BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN HỐ HỌC
------------
LÊ THỊ HỒNG NHUNG
NGHIÊN CỨU HĨA HỌC VÀ THĂM DỊ HOẠT TÍNH SINH HỌC
CỦA LỒI THƠNG LÁ DẸT (PINUS KREMPFII LECOMTE) VÀ
NGŨ GIA BÌ HƯƠNG (ACANTHOPANAX TRIFOLIATUS L. MERR.).
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
Hà Nội – Năm 2014
1
LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng có ai cơng bố trong các cơng trình
nghiên cứu trước đây.
Tác giả luận án
Lê Thị Hồng Nhung
2
LỜI CẢM ƠN
Luận án này được hồn thành tại Phịng Tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa học,
Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam. Trong q trình nghiên cứu, tơi
đã nhận được nhiều sự giúp đỡ chân tình của các thầy cô, các nhà khoa học cũng
như đồng nghiệp, bạn bè và người thân.
Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin gửi đến PGS. TS. Trịnh
Thị Thủy và TS. Nguyễn Thanh Tâm – những người thầy đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi, tận tình hướng dẫn và có nhiều góp ý quý báu trong thời gian thực hiện luận
án.
Tôi xin chân thành cảm ơn GS. TSKH. Trần Văn Sung đã tạo điều kiện tốt
nhất để tơi được học tập, nghiên cứu tại Phịng Tổng hợp hữu cơ và cũng là người
đã ủng hộ tôi thực hiện luận án này.
Tôi cũng xin cảm ơn đến các cán bộ nghiên cứu phòng Tổng hợp hữu cơ –
Viện Hóa học đã giúp đỡ tơi rất nhiều trong q trình thực nghiệm và hồn thành
bản luận án.
Tơi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các nhà khoa học Viện Hóa học đã
giảng dạy, hướng dẫn tơi hoàn thành các học phần và các chuyên đề trong chương
trình đào tạo.
Tơi trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Công nghiệp Hà Nội
cùng Ban lãnh đạo Viện Hóa học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời
gian học tập.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc đến tồn thể gia đình, đồng
nghiệp và bạn bè đã ủng hộ và động viên tơi hồn thành tốt luận án.
Tơi xin trân trọng cảm ơn!
Hà nội, ngày……. tháng…… năm 2014
Tác giả luận án
3
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ………….……………………………….………... v
DANH MỤC CÁC HÌNH ………………………………………….……..........vi
DANH MỤC CÁC BẢNG………………………………………………..…... iix
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT………………………ix
MỞ ĐẦU………….……………………………….………………..…...……… 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................. 3
1.1. Tổng quan về hai loài nghiên cứu.............................................................. 3
1.1.1. Loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) .............................................. 3
1.1.1.1. Đặc điểm thực vật lồi Thơng lá dẹt ................................................. 3
1.1.1.2. Tình hình nghiên cứu lồi Thơng lá dẹt ............................................ 4
1.1.1.3. Tình hình nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của chi Pinus ... 5
1.1.2. Lồi Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L.Merr.) ....................... 8
1.1.2.1. Đặc điểm thực vật loài Ngũ gia bì hương ......................................... 8
1.1.2.2. Ứng dụng trong y học dân gian của lồi Ngũ gia bì hương ............... 9
1.1.2.3. Tình hình nghiên cứu của lồi Ngũ gia bì hương .............................. 9
1.2. Các hợp chất flavonoid ............................................................................ 14
1.2.1. Cấu trúc hóa học ..................................................................................... 14
1.2.2. Hoạt tính sinh học ................................................................................... 16
1.3. Các hợp chất triterpene khung lupane ................................................... 19
1.3.1. Cấu trúc hóa học ..................................................................................... 19
1.3.2. Hoạt tính sinh học ................................................................................... 19
1.4. Chuyển hóa hóa học hợp chất triterpene khung lupane và hoạt tính sinh
học của chúng .................................................................................................. 22
1.4.1. Chuyển hóa nhóm OH ............................................................................. 22
1.4.1.1. Chuyển hóa thành ester .................................................................. 22
1.4.1.2. Chuyển hố thành ketone, acid, oxime, amine ................................ 24
1.4.1.3. Chuyển hóa thành carbamate ......................................................... 26
1.4.2. Chuyển hố nhóm isopropenyl ................................................................ 27
4
1.4.2.1. Khử hố nối đơi ∆ 20(29)............................................................... 27
1.4.2.2. Oxy hố nối đơi ∆ 20(29) .............................................................. 28
1.4.2.3. Chuyển hố ở vị trí allyl của nối đơi .............................................. 28
1.4.3. Chuyển hóa nhóm 28-COOH .................................................................. 29
1.4.3.1. Chuyển hóa thành ester .................................................................. 29
1.4.3.2. Chuyển hóa thành amide ................................................................ 30
CHƯƠNG 2. NGUN LIỆU, HĨA CHẤT VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ................................................................................................................. 32
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị ............................................................. 32
2.1.1. Nguyên liệu ............................................................................................. 32
2.1.2. Hóa chất ................................................................................................. 32
