Nghiên cứu chiết tách thành phần hóa học của cây sâm đất (ruelliea tuberosal l ) và ứng dụng vào thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường

BỘ CƠNG THƯƠNG
ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU KHOA HỌCCẤP TRƯỜNG

Tên đề tài: Nghiên cứu chiết tách thành phần hóa học của cây sâm
đất (Ruellia tuberosa L.) và ứng dụng vào thực phẩm chức năng hỡ trợ
điều trị bệnh đái tháo đường
Mã số đề tài: 184.TP17
Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Thu Nguyệt
Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tại trường Đại học Cơng Nghiệp Thành phố Hồ Chí
Minh, chúng em vơ cùng biết ơn Ban lãnh đạo nhà trường cùng toàn thể thầy cô giáo
Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm đã tạo một môi trường học tập tốt, trang bị
những kiến thức nền tảng vững chắc để chúng em tiếp bước cho sự nghiệp học tập,
nghiên cứu và làm việc sau này.
Chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Nguyễn Ngọc Tuấn đã quan
tâm, nhắc nhở, hướng dẫn chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian thực hiện đề tài, để
chúng tơi hồn thành đề tài này. Qua quá trình thực hiện đề tài, chúng em đã có dịp
hiểu rõ hơn về những kiến thức mà bản thân đã được học ở trường, để từ đó hệ thống
lại các kiến thức cần thiết, phát huy thêm nhiều bài học mới cũng như tinh thần làm
việc và khả năng hoạt động nhóm được nâng cao thêm để làm hành trang chuẩn bị cho
công việc sau này.
Tiếp đến là lời cảm ơn đến gia đình và tất cả bạn bè đã hỗ trợ nhiệt tình trong suốt
thời gian chúng tôi thực hiện đề tài.
Do thời gian nghiên cứu đề tài có hạn, tuy chúng tơi đã cố gắng để hồn thành đồ

án nhưng vẫn khơng thể tránh khỏi những thiếu sót, kính mong nhận được sự giúp đỡ,
đóng góp ý kiến của thầy cơ và các bạn để bài báo cáo được hoàn thiện hơn.
Cuối lời, chúng em xin kính chúc q thầy cơ trong Viện Cơng nghệ Sinh học và
Thực phẩm dồi dào sức khỏe, đạt được nhiều thành tích trong sự nghiệp của mình.
Chúng em xin chân thành cám ơn!
TP.HCM, tháng 11 năm 2020

Nhóm sinh viên thực hiện


Mục Lục
Chương 1: TỔNG QUAN ............................................................................................... 1
1.1. Tổng quan về cây sâm đất ..............................................................................1
1.1.1.

Nguồn gốc: ...........................................................................................1

1.1.2.

Phân loại: .............................................................................................. 1

1.1.3.

Đặc điểm lá sâm đất: ............................................................................2

1.2. Tổng quan về Steroid: ....................................................................................3
1.2.1.

Khái niệm: ............................................................................................3

1.2.2.

Cấu trúc khung cơ bản:.........................................................................4

1.2.3. Phân loại: .............................................................................................. 4
1.3. Tổng quan phương pháp trích ly: ...................................................................6
1.3.1.

Phương pháp chaỵ sắc ký cột ............................................................... 6

1.3.2.

Nạp mẫu: .............................................................................................. 9

1.3.3.

Phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC): ..............................................11

1.3.4.

Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất tự nhiên: ............................ 13

1.3.5.

Phương pháp xác định công thức phân tử và định danh: ...................15

1.1.6.

Phương pháp ức chê emzyme α-glucosidase .....................................18

Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................................. 19
2.1. Nguyên liệu và phương pháp .......................................................................19
2.1.1.

Nguyên liệu ........................................................................................19

2.1.2.

Thiết bị và dụng cụ .............................................................................20

2.1.3.

Quy trình xử lý mẫu ...........................................................................23

2.1.4.

Tách cao phân đoạn Ethyl Acetat: ......................................................24

2.1.5.

