Nghiên cứu chiết tách, phân lập và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hợp chất quercitrin từ hoa đu đủ đực thu hái tại quảng nam đà nẵng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ TÚ OANH

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, PHÂN LẬP VÀ
HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA
HỢP CHẤT QUERCITRIN TỪ HOA ĐU ĐỦ ĐỰC
THU HÁI TẠI QUẢNG NAM - ĐÀ NẴNG

LUẬN VĂN CỬ NHÂN HÓA HỌC

Đà Nẵng - Năm 2020


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ TÚ OANH

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, PHÂN LẬP VÀ
HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA
HỢP CHẤT QUERCITRIN TỪ HOA ĐU ĐỦ ĐỰC
THU HÁI TẠI QUẢNG NAM - ĐÀ NẴNG

LUẬN VĂN CỬ NHÂN HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
ThS. Đỗ Thị Thúy Vân

Đà Nẵng - Năm 2020

LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai
công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Đà Nẵng, ngày tháng năm 2020
Tác giả

Nguyễn Thị Tú Oanh


LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian học tập và rèn luyện tại Trường Đại học Sư phạm - ĐHĐN,
bằng sự biết ơn và kính trọng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến khoa Hoá học
thuộc Trường Đại học Sư phạm và các Thầy Cơ trong khoa đã nhiệt tình hướng dẫn,
giảng dạy và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập,
nghiên cứu và hoàn thiện đề tài khóa luận tốt nghiệp.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Cô Đỗ Thị Thúy Vân, người
đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện cũng như hoàn thành
đề tài khóa luận tốt nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn bạn bè cùng đồng nghiệp đã tạo điều kiện để cho em
tìm tịi, nghiên cứu để hồn thành đề tài này.
Tuy nhiên điều kiện về năng lực bản thân còn hạn chế, chuyên đề nghiên cứu
khoa học chắc chắn khơng tránh khỏi những thiếu sót. Kính mong nhận được sự
đóng góp ý kiến của các thầy cô giáo, bạn bè và đồng nghiệp để bài nghiên cứu của
em được hoàn thiện hơn.
Em xin trân trọng cảm ơn!

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài.....................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu ...........................................................................................2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .....................................................................2
4. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................2
4.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết ...................................................................2
4.2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm .............................................................3
5. Bố cục của luận văn ............................................................................................3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................4
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ .........................................................................4
1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ
TRONG NƯỚC ........................................................................................................5
1.3. NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ NGỒI
NƯỚC ......................................................................................................................7
1.4. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ .....9
1.4.1. Tác dụng trị giun sán..................................................................................9
1.4.2. Tác dụng hạ huyết áp .................................................................................9
1.4.3. Tác dụng kháng sinh, kháng nấm ...............................................................9
1.4.4. Tác dụng trị u bướu, ung thư....................................................................10
1.4.5. Tác dụng chống oxi hóa ...........................................................................11
1.4.6. Các tác dụng dược lý khác .......................................................................11
1.4.7. Cơng dụng trong dân gian........................................................................12
1.5.CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO ................12
1.5.1. Phương pháp MTT ...................................................................................12
1.5.2. Phương pháp SRB ....................................................................................13
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............14
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU .............................14
2.1.1. Nguyên liệu ...............................................................................................14

2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu ...............................................................14
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................15
2.2.1. Phương pháp chiết mẫu thực vật..............................................................15
2.2.2. Phương pháp tách và tinh chế chất ..........................................................15
2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất .......................15
2.3. SƠ ĐỒ ĐIỀU CHẾ CÁC CAO CHIẾT ...........................................................15
2.4. THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CAO CHIẾT
ETHYLACETATE ..................................................................................................16
2.5.THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CHẤT SẠCH .........17
2.6. CHẠY CỘT SẮC KÝ PHẦN CAO ETHYL ACETATE ....................................19
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................21
3.1. THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CAO CHIẾT ETHYL
ACETATE TỪ HOA ĐU ĐỦ ĐỰC ........................................................................21
3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP HỢP CHẤT HÓA HỌC TRONG PHÂN ĐOẠN DỊCH
CHIẾT ETHYL ACETATE .....................................................................................21
3.3.KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA
HỢP CHẤT CPE3 .................................................................................................25
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................26
1. KẾT LUẬN .........................................................................................................26
2. KIẾN NGHỊ........................................................................................................26
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................27


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
d

: Doublet (NMR)

J(Hz)

: Hằng số tương tác (NMR)

Rf

: Retention factor

s

: Singlet (NMR)

ppm

: Parts per million

δ

: Độ chuyển dịch hóa học (NMR)

