Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin trong dung dịch polymer nhạy nhiệt và đánh giá các đặc tính hóa lý của hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin

Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin trong dung dịch polymer nhạy nhiệt và đánh giá các đặc
tính hóa lý của hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ........................................ ii
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................... iii
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ iv
CHƢƠNG 1: THỰC NGHIỆM ......................................................................... 1
1.1 THỰC NGHIỆM .................................................................................. 1
1.1.1
Hóa chất ....................................................................................... 1
1.1.2
Thiết bị và dụng cụ ...................................................................... 1
1.1.3
Thực nghiệm ................................................................................ 1
CHƢƠNG 2: KẾT QUẢ.................................................................................... 1
2.1 ĐẶC TÍNH NHẠY NHIỆT CỦA COPOLYMER GHÉP
CHITOSAN- PLURONIC F127.................................................................... 1
2.2 KẾT QUẢ MANG, NHẢ NANOCURCUMIN CỦA HYDROGEL
NHẠY NHIỆT CHITOSAN-PLURONIC F127 ........................................... 4
2.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA VẬT LIỆU LÊN KHẢ
NĂNG TĂNG SINH NGUYÊN BÀO SỢI................................................... 7
2.4 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM CHỮA LÀNH VẾT THƢƠNG ............. 9
CHƢƠNG 3: KẾT LUẬN ............................................................................... 11
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................

Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Thị Bích Trâm

Page i

Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin trong dung dịch polymer nhạy nhiệt và đánh giá các đặc
tính hóa lý của hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Ý nghĩa

CST

Critical Solution Temperature

CS

Chitosan

Cur

Curcumin

DMF

Dimethyleformamide

DMEM

Dulbecco Modified Eagle Medium

GPC

Gel Permeation Chromatography

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

H-NMR

Proton Nuclear Magnetic Resonance

IR

Infrared

ICP-AES

Inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy

KLPT

Khối lƣợng phân tử

LCST

Lower Critical Solution Temperature

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

PBS

Phosphate-Buffered Saline

PEO

Poly(ethylene oxide)

PEG

Polyethylene glycol

PPO

poly(propylene oxide)

PNIPAM

Poly(N-isopropylacrylamide)

SRB

sulforhodamin B

THF

Tetrahydrofuran

TEM

Transmission Electron Microscope

UCST

Upper Critical Solution Temperature

1

Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Thị Bích Trâm

Page ii


Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin trong dung dịch polymer nhạy nhiệt và đánh giá các đặc
tính hóa lý của hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin

DANH MỤC HÌNH
Hình 2. 1: chuyển hóa sol-gel của dung dịch chitosan-pluronic ở 10oC và 37oC
............................................................................................................................ 1
Hình 2. 2: Giản đồ pha thể hiện sự tƣơng quan giữa nhiệt độ (25°C, 30°C, 37°C,
45°C và 50°C) và nồng độ các mẫu copolyme từ F1-F8, hydrogel CP với
lƣợng khác nhau (wt/ wt) của F127 và lƣợng khơng đổi của chitosan (CS) ....... 3
Hình 2. 3: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi của G’ và G’’ trong dao động nhiệt với
tần số và biên độ không đổi của mẫu F7 nồng độ 15% wt/v ............................. 4
Hình 2. 4: Dạng sol-gel của chitosan-F127 chitosan-Fluronic/nanoCur (F127: CS = 15: 1)
............................................................................................................................ 5
Hình 2. 5: Kết quả TEM của hidrogel chitosan-Fluronic/nanoCur (F127: CS = 15: 1) 5
Hình 2. 6: Khả năng giải phóng nanocurcumin (nCur) từ hidrogel chitosanFluronic/nanoCur (F127: CS = 15: 1) trong mơi trƣờng PBS ........................... 6
Hình 2. 7: Hình thái tăng sinh nguyên bào sợi với (a) mẫu đối chứng; (b) mẫu
xử lý với CS-F127; (c) mẫu xử lý với nCur-CS-F127....................................... 7

Hình 2. 8: Lƣợng nguyên bào sợi tăng sinh của các mẫu thử nghiệm khảo sát
trong thời gian 24 giờ......................................................................................... 8
Hình 2. 9: Hình ảnh theo dõi quá trình chữa lành vết bỏng và đồ thị đánh giá
độ co vết thƣơng ................................................................................................ 9
Hình 2. 10: Kết quả nhuộm hóa mơ Hematoxyline&Eosin của: a) Mơ thƣờng,
b) mơ chữa với Biafine và c) mô chữa với hydrogel composite. .................... 10

Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Thị Bích Trâm

Page iii


Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin trong dung dịch polymer nhạy nhiệt và đánh giá các đặc
tính hóa lý của hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2. 1 Khảo sát nhiệt độ tạo gel của copolymer ghép và khả năng chuyển
đổi từ gel sang dung dịch và ngƣợc lại. ............................................................. 2

Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Thị Bích Trâm

Page iv


Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin trong dung dịch polymer nhạy nhiệt và đánh giá các đặc
tính hóa lý của hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin

CHƢƠNG 1: THỰC NGHIỆM
1.1 THỰC NGHIỆM
1.1.1 Hóa chất

Chitosan (CS, MW~300,000 g/mol, 95% axetyl hố); Pluronic (F127),
(Mw: 12.500 g/mol, Acros Organics); Curcumin (Cur; 1,7-bis (4-hydroxy-3methoxyphenyl)-1,6-hepadiene-3,5-dione);
(NPC) (Mw: 201.56

p-nitrophenyl

chloroformate

g/mol, BASF Corp), THF (Tetrahydrofuran),

Dimethylformamide (DMF); 3-Amino-1-propanol (99%) (Acros Organic),
dietyl ete (Acros Organic); HCl 0,1%.
1.1.2 Thiết bị và dụng cụ
-

Dụng cụ thủy tinh: lọ nhỏ có nắp kín, becher, bình cầu 2 cổ, becher
50ml.

-

Nhiệt kế.

-

Cân phân tích điện tử - HADAM AEP – 250G (4 số lẻ).

-

Máy khuấy từ gia nhiệt.

-

Máy cô quay chân không.

-

Túi thẩm tách Por 7 Regenerated Cellulose Membrane, MWCO:
12.000-14.000 D đƣợc mua của Aldrich

1.1.3 Thực nghiệm
1.1.3.1 Đánh giá đặc tính nhạy nhiệt của copolymer
Copolymer ghép đƣợc hoà tan hoàn toàn trong nƣớc cất (5, 8, 10, 12,
15 và 20% w/v) để khảo sát đặc tính nhạy nhiệt. Đánh giá khả năng nhạy nhiệt
của copolymer ghép bằng phƣơng pháp khảo sát sự chảy của chitosan-pluronic
F127 hydrogel ở các nhiệt độ: 4, 25, 30, 37 và 40 oC. Khả năng nhạy nhiệt của
chitosan-pluronic F127 hydrogel khi có sự thay đổi của nhiệt độ đƣợc xác định
thông qua phép đo lƣu biến (HAAKE RheoStress 6000). Phƣơng pháp đo biến

Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Thị Bích Trâm

Page 1


Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin trong dung dịch polymer nhạy nhiệt và đánh giá các đặc
tính hóa lý của hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin

dạng dao động theo nhiệt độ này đƣợc sử dụng có thể cho biết chính xác nhiệt
độ chuyển pha của hydrogel.
1.1.3.2 Thực nghiệm mang, nhả nanocurcumin của hydrogel nhạy nhiệt
chitosan-pluronic F127

a)

Thực nghiệm mang nanocurcumin của hydrogel nhạy nhiệt chitosanpluronic F127
Dung dịch curcumin trong cồn tuyệt đối với nồng độ 100mM đƣợc nhỏ

giọt vào copolymer ( CS:F127 = 1: 15) 15% trong hỗn hợp dung dịch nƣớc và
cồn (9:1 v/v) dƣới điều kiện siêu âm với tần số 20kHz, hệ số khuếch đại A =
70 trong 15 phút. Sau đó dung dịch phía trên đem đi cô quay để loại bỏ dung
môi và đƣợc đông khô để thu mẫu nanocomposite. Dung dịch curcumin trong
cồn tuyệt đối với nồng độ 100mM đƣợc nhỏ giọt vào copolymer ( CS:F127 =
1: 15) 15% trong hỗn hợp dung dịch nƣớc và cồn (9:1 v/v) dƣới điều kiện siêu
âm với tần số 20kHz, hệ số khuếch đại A = 70 trong 15 phút. Sau đó dung
dịch phía trên đem đi cô quay để loại bỏ dung môi và đƣợc đông khơ để thu
mẫu nanocomposite [1]. Nanocomposite trên đƣợc hịa tan trong nƣớc cất lạnh
cho các thử nghiệm nhƣ đo kích thƣớc hạt nanocurcumin, hiệu quả nhả chậm
curcumin, khả năng tăng sinh nguyên bào sợi và đánh giá hiệu quả chữa lành
vết bỏng (cấp độ 2). Hình thái học của Curcumin đã đƣợc quan sát bằng kính
hiển vi điện tử truyền qua TEM (JEM-1400 JEOL) ở 25°C. Lƣợng nano
curcumin mang trong copolymer đƣợc phân tích gián tiếp thơng qua phổ UVvisible spectroscopy (Agilent 8453 UV-visible spectrophotometer) tại bƣớc
sóng 420 nm. Các nano curcumin tinh khiết đã đƣợc chuẩn bị trong ethanol
tuyệt đối trong khoảng nồng độ 1-10 mg / ml để thiết lập một đƣờng cong
chuẩn [2].
b)