Tách cao phân đoạn EA2: ..................................................................26


Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ......................................................................31
3.1. Khảo sát tính chất ban đầu của SD-RTE9: ...................................................31
3.2. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) .................................................................31
3.3. Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) ................................................................ 34
3.4. Phổ DEPT: ....................................................................................................36
3.5. Kết quả .........................................................................................................39
3.6. Kết quá xét nghiệm: .....................................................................................41

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................45
4.1. Kết luận: .......................................................................................................45
4.2. Kiến nghị: .....................................................................................................45
TÀI LIỆU THAM KHẢO: ............................................................................................ 46


Danh mục hình:
Hình 1.1: Cây Sâm Đất (Ruellia tuberosa L.) .................................................................1
Hình 1.2: Đánh chữ vịng theo đề nghị của IUPAC ........................................................3
Hình 1.3: Gonane .............................................................................................................5
Hình 1.4: Cholane ............................................................................................................6
Hình 1.5: Cholestane .......................................................................................................6
Hình 1.6: Bộ sắc ký cột. ..................................................................................................7
Hình 1.7: Lựa chọn đường kính cột sơ bộ .......................................................................8
Hình 1.8: Hướng dẫn tỷ lệ silica gel/mẫu phụ thuộc vào khả năng tách trên bản mỏng.9
Hình 1.9: Hướng dẫn chạy sắc ký bản mỏng ................................................................ 12
Hình 1.10: Sơ đồ xác định cơng thức hố học............................................................... 17
Hình 2.1: Lá sâm đất chọn làm mẫu ..............................................................................19
Hình 2.2: Bột lá sâm đất sau khi xay .............................................................................20
Hình 2.3: Máy cơ quay hiệu EYELA N – 1200A. ........................................................21
Hình 2.4: Bảng mỏng đoạn EA 2.2. ..............................................................................27
Hình 2.5: Bảng mỏng kết quả SD-RTE9. ......................................................................27


Danh mục bảng biểu:
Phân loại khoa học của sâm đất ......................................................................2
Tóm tắt nội dung và phương pháp. ............... Error! Bookmark not defined.
Thời gian lam việc: ....................................... Error! Bookmark not defined.
Thiết bị và dụng cụ sử dụng ..........................................................................20
Khảo sát phân đoạn mẫu EA2.2 ....................................................................28

Khảo sát phân đoạn mẫu H2.2.2 ...................................................................29
Khảo sát phân đoạn mẫu EA2.2.2: ............................................................... 30


Danh mục các ký tự viết tắt:
Kí hiệu

Tiếng Anh

EA

Ethyl acetate

EOH

Ethanol

MeOH

Methanol

He

n-Hexane

CHCl3

Chloroform

TLC

1

chromatography

Sắc ký lớp mỏng

CC

Column chromatography

Sắc ký cột

IR

Infrared Spectroscopy

Phổ hồng ngoại

MS

Mass Spectrum

Phổ khối

Nuclear Magnetic

Phổ cộng hưởng từ hạt

NMR

13

Thin-layer

Tiếng Việt

C-NMR

H-NMR

Resonance
Carbon Nuclear Magnetic
Resonace
Proton Nuclear Magnetic
Resonace

nhân
Phổ cộng hưởng từ hạt
nhân carbon
Phổ cộng hưởng từ hạt
nhân proton

Distortionless
DEFT

Enhancement by Polarization
Transfer

Phổ DEPT

HMBC

HSQC

Heteronuclear Multiple
Bond Coherence
Heteronuclear Single
Quantum Correlation

Phổ tương tác dị hạt
nhân qua nhiều liên kết
Phổ tương tác dị hạt
nhân qua một liên kết
Độ chuyển dịch hóa



Chemical shif

ppm

Part per million

Một phần triệu

s

Singlet

Mũi đơn

d

Doublet

Mũi đôi

t

Triplet

Mũi ba

q

Quartet

Mũi bốn

m

Multiplet

Mũi đa

J

Coupling constrat

Hằng số ghét spin-spin

Hz

Hert

g

gam

mg

milligam

UV

Ultra violet

học

Tia cực tím


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong các loại thuốc dân gian, cây sâm đất (Ruellia tuberosa L.) có nhiều tác
dụng như hạ sốt, lợi tiểu, tiêu độc, chống đái tháo đường. Ngoài ra, sâm đất thể hiện
nhiều hoạt tính sinh học như chống oxi hóa, hạ đường huyết, kháng viêm, độc tính tế
bào…. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của tác giả nước ngồi cho thấy thành
phần chính có trong sâm đất là hợp chất steroid, flavonoid, terpenoid, và phenyl