2.1.3. Thiết bị .................................................................................................... 32
2.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 33
2.2.1.Phương pháp chiết tách ........................................................................... 33
2.2.1.1. Phương pháp chiết tách các chất từ lồi Thơng lá dẹt ..................... 33
2.2.1.2. Phương pháp chiết tách các chất từ loài Ngũ gia bì hương ............. 34
2.2.2.Phương pháp xác định cấu trúc................................................................ 34
2.2.3.Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học ................................................ 35
2.2.3.1. Hoạt tính kháng chủng Bacillus subtilis ........................................ 35
2.2.3.2. Hoạt tính gây độc tế bào ................................................................ 35
2.2.3.3. Hoạt tính chống oxi hóa ................................................................. 37
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM ...................................................................... 39
3.1. Lồi Thơng lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) ........................................... 38
3.1.1. Cặn chiết n-hexane .................................................................................. 40
3.1.2. Cặn chiết ethyl acetate (EtOAc) .............................................................. 40
3.1.2.1. Phân lập chất.................................................................................. 40
3.1.2.2. Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được .................................. 42
3.1.3. Cặn chiết n-buthanol (n-BuOH) .............................................................. 43
3.2. Lồi Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.) ................ 45
3.2.1. Phân lập các hợp chất từ loài Ngũ gia bì hương ..................................... 45
5
3.2.1.1. Quá trình phân lập.......................................................................... 45
3.2.1.2. Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được .................................. 48
3.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất của hai chất AT1, AT2 ....................................... 48
3.2.2.1. Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT1 ............................................. 48
3.2.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT2 ............................................. 57
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 64
4.1. Kết quả từ lồi Thơng lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte).......................... 64
4.1.1. Thành phần hóa học của cặn n-hexane ................................................... 64
4.1.2. Các chất phân lập được từ cặn EtOAc .................................................... 65
4.1.2.1. Tectochrysin (PK1) ....................................................................... 65
4.1.2.2. Pinostrobin (PK2) .......................................................................... 68
4.1.2.3. Pinobanksin (PK3) ........................................................................ 71
4.1.2.4. Galangin (PK4) ............................................................................. 75
4.1.2.5. Strobopinin (PK5) ......................................................................... 78
4.1.2.6. Crytostrobin (PK6) ........................................................................ 82
4.1.3. Chất phân lập được từ cặn chiết n-BuOH ............................................... 85
4.2. Kết quả từ lồi Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L. Merr.) . 92
4.2.1. Các hợp chất được phân lập và xác định từ lồi Ngũ gia bì hương. ........ 92
4.2.1.1. 24-nor-11α-hydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT1) ...... 92
4.2.1.2. 24-nor-3α,11α dihydroxy-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT2) ......... 95
4.2.1.3. 11α,23-dihydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT3) .......... 98
4.2.2. Các dẫn xuất chuyển hóa hóa học của hợp chất AT1, AT2 ................... 105
4.2.2.1. Các dẫn xuất của AT1.................................................................. 106
4.2.2.2. Các dẫn xuất của AT2 ................................................................ 112
4.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập và chuyển hóa hóa học.117
4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào ....................................................................... 117
4.3.2. Hoạt tính kháng chủng Bacillus subtilis ................................................ 119
4.3.3. Hoạt tính chống oxi hóa ........................................................................ 120
BẢNG TỔNG HỢP CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN HĨA HỐ
HỌC TỪ HAI LỒI NGHIÊN CỨU………….…....…..................... 122
6
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................... 128
CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .................................. 130
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH ........... 132
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 133
PHỤ LỤC
7
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Trang
Sơ đồ 1.1
Ester hoá acid betulinic ở vị trí 3β-OH tạo các hợp chất
22
56.1–56.8
Sơ đồ 1.2
Ester hố betulinic acid ở vị trí 3β-OH tạo hợp chất 57
23
Sơ đồ 1.3
Chuyển hóa nhóm 3β-OH, 28-OH của betulin
23
Sơ đồ 1.4
Chuyển hóa nhóm 28-OH của betulin tạo dẫn xuất 64, 65
24
Sơ đồ 1.5
Chuyển hố nhóm 3β-OH của betulinic acid thành ketone,
25
oxime, amine.