Thực nghiệm nhả nanocurcumin của hydrogel nhạy nhiệt chitosanpluronic F127/ nanocurcumin
Cur đƣợc nhả từ hidrogel chitosan-pluronic/nanoCur đƣợc xác định bằng

máy quang phổ UV Agilent 8453. Hòa tan hidrogel chitosan-pluronic/nano
Cur với nồng độ 2mg/ml, rồi cho vào 3 màng thẩm tách MWCO 12.000 D -

Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Thị Bích Trâm

Page 2


Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin trong dung dịch polymer nhạy nhiệt và đánh giá các đặc
tính hóa lý của hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin

14.000 D mỗi màng 2 ml. Tiến hành thẩm tách trong đệm PBS (10 ml). Lấy
mẫu dung dịch thẩm tách bên ngoài màng, mỗi lần lấy 1,5 ml trong 0 giờ, 0.25
giờ, 0.5 giờ, 1-6 giờ. Mỗi lần lấy mẫu xong, loại bỏ dung dịch thẩm tách bên
ngoài màng và thêm vào lƣợng đệm PBS tƣơng ứng ban đầu là 10 ml, cách
xác định lƣợng nCur nhả ra theo báo cáo của Kailas D.Thakker [3].
1.1.3.3 Thực nghiệm đánh giá ảnh hưởng của vật liệu lên khả năng tăng
sinh nguyên bào sợi
Hydrogel đông khô đƣợc ngâm trong 1 ml (15%) Dulbecco Modified
Eagle Medium (DMEM) và ủ ở 37°C trong 24 h. Các nguyên bào sợi đƣợc
gieo khoảng 3x104 tế bào mỗi giếng trong đĩa 24 giếng và đƣợc ủ qua đêm
trƣớc khi đƣợc xử lý với các hydrogel nhƣ đã chuẩn bị trƣớc. Sau đó, các tế
bào đƣợc cố định với dung dịch axit tricloaxetic 50% (w/v) lạnh trong 2 giờ,
rửa sạch, và nhuộm với 0,2% (w/v) sulforhodamin B (SRB) trong 20 phút. Sau
5 lần rửa với axit axetic 1%. Thuốc nhuộm gắn với protein đƣợc hòa tan trong
10 mM dung dịch Tris bazơ và đƣợc ghi lại trên một đầu đọc microplate ở
bƣớc sóng hấp thụ 620 nm. Dựa trên những đƣờng cong chuẩn đã đƣợc tạo ra
bởi số lƣợng khác nhau của các ngun bào sợi, tính tốn đƣợc số lƣợng
ngun bào sợi trên các mẫu.
Thí nghiệm tiến hành với 3 nhóm nghiệm thức: (a) đối chứng; (b) xử lý
với CS-F127; (c) xử lý với nCur-CS-F127. Quá trình thực nghiệm đƣợc khảo
sát tại Bộ môn Công nghệ sinh học Y Sinh, Khoa Công nghệ Sinh học Đại học
Quốc Tế, Tp.HCM.

1.1.3.4 Thực nghiệm đánh giá hiệu quả chữa lành vết thương
Đánh giá hiệu quả chữa lành vết thƣơng bỏng trên mơ hình chuột nhắt
trắng đƣợc gây bỏng nhân tạo. Chuột nhắt trắng (Mus musculus Var. albino)
có trọng lƣợng 28 – 30g, cung cấp từ của Viện Pasteur Thành Phố Hồ Chí
Minh, đƣợc ni ổn định trong 1 tuần. Cạo sạch lông chuột ở vùng lƣng và
gây mê bằng hốn hợp thuốc mê Ketamine và nƣớc (tỷ lệ 1,5:1,5) với liều
lƣợng 0.02ml/g trọng lƣợng cơ thể chuột, rồi gây bỏng nhiệt ƣớt (độ 2) bằng
thanh kim loại (1cm x 1cm) nung nóng trong nƣớc. Sau 48 giờ gây bỏng, cắt
Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Thị Bích Trâm

