài lẫn cùng loài, để thu lấy chất dinh dƣỡng bên trong,
giúp chúng sống sót chờ đến khi mơi trƣờng thuận lợi hơn. Ngồi ra, để tránh
những ảnh hƣởng của môi trƣờng khắc nghiệt, chúng thƣờng tạo ra bào tử,
nhƣng cách này tiêu hao khá nhiều năng lƣợng [12].
1.2.3. Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu trịn, bắt màu tím Gram (+),
kích thƣớc 0,5 - 0,8µm x 1,5 - 3µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn.
Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 - 12 lơng, sinh bào tử hình bầu dục
nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích thƣớc từ 0,8 - 1,8µm [30].
Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, khơng kháng
acid, có khả năng chịu nhiệt (ở 100ºC trong 180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia
phóng xạ, áp suất, chất sát trùng. Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm.

4


Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống của bào tử Bacillus subtilis trong
200 - 300 năm [17].
1.2.4. Ứng dụng của Bacillus subtilis
Các chủng Bacillus subtilis đƣợc sử dụng trong việc tạo ra các vacxin vi khuẩn.
Bacillus subtilis có nhiều tác dụng có lợi cho sức khỏe nhƣ chống kích thích
hệ miễn dịch, đơng máu, phịng nhiễm khuẩn đƣờng tiết niệu ở ngƣời cao tuổi.
Bacillus subtilis có thể sản sinh ra các enzyme tiêu hóa:

mylase, Protease,

Cellulose … giúp cải thiện tiêu hóa và tăng cƣờng hấp thụ chất dinh dƣỡng [29].
Việc bổ sung lợi khuẩn Bacillus subtilis trong các loại men vi sinh sẽ giúp
tạo ra hệ vi khuẩn có lợi cho hệ tiêu hóa, cung cấp thêm chất dinh dƣỡng và giúp
hệ miễn dịch khỏe mạnh.
Có khả năng đồng hóa một vài vitamin nhƣ B2 (Riboflavin) có vai trị
quan trọng đối với hoạt động sống cơ thể động thực vật, có mặt trong các tế bào,
tham gia vào q trình dinh dƣỡng cũng nhƣ hơ hấp của sinh vật [29].
Bacillus subtilis có thể sản sinh nhiều enzyme, nhƣng quan trọng nhất là 2
loại enzyme trong hệ thống men tiêu hóa: amylase và protease [29].
Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp một số chất kháng sinh làm ức
chế sinh trƣởng, tiêu diệt các vi sinh vật khác, tác dụng lên nấm gây bệnh và vi
khuẩn Gram(-) , Gram(+).
1.2.5. Tình hình nghiên cứu về Bacillus subtilis
B. subtilis và Bacilli gần gũi của nó là nguồn chính của các enzyme cơng
nghiệp nhƣ protease và amylase. Nó cũng đã đƣợc sử dụng để điều tra sự tiết
protein và mở rộng nhƣ là một vật chủ cho việc tạo ra các protein khơng hịa tan.
Dƣới các điều kiện của tính thực nghiệm dinh dƣỡng, B. subtilis ngừng
phát triển và bắt đầu phản ứng của nó để làm tăng trƣởng tăng trƣởng bằng cách
tăng cƣờng hoạt động trao đổi chất. Những phản ứng này bao gồm việc cấy ghép
nhu động và chemotaxis và thế hệ kháng sinh và hydrolases phân tử cao
(protease và carbohydrase) [29, 30].

5


Bacillus subtilis trực tiếp tiết ra protein vào môi trƣờng ni cấy, rút ngắn
q trình lọc các protein tái tổ hợp. Vi khuẩn này không sản xuất nội độc tố.
Một số vectơ đã đƣợc cơng nhận cho q trình sản xuất protein trong B.

subtilis.
Sự biểu hiện cao của cytokine của con ngƣời vẫn là một vấn đề tồn tại
trong B. subtilis. Ngoài ra, một vài nghiên cứu về sản xuất trong sinh vật này đã
đƣợc báo cáo [29].
Bacillus subtilis là một mơ hình rất tốt để thảo luận về peptidoglycan.
Bacillus subtilis có khả năng chiếm và tái tổ hợp DN