BuOH

: Butanol

CD3OD : Methanol- D
CHCl3

: Chloroform

D

: Dichlomethane

DMSO

: Dimethyl sunfoxide

DEPT

: Distortionless enhancement by polarisation transfer

EtOAc

: Ethyl acetate

EtOH

: Ethanol

HMBC

: Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HSQC

: Heteronuclear Single Quantum Corelation

MeOH

: Methanol

Me

: Methyl

MMT

: 3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide

NMR

: Nuclear magnetic resonance

SRB

: Sulforhodamine B

UV

: Ultraviolet

CPE3

: Tên hợp chất phân lập được


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Số hiệu

Tên bảng

bảng
3.1

3.2
3.3

Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cao chiết ethyl
acetate
Số liệu phổ NMR của hợp chất CPE3 và hợp chất tham
khảo
Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hợp chất CP3

Trang

28

31
33


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Số hiệu

Tên hình

hình

Trang

1.1

Hình ảnh Đu đủ

5

2.1

Hoa Đu đủ đực và Bột hoa Đu đủ đực

15

2.2

Sơ đồ điều chế cao ethyl acetate

20

2.3

Sơ đồ phân lập hợp chất CPE3 từ cao chiết CPET

23

3.1

Cấu trúc hóa học của hợp chất CPE3

23

3.2

Phổ MS của hợp chất CPE3

29

3.3

Phổ 1H-NMR của hợp chất CPE3

30

3.4

Phổ 13C-NMR của hợp chất CPE3

30

3.5

Phổ DEPT của hợp chất CPE3

31


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cây đu đủ (Carica papaya Linn) là một loại cây ăn quả có nguồn gốc từ
vùng nhiệt đới châu Mỹ. Hiện nay, đu đủ được trồng ở các nước vùng nhiệt đới,

những nơi có nhiệt độ bình qn trong năm khơng thấp hơn 150C. Sản lượng đu
đủ trên thế giới khoảng trên 5 triệu tấn quả/năm.
Ở Việt Nam, cây đu đủ được trồng hầu hết ở các tỉnh miền Bắc và miền
Nam. Tuy nhiên, chúng được trồng nhiều ở các tỉnh đồng bằng, dọc theo các con
sông, trên các loại đất phù sa. Các tỉnh trồng nhiều đu đủ như: Hà Nội, Hưng
Yên, Hà Nam, Vĩnh Phúc, Tiền Giang, Cần Thơ, các tỉnh Tây Nguyên,… Diện
tích trồng đu đủ của cả nước ước khoảng 10000 – 17000 hecta với sản lượng
khoảng 200 – 350 nghìn tấn quả. Cây đu đủ có lợi thế là loại cây dễ trồng, ra quả
sớm, năng suất cao đồng thời toàn bộ thân, lá, quả đều được sử dụng với nhiều
mục đích khác nhau. Ngồi việc lấy quả tươi, dùng làm nguyên liệu cho chế biến,
đu đủ còn được trồng để lấy nhựa, dùng làm thức ăn chăn nuôi.
Trong dân gian lá cây đu đủ được sử dụng để sát khuẩn, kháng nấm, kháng
viêm, chữa sốt rét, trừ giun sán… Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu về hoạt tính
sinh học của lá đu đủ. Lá đu đủ được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa
rất mạnh. Hoạt tính chống oxy hóa này do các hợp chất phenol gây ra. Lá đu đủ
có hoạt tính kháng khuẩn tốt, có khả năng kháng nhiều loại vi khuẩn gram âm,
gram dương, các loại nấm. Ngoài ra, lá đu đủ còn có khả năng kháng viêm, giảm
đau.
Ở nước ta, cao chiết với cồn từ lá đu đủ được nghiên cứu trong một số mơ
hình ung thư thực nghiệm và được chứng minh có tác dụng ức chế sự phát triển
của khối u gây bởi tế bào ung thư Sarcoma TG-180 ở chuột nhắt trắng. Người
dân nước Úc đã dùng lá đu đủ chữa trị bệnh ung thư. Đầu năm 2010, một nhóm
nghiên cứu Nhật Bản và Mỹ đã thông báo dịch chiết nước lá cây đu đủ có tác
dụng ức chế một số dòng tế bào ung thư người như ung thư dạ dày, ung thư phổi,
ung thư máu,… Ngồi ra, dịch chiết từ lá đu đủ cịn có tác dụng hỗ trợ hệ miễn
dịch để tấn công vào các tế bào ung thư. Bằng cách thúc đẩy sự gia tăng các sản