etanoid.
Sâm đất là một loại dược liệu đã được sử dụng rất nhiều trong nhân gian để trị
nhiều bệnh nhưng chưa có một cơng bố khoa học hay cơng trình nghiên cứu nào xác
thực điều này. Bên cạnh đó, sâm đất cịn sử dụng để ngâm rượu, nấu nước mát, giúp
giải độc, thanh nhiệt và bổ sung một số nguyên tố vi lượng và vitamin. Rễ dùng chữa
đau răng, đau bụng, cảm mạo, bệnh gan, cao huyết áp, tiểu đường, nhiễm trùng đường
tiểu. Kinh nghiệm dân gian ở Nam bộ thường dùng củ sâm đất nấu nước uống làm
thuốc bổ.
Steroid là các chất béo hồ tan có nguồn gốc từ tự nhiên hoặc do con người tổng
hợp. Steroid còn là tiền chất của một số vitamin nhất định như vitamin D, cholesterol.
Theo tìm hiểu của chúng em, ở trong nước chưa có nghiên cứu nào cơng bố về
thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây sâm đất. Mục tiêu của nhóm là phân
lập được một hay nhiều hợp chất tự nhiên thuộc nhiều nhóm chất khác nhau có trong
cao Ethyl Acetate của cây Sâm Đất (Ruellia tuberosa L.). Đây là lần đầu tiên cây sâm
đất được nghiên cứu một cách có hệ thống theo phương diện phân lập hợp chất có
trong tự nhiên về nhóm chất Steroid, góp phần làm sáng tỏ kiến thức y học cổ truyền
về cây thuốc dân gian này.
Vì vậy nhóm chúng em thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết tách thành phần hóa
học của cây sâm đất (Ruellia tuberosa L.) và ứng dụng vào thực phẩm chức năng
hỡ trợ điều trị bệnh đái tháo đường” để góp phần làm giàu danh mục các hợp chất tự
nhiên và khẳng định khả năng trị bệnh của cây sâm đất.


MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
Tách chiết và phân lập các chất có hoạt tính sinh học từ thực vật, ứng dụng chất
tìm được là hướng nghiên cứu chính của nhóm chúng tơi. Nhóm chúng tơi đã nghiên
cứu sàng lọc, tách chiết và phân lập hợp chất từ cao phân đoạn Ethyl Acetate của cây
sâm đất (Ruellia tuberosa L.).
Xác định công thức phân tử và tên của các hợp chất tìm được thơng qua các
phương pháp hố lý như phương pháp phổ khối lượng MS, phổ cổng hưởng từ hạt

nhân NMR.
Để phân lập, tách chiết và làm sạch các hợp chất tự nhiên tìm được cần phải kiểm
sốt hệ dung mơi trích ly phù hợp với khả năng điện ly của các chất được thực hiện
bằng phương pháp sắc ký cột và sắc ký bảng mỏng. Mục tiêu lâu dài của nghiên cứu là
tìm hiểu cơ chế tác dụng điều trị của cây sâm đất như chống oxi hóa, hạ đường huyết,
kháng viêm, độc tính tế bào…. Hồn thành mục tiêu này sẽ cung cấp thơng tin giải
thích khả năng chữa bệnh cũng như thành phần, liều dùng và quy trình chiết xuất hợp
chất có hoạt tính từ lồi này. Vậy mục tiêu được đặt ra là “Xác định công thức phân tử
và tên khoa học của các chất tìm được trong cây sâm đất (Ruellia tuberosa L)”.
Để đạt được mục tiêu trên, chúng tôi đề nghị các mục tiêu cụ thể như sau:
-

Phân lập và tách chiết các cao phân đoạn

-

Tinh sạch các hợp chất

-

Xác đinh công thức phân tử, tên khoa học của các hợp chất tìm được

-

Ứng dụng cao methanol làm thực phẩm chức năng có khả năng ức chế
α-glucoside


Chương 1: TỔNG QUAN

Chương 1:

TỔNG QUAN

1.1.Tổng quan về cây sâm đất
1.1.1.Nguồn gốc:
Cây sâm đất (Ruellia tuberosa L.) là một loại thảo mộc lâu năm phân bố rộng rãi ở
vùng nhiệt đới ở Các nước châu Á và Đông Nam Á bao gồm Thái Lan và Lào. Nó đã
được sử dụng trong y học cổ truyền Thái Lan như là một chất kháng viêm, sát trùng tốt
giống như một loại thuốc giải độc. Cây sâm đất, thuộc họ Acanthaceae, có thân đứng,
cao từ 20 – 40 cm, khuyết tan cao 60-70cm.[1-4]

Hình 1.1:Cây Sâm Đất (Ruellia tuberosa L.
1.1.2.Phân loại:

1


Chương 1: TỔNG QUAN
Phân loại khoa học của sâm đất. [5]
Phân loại khoa học
Giới (regnum)

Plantae

Không phân hạng

Angiospermae

Không phân hạng

Eudicots

Bộ (ordo)

Lamiales

Họ (familia)