ngoại bào vào hệ

gen của nó, điều này làm cho nó tự nhiên đủ điều kiện để biến đổi gen.
Trình tự bộ gen liên quan đến B. subtilis đã cung cấp một sự hiểu biết rất
lớn về lối sống của vi khuẩn. Vi khuẩn này không phải là tác nhân gây bệnh.
Thật thú vị, các thành phần của bộ gen này đã mã hóa nhiều con đƣờng cho việc
sử dụng các phân tử thực vật [29].
Bacillus có tác dụng có lợi đối với vật chủ của chúng, điều này phụ thuộc
vào tiềm năng của chúng để chịu đựng sự căng thẳng oxy, nhiệt và stress thẩm
thấu trong quá trình bảo quản và xử lý [30].
Một chủng liên quan đến B. subtilis (LS 1-2) có thể cải thiện cân bằng vi
khuẩn đƣờng ruột và sức khỏe đƣờng ruột của gà thịt. Ngoài ra, nó có thể đƣợc
sử dụng nhƣ một promoter tăng trƣởng trong khẩu phần ăn liên quan đến gà thịt.
Bacillus subtilis là một loại vi khuẩn đã đƣợc lên kế hoạch thành công để
biểu hiện các yếu tố kháng nguyên không đồng nhất về mặt di truyền với protein
của bào tử, nhƣ một loại vắc-xin đƣợc ƣu tiên chống lại nhiệt và ảnh hƣởng nhƣ
một sinh vật probiotic cho cả động vật và ngƣời.
Các chủng B. subtilis cũng đƣợc sử dụng trong việc tạo ra các vacxin vi
khuẩn hoặc là các kháng nguyên kháng nguyên hoặc nhƣ các nhà máy sản xuất
tế bào kháng nguyên. Việc áp dụng các bào tử B. subtilis làm phƣơng tiện vắcxin, phân phối qua miệng, đã thu hút sự chú ý đáng chú ý vì các hiệu ứng
probiotic của nó và thời hạn sử dụng kéo dài.
Trong một nghiên cứu khác, nó đã đƣợc chứng minh rằng B. subtilis
(chủng NC11) là một probiotic tiềm năng, và hiển thị một vai trò tốt nhƣ một

6


chất ức chế chống nhiễm trùng liên quan đến Salmonella enteritidis trong các tế
bào biểu mô ruột.
Một nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng B. Subtilis (WD161) – nhà sản xuất
amylase – có thể đƣợc áp dụng để ni cấy với Clostridium butylicum (TISTR
1032). Điều này sẽ làm tăng sản xuất acetone-butanol-ethanol ( BE) từ tinh bột
mà khơng có phƣơng pháp kỵ khí.
Dịng B. subtilis, AS-S01a, là một loại vi khuẩn tạo ra một tỷ lệ cao alphaamylase kiềm. Nó có thể đƣợc áp dụng nhƣ một nguồn vi khuẩn tốt trong việc
sản xuất một tỷ lệ cao của alpha-amylase kiềm trong một tình huống thích hợp.
Enzyme này khơng cần ion Ca2+ để thực hiện tác dụng của nó nhƣ một chất tẩy
rửa và nó cho thấy sự nhất quán trong sự hiện diện của các enzym, nhƣ protease,
chất hoạt động bề mặt, chất oxy hóa và các tác nhân chel hóa ion kim loại.
Bacillus subtilis (natto) Takahashi, nhƣ một món khai vị natto, thƣờng
đƣợc sử dụng để sản xuất một sản phẩm lên men, một loại thực phẩm truyền
thống ở Nhật Bản trong hơn 1000 năm. Nó cũng tạo ra các enzyme đông máu.
Các enzym tiêu sợi huyết trong vi khuẩn có vai trị giải thể về các cục
máu đông fibrin và đƣợc sử dụng rõ ràng nhƣ các tác nhân tan huyết khối. Các
enzim này đã đƣợc phát hiện ở nhiều loại vi khuẩn khác nhau, trong đó quan
trọng nhất là chi Bacillus, đặc biệt là Bacillus subtilis, từ các loại thực phẩm lên
men truyền thống. Số lƣợng vi khuẩn, chất lƣợng nƣớc và tăng trƣởng trong quá
trình phát triển sớm tôm thẻ chân trắng làm tăng tác dụng của Bacillus subtilis
trong tôm.
Trong một nghiên cứu khác, Bacillus subtilis E20, một loại vi khuẩn
probiotic, đƣợc chứng minh là có tiềm năng tăng sự tăng trƣởng của tơm thẻ
chân trắng bằng cách tăng cƣờng hoạt động của các enzyme tiêu hóa và thu hút
thức ăn.
Q trình lên men hiếu khí là một phƣơng pháp phổ biến để sản xuất
enzyme trong các chủng B. subtilis (ví dụ: amylase, protease), thuốc trừ sâu,

thuốc

kháng

sinh,

nucleotide

purine,

axit

polyglutamic,

D-ribose,

polyhydroxybutyrate (PHB), v.v. Những sản phẩm này rất quan trọng trong cả
khoa học y tế và công nghiệp.
7


Xét nghiệm độc tính cấp và subchronic hiện nay đã đƣợc kiểm tra rộng rãi
trên B. subtilis var. Natto trong các nghiên cứu in vitro. Những nghiên cứu này
đƣợc tiến hành trên động vật. Kết quả của họ bảo vệ việc áp dụng B. subtilis nhƣ
một thực phẩm bổ sung [29].