2
phẩm cytokine dạng Th1 như là IL-12p40, IL-12p70, INF-γ và TNF-α, các

cytokine này có khả năng chống lại khối u.
Gần đây, người dân địa phương ở Quảng Nam – Đà Nẵng còn sử dụng hoa
cây đu đủ đực để điều trị các bệnh về đường hô hấp như viêm họng, ho… Ngồi
ra, hoa đu đủ đực cịn được coi như thần dược để hỗ trợ điều trị bệnh ung thư
như: ung thư phổi, ưng thư vú và ung thư gan,…
Chính bởi công dụng chữa bệnh của cây đu đủ như trên, có rất nhiều đề tài
nghiên cứu đã tập trung xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của lồi
cây này. Thế nhưng vẫn cịn rất ít nghiên cứu về bộ phận hoa của chúng.
Việc sử dụng hoa đủ đực hiện nay vẫn chỉ theo kinh nghiệm dân gian. Vì vậy,
việc tìm hiểu thành phần hóa học và cao hơn nữa là chứng minh được thành phần
hoạt chất cụ thể của hoa đu đủ đực là một việc làm hết sức cần thiết, tạo cơ sở khoa
học cho việc ứng dụng nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam làm thuốc điều trị các
căn bệnh hiểm nghèo, trong đó có bệnh ung thư. Trong điều kiện cho phép của luận
văn cử nhân hóa học, tôi chọn đề tài “Nghiên cứu chiết tách, phân lập và hoạt
tính gây độc tế bào ung thư của hợp chất quercitrin từ hoa đu đủ đực thu hái
tại Quảng Nam -Đà Nẵng” làm đề tài luận văn của mình.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập hợp chất hoá học từ cao chiết ethyl acetate của hoa đu đủ đực và xác
định cấu trúc hoá học.
Xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hợp chất hóa học được phân
lập từ hoa đu đủ đực.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Hoa đu đủ đực được thu hái tại Quảng Nam-Đà Nẵng.
- Cao chiết từ lồi hoa trên với dung mơi ethyl acetate.
- Hợp chất phân lập từ cao chiết nghiên cứu.
4. Phương pháp nghiên cứu
4.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết
- Phương pháp nghiên cứu các hợp chất tự nhiên.
- Nghiên cứu trên mạng Internet, tham khảo các cơng trình nghiên cứu trên
thế giới về loài cây này.

3
- Tổng quan các tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hoá học,
ứng dụng của các bộ phận của cây đu đủ.
4.2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
- Các phương pháp xử lý mẫu thực nghiệm
- Các phương pháp chiết mẫu, phân lập các hợp chất hữu cơ
- Các phương pháp phân tích sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột
- Các phương pháp nghiên cứu cấu tạo hợp chất hóa học: kết hợp các
phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, phổ hồng
ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV) và các phương pháp khác.
5. Bố cục của luận văn
Luận văn gồm 33 trang, 3 bảng, 9 hình ảnh, 46 tài liệu tham khảo. Cấu trúc
luận văn như sau:
Phần mở đầu (3 trang)
Chương 1 – Tổng quan (10 trang)
Chương 2 – Những nghiên cứu thực nghiệm (7 trang)
Chương 3 – Kết quả và thảo luận (6 trang)
Kết luận và kiến nghị (1 trang)
Tài liệu tham khảo (6 trang)


4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ
Đu đủ (Carica Papaya L), thuộc họ đu đủ (Caricaceae), nguồn gốc Châu
Mỹ được trồng khắp nơi ở nước ta. Họ đu đủ (Caricaceae) trên thế giới gồm có 4
chi và 45 loài [16]. Cây đu đủ có tên khoa học là Carica papaya Linn. Cây nhỏ

hoặc nhỡ, cao từ 2 - 4 mét, thân thẳng, không phân nhánh. Lá to, mọc so le, tập
trung ở ngọn. Cuống lá rất dài, xẻ 5 - 7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi
thùy lại chia tiếp thành nhiều thùy nhỏ khơng đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt
nhẵn [1]. Cây đu đủ còn được gọi thù đủ ở Huế, phiên mộc, cà lào, phiên qua,
phan qua thụ, lô hong phlê (Campuchia), mắc hung (Lào), má hống (Thái). Đu
đủ thường là cây đồng chu, nhưng đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên phương diện
giới tính: cây đực, cây lưỡng tính và cây cái. Vài cây đu đủ cũng có thể trổ cả ba
loại hoa nói trên. Ngoài ra cũng có cây ra hoa khơng hẳn hồn tồn đực, cái hay
lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại hoa. Khuynh hướng thay
đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra như khơ hạn và thay đổi nhiệt độ [7]. Ở
Việt Nam, một số giống đu đủ hiện nay đang được trồng bao gồm:
* Giống Đu đủ ta: bao gồm các giống đu đủ có từ lâu đời ở nước ta. Đặc
tính chung của nhóm cây này là sinh trưởng khỏe, lá xanh đậm, song phiến lá
mỏng, cuống lá dài, mảnh nhỏ và thường có màu xanh. Thịt quả màu vàng,
mỏng, năng suất thấp.
* Giống đu đủ Mêhico: là giống nhập nội trong những năm 70 của thế kỷ
20. Quả dài, tương đối đặc ruột, thịt quả màu vàng, năng suất cao. Lá xanh đậm,
phiến lá dày, cuống lá to, màu xanh.
* Giống đu đủ So Lo: còn có tên gọi khác là đu đủ Mỹ, thân cây cao trung
bình, sinh trưởng khỏe. Quả hình quả lê, to, thịt quả màu vàng, chất lượng tốt,
năng suất cao, là giống yêu cầu nhiệt cao nên được trồng chủ yếu ở các tỉnh phía
Nam.
* Giống đu đủ Trung Quốc: là giống nhập từ Quảng Đông, Quảng Tây
Trung Quốc. Cây thấp, sinh trưởng trung bình, năng suất khá cao. Quả dài, thuôn
dài, thịt quả dày trung bình, thịt quả có màu vàng đến đỏ. Lá có màu xanh đậm,
chia thùy sâu, phiến lá dày.