Acanthaceae

Chi (genus)

Ruellia

Loài (species)

R. tuberosa Linn

Trong các loại thuốc dân gian, cây sâm đất (Ruellia tuberosa L.) có tác dụng hạ sốt, lợi
tiểu, tiêu độc, chống đái tháo đường. Ngoài ra, sâm đất thể hiện nhiều hoạt tính sinh
học như chống oxi hóa, hạ đường huyết, kháng viêm, độc tính tế bào…. Nó là một loại
dược liệu đã được sử dụng nhiều trong nhân gian để trị nhiều bệnh. Trong số đó có
những bài thuốc đơng y thường sử dụng sâm đất để làm thuốc bổ, giảm ho, hen suyễn.
Các nghiên cứu về thành phần hóa học của tác giả ngồi nước cho thấy thành phần
chính có trong sâm đất là hợp chất flavonoid và phenyl etanoid. [4]
. “Theo tài liệu nước ngồi, cây nổ cịn có tác dụng gây nơn và dùng thay thế Ipeca
có tác dụng ra nhiệt, làm ra mồ hơi”. [6]
Ngồi ra, sâm đất cịn sử dụng để ngâm rượu, nấu nước mát, giúp giải độc, thanh
nhiệt và bổ sung một số nguyên tố vi lượng và vitamin.[7]

1.1.3.Đặc điểm lá sâm đất:
Lá đơn giản có hình elip, dài khoảng 5 cm, mỏng, phiến lá mờ theo hình xương cá, đầu
lá nhọn. [2]
Lá có vị hơi đắng, cay; tính lạnh, có ít độc (gây nơn nếu dùng liều cao). [6]
Lá dùng chữa đau răng, đau bụng, cảm mạo, bệnh gan, cao huyết áp, tiểu đường,
nhiễm trùng đường tiểu. Kinh nghiệm dân gian ở Nam bộ thường dùng củ sâm đất nấu
nước uống làm thuốc bổ.

2


Chương 1: TỔNG QUAN

1.2.Tổng quan về Steroid:
1.2.1.Khái niệm:
Steroid là loại hợp chất hữu cơ co chứa sự sắp xếp đặc trưng của bốn vong
cycloalkane được nối với nhau. Lõi của steroid gồm 20 nguyên tử carbon liên kết với
nhau qua hình thức của bốn vịng hợp nhất: ba vịng cyclohexane (được xem như là
vòng A, B và C) và một vịng cyclopentane (vịng D).
Steroid là nhóm chất các chất béo hữu co hồ tan có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng
hợp bao gồm các sterol và acid mật, hormone tuyến thượng thận và hormone giới tính.

Hình 1.2:Đánh chữ vịng theo đề nghị của IUPAC
Steroid cịn bao gồm một nhóm lớn các chất trung gian cho một loạt các phản ứng sinh
học rất đa dạng. Phổ biến nhất trong cơ thể là cholesterol, một thành phần thiết yếu của
màng tế bào và là điểm khởi đầu để tổng hợp các steroid khác - hormone giới tính,
hormone vỏ thượng thận và muối mật. Theo SA Bhawani và cộng sự (2010
glococorticoids, mineralocorticoids, androgen, estrogen và proestagens có chức năng
như là hormone, kiểm sốt sự trao đổi chất, cân bằng muối, sự phát triển và chức năng
của các cơ quan sinh dục cũng như sự khác biệt sinh học khác giữa hai giới [8].

Steroid ở dạng muối mật (ví dụ, muối của axit cholic và deoxycholic và các liên hợp
glycine và taurine của chúng) hỗ trợ trong q trình tiêu hóa, trong khi một steroid
khác là vitamin (calcitriol) tham gia kiểm soát canxi. Steroid (tự nhiên hoặc tổng hợp)