Hình 1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis
/>
1.3. Sơ lƣợc về vi khuẩn Bacillus licheniformis
1.3.1. Đặc điểm sinh học và phân bố trong tự nhiên

Bacillus licheniformis là một loại vi khuẩn thƣờng đƣợc tìm thấy trong đất.
Nó đƣợc tìm thấy trên lơng chim, đặc biệt là bộ lông ngực và lƣng ở các loài
chim sống dƣới nƣớc và các loài thủy sinh.
Là một loại vi khuẩn gram dƣơng, hình que, ƣa nhiệt. Nhiệt độ tăng trƣởng
tối ƣu khoảng 30ºC. Nhiệt độ tối ƣu để sản sinh enzyme là 37ºC. Trong điều
kiện môi trƣờng khắc nghiệt, nghèo dinh dƣỡng, đặc biệt trong đất, nó cũng có
khả năng tạo bào tử. Những bào tử này là khá chịu nhiệt, lạnh, bức xạ, và các áp
lực môi trƣờng khác. Dƣới những điều kiện tốt, các bào tử nảy mầm trở thành tế
bào vi khuẩn thể hoạt động.
1.3.2. Ứng dụng của Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis có khả năng sản sinh nhiều enzyme, đặc biệt là
amylase và protease - 2 loại enzyme quan trọng thuộc hệ thống men tiêu hóa,
sản sinh các enzyme có khả năng thủy phân glucid, lipid, protid, enzyme
cellulase biến đổi chất xơ thành các loại đƣờng dễ tiêu, lecitinase thủy phân các
chất béo phức hợp, enzyme phân giải gelatin, enzyme phân giải fibrin và một

8


loại enzyme giống lysozyme gây tác dụng trực tiếp dung giải một số typ vi
khuẩn Proteus gây bệnh trong đƣờng ruột….
Ngồi ra, Bacillus licheniformis góp phần ổn định hệ vi khuẩn có ích cho
đƣờng ruột, có khả năng tổng hợp một số chất kháng sinh tự nhiên có tác dụng
ức chế sinh trƣởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác, tác dụng lên cả vi
khuẩn gram âm lẫn gram dƣơng, nấm gây bệnh. Do đó, Bacillus licheniformis có
khả năng cạnh tranh tốt với các vi khuẩn gây hại [31].
B. licheniformis giúp cải thiện trọng lƣợng, chuyển hóa thức ăn và giảm
bệnh tiêu chảy, tỉ lệ chết non ở vật nuôi.
B. licheniformis tiết ra enzyme phân hủy các chất nhƣ carbonhydrate, chất
béo và đạm thành những đơn vị nhỏ hơn. Chúng cũng có khả năng phân hủy các chất

phế thải hữu cơ, tích lũy trong nền đáy ao ni, làm sạch nƣớc. B. licheniformis có
tác dụng làm giảm COD, H2S trong ao tôm làm tăng năng suất nuôi.
Các chế phẩm men vi sinh chứa nhóm vi khuẩn Bacillus sp có tác dụng
phân huỷ nhanh các hợp chất hữu cơ, làm mất mùi hơi, kích thích sự phát triển
các vi khuẩn có lợi, cạnh tranh mơi trƣờng sống, làm giảm số lƣợng vi khuẩn có
hại gây bệnh, làm ổn định mơi trƣờng. Giúp chuyển hố các chất hữu cơ nhƣ:
xác động thực vật, cặn bã thành CO2 và nƣớc; chuyển các chất độc hại nhƣ
NH3-, NO2- thành các chất không độc nhƣ NO3- , NH4+ từ đó làm ổn định chất
lƣợng nƣớc.[31]

Hình 1.2. Vi khuẩn Bacillus licheniformis
/>
9


PHẦN II.
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập đƣợc một số chủng vi khuẩn Bacillus từ đất và xác định đƣợc đặc
điểm sinh học của các chủng vi khuẩn đã phân lập.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu, phân lập một số chủng vi khuẩn Bacillus từ đất
- Xác định một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn đã phân lập
+ Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào của các chủng
vi khuẩn.
+ Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn.
+ Nghiên cứu khả năng sinh trƣởng trong điều kiện kỵ khí, khả năng đồng
hóa nguồn carbon và khả năng lên men tạo acid của các chủng vi khuẩn.
+ Xác định khả năng chịu muối và khả năng chịu nhiệt của các chủng vi khuẩn.
+ Xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn.