5
* Giống đu đủ Thái Lan: là giống được nhập trồng trong thời gian gần đây.

Cây thấp, năng suất cao, quả to, ruột quả màu vàng, chất lượng tốt. Tuy nhiên
giống này dễ bị nhiễm bệnh khảm lá.
* Giống đu đủ Đài Loan: là giống mới được nhập trồng trong thời gian gần
đây. Cây thấp, sinh trưởng khỏe, ít nhiễm bệnh, cho năng suất cao, khoảng 60 –
70 kg quả/ cây. Thịt quả màu đỏ, ngọt, thơm, mềm mà không nát, vỏ quả cứng dễ
bảo quản và vận chuyển. Lá có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến lá dày [11].

A: hoa cái

D: trái của cây cái

B: hoa lưỡng tính

E: trái lưỡng tính

C: hoa đực

F: cây đực

Hình 1.1. Hình ảnh Đu đủ
1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ
TRONG NƯỚC
Năm 1983, Nguyễn Tường Vân và cộng sự đã chiết xuất và xác định được
alkaloid carpaine trong lá đu đủ [13].
Năm 2007, Hà Thị Bích Ngọc đã sử dụng kỹ thuật HPLC phân tích các chất
carotenoid trong lá đu đủ. Kết quả cho thấy β-carotene, luteine chiếm tỷ lệ tương
ứng là 57,05 và 11,864% so với tổng các chất carotenoid, tuy nhiên không xác
định được lycopene [9].

6
Năm 2012, Trần Thanh Hà đã phân lập được 4 chất từ phân đoạn chiết nhexan của lá đu đủ. Bao gồm, β- sitosterol, daucosterol, cycloart -23-ene-3β,25diol (sterculin A) và cycloart-25-ene-3β,24 (R/S)-diol. Trong đó, sterculin A và
cycloart-25-ene-3β,24 (R/S)- diol là 2 tritecpen lần đầu tiên phân lập từ lá đu đủ
[4].
Theo nghiên cứu Nguyễn Văn Rư, Vũ Quang Thái đã tách chiết
chymopapain từ nhựa quả đu đủ xanh và chế thử thành dạng bột pha tiêm [10].

(1) β- sitosterol

(3) Sterculin A

(2) Daucosterol

(4) Cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol

Năm 2014, Hồ Thị Hà đã tiến hành chiết phân đoạn dịch chiết MeOH từ lá
đu đủ bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexan, CH2Cl2, EtOAc,
buthanol). Từ cặn chiết CH2Cl2 phân lập được 6 hợp chất: danielone, carpainone,
axit pluchoic, apocynol A, carpaine, pseudocarpaine. Trong đó, carpainone là
hợp chất mới và 2 chất danielone và apocynol A lần đầu tiên được chiết ra từ lá
đu đủ [5].
Năm 2015, Giang Thị Kim Liên và Đỗ Thị Lệ Uyên khảo sát thành phần
hóa học của hoa đu đủ đực. Kết quả cho thấy sự có mặt của alkaloid, este, acid
béo, một số sterol trong hoa đu đủ đực thu hái tại Đà Nẵng [6].


7
1.3. NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ
NGOÀI NƯỚC
Trên thế giới, năm 1965, Govindachari Go, Nagarajan và Viswanathan đã

xác định được cấu trúc của carpaine và pseudocarpaine là alkaloid được chiết
xuất từ lá đu đủ [27].

(4) Carpaine

(6) Pseudocarpaine

Năm 1979, Chung – Shih Tang đã phân lập được 2 alkaloid
piperideine là dehydrocarpaine I và dehydrocarpaine II từ lá đu đủ [22]. Cấu trúc
của chúng.
N

Me
N

H
O

Me

H
O

H
H
O

O
O

O

O

H
O

H

H

(7) Dehydrocarpaine I

H

H

N
Me

H

N
Me

(8) Dehydrocarpaine II

Năm 2002, David và cộng sự đã xác định được glycosid là prunasin và
sambunigrin trong lá và thân đu đủ [23].

(9) Prunasin

(10) Sambunigrin

Năm 2007, Antonella Canini và cộng sự nghiên cứu các hợp chất phenol
trong lá đu đủ cho kết quả các hợp chất như sau: axit caffeic: axit p-coumari; axit
protocatechuic; kaempferol; quercetin và 5,7- dimethoxycoumair. Cấu trúc phân
tử của một số phenolic trong lá đu đủ như sau [19].