Sơ đồ 1.6
Tổng hợp acid betulinic từ betulin
25
Sơ đồ 1.7
Tổng hợp các dẫn xuất carbamate của betulinic acid
26
Sơ đồ 1.8
Chuyển hóa các dẫn xuất carbamate của betulin
27
Sơ đồ 1.9
Khử hố nối đơi ∆ 20(29) của betulinic acid
27
Sơ đồ 1.10
Oxi hóa nối đơi ∆ 20(29) của betulinic acid
28
Sơ đồ 1.11
Chuyển hóa vị trí allyl của nối đơi tạo hợp chất 85- 87
29
Sơ đồ 1.12
Tổng hợp một số dẫn xuất este của 23-hydroxy betulinic acid
30
Sơ đồ 1.13
Tổng hợp dẫn xuất A43-D của betulinic acid
31
Sơ đồ 3.1
Quy trình chiết rễ Thơng lá dẹt
39
Sơ đồ 3.2
Phân lập các chất từ cặn chiết EtOAc của rễ Thông lá dẹt
41
Sơ đồ 3.3
Phân lập chất PK7 từ cặn chiết n-BuOH của rễ Thông lá dẹt
44
Sơ đồ 3.4
Quy trình chiết mẫu Ngũ gia bì hương
45
Sơ đồ 3.5
Phân lập các hợp chất từ cặn chiết dichlorometan của loài
47
Ngũ gia bì hương
Sơ đồ 4.1
Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT1
106
Sơ đồ 4.2
Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT2
112
8
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1
Ảnh cây và tiêu bản của lồi Thơng lá dẹt
4
Hình 1.2
Hình ảnh về lồi Ngũ gia bì hương
8
Hình 1.3
Vịng benzopyrano của hợp chất flavonoid
14
Hình 4.1
Phổ khối ESI-MS (positive) của chất PK1
67
Hình 4.2.
Phổ 1H-NMR của chất PK1 (500 MHz, DMSO-d6)
67
Hình 4.3
Phổ 13C-NMR và DEPT của chất PK1 (125 MHz, DMSO-d6)
68
Hình 4.4
Phổ 1H-NMR của chất PK2 (500 MHz, CD3OD)
70
Hình 4.5
Phổ 1H-NMR (giãn) của chất PK2 (500 MHz, CD3OD)
70
Hình 4.6
Phổ 13C-NMR và DEPT của chất PK2 (125 MHz, CD3OD)
71
Hình 4.7
Phổ khối FT-IR của chất PK3
73
Hình 4.8
Phổ khối ESI-MS (positive ion) của chất PK3
73
Hình 4.9
Phổ 1H-NMR của chất PK3 (500 MHz, CD3OD)
74
Hình 4.10
Phổ 1H-NMR (giãn) của chất PK3 (500 MHz, CD3OD)
74
13
Hình 4.11
Phổ C-NMR của chất PK3 (125 MHz, CD3OD)
75
Hình 4.12
Phổ ESI-MS (positive ion) của chất PK4
77
Hình 4.13
Phổ 1H-NMR của chất PK4(500 MHz, CD3OD)
77
Hình 4.14
Phổ 13C-NMR của chất PK4 (125 MHz, CD3OD)
78
Hình 4.15
Phổ FT-IR của chất PK5
80
Hình 4.16
Phổ 1H-NMR của chất PK5 (500 MHz, CD3OD)
81
Hình 4.17
Phổ 1H-NMR (giãn) của chất PK5 (500 MHz, CD3OD)
81
Hình 4.18
Phổ 13C-NMR và DEPT của chất PK5 (125 MHz, CD3OD)
82
Hình 4.19
Phổ 1H-NMR của chất PK6 (500MHz, CD3OD)
84
Hình 4.20
Phổ 1H-NMR (giãn) của chất PK6 (500MHz, CD3OD)
84
Hình 4.21
Phổ 13C-NMR và DEPT của chất PK6 (125MHz, CD3OD)
85
Hình 4.22
Một số tương tác chính trong phổ HMBC của chất PK7
86
Hình 4.23
Một số tương tác chính trong phổ NOESY của chất PK7
87
Hình 4.24
Chất burselignan (PK7a)
87
9
Hình 4.25
Phổ HR-ESI-MS (positive ion) của chất PK7
88
Hình 4.26
Phổ 1H NMR của chất PK7 (500 MHz, CD3OD)
89
Hình 4.27
Phổ 13C và DEPT của chất PK7 (125 MHz, CD3OD)
89
Hình 4.28
Phổ HSQC của chất PK7
90
Hình 4.29
Phổ HMBC của chất PK7
90
Hình 4.30
Phổ NOESY của chất PK7
91
Hình 4.31
Phổ khối ESI-MS (positive ion) của chất AT1
94
Hình 4.32
Phổ 1H-NMR của chất AT1 (500 MHz, CDCl3)
94
Hình 4.33
Phổ 13C-NMR và DEPT của chất AT1 (125MHz, CDCl3)
95
Hình 4.34
Phổ ESI-MS (positive ion) của chất AT2
97
1
Hình 4.35
Phổ H-NMR của chất AT2 (500 MHz, CDCl3)
97
Hình 4.36
Phổ 13C-NMR và DEPT của chất AT2 (125MHz, CDCl3)
98
Hình 4.37
Các tương tác chính trên phổ COSY, HMBC của chất AT3
100
Hình 4.38
Phổ FT- IR của chất AT3
101
Hình 4.39
Phổ HR-ESI-MS (positive ion) của chất AT3
101
Hình 4.40
Phổ 1H-NMR của chất AT3 (500 MHz, CD3OD)
102
Hình 4.41
Phổ 1H-NMR (giãn) của chất AT3 (500 MHz, CD3OD)
102
13
Hình 4.42
Phổ C-NMR và DEPT của chất AT3 (125 MHz, CD3OD)
103
Hình 4.43
Phổ HSQC của chất AT3
103
Hình 4.44
Phổ HMBC của chất AT3
104
Hình 4.45
Phổ COSY của chất AT3
104
10
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1
Một số thành phần thường có trong tinh dầu, nhựa của chi
6
Pinus
Bảng 1.2