2.3. Nguyên liệu
2.3.1. Nguồn vi sinh vật
Vi khuẩn Bacillus phân lập từ 3 mẫu đất thu thập tại Hợp tác xã Nông
nghiệp Hoa Sen (xã Tiền An, thị xã Quảng Yên) ở Quảng Ninh.
2.3.2. Hóa chất
Các hóa chất nhƣ: Peptone, cao nấm men, NaCl, K2HPO4 , (NH4)2SO4,
CaCO3, MgSO4.7H2SO4, FeSO4.7H2O, MnSO4.4H2O, L-asoaragun, tinh bột,…
do Trung Quốc, Việt Nam, Mỹ, Đức, … sản xuất.
2.3.3. Thiết bị sử dụng
Các máy móc, dụng cụ đƣợc sử dụng có tại Viện Cơng nghệ sinh học bao gồm:
Máy đo pH HANA HI 2211 PH/ORP Meter – Ý, Nồi khử trùng HVE 50 Nhật Bản, Máy ly tâm lạnh - Mỹ, Máy lắc ổn nhiệt - Thụy Sĩ, Tủ ấm (Memmert)
- Đức, Cân phân tích OHAUS PA 213 - Mỹ, Tủ lạnh 4oC; -20oC; -80oC - Nhật

10


Bản, Kính hiển vi quang học, Tủ cấy (Box laminar PII) – Đức, Micropipet Đức, Lị vi sóng 20 lít, 30 lít – Liên Doanh
2.3.4. Mơi trường nghiên cứu
- Mơi trƣờng LB phân lập và nuôi cấy các chủng Bacillus
Bảng 2.1: Công thức môi trƣờng LB
Thành phần

Hàm lƣợng (g/l)

Peptone

10

Cao nấm men

5

NaCl

10

Agar

20
pH = 7

- Môi trƣờng xác định khả năng đồng hóa nguồn carbon của các chủng vi khuẩn
Bảng 2.2: Cơng thức mơi trƣờng xác định khả năng đồng hóa nguồn carbon
Thành phần

Hàm lƣợng (g/l)

Nguồn carbon

1%

MgSO4.7H2O

0,2

NaH2PO4.H2O

2

CaCl2.2H2O

0,1

(NH4)2SO4

2

K2HPO4

0,5

Nguồn carbon bổ sung vào môi trƣờng xác định khả năng đồng hóa nguồn
carbon là một trong các loại đƣờng sau: glucose, lactose, glyxerol, maltose,
sucrose, fructose và mannitol

11


- Mơi trƣờng xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn:
Bảng 2.3: Công thức môi trƣờng xác định hoạt tính enzyme
Mơi trƣờng định tính

Thành phần, hàm lƣợng

Thuốc thử

Amylase

2% Agar + 1% Tinh bột

Lugol 1%

Cellulase

2% Agar + 1% CMC

Lugol 1%

Protease

2% Agar + 1% Casein

Thuốc thử gồm:
metanol, acid acetic và
nƣớc (theo tỉ lệ 3: 1: 6)

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp phân lập và làm thuần vi sinh vật [2]
Cách tiến hành: Lấy 1g mẫu đất đƣa vào ống falcon chứa 9ml nƣớc cất đã
đƣợc khử trùng để đƣợc độ pha loãng 10-1. Voltex đều rồi lấy 1ml dung dịch ở
độ pha loãng 10-1 cho vào ống falcon chứa 9ml nƣớc cất vơ trùng đƣợc độ pha
lỗng 10-2. Tiếp tục nhƣ vậy đến nồng độ 10-6. Gia nhiệt ở 800C trong 20 phút
rồi lấy 100μl dung dịch pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp trải đều lên đĩa
peptri chứa môi trƣờng nuôi cấy. Ủ ở 37°C trong 24 giờ. Chọn khuẩn lạc có hình
thái đặc trƣng cho vi khuẩn Bacillus và tiến hành làm thuần bằng cách cấy ria
trên môi trƣờng LB-agar, cho tới khi quan sát thấy chỉ có một dạng khuẩn lạc
duy nhất trên mơi trƣờng.
2.4.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn [2]
Chủng đƣợc quan sát trên môi trƣờng LB-agar bằng mắt thƣờng và kính
hiển vi quang học.