8

(11) 5,7-dimethoxycoumair

(12) Axit protocatechuic
O
OH

O
COOH

OH

OH

OH
OH

(13) Axit chlorogenic
Năm 2008 Krishna K.L và cộng sự đã tổng hợp các cơng trình nghiên cứu

về thành phần hóa học các bộ phân cây đu đủ [30].


Quả: protein, chất béo, xenluloza, carbohydrate, chất khoáng, Ca, P, Fe,

vitamin C, B, B2, niacin và carotene, amino axit, acit citric, acid malic(quả
xanh), linalool, benzylisothiocyanate, cis và trans 2,6-dimethyl -3,6 epoxy-7
octen-2-ol,

alkaloid,

carpain,

benzy–β-D-glucoside,

2-phenylethyl–β-D-

glucoside, 4-hydroxyphenyl-2 ethyl –β-D-glucoside và 4 đồng phân benzyl-β-Dglucoside.


Nước ép quả: N-butyric, n-haxanoic và n-octanoic acid, lipid, các acid

myristic, palmatic, stearic, lioleic, linolenic, cis-vaccenic và oleic.


Hạt: acid fatty, protein, chất xơ, dầu, carpaine, benzylisothiocyanate,

benzylglucosinolate,

glucotropacolin,

benzylthiourea,

hentriacontane,

β-

sitosterol, caricin và enzym myrosin.


Rể: carposide và enzym myrosin.



Lá: alkaloid carpain, pseudocarpain và dehydrocarpain I và II, choline,

carposide, vitamin C, E.


Vỏ cây: β-sitosterol, glucose, fructose, sucrose, galactose và xylitol.



Nhựa mủ: enzym proteolytic, papain và chemopapain, glutamine

cyclotransferase, chymopapain A, B và C, peptid A và B và lysozyme.


9
Năm 2015, Stephen Chinwendu và cộng sự công bố “Nghiên cứu thành

phần hóa học của hoa đu đủ ở Nigeria”. Cho kết quả trong hoa chứa saponin
(0.07%), alkaloid (0.05%), tannin (0.002%) và flavonoid (2.8%). Ngồi ra cịn
chứa các ngun tố vô cơ Na, Ca, Mg, P và các vitamin như B1, B2, B3, C [40].
Cũng trong năm 2015, Marline Nainggolan, Kasmirul công bố kết quả trong
hoa đu đủ đực có chứa các thành phần gồm triterpenoids, steroid, flavonoid,
tannin, và glycosides, saponin [33].
1.4. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY ĐU
ĐỦ
Các phương pháp nghiên cứu về hoạt tính sinh học, dược lý của thực vậy
được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm [2], [3], [18], [29]. Hoạt tính sinh học
của các bộ phận của cấy đu đủ như lá, quả, nhựa được các nhà khoa học trên thế
giới công bố khá phong phú.
1.4.1. Tác dụng trị giun sán
Năm 1994, Satrija và cộng sự nghiên cứu tác dụng trị giun sán của nhựa đu
đủ đã được thử nghiệm để diệt giun sán ở súc vật [40].
Năm 2001, Kermanshai và cộng sự nghiên cứu dịch chiết từ hạt đu đủ được
thử nghiệm để trị sán Caenorhabdi tiselegans. Kết quả cho thấy trong hạt có
benzyl isothiocynat (BITC) là hoạt chất chính có tác dụng diệt giun sán. Các
phần khác nhau của cây cũng đã được thử nghiệm về hoạt tính diệt giun
Ascaridia galli nhiễm ở gia cầm [31].
1.4.2. Tác dụng hạ huyết áp
Năm 2000, Eno AE và cộng sự nghiên cứu dịch chiết ethanol từ trái đu đủ
xanh được thử nghiệm trên chuột cống trắng đực. Các kết quả nghiên cứu cho
rằng nước ép từ quả đu đủ gây hạ huyết áp do hoạt tính trên các thụ thể αadrenoceptive [24].
1.4.3. Tác dụng kháng sinh, kháng nấm
Năm 1997, Giordani và cộng sự nghiên cứu tác dụng của nhựa đu đủ ức chế
sự tăng trưởng của nấm Candida albicans khi thêm vào mơi trường cấy nấm
[26].
Đỡ Huy Bích, Đặng Quang Chung (2006) công bố nghiên cứu cao lá đu đủ
có tác dụng kháng khuẩn đối với Typhimurium mentagrophytes, T. rubrum và