Page 3


Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin trong dung dịch polymer nhạy nhiệt và đánh giá các đặc
tính hóa lý của hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin

lọc hoại tử ở vết thƣơng bỏng (nếu có). Tiến hành thí nghiệm với 4 nhóm
nghiệm thức: (i) đối chứng (để lành tự nhiên); (ii) phun dung dịch CS-F127
copolymer; (iii) Phun dung dịch nCur-CS-F127; (iv) bôi kem điều trị bỏng độ
2 thƣơng mại (Biafine, Janssen, France). Quá trình thử nghiệm và theo dõi tiến
trình lành hóa, đánh giá mơ học vết thƣơng bỏng ở chuột sau 14 ngày khảo sát
tại Bộ môn Sinh lý động vật–Khoa sinh ĐH Khoa học Tự nhiên Tp.HCM.

Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Thị Bích Trâm

Page 4


Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin trong dung dịch polymer nhạy nhiệt và đánh giá các đặc
tính hóa lý của hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin

CHƢƠNG 2: KẾT QUẢ
2.1 ĐẶC TÍNH NHẠY NHIỆT CỦA COPOLYMER GHÉP
CHITOSAN- PLURONIC F127
Nhƣ kết quả (bảng 1), mẫu F1 với tỷ lệ chitosan/pluronic F127 ở 1:1 không
thể tạo gel. Khi tăng tỷ lệ pluronic F127 trong hệ copolyme lên, khả năng tạo
gel đƣợc hình thành (hình 2. 6).

Hình 2. 1: chuyển hóa sol-gel của dung dịch chitosan-pluronic ở 10oC và 37oC
Mẫu F7 và F8 có gel hình thành tốt ở nhiệt độ của cơ thể con ngƣời (37oC),
tuy nhiên mẫu F8 với tỷ lệ chitosan/ pluronic là 1:20 cho thấy gel có thể hình
thành ở nhiệt độ 25oC. Nhƣ vậy, nhiệt độ tạo gel càng thấp khi tăng hàm lƣợng
pluronic F127. Bên cạnh đó, khi giảm nhiệt độ, mẫu gel này cho thấy sự thối
biến bởi nhiệt. Đặc tính đảo ngƣợc trạng thái sol-gel theo nhiệt độ môi trƣờng
của gel này cho thấy tiềm năng trong định hƣớng trong việc nghiên cứu lớp
màng polyme sinh học. Kết quả khảo sát chuyển trạng thái sol-gel theo nồng
độ và nhiệt độ (hình 2. 6) cho thấy mẫu F7 có thể tạo gel ở nồng độ copolymer
khá thấp (trên 10% wt/v) tại khoảng nhiệt độ 32-37oC.

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm


Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin trong dung dịch polymer nhạy nhiệt và đánh giá các đặc
tính hóa lý của hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin

Bảng 2. 1 Khảo sát nhiệt độ tạo gel của copolymer ghép và khả năng chuyển
đổi từ gel sang dung dịch và ngƣợc lại.
Khả năng

NPCTên Chitosan

F127-

mẫu

Amin

(g)

chuyển
o

o

o

o

o

o

4 C 25 C 33 C 37 C 40 C 50 C

pha solgel

(g)
F1

0.25

0.25

--

--

--

--

--

--

Khơng

F2

0.25

0.5

--

--

--

-

+

--

Có

F3

0.25

0.75

--

--

--

+

+

--

Có

F4

0.25

1

--

--

--

+

+

--

Có

F5

0.25

1.25

--

--

+

++

+

--

Có

F6

0.25

2.5

--

--

++

++

++

--

Có

F7

0.25

3.75

--

--

++

+++

+++

--

Có

F8

0.25

5

--

+

+++

+++

+++

--

Có

(---: khơng có khả năng tạo gel; +: tạo gel yếu; ++: tạo gel khá tuy nhiên gel chƣa đặc lại hoàn toàn; +++: tạo gel tốt,
gel đông đặc không chảy khi đặt nghiêng).