3


Chương 1: TỔNG QUAN
như methylprednisolone, hydrocortison, glucocortisteroids, corticosteroid, squalamine,
oestrogen, androgen, cũng được sử dụng để điều trị các bệnh khác như dị ứng, viêm
khớp, một số bệnh ác tính.
1.2.2.Cấu trúc khung cơ bản:
Steroid là những hợp chất có khung carbon cyclopentanoperhydro phenanten. Có 7
carbon đối xứng, có tối đa 27= 128 đồng phân lập thể.
Tính chất của Steroid:
Steroid có hai chức năng sinh học chính: là thành phần quan trọng của màng tế bào
làm thay đổi tính lưu động của màng, steroid hoạt động như các phân tử tính hiệu.
Hàng trăm steroid đucợ tìm thấy trong thực vật, động vật và nấm.
Steroid cịn có thể thay đổi cấu trúc vịng, ví dụ như cắt một trong các vịng. Cắt
vịng B sẽ sản xuất secosteroids (một trong số đó là vitamin D3), lipid cholesterol, các
hormone giới tính (estradiol và testosterone) và thuốc chống viêm dexamethasone.
Một steroid bất kỳ sẽ tạo được chất hydroccarbon diel thông qua chưng cất với
Selen ở nhiệt độ cao.
1.2.3.Phân loại:
Steroid đã được phân loại thành một số của các nhóm bởi Scott [8] dựa trên các chức
năng như sau: Sterol, Steroid, Ancohols, kích thích hoc-mơn sinh dục.
Steroid thường được sản xuất từ vỏ não của tuyến thượng thận hay acid mật.
Steroid thường liên kết với taurine hoặc glycine là tác nhân nhũ hoá trong ruột. [8]
Steroid được sử dụng trong thực phẩm như một dạng thực phẩm chức năng như:
Sapogein là một dạng sản phẩm thực phẩm chức năng có steroid liên kết với

carbohydrate. Cardiac glycoside là một thực phẩm tương tự như Sapogein được sử
dụng như một chất kích thích tim và tiền chất vitamin D. Ngồi ra, steroid cịn được
biết đến như chất kích thích cơ bắp cho các vận động viên cử tạ.

4


Chương 1: TỔNG QUAN
Steroid có nhiều trong thiên nhiên và chúng tạo thành một nhóm chất phân bố rộng
trong động thực vật và nấm[4]. Chúng bao gồm:
-

Sterol

-

Vitamin D

-

Acid mật

-

Các hormone sinh dục

-

Sapogenin
Một vài khung cơ bản của steroids:

Hình 1.3:Gonane

5


Chương 1: TỔNG QUAN

Hình 1.4:Cholane

Hình 1.5:Cholestane

1.3.Tổng quan phương pháp trích ly:
1.3.1.Phương pháp chaỵ sắc ký cột
Kỹ thuật sắc ký đã được sử dụng nhiều từ lâu. Phương pháp được phát triển nhanh
chóng từ những năm 1930-1940.
Sắc ký là q trình tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sự phân bố
không đồng đều của chúng giữa những pha tĩnh và pha động khi cho pha động đi
xuyên qua pha tĩnh.[9, 10]

6


Chương 1: TỔNG QUAN
Trong sắc ký cột, chất hấp phụ hay chất làm nền cho pha cố định được nhồi trong
1 ống hình trụ được gọi là “cột”. Tùy theo tính chất của chất được được sử dụng làm
cột mà quá trình tách trong cột sẽ xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ), cơ
chế phân bố (cột phân bố) hay cơ chế trao đổi ion (cột trao đổi ion). Ở đây chúng em
chỉ sử dụng phương pháp sắc ký cột hấp phụ.

Hình 1.6: Bộ sắc ký cột.
Nguyên tắc
Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống thủy tinh thẳng đứng gọi là “cột” với
chất hấp phụ đóng vai trị pha tĩnh, dung mơi rửa cột đóng vai trị pha động chảy qua
chất hấp phụ.
Đối với các chất riêng biệt trong hỗn hợp, tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng
hịa tan của nó đối với dung môi rửa cột để được lấy ra lần lượt trước hoặc sau.
Chất hấp phụ trong sắc ký cột thừơng dùng là oxid nhơm, silicagel, CaCO3, than
hoạt tính, polyamid, … [9]. Các chất này phải được tiêu chuẩn hóa.
Dung mơi dùng trong sắc ký cột có thể là từng loại riêng biệt hoặc hỗn hợp 2, 3
loại dung mơi có tỉ lệ thích hợp.
Với các chất hấp phụ cổ điển, dung mơi sử dụng có độ phân cực tăng dần.

7


Chương 1: TỔNG QUAN
Việc lựa chọn kích thước cột rất quan trọng. Thơng thường cột có đường kính nhỏ
và chiều dài càng dài thì sự tách càng tốt. Một vài cột bán sẵn trên thị trường có kích
thước tương ứng với chiều dài và kích thước cột:[11]

Hình 1.7:Lựa chọn đường kính cột sơ bộ
Kỹ thuật triển khai
Chuẩn bị cột
Rửa cột thật sạch, tráng với nước cất và sấy khô.
Cho bông gịn vào đáy cột (có thể cho thêm một lớp bông thuỷ tinh sạch).
Kẹp cột thẳng đứng trên giá.
Yêu cầu của cột sắc ký là chất rắn dùng làm cột phải phân tán đồng đều ở mỗi
điểm trong cột và tạo thành một khối đồng nhất.
Cho chất hấp phụ vào cột thường được gọi là nhồi cột.

Tỷ lệ =

𝑇𝑟ọ𝑛𝑔 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑐ℎấ𝑡 𝑝ℎâ𝑛 𝑡í𝑐ℎ
𝑇𝑟ọ𝑛𝑔 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑐ℎấ𝑡 ℎấ𝑝 𝑡ℎụ

Vận tốc giải ly từ 1-2 mL/phút.[10]

8


Chương 1: TỔNG QUAN
Tùy thuộc vào khả năng tách của chất hấp phụ mà tỷ lệ này thay đổi, thông thường
dựa vào việc phân tích trên TLC mà quyết định tỷ lệ này từ 1/20, 1/50, 1/100,….

Hình 1.8:Hướng dẫn tỷ lệ silica gel/mẫu phụ thuộc vào khả năng tách trên bản mỏng.
1.3.2.Nạp mẫu:
Có 2 cách nhồi cột: nhồi cột ướt và nhồi cột khô.
Nhồi cột ướt: Dùng cho các chất hấp phụ có khả năng trương phình như Silica
gel, Sephadex … thì phải ngâm trong dung mơi trước một thời gian trước khi cho vào
cột để tránh làm nứt cột. Lắc, trộn đều bột hấp phụ với dung môi thành một hỗn hợp
dịch, rót vào cột, chất hấp phụ sẽ lắng tự nhiên xuống đáy cột. Hỗn dịch dung môi và
chất hấp phụ không nên quá sệt để tránh bọt khí bị giữ trong cột và cũng khơng nên
q lỏng để rót nhiều lần vào cột. Chú ý trong quá trình nhồi cột, dung mơi vẫn liên
tục chảy đều ra bình hứng, và khơng được để khơ dung mơi trong cột. Sau khi chất hấp
phụ được cho hết vào cột, dung mơi vẫn tiếp tục được rót và hứng thêm một khoảng

9


Chương 1: TỔNG QUAN

thời gian nữa để cột hồn tịan ổn định. Mặt thoáng trên cột phải phẳng, người ta có
thể cho thêm một lớp cát hoặc bơng để tránh làm xáo trộn lớp Silicagel khi rót dung
mơi.[9]
Nhồi cột khơ: Dùng cho các chất hấp phụ khơng có khả năng trương nở như
Al2O3, CaCO3. Chất hấp phụ được nhồi từ từ vào cột ở dạng khơ bởi một phểu có
cuống dài. Dùng một que bằng gỗ hoặc cao su gõ nhẹ và đều xung quanh cột theo
chiều từ dưới lên để bột xuống được đều. Khi chất hấp phụ được cho hết vào cột, rót
dung mơi vào và cho chảy liên tục một thời gian để cột được ổn định và không được
để khô dung môi trong cột.[9]
1.3.2.1.Đưa chất phân tích vào cột
Yêu cầu khi đưa chất phân tích vào cột là phải phân tán thành một lớp mỏng đồng
đều trên mặt thống phẳng.
Có 2 cách để nạp mẫu vào cột là nạp mẫu ở dạng dung dịch và nạp mẫu ở dạng
khơ. Trong khóa luận này sử dụng cách nạp mẫu ở dạng dung dịch với cột Sephadex
và cột đảo, nạp mẫu ở dạng khô đối với cột thường.
1.3.2.2.Rửa cột
Rửa cột còn được gọi là giải ly chất ra khỏi cột.
Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà có thể tiến hành
giải ly cột bằng áp suất thường hoặc áp suất nén.
Rửa cột bằng áp suất thường: nghĩa là dung môi chảy ra nhờ vào trọng lực. Cột áp
suất thường có nhược điểm là chảy chậm, chỉ dùng cho các chất hấp phụ có kích thước
hạt lớn.
Rửa cột bằng áp suất nén: Thường cho một dịng khí nén (khí nitrogen hoặc khơng
khí) vào đầu cột. Tốc độ dồng khí có thể được kiểm soát nhờ vào một van điều chỉnh.
Cột dùng với áp suất nén phải có nút bảo đảm kín ở miệng, và có khóa hoặc dây buộc
chặt vào miệng cột