Một số terpene tiêu biểu được phân lập từ thân gỗ của chi
7
Pinus
Bảng 1.3
Một số khung flavonoid thường gặp
15
Bảng 3.1
Các thông số của phản ứng chuyển hóa tạo AT6, AT7
50
Bảng 3.2
Các thơng số của phản ứng chuyển hóa tạo AT10 – AT12
52
Bảng 3.3
Các thơng số của phản ứng chuyển hóa tạo AT15 – AT17
55
Bảng 3.4
Các thơng số của phản ứng chuyển hóa tạo AT20 – AT23
58
Bảng 4.1
Kết quả phân tích thành phần hóa học của cặn chiết n-
64
hexane bằng phương pháp GC-MS
Bảng 4.2
Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR của PK1 và tectochrysin
1
13
66
Bảng 4.3
Số liệu phổ H, C-NMR của PK2 và pinostrobin
69
Bảng 4.4
Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của PK3 và số liệu của pinobanksin
72
Bảng 4.5
Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của PK4
76
Bảng 4.6
Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR của PK5 và (2S)-Strobopinin
79
Bảng 4.7
Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR của PK6 và (2S)-Cryptostrobin
83
Bảng 4.8
Số liệu phổ 1H,
C-NMR của PK7, (+)-Isolariciresinol và
87
C-NMR của AT1 và 24-nor-11α-hydroxy-
93
13
Burselignan
Bảng 4.9
Số liệu phổ 1H-,
13
3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid
Bảng 4.10
Số liệu phổ
1
H-,
13
C-NMR của AT1 và 24-nor-3α,11α
96
dihydroxy-lup-20(29)-ene-28-oic acid
Bảng 4.11
Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của AT3 (CD3OD, 500/125MHz)
99
Bảng 4.12
Kết quả hoạt tính gây độc tế bào
117
11
Bảng 4.13
Kết quả hoạt tính kháng chủng Bacillus subtilis
119
Bảng 4.14
Kết quả hoạt tính chống oxi hóa theo phương pháp DPPH
120
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
1
H-NMR
Proton Nuclear Magnetic
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Resonance Spectroscopy
13
C-
Carbon -13 Nuclear Magnetic
NMR
Resonance Spectroscopy
DEPT
Distortionless Enhancement by
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13
Phổ DEPT
Polarisation Transfer
HMBC
HSQC
1
H-1H-
Heteronuclear Multiple Bond
Phổ tương tác đa liên kết hai chiều dị hạt
Correlation
nhân
Heteronuclear Single Quantum
Phổ tương tác hai chiều trực tiếp dị hạt
Coherence
nhân
1
Phổ tương tác hai chiều đồng hạt nhân
H-1H- Correlation Spectroscopy
1
H-1H
COSY
ESI-MS
Phổ khối ion hóa bằng phun mù điện tử
Electron Spray Ionization-Mass
Spectroscopy
HR-ESI-
High Resolution Electron Spray
Phổ khối phân giải cao ion hóa bằng
MS
Ionization Mass Spectroscopy
phun mù điện tử
FT-IR
Infrared Spectroscopy
Phổ hồng ngoại
s
singlet
d
doublet
t
triplet
q
quartet
dd
doublet of doublet
dt
doublet of triplet
br
broad
m
multiplet
J (Hz)
Hằng số tương tác (Hz)
12
δ (ppm)
Độ dịch chuyển hóa học tính
(ppm = part per million)
bằng ppm (phần triệu)
CC
Column Chromatography
Sắc ký cột
SKLM
Sắc ký lớp mỏng
KB
Human epidermoid carcinoma
Ung thư biểu mô
Hep-G2
Hepatocellular carcinoma human
Ung thư gan người
MCF-7
Adeno carcinoma
Ung thư vú
Lu
Human lung carcinoma
Ung thư phổi
RD
Human rhabdomyosarcoma
Ung thư màng tim
TPA
12-O-Tetradecanoylphorbol-13acetate
IC50
Inhibitory concentration 50%
Nồng độ ức chế 50% tế bào thử nghiệm
EC50
Effective concentration 50%
Liều có hiệu quả trên 50% tế bào thử
nghiệm
MIC
Minimum inhibitory concentration
Nồng độ ức chế tối thiểu
Ac
CH3CO-
Acetyl
Me
-CH3
Methyl
Bu
-C4H9
Butyl
Et
-C2H5
Ethyl
DMSO
Dimetylsunfoxit
TMS
Tetrametyl Silan
4-DMAP
4-dimetylaminopyridin
THF
Tetrahydrofuran
TEA
Triethylamine
AZT
Azidothymidine
TBDPSCl
Tert-Butyldiphenylchlorosilane
DIBALH
Diisobutylaluminium hydride
EDCI
1-Ethyl-3-(3-
13
dimethylaminopropyl)carbodiimide
PL
rt
Phụ lục
Nhiệt độ phòng
Room temperature
hiệu suất phản ứng
H
Rf
Retention factor
[αD]
Năng suất quay cực
LSP
Lượng sản phẩm
CTPT
Công thức phân tử
KLPT
Khối lượng phân tử
14
15
MỞ ĐẦU