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm


Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin trong dung dịch polymer nhạy nhiệt và đánh giá các đặc
tính hóa lý của hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin

Hình 2. 2: Giản đồ pha thể hiện sự tƣơng quan giữa nhiệt độ (25°C, 30°C, 37°C,
45°C và 50°C) và nồng độ các mẫu copolyme từ F1-F8, hydrogel CP với
lƣợng khác nhau (wt/ wt) của F127 và lƣợng khơng đổi của chitosan (CS)
Để có kết luận chính xác về q trình chuyển pha của chitosan-pluronic
F127 hydrogel, phƣơng pháp đo lƣu biến học bằng cách đo sự thay đổi của
modul tích G’ và modul thốt G’’ theo nhiệt độ dao động từ 4oC đến 45oC với
tần số và biên độ cố định. Nhƣ số liệu thể hiện ở hình 3. 8, ở tần số khơng đổi
là 1Hz, giá trị G’ tăng dần, điều này có nghĩa là khi nhiệt độ tăng lên, các liên
kết hydro trong mạch chitosan-pluronic F127 bị phá vỡ và hệ bị hỗn loạn cấu
trúc mạch ngang hệ quả là giá trị G’ tăng dần. Mặt khác giá trị G’ tăng dần
còn cho thấy độ cứng của vật liệu cũng tăng dần hay có thể nói hệ chitosanpluronic F127 cho phép truyền ứng xuất hiệu quả trong trạng thái nghỉ. Mặt
khác giá trị G’’ trong khoảng nhiệt độ từ 4oC đến dƣới 30oC có xu hƣớng giảm
dần biểu thị cho sự chảy nhớt và độ linh động của phân tử giảm dần. Nguyên
nhân có thể do mạch sƣờn chitosan làm giảm lớp hydrat hóa bao quanh các

phân tử pluronic trong dung dịch nƣớc, làm phân tán chúng và kết quả là độ
tan của copolymer giảm dần [6]. Thêm vào đó, ở gần nhiệt độ tạo gel, giá trị
G’’ tăng lên nhanh chóng, năng lƣợng của hệ thoát ra càng nhiều, sự chảy nhớt
Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm


Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin trong dung dịch polymer nhạy nhiệt và đánh giá các đặc
tính hóa lý của hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin

và độ linh động càng tăng nên các chuỗi kỵ nƣớc trên pluronic F127 có xu
hƣớng quy tụ lại tạo thành các mắt xích trong mạng lƣới liên kết, tạo thành hệ
hỗn loạn. Tại nhiệt độ gel đƣợc hình thành, năng lƣợng của hệ mất đi cao nhất
tức là giá trị G’’ đã chạm ngƣỡng tối đa. Ở nhiệt độ thấp giá trị G’’ >> G dẫn
đến góc 45o < δ < 90o hay giá trị tan δ >> 1, điều này có nghĩa vật liệu đang ở
trạng thái dung dịch đàn hồi nhớt hay ở trạng thái lỏng. Bắt đầu từ 30oC, cả hai
giá trị cùng đồng thời tăng và tại điểm 35oC hai giá trị này gần nhƣ bằng nhau
(G’= 501.992 Pa và G’’= 502.125). Nhƣ vậy điểm gel của chitosan-pluronic
F127 (nồng độ 15%) đƣợc ghép ở tỷ lệ 1:15 đƣợc xác định tại 35oC, điểm này
rất thích hợp cho các ứng dụng y sinh sau này vì nhiệt độ cơ thể con ngƣời
bình thƣờng dao động khoảng 37oC. Hệ hydrogel trên có thể phù hợp cho việc
phát triển một hệ chất mang thuốc trong chữa lành vết thƣơng ngoại-nội mơ.

Hình 2. 3: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi của G’ và G’’ trong dao động
nhiệt với tần số và biên độ không đổi của mẫu F7 nồng độ 15% wt/v

2.2 KẾT

QUẢ

MANG,

NHẢ

NANOCURCUMIN

CỦA

HYDROGEL NHẠY NHIỆT CHITOSAN-PLURONIC F127
nCur đã đƣợc chuẩn bị theo phƣơng pháp ƣớt trong ethanol tuyệt đối
thay vì sử dụng dichloromethane thông thƣờng. Dung dịch Cur trong ethanol
đƣợc thêm từng giọt vào dung dịch copolymer Chitosan-g-Pluronic (CS: F127
với tỷ lệ 1:15 về khối lƣợng). Q trình thí nghiệm sử dụng siêu âm (tần số
20kHz, hệ số khuếch đại A = 70 trong 15 phút) nhằm mục đích nâng cao hiệu

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm


Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin trong dung dịch polymer nhạy nhiệt và đánh giá các đặc
tính hóa lý của hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin

quả phân bố Cur vào copolymer Chitosan-g-Pluronic [1]. Với mục đích điều
trị bỏng, trong báo cáo này chúng tôi khảo sát và điều chỉnh hàm lƣợng Cur
đƣợc mang khoảng 0.5% trọng lƣợng hidrogel, với hàm lƣợng Cur cao hơn
0.75% (wt/wt), Cur sẽ ức chế nguyên bào sợi phát tiển, theo báo cáo của Kang
JY [7].