10
Staphylococcus aureus. Cao chiết từ vỏ và hạt có tác dụng kháng khuẩn đối với
Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa và Shigella flexneri. Benzyl isothiocyanate phân lập từ đu đủ, ức chế
sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn gram dương, gram âm như Escherichia coli,
Penicillium notatum và Shigella. Rễ đu đủ có tác dụng kháng khuẩn yếu [1].
Năm 2011, Rahman và cộng sự nghiên cứu dịch chiết bằng ethanol 95%
của lá và thân đu đủ được thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn gram âm và gram
dương tại nồng độ 5 và 10 mg/ml [38].
Năm 2014, Hồ Thị Hà đã chứng minh hợp chất pseudocarpaine có khả năng
kháng vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus với IC50 = 80 µg/ml, khơng
thể hiện hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn gram dương, gram âm và nấm khác
ở nồng độ chất thử cao nhất là 128 µg/ml (với IC50 > 128 µg/ml) [5].
1.4.4. Tác dụng trị u bướu, ung thư
Năm 2001, Tác giả Phạm Kim Mãn và cộng sự đã chứng minh cao chiết với
cồn từ lá đu đủ có tác dụng ức chế sự phát triển u báng gây bởi tế bào ung thư
Sarcoma TG -180 ở chuột nhắt trắng, làm giảm thể tích u, giảm mật độ tế bào
ung thư, giảm sự tăng sinh khối u [8].
Theo Đỗ Thị Thảo (năm 2006), cặn chiết methanol của lá đu đủ chỉ có tác
dụng gây độc tế bào ung thư phổi LU với IC50 = 19,2 μg/ml, và không có tác
dụng gây độc các dòng tế bào ung thư khác như ung thư biểu mô KB, ung thư vú
MCF-7, ung thư máu cấp tính HL-60, ung thư tiền liệt tuyến LNCaP, ung thư gan
Hepa1c1c7. Đồng thời cặn chiết methanol cũng không gây độc với tế bào gốc
tách từ phôi chuột [12].
Năm 2002, Rahmat và cộng sự đã kiểm tra khả năng ức chế sự tăng sinh
của tế bào ung thư vú, ung thư gan bằng lycopene tinh khiết, lycopene tách chiết
từ quả đu đủ và dưa hấu, và nước ép quả đu đủ [17].
Năm 2006, Rumiyati và cộng sự đã chứng minh trong lá đu đủ có chứa

protein bất hoạt ribosome (RIPs). Các kết quả nghiên cứu cho thấy RIPs có khả
năng dẫn đến quá trình tự chết của tế bào ung thư [39].
Năm 2014, Hồ Thị Hà đã xác định được phân đoạn cặn chiết CH2Cl2 của lá
đu đủ có khả năng gây độc tế bào ung thư biểu mô KB (IC50 = 18,44 µg/ml), ung
thư phổi LU-1 (IC50 = 18,21 µg/ml) và ung thư vú MCF-7 (IC50 = 19,16 µg/ml).


11
Đồng thời hai hợp chất carpaine và pseudocarpaine phân lập từ cặn CH2Cl2 của
lá đu đủ lần đầu tiên được chứng minh có hoạt tính gây độc mạnh trên cả bốn
dịng tế bào ung thư người: ung thư biểu mơ KB, ung thư máu HL-60, ung thư
phổi LU-1, ung thư vú MCF-7 (IC50 từ 1,13 đến 3,49 µg/ml) [5].
Năm 2015, Marline Nainggolan và Kasmiru công bố nghiên cứu dịch chiết
ethanol của hoa đu đủ đực có tác dụng gây độc tế bào trên MCF-7 dòng tế bào
ung thư vú [20].
1.4.5. Tác dụng chống oxi hóa
Gốc tự do là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây ra nhiều loại bệnh
trong cơ thể, trong đó có ung thư. Gốc tự do được tạo ra trong cơ thể bởi nhiều
cách khác nhau như: ô nhiểm môi trường, chất phóng xạ, thuốc-hóa chất, căng
thẳng thần kinh….
Năm 2010, Srikanth và cộng sự dùng nước để chiết các chất có trong lá đu
đủ. Chất chiết thu được đem thử hoạt tính chống oxy hóa bằng các phương pháp
khác nhau [40].
Năm 2013, Maisarah và cộng sự nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa từ các
bộ phận khác nhau của cây đu đủ bao gồm: quả chín, quả xanh, hạt và lá non. Hai
tác nhân được sử dụng để đánh giá là DPPH và β - carotene. Kết quả cho thấy
hoạt tính chống oxy hóa giảm dần theo thứ tự: lá non →quả xanh → quả chín →
hạt. Tuy nhiên, các hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa còn chưa được phân lập
[35].
1.4.6. Các tác dụng dược lý khác

Ngồi những hoạt tính sinh học trên, các bộ phận khác nhau của cây đu đủ
cũng đã được chứng minh có tác dụng như kháng virus sốt xuất huyết, tác dụng
giảm thời gian đông máu, kháng viêm…
Năm 2008, Bamidele V và cộng sự đã cơng bố hoạt tính kháng viêm của
dịch chiết cồn từ lá cây đu đủ [21]. Năm 2013, Swati Patil và cộng sự đã công bố
chất chiết lá đu đủ bằng nước làm tăng số lượng tiểu cầu và làm giảm thời gian
đông máu ở chuột [46].
Năm 2014, Hồ Thị Hà lần đầu tiên được chứng minh khả năng kích hoạt
enzyme caspase 3/7 của hai hợp chất carpaine và pseudocarpaine (tương ứng là
386,5 và 778 RFU) ở nồng độ thử nghiệm cao nhất (tương ứng 20 và 30 µg/ml)


12
nhưng không mạnh khi so với chất đối chứng là tamoxifen (là 3100 RFU ở nồng
độ thử 20 µg/ml) [5].
1.4.7. Cơng dụng trong dân gian
- Quả đu đủ chín là món ăn bồi bổ và giúp sự tiêu hóa các chất thịt, các chất
lòng trắng trứng.
- Đu đủ xanh được nấu kỹ với thịt gà chữa viêm loét dạ dày.
- Nhựa đu đủ được dùng làm thuốc giun.
- Lá đu đủ được sử dụng làm mềm thịt khi nấu.
- Trong dân gian hoa đu đủ đực tươi hoặc phơi khô hấp với đường phèn
dùng chữa bệnh ho, viêm cuống phổi, khàn tiếng hoặc mất tiếng ở người lớn,nhất
là ở trẻ em. Ngoài ra, hoa đu đủ đực được dùng để chửa sỏi thận hiệu quả [2], [7],
[11], [16].
Nhận xét chung: Như vậy, hoạt tính dược lý và thành phần hóa học của
cây đu đủ đã được nghiên cứu. Tuy nhiên các công trình nghiên cứu chủ yếu
là lá và quả đu đủ, các công trình nghiên cứu hoa đu đủ đực hầu như rất ít.
1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO
Hoạt tính gây độc tế bào được thử theo phương pháp của Scudiero D.A. và

cộng sự [41]. Đây là phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được viện Ung thư
Quốc gia (NIC) Maryland, Hoa Kỳ xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn,
nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế
bào ung thư ở điều kiện in vitro.
Trong những năm gần đây, một số phương pháp so màu nhanh đã được
miêu tả trong thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư ở mức độ in vitro, hiện nay
hai phương pháp thường được sử dụng là: phương pháp MTT và phương pháp
SRB. Trong đó, phương pháp tetrazolium (MTT) được sử dụng phổ biến.
1.5.1. Phương pháp MTT
Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp chí
Immunological Methods năm 1983 [14]. Theo tác giả, muối tetrazolium được dùng
để triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát
triển của tế bào động vật. Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt
vào ti thể của tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu
vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan. Kết quả đọc trên máy quang


13
phổ và có độ chính xác cao. Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất
nghiên cứu, khả năng phát triển và hoạt động của tế bào.

Tetrazolium (màu vàng)

Formaran (màu tím)

1.5.2. Phương pháp SRB
Phép thử SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm 1990 để
đánh giá độc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển của tế bào trong
ứng dụng sàng lọc thuốc ở qui mô lớn. Nguyên tắc của phép thử là khả năng
nhuộm màu của SRB lên protein SRB nhuộm bằng cách phá vỡ màng tế bào,

những mảnh vỡ tế bào không bị nhuộm, do đó không ảnh hưởng đến số liệu thực
nghiệm.
Phương pháp SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào
pH của các dư lượng amino acid của các protein. Dưới các điều kiện môi trường
axit nhẹ, SRB liên kết với các dư lượng amino acid trên các protein của các tế
bào đã được cố định bằng trichloroacetic acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu như
Tris-base để hòa tan và đo mật độ quang của dịch chiết từ tế bào một cách định
lượng.


14

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu hoa cây đu đủ đực được thu hái tại Quảng Nam-Đà Nẵng vào
tháng 01 năm 2017. Hoa đu đủ đực – đã được định danh, sau khi được thu hái sẽ
được rửa sạch, phơi, sấy khô và xay nhỏ thành bột để sử dụng cho nghiên cứu.
Bột hoa đu đủ đực hơi thô, màu vàng nhạt, được bảo quản trong bình hút ẩm.

Hình 2.1. Hoa đu đủ đực và Bột hoa đu đủ đực
2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
Sắc ký lớp mỏng sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel 60GF 254, độ
dày 0,2mm. Phân lập các chất bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ là
silicagel cỡ hạt 0,040 – 0,063mm Merck và silicagel pha đảo RP-18.
Các thiết bị xác định cấu trúc chất: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H – NMR,
13

C – NMR, HSQC và HMBC đo trên máy Bruker Avance – 500 MHz, chất

chuẩn nội là TMS cho 1H – NMR và tín hiệu dung mơi (CDCl3) cho 13C – NMR.
Đèn tử ngoại (UV BIOBLOCK) bước sóng λ = 254nm và 365nm dùng để soi bản
mỏng.
Ngồi ra cịn dùng một số trang thiết bị khác như máy quay cất chân không,
máy sấy, máy nung, máy siêu âm, cân phân tích, cốc thủy tinh, bình tam giác, các
loại pipet, bình định mức, giấy lọc, cột sắc kí,…
Thuốc thử phun lên bản mỏng chủ yếu sử dụng dung dịch H2SO4 10%, sau
đó sấy ở nhiệt độ khoảng 110oC. Dung môi dùng để chạy cột và triển khai sắc kí
lớp mỏng bao gồm n-hexan, CH2Cl2, EtOAc, MeOH và BuOH loại tinh khiết đã


15
được cất lại qua cột Vigereux trước khi sử dụng để loại bỏ tạp chất, chất làm
mềm.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp chiết mẫu thực vật
Rót dung mơi tinh khiết (H2O, MeOH) vào bình cho đến bề mặt của lớp bột
cây. Chiết mẫu ở nhiệt độ từ 800C – 900C. Sau đó, dung dịch chiết được lọc
ngang qua một tờ giấy lọc. Quá trình chiết được lặp lại nhiều lần, mỗi lần chiết
khoảng 24h. Gộp dịch chiết, cất loại dung môi dưới áp suất thấp bằng máy quay
cất chân khơng, thu được cao chiết tổng. Có thể gia tăng hiệu quả chiết bằng cách
thỉnh thoảng đảo lộn, xốc đều hoăc sử dụng máy siêu âm. Cao chiết tổng này
được cho thêm nước và chiết phân lớp lần lượt với n-hexan, chloroform,
dichloromethane, ethyl acetate và butanol bằng phễu chiết. Với mỗi loại dung
môi thực hiện chiết 3 lần. Các dịch chiết được cất loại dung môi sẽ thu được các
cao chiết tương ứng (cao chiết n-hexan, chloroform, dichloromethane, EtOAc và
BuOH) để tiếp tục nghiên cứu.
2.2.2. Phương pháp tách và tinh chế chất
Các cao chiết trong các dung môi khác nhau thu được được tách và tinh chế
bằng phương pháp sắc kí cột kết hợp với sắc kí lớp mỏng với các hệ dung mơi

thích hợp. Sắc kí cột gồm sắc kí cột thường sử dụng silicagel pha thuận và pha
đảo. Đối với các chất có khối lượng phân tử khác nhau có thể sử dụng sắc kí cột
Sephadex LH–18. Trường hợp cần thiết có thể chạy cột lặp lại nhiều lần hoặc
dùng phương pháp kết tinh phân đoạn, kết tinh lại để tinh chế chất. Kiểm tra độ
tinh khiết của các chất cũng như theo dõi quá trình tách chất trên cột bằng sắc kí
lớp mỏng với hệ dung mơi thích hợp.
2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất
Việc xác định cấu trúc hóa học của các chất sạch được thực hiện thông qua
việc đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D và 2D NMR)
như 1H–NMR, 13C–NMR, DEPT, HSQC, HMBC. Các loại phổ được đo tại Viện
Hoá học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3. SƠ ĐỒ ĐIỀU CHẾ CÁC CAO CHIẾT
Quá trình điều chế các loại cao chiết được mơ tả theo hình 2.2.


16

Bột hoa đu đủ đực (5,0 kg)
1. Ngâm chiết siêu âm bằng methanol (8 lít x 3)
2. Cất loại dung môi dưới áp suất thấp
Cao methanol (300 g)
1. Bổ sung nước cất (2 lít)
2. Chiết phân bố lần lượt với n-hexane (5
lít x 2), chloroform (5 lít x 2),
dichloromethane (5 lít x 2) và ethyl
acetate (5 lít x 2)
3. Cất loại dung môi dưới áp suất thấp

CPH (54 g)
Cao n-hexane

CPC (12 g)
Cao chloroform

CPD (52 g)
Cao dichloromethane

CPET (20 g)
Cao ethyl acetate

Hình 2.2. Sơ đồ điều chế các cao chiết
2.4. THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CAO CHIẾT
ETHYL ACETATE
Phân đoạn cao chiết ethyl acetate thu được từ cao methanol được xác định
hoạt tính độc tế bào ung thư tại Phịng thử hoạt tính sinh học – Viện hóa sinh
biển – Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.
Các dòng tế bào: Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC
gồm: Phổi (A549), Gan ( Hep3B), Vú ( MCF- 7).
Phương pháp: Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư
Quốc gia Hòa Kỳ (NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng
lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ưng
thư ở điều kiện in vitro. Các dịng tế bào ung thư nghiên cứu được ni cấy trong
các mơi trường ni cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh bò (FBS) và
các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37C; độ ẩm 98%
vơ trùng tuyệt đối). Tùy thuộc đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian
cấy chuyển cũng khác nhau.