Y học cổ truyền phương Đơng có một lịch sử lâu đời và là một kho tàng y
dược phong phú từ hàng nghìn năm. Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học
kỹ thuật nói chung, y học nói riêng, nền y học cổ truyền đang có những đóng góp to
lớn vào việc phịng và chữa bệnh, làm tăng tuổi thọ của con người và nâng cao chất
lượng cuộc sống. Nhiều hợp chất hóa học có nguồn gốc từ thiên nhiên được sử dụng
làm thuốc có hiệu quả như atermisinin từ cây Thanh hao hoa vàng (Artemisia annua
L.) làm thuốc chống sốt rét diệt thể phân liệt, taxol từ cây Thông đỏ (Taxus
Cuspidata) được sử dụng làm thuốc chống ung thư…Ngồi ra, người ta cịn có thể
sử dụng dịch chiết của thảo dược làm thực phẩm chức năng trong việc hỗ trợ chữa
bệnh như dịch chiết từ cây Trinh nữ hồng cung (Crinum latifolium) là thuốc điều
trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt (u xơ tuyến tiền liệt) ở nam giới và u xơ tử cung ở
nữ giới, hay gần đây là sản phẩm từ dịch chiết của 7 loại thảo dược quý (Khổ qua,
Dây thìa canh, Hoài sơn, Sinh địa, Thương truật, Linh chi và tảo Spirulina) có khả
năng điều trị đái tháo đường… Với những kết quả đạt được cho thấy việc nghiên
cứu thành phần hóa học từ những cây cỏ thiên nhiên có một ý nghĩa khoa học và
thực tiễn cao, đặc biệt ở Việt Nam, một nước có thảm thực vật phong phú, có nguồn
tài ngun dược liệu vơ cùng q giá.
Ngồi việc phân lập các hợp chất trong thiên nhiên, các nhà khoa học cịn
tiến hành chuyển hóa hóa học từ các hợp chất thiên nhiên ban đầu nhằm tạo ra các
hoạt chất mới có hoạt lực cao hơn, ưu việt hơn, độc tính thấp hơn. Đây cũng là một
phương pháp để tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, định hướng cho ngành
hóa dược. Theo thống kê dựa vào đơn thuốc ở Mỹ công bố cho thấy trên 50% loại
thuốc được kê đơn chứa các hoạt chất có nguồn gốc từ tự nhiên hoặc được tổng hợp
dựa vào cấu trúc của các hợp chất tự nhiên.
Lồi Thơng lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) thuộc chi Pinus, họ Pinaceae.
Loài này mới chỉ có một cơng bố duy nhất trên thế giới từ năm 1966 và là một thực
vật đặc hữu của Việt Nam, “hóa thạch sống” hiếm hoi cịn sót lại cho đến ngày nay.
16
Việc nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của lồi Thơng lá dẹt
ngồi ý nghĩa về khoa học cịn có ý nghĩa rất lớn về mặt xã hội.
Lồi Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.) thuộc chi
Acanthopanax, họ Araliaceae. Ngay từ những năm 80 của thế kỷ trước, đã có nhiều
cơng trình cơng bố về thành phần hóa học của cây này. Nhiều hợp chất triterpene
acid có khung lupan với hàm lượng khá cao đã được phân lập và xác định. Tuy
nhiên, cho đến nay chưa có cơng trình khoa học nào về nghiên cứu tổng hợp các
dẫn xuất triterpene từ cây này được cơng bố.
Trên nền tảng đó, chúng tơi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu hóa học và thăm
dị hoạt tính sinh học của lồi Thơng lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) và Ngũ
gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L.Merr.)”.
Mục tiêu của luận án:
1. Nghiên cứu thành phần hóa học của lồi Thơng lá dẹt (Pinus krempfii
Lecomte)
2. Nghiên cứu chiết tách các chất, đặc biệt là các triterpene khung lupane có
hàm lượng cao từ Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L.Merr.) để làm
nguyên liệu cho q trình chuyển hóa.
3. Tổng hợp các dẫn xuất từ các triterpene phân lập được
4. Khảo sát hoạt tính sinh học như khả năng kháng chủng Bacillus subtilis, khả
năng gây độc với một số dòng tế bào ung thư, khả năng chống oxi hóa của các dịch
chiết và các chất phân lập được làm cơ sở khoa học định hướng cho việc nghiên cứu
ứng dụng các hợp chất này trong cơng nghệ hóa dược.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
17
1.1.
Tổng quan về hai lồi nghiên cứu
1.1.1. Lồi Thơng lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte)
1.1.1.1.
Đặc điểm thực vật lồi Thơng lá dẹt
Thơng lá dẹt hay cịn được gọi là Thơng hai lá dẹt hay Thông lá dẹp, Thông
Sré (Pinus krempfii, tên đồng nghĩa là Ducampopinus krempfii (Lecomte) A. Chev),
thuộc chi Pinus, họ Thơng Pinaceae. Lồi này được ví như “sứ giả thời tiền sử” sinh cùng thời với khủng long, là một thực vật cổ “hóa thạch sống” hiếm hoi cịn sót
lại cho đến ngày nay. Hiện tại, Thơng hai lá dẹt được xếp ở lồi hiếm, mức độ đe
dọa có thể bị tuyệt chủng (bậc R) do nạn săn lùng của sơn tràng và do môi trường
sống của chúng (rừng) bị thu hẹp đáng kể. Lồi thơng cổ với đặc trưng là có hai lá
dẹt hình lưỡi kiếm, là lồi đặc hữu của Việt Nam, nó phân bố hẹp ở tỉnh Lâm Đồng
và đây là lồi thơng được nhiều nhà thực vật học trên thế giới hết sức quan tâm [1],
[2], [3], [4].
Thông lá dẹt là những cây đại thụ cao trên dưới 30m, đường kính có thể đạt
1,5-1,6m, đơi khi tới 2m. Tán của cây thường khá rộng, dày, sẫm màu và có hình rẻ
quạt. Đoạn thân dưới cành lớn, hầu như khơng có cành nhánh, trịn đều và đâm
thẳng vào tán lá. Cây mầm thường có khoảng 10-13 lá mầm đầu tiên có hình xoắn
cong về một hướng như lưỡi liềm, lá dài khoảng 2-3cm, sau đến là các lá nhỏ mọc
quanh thân, dài 1,5-2,5cm. Khi cây ở độ tuổi non (5-20 tuổi), lá dài và rộng bản (dài
10-15cm) hơn lá cây trưởng thành, xếp như hai lưỡi kéo ở phần đầu cành. Khi cây
trưởng thành, lá nhỏ và ngắn lại (dài 4-5cm), màu sẫm, mọc thành búi dày ở đầu
cành, làm cho tán cây thông già trở nên dày và sẫm màu hơn [3].
Hạt màu nâu nhạt và có cánh trắng khi chín, hạt có thể phát tán trong một
phạm vi tương đối rộng và nón quả cịn tồn tại một thời gian trên cây. Quả chín vào
mùa mưa.
18
Hình 1.1. Ảnh cây và tiêu bản của lồi Thơng lá dẹt
(lưu tại Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam)
Trong công trình Thực vật học đại cương của Đơng Dương, Hickel cho biết
thông lá dẹt thường gặp ở độ cao 1200 - 1500m và cây mọc thành quần thụ lớn. Ở
Việt Nam, Thơng lá dẹt phân bố chính ở Lâm Đồng, song nơi dễ tiếp cận nhất là
vùng Cổng Trời, trên dãy Hòn Nga thuộc xã Lát, huyện Lạc Dương, cách thành phố
Đà Lạt 20km hoặc vùng núi Bidoup nằm trong khu bảo tồn thiên nhiên Thượng Đa
Nhim, địa phận Long Lanh, cách thành phố Đà Lạt 50km.
1.1.1.2.
Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
lồi Thông lá dẹt
Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, mới chỉ có duy nhất một cơng trình
nghiên cứu về thành phần hóa học lồi này của Holger Erdtman, Thụy Sĩ được công
bố vào năm 1966. Từ thân gỗ Thông lá dẹt thu tại Nha Trang, Việt Nam, 10 chất là
chrysin
(5,7-dihydroxyflavone)
(1),
strobopinin
(2),
cryptostrobin
(3),
demethoxymatteucinol (6,8-dimethylpinocembrin) (4), pinosylvin (5), pinosylvin
monomethylether (6), tectochrysin (7), pinobanksin (8), pinocembrin (9),
pinostrobin (10) đã được nhóm nghiên cứu này phân lập và nhận dạng [4]. Điều thú
19
vị là tất cả các hợp chất này đều thuộc nhóm flavanoid. Trong đó, các hợp chất Cmethyl flavanoid như 2, 3, 4, 8, 9 là các hợp chất có cấu trúc thú vị [4],[5]:
HO
O
HO
H
O
H
OH
H3C
O
OH
1
H
O
2
CH3
H
HO
O
H
H3C
H
OH
O
4
RO
O
O
HO
OH
5: R = H
6: R = Me
HO
O
O
7
H
O
O
H
OH
O
R
OH
8: R = OH
9: R = H
O
10
Bên cạnh đó, thành phần chính của nhựa gỗ được xác định là dehydroabietic
acid và của tinh dầu là các monoterpenoid, thành phần đặc trưng có mặt trong hầu
hết tình dầu của các lồi thơng, đặc biệt là α- và β-pinen.
1.1.1.3.
Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
của chi Pinus
Trong khi lồi Thơng lá dẹt mới chỉ được nghiên cứu rất ít thì có nhiều lồi
thuộc chi Pinus lại có nhiều cơng trình nghiên cứu về thành phần và hoạt tính sinh
học đã được cơng bố và cho thấy có nhiều điều thú vị ở chi này. Theo thống kê trên
thế giới đến năm 2012 có trên 450 hợp chất được phân lập từ hơn 80 loài thuộc chi
20
Pinus, bao gồm các hợp chất carbohydrate, cyclitol, acid béo, terpene (diterpene
khung abietane, cembrane; lignan; steroid….), phenol, flavonoid và flavonoid
glycoside [5], [6].
Hầu hết các lồi thơng đều có chứa tinh dầu và nhựa. Thành phần chính là
các acid thuộc khung abietane, pimarane và monoterpenoid đặc trưng như α,βpinene, có thể cịn có β- phellandrene (P. contorta, P. banksiuna). Tuy nhiên, ở một
số lồi P. sylvestris, P. albicaulis lại thấy có sự xuất hiện của sesqui- và diterpene
như (+)-δ-cadinene, (-)-torreyol. Đặc biệt, lồi P. jefieyi có thể sản sinh ra loại nhựa
mà thành phần chính của nó là n-heptane, một hợp chất khơng có sự liên quan nào
đến các hợp chất terpene.
H
OH
H
H
torreynol
Bảng 1.1. Một số thành phần thường có trong tinh dầu, nhựa của chi Pinus
Một điều thú vị là thân gỗ của hầu hết các loài Pinus nghiên cứu đều có chứa
các hợp chất flavonoid như pinosylvin (5), pinobanksin (8), pinocembrin (9), và các
dẫn xuất monomethyl của chúng. Ngoài ra, phần lớn các hợp chất xác định được từ
chi này là các hợp chất terpene như thunbergene được phân lập từ hai loài P.
21
thunbergii, P. Albicaulis và lambertianic, communic acid – hai diterpene khung
labdane có mặt trong các lồi P. lambertiana, P. Elliottii tương ứng. Từ hạt của P.
sylvestris, hai diterpene acid khung labdane là pinifolic và dehydropinifolic acid
cũng được phân lập. Một chất mới thuộc nhóm này, anticopalic acid đã được tìm
thấy trong dịch chiết từ vỏ cây và gỗ của loài thông trắng P. monticola.
Bảng 1.2. Một số terpene tiêu biểu được phân lập từ thân gỗ của chi Pinus
Bên cạnh đó, nhiều cơng trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi này
cũng được cơng bố.
Hoạt tính sinh học của các loài này được các nhà khoa học đánh giá cao là
khả năng chống oxi hóa. Từ vỏ của loài P. radiata và P. pinaster đã phân lập được
procyanidin, catechin và gallic acid - các hợp chất được biết đến với khả năng
chống oxi hóa [7], [8], [9]. Trong một cơng trình cơng bố năm 2012 của Osman
Ustun cho thấy tinh dầu của năm loài P. brutia, P. halepensis, P. nigra, P. pinea và
P. sylvestris đều cho hoạt tính chống oxi hóa [10].
Năm 2012, Ipek Suntar và cộng sự còn phát hiện khả năng chống viêm của
22
tinh dầu một số loài thuộc chi này như P. brutia Ten., P. halepensis Mill., P. nigra
Arn., P. pinea L. và P. sylvestris L. [11].
Ngoài ra, tinh dầu của một số loài khác như P. halepensis Mill., P.
densiflora, P. thunbergii, P. rigida lại cho thấy khả năng kháng vi sinh vật rất tốt
[12], [13].
1.1.2. Lồi Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L.Merr.)
1.1.2.1.
Đặc điểm thực vật lồi Ngũ gia bì hương
Ngũ gia bì hương có tên khoa học là Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.,
thuộc chi Acanthopanax, họ Araliaceae. Cây bụi trườn, vươn cao hay dài đến 2-7m,
có phân cành,vỏ lúc non màu xanh, khi già
màu nâu xám, có nhiều gai nhọn sắc; cuống dài
2,5-3,5 cm, có gai; 3-5 lá chét, từ hình trứng
thn có mép khía răng khơ đến hình thn dài
ở mép có gai nhọn (var. setosus Li), lá chét
giữa thường lớn hơn các lá chét bên; kích
thước lá chét thường 4-8 x 1,5-3 cm. Cụm hoa
dạng chùm tán, mọc ở đầu cành; hoa màu vàng
ngà hay trắng ngà, có cuống mảnh, dài 0,7-1
cm. Đài 5, nhỏ; cánh hoa 5 hình tam giác tròn
đầu. Nhị 5, chỉ nhị dài hơn cánh hoa. Bầu 2 ơ,
đầu nhụy chẻ đơi. Quả hình cầu, hơi dẹt, khi
chín màu tím đen. 1-2 hạt nhỏ. Vỏ thân, vỏ rễ
và lá vị nát có mùi thơm đặc biệt [14], [15],
Hình 1.2. Hình ảnh về lồi Ngũ
gia bì hương [14]
[16].
Ngũ gia bì hương phân bố ở Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn Độ, các nước Đông
Dương cho tới Philippin. Ở Việt Nam có gặp ở Lai Châu, Lào Cai, Hà Giang, Cao
Bằng, Lạng Sơn, Vĩnh Phúc, Hịa Bình. Mọc ở rừng rậm nhiệt đới thường xanh mưa
mùa ẩm, ở độ cao 200 - 1500m. Cây thích nghi ở ven suối, vách đá ẩm, ven đường
23
mịn. Lúc nhỏ ưa bóng và ẩm, khi lớn ưa sáng và có thể sống trong điều kiện khắc
nghiệt về đất đai và khí hậu. Tái sinh bằng chồi, rễ và giâm cành. Mùa hoa tháng 7 9; mùa quả chín tháng 12.
1.1.2.2.
Ứng dụng trong y học dân gian của lồi Ngũ gia bì hương
Trong y học, lồi này được dân gian sử dụng để chữa nhiều loại bệnh khác
nhau. Vỏ, rễ, thân, lá làm thuốc bổ, tăng lực, mạnh gân cốt, kích thích tiêu hóa, ăn
ngon miệng, ngủ tốt, chữa đau nhức xương, mỏi gối, đau lưng, thấp khớp, ho, cảm
mạo, viêm ruột, đi tả, sỏi thận.
Vỏ được coi như một vị thuốc bổ. Nước sắc và rượu chế từ vỏ cây được dùng
phổ biến làm thuốc bổ nâng cao sức của các cơ, tăng trí nhớ, ngồi ra cịn dùng làm
thuốc chữa bệnh phụ khoa, chữa đàn ơng liệt dương, chữa các bệnh dạ dày, nhất là
nó cịn có hiệu lực để chữa bệnh chậm lớn của trẻ em. Vỏ ngâm rượu cũng dùng
chữa bệnh tê thấp.
Rễ và cành lá dùng chữa: 1. Cảm mạo sốt cao, ho, đau ngực; 2. Đau lưng,
phong thấp đau nhức khớp; 3. Đau dạ dày, viêm ruột, đau bụng tiêu chảy; 4. Vàng
da, viêm túi mật; 5. Sỏi niệu đạo, bạch đới; 6. Gãy xương, viêm tuyến vú. Dùng 30 60g, sắc uống; 7. Dùng ngồi chữa địn ngã, eczema, mụn nhọt và viêm mủ da. Rễ
tươi và lá được giã đắp ngoài hoặc nấu nước rửa, tắm.
Cành nhỏ nấu lên rửa, tắm chữa ngứa, ghẻ. Rễ và lá của nó cùng với hoa cúc
trắng giã nhỏ đắp mụn nhọt và nứt kẽ chân cũng có cơng hiệu [14], [15], [16].
1.1.2.3.
Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
của lồi Ngũ gia bì hương
Một số kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của
lồi cây Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.) đã được các nhà
khoa học trên thế giới cũng như ở Việt Nam cơng bố.
a. Thành phần hóa học
Các kết quả nghiên cứu cho thấy nhiều hợp chất thuộc nhóm chất triterpene
đã được tìm thấy từ lồi cây này.
24
Năm 1971, các nhà khoa học của Đại học Quốc gia Đài Loan đã nghiên cứu
về thành phần của loài này thu hái ở Taipei - Đài Loan. Từ dịch chiết MeOH, các
hợp chất (1,2,3,4,5,6)-cyclohexanehexol (scyllitol, 11) và myo-inositol (12) đã được
phân lập. Cũng chính từ cặn chiết này khi hịa tan trong nước và chiết phân lớp với
benzene nhóm tác giả đã phân lập được taraxerol (13), β-sitosterol (14), các ankan
C29 – C33, hai rượu béo triacontanol (15) và dotriacontanol (16) [17].
Từ lá của loài này thu hái gần Hà Nội, Ph.D.Ty và cộng sự đã phân lập và
xác định được năm triterpene acid khung lupane mới 17-21 là 3α,11α-dihydroxy23-oxo-lup-20(29)-en-28-oic acid (17); 3α, 11α-dihydroxylup-20(29)-en-28-oic
acid (18); 30α, 11α,23-trihydroxylup-20(29)-en-28-oic acid (19) và hai hợp chất
nor-triterpene: 24-nor-3α, 11α-dihydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid (20); 24-nor11α-hydroxy-3-oxo-lup-20(29)-en-28-oic acid (21). Và cũng từ các chất phân lập
được, nhóm nghiên cứu đã tạo được 17 các dẫn xuất khác nhau bằng các phản ứng
este hóa, ankyl hóa,… [18], [19], [20].
25