Hình 2. 4: Dạng sol-gel của chitosan-F127 chitosan-Fluronic/nanoCur (F127: CS = 15: 1)
Cur sau khi đƣợc phân bố vào copolymer CP là một màu vàng trong
suốt, đồng nhất (Hình 2.9). Bên cạnh đó, kính hiển vi điện tử truyền qua (Hình
3.10) phân tích cho thấy các hạt nCur phân bố trong dung dịch hidrogel

chitosan-pluronic với kích thƣớc khoảng 8-23 nm cho thấy Cur phân bố đều
và tan tốt trong dung dịch nƣớc. Điều đặc biệt ở đây là khơng có sự khác biệt
về nhiệt độ gel thể hiện qua sự chuyển pha Sol-Gel của copolymer CP và
copolymer CP/nCur ở nhiệt độ 25°C và 35°C (Hình 2.9).

Hình 2. 5: Kết quả TEM của hidrogel chitosan-Fluronic/nanoCur (F127: CS = 15: 1)
Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm


Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin trong dung dịch polymer nhạy nhiệt và đánh giá các đặc
tính hóa lý của hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin

Khảo sát khả năng nhả Cur in vitro từ hidrogel chitosanFluronic/nanoCur trong môi trƣờng phosphate-buffered saline (PBS) (pH = 7,4)
đƣợc thực hiện bằng cách sử dụng phƣơng pháp khuếch tán với màng thẩm tách
sinh học MWCO 12.000 D - 14.000 D. Lƣợng Cur đƣợc nhả từ hidrogel
chitosan-Fluronic/nanoCur đƣợc xác định bằng máy quang phổ UV Agilent
8453.

Hình 2. 6: Khả năng giải phóng nanocurcumin (nCur) từ hidrogel chitosanFluronic/nanoCur (F127: CS = 15: 1) trong môi trƣờng PBS
Kết quả thử nghiệm in vitro chứng minh khả năng nhả chậm Cur từ
hidrogel chitosan-Fluronic/nanoCur (Hình 2.11). Sau 2 giờ, 56.98 ± 0.001%
nCur đã đƣợc nhả từ hidrogel này. Từ 2-6 h, nCur đã đƣợc nhả ra với một tốc
độ không đổi. Theo một số báo cáo, hidrogel chitosan-Fluronic sẽ trƣơng
phồng trong môi trƣờng sinh lý cơ thể. Do đó, cho phép sự khuếch tán của
thuốc thơng qua mạng lƣới hydrogel [8, 9]. Vì vậy, quá trình nhả chậm Cur từ
hidrogel chitosan-Fluronic/nanoCur cho thấy tiềm năng ứng dụng để điều trị
các tổn thƣơng về da nhƣ chữa lành vết thƣơng.

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm

Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin trong dung dịch polymer nhạy nhiệt và đánh giá các đặc
tính hóa lý của hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin

2.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA VẬT LIỆU LÊN

KHẢ NĂNG TĂNG SINH NGUYÊN BÀO SỢI
Kết quả thực nghiệm cho thấy sự phát triển của tế bào trong những điều
kiện nuôi cấy khác nhau có sự khác biệt rõ rệt. Quan sát mẫu xử lý với nCurCS-F127 có sự tăng sinh mạnh nguyên bào sợi khi so sánh với mẫu xử lý với
CS-F127 và mẫu đối chứng (hình 2. 12).

Hình 2. 7: Hình thái tăng sinh nguyên bào sợi với (a) mẫu đối chứng; (b) mẫu xử
lý với CS-F127; (c) mẫu xử lý với nCur-CS-F127
Dựa trên những đƣờng cong chuẩn đã đƣợc tạo ra bởi số lƣợng khác nhau
của các nguyên bào sợi tạo ra trong thời gian 24 giờ, tính tốn đƣợc số lƣợng

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm


Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin trong dung dịch polymer nhạy nhiệt và đánh giá các đặc
tính hóa lý của hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin

nguyên bào sợi tăng sinh trên các mẫu đối chứng; mẫu xử lý với CS-F127 và mẫu
xử lý với nCur-CS-F127 (hình 2. 13).