10

Chương 1: TỔNG QUAN
Việc lựa chọn các phương pháp rửa cột khác nhau tùy thuộc vào việc sử dụng kích
thước hạt gel làm pha tĩnh và việc sử dụng áp lực để giải ly dung môi ra khỏi cột.[9]
Một hợp chất có thể bị chất hấp phụ giữ lại mạnh hay yếu còn tùy thuộc vào độ
phân cực của dung môi giải ly.
Ở sắc ký cột cổ điển, người ta thường hay dùng dung mơi tinh khiết có độ phân
cực tăng dần để rửa cột. Tạp chất có trong dung môi thường làm thay đổi độ phân cực,
do vậy người ta thường cất dung môi trước khi sử dụng.
1.3.2.3.Chọn chất hấp phụ cho cột sắc kí
Thường sử dụng silicagel pha thường cho phân đoạn cao hay hỗn hợp chất cần tách
có độ phân cực thấp đến trung bình, silicagel pha đảo thường được dùng khi cần cô lập
các hợp chất phân cực mạnh hơn. Trong silica gel pha thường thì hợp chất ít phân cực
được giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực hơn được giải ly sau và ngược lại đối
với silica gel pha đảo. Thông thường để tách chất tốt thì trọng lượng chất hấp phụ phải
lớn hơn 25 – 50 lần so với trọng lượng của mẫu chất. Chiều cao chất hấp thụ và đường
kính trong của cột thường là theo tỉ lệ khoảng 10:1.[9]
1.3.3.Phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC):
Sắc ký bảng mỏng (TLC) là một kĩ thuật sắc ký được dùng để tách các chất trong
hỗn hợp. Phương pháp sắc ký bảng mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất
hấp phụ, thường là silica gel, aluminium oxit, hoặc cellulose được phủ trên một mặt
phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hịa tan trong một
dung mơi thích hợp và được hút lên bản sắc ký bởi mao dẫn, tách dung dịch thí
nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch.

11


Chương 1: TỔNG QUAN

Hình 1.9:Hướng dẫn chạy sắc ký bản mỏng

Dung mơi thích hợp dùng trong sắc ký lớp mỏng sẽ là một dung mơi có tính phân
cực khác với pha tĩnh. Nếu một dung môi phân cực được dùng để hòa tan mẫu thử trên
một pha tĩnh phân cực, vệt nhỏ mẫu nhỏ thử sẽ lan tròn do mao dẫn, và các vệt khác
nhau có thể trộn lẫn vào nhau. Do đó, để hạn chế sự lan trịn của các vệt mẫu, dung
mơi được sử dụng để hịa tan mẫu thử phải không phân cực, hoặc phân cực một phần,
nếu pha tĩnh phân cực và ngược lại.
Lựa chọn dung môi tiến hành sắc ký
Trước khi triển khai sắc ký cột cần dùng sắc ký bản mỏng để dò hệ giải ly phù hợp
theo các bước sau:
Bước 1: Hòa tan mẫu trong dung môi phù hợp (dung dịch A).
Bước 2: Chuẩn bị những tấm bản mỏng có kích thước 4x10 cm. Chấm lên những
bản này dung dịch A với nồng độ dung dịch khoảng 2 - 5%.
Bước 3: Giải ly bản mỏng với những hệ dung môi khác nhau.
Bước 4: Hiện hình các vết trên bản bằng đèn UV hoặc thuốc thử. Từ đó nhận định
hệ dung mơi phù hợp cho quá trình giải ly cột sắc ký dựa vào giá trị Rf. Với:

12


Chương 1: TỔNG QUAN

Rf =

𝑎
𝑏

Trong đó:
a là khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm của vết mẫu thử (đơn vị: cm).
b là khoảng cách từ vạch xuất phát đến vạch dung môi trên cùng đường đi của vết
(đợn vị: cm). [9, 11]

Rf chỉ có giá trị từ 0 đến l (vào khoảng 0.2 ÷ 0.3 là được). Đối với mẫu cao thô ban
đầu, dung môi giải ly đầu tiên là dung mơi đẩy vết ít phân cực nhất lên vị trí có
Rf = 0,5 và dung mơi chấm dứt sắc ký cột là dung môi đẩy vết phân cực nhất lên vị trí
có Rf = 0,2.
Chọn chất hấp phụ cho cột sắc kí
Thường sử dụng silica gel pha thường cho phân đoạn cao hay hỗn hợp chất cần
tách có độ phân cực thấp đến trung bình, silica gel pha đảo thường được dùng khi cần
cô lập các hợp chất phân cực mạnh hơn. Trong silica gel pha thường thì hợp chất ít
phân cực được giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực hơn được giải ly sau và ngược
lại đối với silica gel pha đảo. Thông thường để tách chất tốt thì trọng lượng chất hấp
phụ phải lớn hơn 25 – 50 lần so với trọng lượng của mẫu chất. Chiều cao chất hấp thụ
và đường kính trong của cột thường là theo tỉ lệ khoảng 10:1.

1.3.4.Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất tự nhiên:
Tiến hành xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất thu được bằng các phương
pháp phổ như 1H - NMR, 13C – NMR, HMBC, HSQC, DEPT trên máy Bruker tần số
500 MHz đối với phổ 1H – NMR và 125 MHz với phổ 13C – NMR.
-

Phổ hồng ngoại (IR)

-

Phổ khố MS

-

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT).

-

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (HMBC, HSQC).
13


Chương 1: TỔNG QUAN
1.3.4.1.Phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H
Nhiệm vụ của phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân là phải tìm được các thơng số
từ các phổ ghi ra. Ở đây, giới hạn ở việc tìm các giá trị: độ chuyển dịch hố học δ và
hằng số tương tác spin – spin (J) của các proton và các hạt nhân khác có I = ½.
Phổ 1H-NMR
Cho biết thơng tin về các proton 1H có trong phân tử. Các thông số phổ 1H-NMR
cho biết độ dịch chuyển hóa học 𝛿, hình dạng tín hiệu và hằng số tương tác (J) spinspin giựa các proton không tương đương kế cận nhau sẽ cho các kiểu ghép vân phổ
(tín hiệu bội), cường độ tích phân của tín hiệu thể hiện số lượng proton tương ứng với
tín hiệu đó.
1.3.4.2.Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C
Vì tất cả các hợp chất hữu cơ đều chứa nguyên tử cacbon mà tron ự nhiên nguyên
tử cacbon -13 chiếm tỷ lệ 1,1% nên phổ cộng hưởng từ nhân 13C (NMR-13C) hiện nay
có ý nghĩa quan trọng, nó cho nhiều thơng tin hơn phổ NMR-1H, ví dụ ở hợp chất hữu
cơ khơmg chứa hiđro thì khơng có tín hiệu trong phổ NMR-1H nhưng nó cho tín hiệu
của phổ NMR-13C. Vì tỷ lệ của

13

C nhỏ và hằng số tỷ lệ gyromagnetic thấp nên tín

hiệu cộng hưởng từ thường nhỏ, người ta phải đo trên phổ kế cộng hưởng từ biến đổi
Fourier (FT). Khi dùng máy này có thể ghi phổ NMR-13C theo một số cách khác nhau,
nhưng quan trọng nhất là phương pháp phổ 13C tương tác 1H và xoá tương tác 1H. Cả
hai phương pháp đều cho các thông tin giá trị trong việc phân tích cấu trúc các hợp

chất hữu cơ.
Phổ 13C-NMR
Cho thơng tin về các cacbon có trong phân tử. Các tính hiệu phổ

13

C-NMR xuất

hiện trong khoảng thang chia độ rộng (0-250ppm) (có thể đến 600ppm cho trường hợp
đặc biệt) nên các tín hiệu tách rõ rang, mũi đơn giản dể quan sát. Mỗi loại cacbon
trong hợp chất hữu cơ có độ dịch chuyển hóa học khác nhau. Dựa vào độ dịch chuyển

14


Chương 1: TỔNG QUAN
hóa học của cacbon trong phổ 13C-NMR, có thể dự đốn được loại cacbon và liên kết
của cacbon đó
Kỹ thuật ghi phỗ 13C-NMR khử ghép DEPT cũng là một dạng phổ 13C-NMR thực
hiện đồng thời trên cả 2 kênh 1H-NMR và 13C-NMR cho các tín hiệu cacbon gắn với
1,2 hoặc 3 hydro.
-DEPT-45 mỗi cacbon có mang hydrogen đều hiện lên 1 mũi trên phổ đồ
-DEPT-90 chỉ những cacbon loại metin-CH cho mũi dương
-DEPT-135 cho xuất hiện mũi dương các cacbon meitn –CH và metil –CH3 xuất
hiện mũi âm các cacbon metilen CH2, cacbon tứ cấp không cho mũi trong phổ.
Cho biết mối liên quan giữa các proton với nhau: proton gem (2 proton gắn trên
cùng một cacbon), proton vic (2 proton gắn trên 2 cacbon kề nhau), mối liên quan giữa
các nguyên tử H trong một phân tử.
1.3.5. Phương pháp xác định công thức phân tử và định danh:
1.3.5.1.Sơ đồ quy tình xác định cơng thức phân tử:

15