2.4.2.1. P ươn p p quan s t đặc đ ểm khuẩn lạc
Tiến hành quan sát các khuẩn lạc này từ các phía (từ trên xuống, từ bên
cạnh), chú ý về kích thƣớc, hình dạng khuẩn lạc, hình dạng mép, bề mặt, độ dày,
có núm hay khơng, độ trong, màu sắc (trên, dƣới, có khuếch tán ra mơi trƣờng
hay khơng)
12


2.4.2.2. P ươn p p n u m
Nguyên tắc: Dựa trên sự khác nhau về cấu trúc của vách tế bào nên trong
quá trình nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dƣơng sẽ giữ đƣợc phức hợp tím
gentians-iod khơng bị tẩy màu bởi cồn, trong khi vi khuẩn Gram âm không giữ
đƣợc phức hợp này. Do vậy, kết quả sau khi nhuộm là vi khuẩn Gram dƣơng
vẫn giữ đƣợc màu tím của gentians, còn vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng của
safranine.
Cách tiến hành: Làm vết bôi vi khuẩn phẩm trên 1 lam kính sạch. Để khơ
tự nhiên và cố định bằng cách hơ nóng qua ngọn lửa đèn cồn. Nhỏ vài giọt
Crystal Violet (tím kết tinh) cho phủ lên bề mặt vết nhuộm và để yên trong vòng
1 phút. Rửa nhanh bằng nƣớc. Nhỏ vài giọt Lugol cho phủ đều lên trên bề mặt
vết nhuộm và để yên trong vòng 1 phút. Rửa nhanh bằng nƣớc. Tẩy màu bằng
cách nghiêng lam kính và nhỏ từ từ cồn lên vết nhuộm, khi giọt cồn rời khỏi lam
kính khơng có màu tím thì ngừng ngay. Rửa nhanh bằng nƣớc. Nhỏ vài giọt
safranine cho phủ đều trên bề mặt vết nhuộm và để yên trong vịng 1 phút. Rửa
nhanh bằng nƣớc. Thấm khơ vết nhuộm và quan sát dƣới kính hiển vi với vật
kính x100.
Kết quả: VK Gram âm sẽ bắt màu hồng, VK Gram dƣơng sẽ bắt màu tím.
Quan sát hình dạng vi khuẩn (cầu khuẩn, trực khuẩn,...) và cách sắp xếp (chuỗi,
chùm, rời rạc,...).
2.4.2.3. P ươn p p x c địn k ả n n s n b o tử
Xác định khả năng hình thành nội bào tử của vi khuẩn theo phƣơng pháp

của Schaeffer–Fulton cải tiến.
Nguyên tắc: Bào tử vi khuẩn là một phƣơng thức sống của vi khuẩn thích
nghi với các điều kiện mơi trƣờng khắc nghiệt, bào tử có 4 lớp, trong đó lớp thứ
hai là áo bào tử chứa lƣợng lớn protein sừng (50-80% lƣợng protein của vi
khuẩn), thẩm thấu kém và lớp thứ ba là vỏ bào tử chứa chủ yếu peptidoglican.
Do đó muốn thấm đƣợc thuốc nhuộm thì cần đun trên lửa đèn cồn trong 5 phút
làm biến tính protein bào tử, giúp thẩm thấu đƣợc xanh methylene vào lớp
13


protein và peptidoglican, làm bào tử bắt màu xanh. Tế bào chất của vi khuẩn giữ
màu kém nên lần nhuộm đầu bắt màu xanh nhƣng sau đó bị rửa trơi bởi nƣớc,
đồng thời các thành phần tế bào chất có tính kiềm nên sau đó lại bắt màu thuốc
nhuộm bổ sung có tính axit (axit fuchsin) nên có màu hồng.
Cách tiến hành: Lam kính đƣợc vơ trùng bằng cồn 70%, sau đó khuẩn lạc
của vi khuẩn đƣợc trải lên lam kính và đƣợc cố định bằng nhiệt (tạo vết bơi).
Phủ lên vết bơi một mảnh giấy lọc, sau đó dùng pipet nhỏ dung dịch xanh
methylene lên trên giấy lọc để nhuộm vết bôi. Vừa nhỏ màu xanh methylene lên
giấy lọc vừa đun nhẹ lam kính trên đèn cồn, liên tục nhỏ thuốc nhuộm trong khi
đun để tránh lam kính bị khơ (nhƣng khơng để thuốc nhuộm sơi trên lam kính).
Sau khi nhuộm với xanh methylene trên ngọn đèn cồn trong 5 phút, để nguội
lam kính và rửa lam bằng nƣớc cất đến khi màu nƣớc rửa ra khơng cịn màu
xanh. Hong khơ lam kính sau khi rửa, tiếp theo lại nhuộm vết bôi với thuốc
nhuộm fuchsin trong một phút (tƣơng tự nhƣ nhuộm xanh methylene). Tiếp theo
rửa vết bôi với nƣớc cất và quan sát dƣới kính hiển vi quang học với vật kính
x100 trong giọt dầu.
Kết quả: Dƣới hiển vi trƣờng, bào tử của vi khuẩn bắt màu xanh của xanh
methylene và tế bào chất của vi khuẩn bắt màu hồng của thuốc nhuộm fuchsin
2.4.3. Xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn [2]
2.4.3.1. X c định hoạt tính amylase

Cách tiến hành: Ni VK trong mơi trƣờng LB-lỏng, sau 24 giờ lấy dịch
đem ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, thu phần dịch nổi bên trên (dịch chứa
enzyme thơ). Chuẩn bị mơi trƣờng xác định hoạt tính. Dùng khoan nút chai
(đƣờng kính d=0,7cm) đục 2 lỗ ở trên đĩa thạch (1 lỗ đối chứng). Dùng pipet hút
100µl dịch enzyme thô cho vào lỗ thạch, ủ ở 4°C trong 2 giờ. Sau đó, ủ tiếp ở
37°C trong 24 giờ. Kiểm tra hoạt tính bằng thuốc thử Lugol 1%. Nếu vi khuẩn có
sinh amylase sẽ tạo vịng trong suốt quanh lỗ khoan, vùng tinh bột chƣa bị phân giải
có màu tím đậm.

14


Kết quả: Đánh giá khả năng sinh amylase bằng cách đo đƣờng kính vịng
phân giải (D-d), cm. Trong đó D: đƣờng kính vịng phân giải (cm), d: đƣờng
kính lỗ thạch (cm).
Nếu: D-d ≥ 2,5 cm: rất mạnh,
D-d ≥ 2,0 cm: mạnh,
D-d ≥ 1,5 cm: trung bình và D-d < 1,0 cm: yếu
2.4.3.2. X c định hoạt tính protease
Enzyme tác động với cơ chất trong môi trƣờng thạch, cơ chất bị phân hủy
tạo thành vòng trong suốt xung quanh lỗ khoan. Độ lớn mơi trƣờng trong suốt
phản ánh hoạt tính của enzyme.
Cách tiến hành: Nuôi VK trong môi trƣờng LB-lỏng, sau 24 giờ lấy dịch
đem ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, thu phần dịch nổi bên trên (dịch chứa
enzyme thô). Chuẩn bị mơi trƣờng xác định hoạt tính. Dùng khoan nút chai
(đƣờng kính d=0,7cm) đục 2 lỗ ở trên đĩa thạch (1 lỗ đối chứng). Dùng pipet hút
100µl dịch enzyme thô cho vào lỗ thạch, ủ ở 4°C trong 2 giờ. Sau đó, ủ tiếp ở
37°C trong 24 giờ. Kiểm tra hoạt tính bằng thuốc thử là dung dịch hỗn hợp gồm
metanol, acid acetic và nƣớc (theo tỉ lệ 3: 1: 6). Nếu VK có sinh protease sẽ tạo
vịng trong suốt quanh lỗ đục, phần cịn lại có màu trắng đục do phản ứng của

casein với hỗn hợp dung dịch thuốc thử trên.
Kết quả: Đánh giá khả năng sinh protease bằng cách đo đƣờng kính vịng
phân giải (D-d), cm. Trong đó D: đƣờng kính vịng phân giải (cm), d: đƣờng
kính lỗ thạch (cm).
Nếu: D-d ≥ 2,5 cm: rất mạnh,
D-d ≥ 2,0 cm: mạnh,
D-d ≥ 1,5 cm: trung bình và D-d < 1,0 cm: yếu.
2.4.3.3. X c định hoạt tính cellulase
Cách tiến hành: Nuôi VK trong môi trƣờng LB-lỏng, sau 24 giờ lấy dịch đem
ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, thu phần dịch nổi bên trên (dịch chứa enzyme
thô). Chuẩn bị mơi trƣờng xác định hoạt tính. Dùng khoan nút chai (đƣờng kính
15


d=0,7cm) đục 2 lỗ ở trên đĩa thạch (1 lỗ đối chứng). Dùng pipet hút 100µl dịch
enzyme thơ cho vào lỗ thạch, ủ ở 4°C trong 2 giờ. Sau đó, ủ tiếp ở 37°C trong 24
giờ.
Kiểm tra hoạt tính bằng thuốc thử Lugol 1%. Nếu vi khuẩn có sinh
cellulase sẽ tạo vòng trong suốt quanh lỗ đục.
Kết quả: Đánh giá khả năng sinh cellulase bằng cách đo đƣờng kính vịng
phân giải (D-d), cm. Trong đó D: đƣờng kính vịng phân giải (cm), d: đƣờng
kính lỗ thạch (cm).
Nếu: D-d ≥ 2,5 cm: rất mạnh,
D-d ≥ 2,0 cm: mạnh,
D-d ≥ 1,5 cm: trung bình và D-d < 1,0 cm: yếu.
2.4.3.4. X c định hoạt tính catalase
Nguyên tắc: Catalase hiện diện ở các VSV hiếu khí và kị khí tùy ý. Catalase
thủy phân hydrogen perioxide (H2O2) thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ của
phân tử có độc tính cao này trong tế bào. Sự thủy phân H2O2 sẽ giải phóng O2,
đƣợc ghi nhận qua hiện tƣợng sủi bọt khí. Thử nghiệm này thƣờng đƣợc dùng để

phân biệt các VSV hiếu khí với kị khí ví dụ nhƣ Bacillus với Clostridium.
Cách tiến hành: Nhỏ một giọt dung dịch H2O2 30% lên trên khuẩn lạc
Bacillus, hoặc chuyển một lƣợng VSV lên lam kính rồi thử bằng dung dịch H2O2
30%. Ghi nhận hiện tƣợng sủi bọt nếu có.
Kết quả: Thử nghiệm là (+) khi có hiện tƣợng sủi bọt khí do O2 đƣợc tạo ra,
ngƣợc lại là (-) khi khơng có sủi bọt khí.
2.4.4. Xác định khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn trong mơi
trường kỵ khí [2]
Cách tiến hành: Dùng que cấy nhọn ( đã đƣợc khử trùng) chấm vào một
khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trƣờng đĩa thạch. Cấy vi khuẩn bằng cách ấn sâu
que cấy vào môi trƣờng thạch đứng trong ống nghiệm, phủ thêm 1 lớp môi
trƣờng mỏng phía trên để cách ly khơng khí và bề mặt thạch sát miệng ống
nghiệm. Đậy nắp ống nghiệm. Ủ ở 37°C, trong 24 giờ.
16


Kết quả: Dựa trên kết quả hình thành sinh khối vi khuẩn dọc vết cấy và
kết luận khả năng phát triển trong mơi trƣờng kỵ khí của các chủng vi khuẩn
đã phân lập.
2.4.5. Xác định khả năng đồng hóa nguồn carbon [34]
Xác định khả năng lên men của vi sinh vật đối với nguồn carbohydrate cụ
thể(Glucose, Lactose, Xylose…) kết hợp với môi trƣờng kiểm tra khả năng sinh
acid.
Cách tiến hành: đổ 4-5ml mơi trƣờng vào mỗi ống nghiệm, nhỏ 1µl dịch
khuẩn vào ống nghiệm. Nhỏ 1 chất chỉ thị Bromcresol purple vào dịch nuôi. ủ 25 ngày ở 370C. Chất chỉ thị Bromcresol purple có pH acid = 5,2 – vàng và pH
kiềm = 6,8 – tím.
Kết quả: Nếu mơi trƣờng chuyển màu vàng là vi khuẩn lên men nguồn
carbon và sinh acid trong môi trƣờng làm pH giảm (pH≤5,2 mơi trƣờng có màu
vàng), nếu mơi trƣờng khơng đổi màu là vi khuẩn không lên men nguồn carbon
và không sinh acid trong mơi trƣờng (pH≥6,8 mơi trƣờng có màu tím).

2.4.6. Xác định khả năng chịu NaCl [34]
Các chủng Bacillus có thể sinh trƣởng và phát triển trong mơi trƣờng có
nồng độ muối cao, đây là đặc điểm mà nhiều loài vi khuẩn khác khơng có. Bên
cạnh đó, tình hình nhiễm mặn môi trƣờng đất và nƣớc ngày càng phổ biến. Vì
vậy, thí nghiệm xác định khả năng chịu mặn của các chủng Bacillus là cần thiết
trong việc tạo chế phẩm probiotic trong ni thủy sản và xử lí ao hồ.
Cách tiến hành: đổ 30ml mơi trƣờng vào bình tam giác. Nhỏ 30µl của
chủng đƣợc chọn vào mơi trƣờng LB lỏng ở các nồng độ muối 1.5, 2, 3 và 5%.
Ủ ở 37°C, trong 24 giờ.
Kết quả: Dựa trên kết quả đo OD600nm trên máy so màu để kết luận khả
năng chịu muối của các chủng vi khuẩn đã phân lập.
2.4.7. Xác định khả năng chịu nhiệt [34]
Xác định khả năng chịu nhiệt của tế bào sinh dƣỡng của vi khuẩn
Bacillus.
Cách tiến hành: cấy trải các chủng đƣợc chọn trên môi trƣờng LB agar. Ủ
ở 40°C, 45°C, 50oC và 60oC, trong 24 giờ.
17


Kết quả: Dựa trên kết quả quan sát số lƣợng vi khuẩn tạo thành trên bề
mặt môi trƣờng nuôi cấy để kết luận khả năng chịu nhiệt của các chủng vi khuẩn
đã phân lập.
2.4.8. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các vi sinh vật thử nghiệm đối với
một số vi khuẩn gây bệnh nhƣ: E.coli, Salmonella, Bacillus cereus, Shighella
theo phƣơng pháp của Aslim và cộng sự (2005).
Nguyên tắc: Thực hiện theo nguyên tắc khuếch tán trên đĩa thạch, nguyên
tắc này dựa trên khả năng kháng các vi sinh vật chỉ thị của 2 sản phẩm.
Cách tiến hành: Mơi trƣờng thử hoạt tính kháng khuẩn đƣợc đổ trên đĩa
Petri (đã chứa vi khuẩn kiểm định) sau khi môi trƣờng đã đông cứng tiến hành

đục lỗ thạch. Nhỏ phần dịch trong (dịch nuôi cấy đã li tâm ở 10000vòng/phút
trong 10 phút) vào các lỗ đã đục để ở 4oC trong 6 giờ sau đó mang các đĩa thạch
để 37oC.Sau 24 giờ quan sát vòng kháng khuẩn tạo thành.
Kết quả: Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật tuyển chọn
đƣợc tính bằng đƣờng kính vịng kháng khuẩn ∆D.
∆D = D-d (cm) với D: đƣờng kính vịng vơ khuẩn (cm). d: đƣờng kính lỗ
thạch (cm).
(D-d) ≥ 2,5cm: hoạt tính rất mạnh
(D-d) ≥ 2,0cm: hoạt tính mạnh
(D-d) ≥ 1,0-1,95cm: hoạt tính trung bình
(D-d) ≤ 1,0cm: hoạt tính yếu
(D-d) = 0: khơng kháng, kí hiệu (-)
Hiệu số (D-d, cm) càng lớn, hoạt tính ức chế của chủng Bacillus càng
mạnh.
2.5. Phƣơng pháp thu thập và xử lý số liệu
- Thu thập số liệu từ tài liệu từ thực nghiệm: quan sát, theo dõi, đo đạc qua
các thí nghiệm
- Sử dụng nhật ký ghi chép
- Thống kê số liệu, so sánh và lập biểu đồ

18


PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và sàng lọc sơ bộ các chủng Bacillus
Từ 3 mẫu đất thu thập tại các ruộng rau màu Hợp tác xã Nông nghiệp Hoa
Sen (xã Tiền An, thị xã Quảng Yên) ở Quảng Ninh, tiến hành phân lập các
chủng Bacillus. Kết quả phân lập và tinh sạch đƣợc 5 chủng vi khuẩn tạo dạng
khuẩn lạc khác nhau, đƣợc kí hiệu là LB1, LB2, LB3, LB4 và LB5. Sau đó, tiến
hành ni cấy các chủng này trên môi trƣờng LB ở 37°C. Sau 24 giờ quan sát

hình dạng, màu sắc, bề mặt khuẩn. Làm tiêu bản nhuộm Gram, xác định khả
năng sinh enzyme catalase và khả năng sinh bào tử. Kết quả đƣợc trình bày tóm
tắt ở bảng 3.1, một phần hình ảnh trong quá trình nghiên cứu đã thu thập đƣợc
trình bày ở hình 3.1, 3.2 và 3.3.
Bảng 3.1. Tổng hợp các đặc điểm hình thái khuẩn lạc và một số đặc điểm
sinh học của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc
Kí
hiệu
LB1
LB2
LB3

LB4

LB5

Hình thái khuẩn
lạc

sn n

c ú: +: l

Catalase

Khả năng
sinh nội bào
tử

Que, xếp đơn hoặc

đôi

+

+

+

Que, xếp đơn hoặc
đôi

+

+

+

Que, đứng riêng rẽ
hoặc xếp thành chuỗi

+

+

+

Que, đứng riêng rẽ
hoặc xếp thành chuỗi

+

+

+

Que, đứng riêng rẽ
hoặc xếp thành chuỗi

+

+

+

Hình thái tế bào

Trắng sữa, mép gần
trịn, lồi và nhăn ,
đƣờng kính 2-3 cm
Trắng, nhăn, đƣờng
kính 3-4 cm
Trắng sữa, mép
nhăn, lồi và trơn,
đƣờng kính 2-3 cm
Trắng, nhăn, có viền
ngồi, lồi, đƣờng
kính 2-3 cm
Trắng, mép nhăn,
lồi, đƣờng kính 3-4
cm

G

Tính chất
Gram

ram dươn

oặc dươn tín catalase oặc có k ả n n

b o tử

19