Hình 2. 8: Lƣợng nguyên bào sợi tăng sinh của các mẫu thử nghiệm khảo sát
trong thời gian 24 giờ
Qua kết quả thử nghiệm có thể kết luận rằng mẫu hydrogel CS-F127 có
chứa nanocurcumin hỗ trợ nguyên bào sợi phát triển. Theo một số báo cáo, khi
những nguyên bào sợi này tăng sinh, chúng tạo ra các thành phần đệm gian

bào làm nền cho q trình biểu mơ hố và cung cấp các sợi laminin, decorin,
elastin, fibronectin để tế bào biểu mô bám và trƣợt trên đó giúp tăng nhanh
q trình biểu mơ hố che phủ vết thƣơng. Chúng sản sinh ra collagen có vai
trị quan trọng trong q trình sửa chữa vết thƣơng, phục hồi cấu trúc và chức
năng của mô. Đồng thời nguyên bào sợi là nguồn cung cấp quan trọng một số
yếu tố tăng trƣởng (growth factors - GF) kích thích liền vết thƣơng nhƣ TGFβ, PDGF, KGF, … Hơn nữa, nguyên bào sợi chuyển dạng thành
myofibroblasts tạo nên sự co rút và liền vết thƣơng nhanh hơn. Nguyên bào
sợi còn tham gia vào giai đoạn sửa chữa sẹo diễn ra trong nhiều năm sau khi
vết thƣơng đã liền [10-13]. Thử nghiệm này cho thấy tìm năng ứng dụng vật
liệu hydrogel nCur-CS-F127 trong lĩnh vực làm lành vết thƣơng.

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm


Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin trong dung dịch polymer nhạy nhiệt và đánh giá các đặc
tính hóa lý của hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin

2.4 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM CHỮA LÀNH VẾT THƢƠNG
(Đánh giá hiệu quả chữa lành vết thƣơng bỏng độ 2)
Kết quả thử nghiệm chữa lành vết bỏng độ 2 của trên các mơ hình chuột
cho thấy sau 14 ngày vết bỏng phủ với hydrogel composite chứa
nanocurcumine lành gần nhƣ hồn tồn với nhiều lơng mới mọc trên mơ tái
tạo. Trong khi đó mẫu thuốc thƣơng mại vết bỏng chữa lành khá tốt với độ co
vết thƣơng trên 95%.Trong khi đó mẫu khơng khơng điều trị thì vết bỏng chỉ
chữa lành khoảng 80% (hình 2. 14).

Hình 2. 9: Hình ảnh theo dõi quá trình chữa lành vết bỏng và đồ thị đánh giá
độ co vết thƣơng

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm

Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin trong dung dịch polymer nhạy nhiệt và đánh giá các đặc
tính hóa lý của hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin

Kết quả đánh giá mô học cho thấy các gel không gây dị ứng, khơng làm
ngăn cản q trình đáp ứng bình thƣờng của cơ thể. Gel composite có tác dụng
đẩy nhanh q trình tái tạo và lành hóa vết thƣơng bỏng với mật độ collagen
tái tạo có trật tự, nhiều mạch máu và mơ hạt hình thành tƣơng đƣơng kết quả
phân tích mơ học của vết bỏng đƣợc xử lý với thuốc thƣơng mại Biafine. Tuy
nhiên, trong mẫu mô tái tạo với hydrogel composite cho trật tự hình thành lớp
thƣợng bị, hạ bì và lớp cơ có trật tự nhƣ mẫu mơ tự nhiên (hình 2.12). Kết quả
nghiên cứu sơ khởi này cho thấy tiềm năng của hydrogel trên cơ sở chitosan
mang nanocurcumine trong chữa lành vết thƣơng.

Hình 2. 10: Kết quả nhuộm hóa mơ Hematoxyline&Eosin của: a) Mơ thƣờng,
b) mơ chữa với Biafine và c) mô chữa với hydrogel composite.

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm


Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin trong dung dịch polymer nhạy nhiệt và đánh giá các đặc
tính hóa lý của hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin

CHƢƠNG 3: KẾT LUẬN

KẾT LUẬN
Copolymer ghép nhạy nhiệt Chitosan- Pluronic F127 đã đƣợc tổng hợp
thành công để làm chất nền cho tổng hợp nanocomposite hydrogel chứa
nanocurcumin ở kích thƣớc khoảng 8-23 nm.

Dung dịch copolymer mang nanocurcumine phân tán có điểm chuyển
nhiệt giữa trạng thái sol sang gel ở 34oC, đây là khoảng nhiệt độ lí tƣởng cho
các thử nghiệm về ứng dụng hydrogel trong chữa lành vết thƣơng ngồi da.
Hệ nanocomposite hydrogel có thể nhả chậm curcumin ổn định theo thời
gian. Kết quả thử nghiệm tƣơng hợp sinh học cho thấy hệ nanocomposite
hydrogel tăng cƣờng sự phát triển của nguyên bào sợi fibroblast.
Kết quả thử nghiệm sơ bộ trên mơ hình bỏng độ 2 ở chuột cho thấy
nanocomposite hydrogel tăng cƣờng hiệu quả chữa lành vết bỏng độ 2. Hiện
các nghiên cứu xa hơn về hệ nanocomposite hydrogel trên đang đƣợc thực
hiện để đánh giá tiềm năng của nanocomposite hydrogel trong ứng dụng thực
tế.

KIẾN NGHỊ
Tiếp tục phát triển đề tài này ở phạm vi cấp cơ sở lên cấp tỉnh với các
chỉ tiêu đánh giá cao hơn nhƣ: Đánh giá hiệu quả chữa lành vết thƣơng bỏng ở
cấp độ cao hơn (cấp độ 3) và thực hiện các thử nghiệm trên lâm sàn để ứng
dụng vào thực tế

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm


Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin trong dung dịch polymer nhạy nhiệt và đánh giá các đặc
tính hóa lý của hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

W.N. Findley and F.A. Davis, 2013. Creep and relaxation of nonlinear
viscoelastic materials. Courier Corporation.

2.

Z. Hu and Y. Che, Production of organic compound nanoparticles with
high repetition rate ultrafast pulsed laser ablation in liquids. 2015,
Google Patents.

3.

K.D. Thakker and W.H. Chern, 2003, Development and validation of in
vitro release tests for semisolid dosage forms-case study. Dissolution
Technologies. 10(2): p. 10-16.

4.

D.H. Nguyen, N.Q. Tran, and C.K. Nguyen, 2013, Tetronic-grafted
chitosan hydrogel as an injectable and biocompatible scaffold for
biomedical applications. Journal of Biomaterials Science, Polymer
Edition. 24(14): p. 1636-1648.

5.

N.Q. Tran, Y.K. Joung, E. Lih, K.M. Park, and K.D. Park, 2011, RGDconjugated in situ forming hydrogels as cell-adhesive injectable
scaffolds. Macromolecular research. 19(3): p. 300-306.

6.

H.H. Winter and F. Chambon, 1986, Analysis of linear viscoelasticity
of a crosslinking polymer at the gel point. Journal of Rheology (1978present). 30(2): p. 367-382.

7.

J. Kang, H. Huang, and F. Zhu, 2009, Effect of curcumin on growth
and function of fibroblast in human hyperplastic scar. Zhongguo Zhong
xi yi jie he za zhi Zhongguo Zhongxiyi jiehe zazhi= Chinese journal of
integrated traditional and Western medicine/Zhongguo Zhong xi yi jie
he xue hui, Zhongguo Zhong yi yan jiu yuan zhu ban. 29(12): p. 11001103.

8.

J. Gopal, M. Muthu, and S.-C. Chun, 2015, One-step, ultrasonicationmobilized, solvent-free extraction/synthesis of nanocurcumin from
turmeric. RSC advances. 5(60): p. 48391-48398.

9.

J.H. Cho, S.-H. Kim, K.D. Park, M.C. Jung, W.I. Yang, S.W. Han, J.Y.
Noh, and J.W. Lee, 2004, Chondrogenic differentiation of human

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm


Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin trong dung dịch polymer nhạy nhiệt và đánh giá các đặc
tính hóa lý của hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin

mesenchymal

stem

cells

isopropylacrylamide)

and

using

a

thermosensitive

water-soluble

chitosan

poly

(N-

copolymer.

Biomaterials. 25(26): p. 5743-5751.
10.

C.P. Kiritsy and S.E. Lynch, 1993, Role of growth factors in cutaneous
wound healing: a review. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine.
4(5): p. 729-760.

11.

D.A. Lauffenburger and A.F. Horwitz, 1996, Cell migration: a
physically integrated molecular process. Cell. 84(3): p. 359-369.

12.

C.J. Schaffer and L.B. Nanney, 1996, Cell biology of wound healing.
International review of cytology. 169: p. 151-181.

13.

I.K. Cohen, R.F. Die-gelmann, W.J. Lindblad, and N.E. Hugo, 1992,
Wound Healing: Biochemical and Clinical Aspects. Plastic and
Reconstructive Surgery. 90(5): p. 926.

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm