Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu hoạt tính sinh học hạ đường huyết và hạ cholesterol máu của một số nhóm hoạt chất chính từ cây Nopal (Opuntia spp) được nhập

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Tạ Thu Hằng

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC HẠ ĐƯỜNG HUYẾT
VÀ CHOLESTEROL MÁU CỦA MỘT SỐ NHĨM HOẠT
CHẤT CHÍNH TỪ CÂY NOPAL (OPUNTIA SPP)
ĐƯỢC NHẬP VÀO VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 62420116

DỰ THẢO TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội-2017

1


Cơng trình đƣợc hồn thành tại trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên Đại học Quốc gia Hà Nội
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
1. PGS.TS Lê Tất Khƣơng
2. PGS.TS Nguyễn Văn Mùi

Phản biện 1: PGS.TS. Nguyễn Quang Huy
Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên-ĐHQG Hà Nội
Phản biện 2: GS. TS Đặng Thị Thu
Trƣờng Đại học Bách khoa-Hà Nội
Luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng cấp Đại Học Quốc gia chấm
luận án tiến sĩ họp tại Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên-ĐHQG Hà

Nội
Vào hồi

giờ

ngày

tháng

năm 201

Có thể tìm hiểu luận án tại:
-Thƣ viện Quốc gia Việt Nam
-Trung tâm Thông tin-Thƣ viện, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiênĐHQG Hà Nội

2


MỞ ĐẦU
1.Tính cấp thiết của đề tài
Xƣơng rồng (XR) Nopal thuộc chi Opuntia ficus-indica (L.) Mill, là
một loài xƣơng rồng mà từ lâu đƣợc trồng rộng rãi trên khắp vùng khơ cằn và
bán khơ cằn của thế giới. Nó có nguồn gốc từ Mêxicơ. XR Nopal ngồi việc
sử dụng nhƣ rau ăn hàng ngày và chế biến các loại thực phẩm, mỹ phẩm,
dƣợc phẩm, chất đốt sinh học, xử lý nƣớc thải…[Error! Reference source
not found.] theo truyền thống ở Mêxicô cây XR Nopal đƣợc sử dụng để điều
trị bệnh đái tháo đƣờng. Các nghiên cứu cho thấy lồi Opuntia ficus-indica
có tác dụng hạ glucose huyết, giảm rối loạn lipid máu, làm tăng dịch chuyến
protein vận chuyển (GLUT4) glucose ra màng tế bào, tăng khả năng hấp thu
glucose, giảm kích thƣớc tế bào mô mỡ...[Error! Reference source not

found.],[Error! Reference source not found.],[Error! Reference source
not found.].
Tỷ lệ bệnh ĐTĐ đang gia tăng nhanh chóng trên tồn thế giới kéo theo
những hậu quả nghiêm trọng về sức khỏe và kinh tế đối với toàn xã hội. Số
ngƣời mắc bệnh ĐTĐ trên toàn thế giới tăng từ 171 triệu năm 2000 lên 194
triệu năm 2003, đã tăng vọt 246 triệu năm 2006 và đƣợc dự báo tăng lên 380399 triệu vào năm 2025. Việt Nam nằm trong 10 quốc gia có tỷ lệ gia tăng
bệnh nhân ĐTĐ cao nhất thế giới. Ƣớc tính có khoảng 53.458 ca tử vong do
bệnh tiểu đƣờng vào năm 2015.
Cây XR Nopal đã đƣợc Viện Nghiên cứu và Phát triển Vùng nhập nội
từ Mêxicô vào Việt Nam từ năm 2009, đã tiến hành trồng thử nghiệm thành
công chống cát bay, cát nhảy ở vùng đất khô hạn của tỉnh Ninh Thuận. Để
tận dụng đƣợc nguồn nguyên liệu cây XR Nopal dùng làm nguồn dƣợc liệu,
các chất tách từ cây có thể dùng làm thuốc hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đƣờng
là vấn đề có ý nghĩa vì vậy chúng tơi tiền hành đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính
sinh học hạ đường huyết và hạ cholesterol máu của một số nhóm hoạt
chất chính từ cây Nopal (Opuntia spp) được nhập vào Việt Nam”
2. Mục tiêu nghiên cứu: Xác định nhóm hoạt chất hay hợp chất chính trong
cây xƣơng rồng Nopal trồng tại Việt Nam có tác dụng hạ đƣờng huyết và hạ
cholesterol.
3. Nội dung nghiên cứu:

3


+ Xác định các thành phần dinh dƣỡng chính, thành phần hóa học của cây
Nopal nhập nội.
+ Thử độc tố LD 50. Xác định tác dụng hạ glucose huyết và lựa chọn đƣợc
phân đoạn dịch chiết có tác dụng chiếm ƣu thế của cây Nopal trồng tại Việt
Nam trên thực nghiệm.
+ Đánh giá tác dụng và bƣớc đầu tìm hiểu cơ chế gây hạ glucose, choleterol

huyết của cao phân đoạn dịch chiết có tác dụng chiếm ƣu thế của cây Nopal
trồng tại Việt Nam.
+ Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số chất tinh khiết từ thân cây
Nopal trồng tại Ninh Thuận. Đánh giá tác dụng hạ đƣờng huyết của các chất
phân lập trên một mơ hình thử nghiệm in vitro.
4.Bố cục của Luận án
Luận án có 144 trang gồm 3 trang mở đầu, 36 trang tổng quan tài liệu,
23 trang đối tƣợng, nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu; 55 trang kết quả
nghiên cứu và thảo luận, 3 trang kết luận và đề nghị, 1 trang các cơng trình
khoa học cơng bố, 12 trang tài liệu tham khảo, 12 trang mục lục, chữ viết tắt,
danh mục bảng, hình, trang phụ lục luận án có … bảng số liệu và … hình vẽ.
5. Điểm mới của luận án:
- Xác định đƣợc đặc điểm hình thái thực vật, giải phẫu thân, rễ, tên khoa
học của giống XR Nopal trồng tại Ninh Thuận-Việt Nam.
- Xác định đƣợc thành phần dinh dƣỡng, định tính các nhóm chất, phân
lập, xác định cấu trúc và định tên đƣợc các hợp chất phân lập đƣợc
trong cây XR Nopal giống Jalpa.
- Xác định đƣơc 1 giống XR có tác dụng hạ đƣờng huyết hiệu quả nhất
trong 03 giống thử nghiệm.
- Xác định đƣợc phân đoạn Ethylacetat chứa nhiều flavonid, có tác dụng
hạ đƣờng huyết, cholesterol và khả năng hoạt hóa enzym p-AMPK và
p-ACC tốt nhất.
- Xác định đƣợc 01 chất đặc trƣng trong cây XR Jalpa có tác dụng hoạt
hóa p-AMPK và p-ACC, ức chế FAS (tổng hợp acid béo), làm tăng sự
hấp thu glucose trong tế bào, có tác dụng làm giảm đƣờng huyết và
chống béo phì.
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Cây xương rồng Nopal và một số nghiên cứu về chi Opuntia

4


Loài Opuntia ficus-indica (L.) Mill thuộc chi Opuntia, họ Cactaceae,
với khoảng 1.500 lồi xƣơng rồng, có nguồn gốc từ Mêxicơ và lan rộng khắp
Trung và Nam Mỹ, Úc, Nam Phi, bao gồm cả các khu vực Địa Trung Hải
[Error! Reference source not found.].
Chi Opuntia có chứa một lƣợng đáng kể các axit ascorbic, vitamin E,
carotenoid, chất xơ, axit amin và các hợp chất chống oxy hóa (phenol,
flavonoids, betaxanthin và betacyanin), có lợi ích cho sức khỏe nhƣ: hạ
đƣờng huyết và hạ mỡ máu, và chống oxy hóa [Error! Reference source not
found. ].
1.2.Tác dụng hạ glucose, cholesterol huyết của chi Opuntia
Cây XR Opuntia ficus-indica chứa hàm lƣợng chất xơ, chất nhầy cao.
Uống bột XR Nopal trƣởng thành và XR Nopal non liều 50 mg / kg thể trọng
có tác dụng giảm glucose máu sau ăn trên chuột bị tiểu đƣờng tƣơng ứng là
46,0 và 23,6% (p <0,05) so với nhóm đối chứng[Error! Reference source
not found.].
Opuntia ficus-indica var.saboten (OFS) sử dụng với liều 1 g / kg và 2 g
/kg trọng lƣợng cơ thể có tác dụng hạ đƣờng huyết. OFS kích hoạt
phosphoryl hóa AMPK và MAPK p38 [Error! Reference source not
found.].
Quả của cây Opuntia ficus-indica có nhiều giá trị dinh dƣỡng: ascorbic
acid, vitamin E, carotenoid, sợi, axit amin, và với lƣợng lớn glucose và
fructose và các phenol, flavonoid, betaxanthin và betacyanins, có tác dụng hạ
đƣờng huyết và hạ lipid, có tác dụng hạ đƣờng huyết và hạ lipid và chống
oxy hóa[Error! Reference source not found.].
Dịch chiết từ cây Opuntia humifusa có chứa hàm lƣợng chất chống oxy
hóa cao bao gồm vitamin C, flavonoids và polyphenols, uống với liều 150mg,
250mg, 500 mg / kg trọng lƣợng/ ngày trong 7 tuần điều trị có tác dụng giảm

glucose, triglyceride máu, giảm đáng kể cholesterol tổng số và giảm LDL,
tăng HDL ở những con chuột bị tiểu đƣờng.[93]
Viên nang chứa cellulose vi tinh thể, 70% chất chiết tự nhiên từ nhánh
và quả của Opuntia ficus-indica thử nghiệm trên ngƣời có tác động hạ đƣờng
huyết cấp tính và lâu dài, an tồn. Uống liều 400 mg trong vòng 30 phút
trƣớc khi nạp 75 g glucose đã làm giảm đáng kể nồng độ glucose huyết sau
khi dùng[Error! Reference source not found.].

5


Chuột ăn với chế độ giàu chất béo bổ sung chất chiết xuất Opuntia
ficus-indica (OFI) giàu isorhamnetin glycosides, đƣợc bổ sung với liều thấp
(0.3%) và liều cao (0.6%) vào thức ăn thì có trọng lƣợng cơ thể, cholesterol
tồn phần, LDL và HDL, nồng độ glucose và insulin thấp hơn so với chuột
chỉ dùng chế độ giàu chất béo. Chiết xuất OFI đã kích thích sự bài tiết insulin
trong ống nghiệm, kết hợp với sự gia tăng vận chuyển glucose (GLUT2),
tăng khả năng hấp thụ glucose, tạo thêm năng lƣợng. [89]
Giống XR Milpa Alta thuộc OFI với hàm lƣợng chất xơ, nồng độ
polyphenol cao và khả năng chống oxy hoá đã làm tăng q trình oxy hóa
axit béo và tổng hợp VLDL, giảm stress oxy hố, và cải thiện tín hiệu insulin
gan ở chuột Zucker béo phì. Những con chuột bị béo phì Zucker đƣợc cho ăn
chế độ ăn kiêng có bổ sung 4% bột XR Nopal trong 7 tuần thì chỉ số
triglicerid trong máu thấp hơn 50% so với nhóm đối chứng, ngoài ra khối u
gan, dấu hiệu sinh học của tổn thƣơng tế bào gan giảm[Error! Reference
source not found.].
Lợn nái ăn thức ăn thƣơng phẩm bổ sung thêm 2,0 ± 0,5 kg cây xƣơng
rồng Opuntia ficus-indica có chỉ số glucose trong máu hạ tốt hơn, thời gian
cai sữa dài hơn nhóm ăn thức ăn thƣơng phẩm khơng bổ sung cây xƣơng
rồng OFI. Hiệu quả hạ đƣờng huyết của cây xƣơng rồng là do hàm lƣợng

chất xơ cao, đặc biệt là pectin, gel pectin làm giảm sự hấp thụ carbohydrate.
Ngoài ra, chất xơ cao làm tăng hoạt tính enzyme vi khuẩn, ảnh hƣởng hoạt
tính của α-glucosidase và β-galactosidase, dẫn đến sự ức chế sự thủy phân
liên kết glycosidic[Error! Reference source not found.].
Dầu hạt của quả của cây Opuntia ficus-indica L. MILL. có thành phần
lipophilic chứa 83% axit béo chƣa bão hịa (56% acid linoleic và 20% axit
oleic) có tác dụng bảo vệ có thể ngăn ngừa chứng đái tháo đƣờng ở chuột
đƣợc gây ra bởi Alloxan và ức chế các tổn thƣơng mô ở các tế bào tụy.[28]
1.3. Tác dụng sinh học khác của chi Opuntia:
 Hoạt tính kháng viêm
Isorhamnetin-glucosyl-rhamnoside (IGR) chiết từ Opuntia ficus
indica có khả năng ức chế sản xuất các chất trung gian gây viêm da nhƣ
COX-2, yếu tố hoại tử khối u alpha TNF- và interleukin- (IL-) 1 và IL-6. IGR
nhƣ là một hợp chất tự nhiên thích hợp cho phát triển thành phần chống viêm
mới [Error! Reference source not found.].

6


Lorenzo và cộng sự (2017) đã nghiên cứu cho thấy toàn bộ chất nhầy
và các thành phần khối lƣợng phân tử thấp nhƣ acid lactic, D-mannitol,
piscidic, eucomic và 2-hydroxy-4- (4’ -hydroxyphenyl) -butanoic axit trong
Opuntia ficus-indica có tác dụng trong việc chữa vết thƣơng qua mơ hình tế
bào in vitro đƣợc đơn giản hóa dựa trên một lớp vỏ keratin [Error!
Reference source not found.].

Hoạt tính chống ung thư
Glycosid isorhamnetin tinh khiết chiết xuất từ O. ficus-indica (giống
Jalpa) có tác dụng gây độc tế bào ung thƣ ruột kết ở ngƣời: HT-29 và Caco2.
Những ảnh hƣởng này liên quan đến quá trình gây chết tế bào (apoptosis)

thông qua cascade, một enzyme dạng protease, đóng vai trị trung tâm trong
việc truyền tín hiệu gây chết tế bào [Error! Reference source not found.].
Betanin, chiết xuất từ quả O.ficus-indica, có thể ức chế sự phát triển
của dòng tế bào ung thƣ bạch cầu K562 mãn tính ở ngƣời thơng qua con
đƣờng tự do apoptotic [Error! Reference source not found.].
Flavonoids, trans Taxifolin, và dihydrokaempferol đã đƣợc phân lập
từ Opuntia humifusa có thể là những chất có tiềm năng để điều trị ung thƣ cổ
tử cung ở ngƣời [Error! Reference source not found.].

Chống oxy hóa
Glycoprotein đƣợc phân lập từ O. ficus-indica giống Saboten Makino
(một loài Opuntia đƣợc sử dụng trong y học dân gian ở Triều Tiên) có tác
dụng chống oxy hố mạnh và các tính chất hypolipidemic có tác dụng bảo vệ
đối với những con chuột đƣợc điều trị bằng triton WR-1339, một chất ức chế
lipoprotein lipase [Error! Reference source not found.].
 Bảo vệ tế bào thần kinh
Các polysaccharides của Opuntia Milpa Alta (MAP) có tác dụng bảo
vệ thần kinh đƣợc đánh giá ở mức độ cơ học trong mơ hình invitro của tổn
thƣơng thiếu máu ở não chuột. [Error! Reference source not found.].

Giảm triệu chứng của bệnh táo bón
Chuột đƣợc tiêm dƣới da Loperamide (2 mg / kg) để gây táo bón. Cho
chuột uống nƣớc chiết từ Opuntia humifusa với nồng độ 3% và 6% trong
thời gian 25 ngày, kết quả cho thấy độ dày của ruột già cũng tăng lên ở các
nhóm phụ thuộc theo liều. Những kết quả này cho thấy rằng chiết xuất của
Opuntia humifusa làm giảm các triệu chứng của táo bón do loperamide gây ra
[Error! Reference source not found.].

7



Làm chậm sự phát triển tổn thương xơ vữa động mạch và các bệnh
tim mạch
Các nghiên cứu in vivo trên chuột apoE-KO, tự phát triển các tổn
thƣơng xơ vữa động mạch trong điều kiện ăn kiêng cơ bản, chỉ ra rằng việc
bổ sung chế độ ăn uống có chứa bột thân cây O. streptacantha hoặc O.ficusindica (10 mg/kg trong 15 tuần) làm giảm đáng kể sự phát triển của tổn
thƣơng xơ vữa động mạch [Error! Reference source not found.].
 Ngăn ngừa sự phát triển bất thường của chuyển hóa liên quan đến
béo phì
Flavonoid kaempferol hoặc isorhamnetin chiết xuất từ Opuntia có thể
ngăn sự tích tụ lipid hoặc ức chế sự hình thành adipogenesis thơng qua việc
giảm sự điều hịa gen có adipogenic [Error! Reference source not found.].
1.4. Những nghiên cứu hoạt tính sinh học hạ glucose huyết, hạ
cholesterol từ các loài thực vật khác.
Scoparia dulcis L. thƣờng đƣợc gọi là cây đậu ngọt giàu hàm lƣợng
saponin, khi sử dụng ở liều 20 và 30 mg / kg có tác dụng hạ đƣờng huyết
trên mơ thí nghiệm bệnh ĐTĐ ở chuột [Error! Reference source not
found.].
Mangifera indica kernel flour (MIKF) hay bột nhân hạt xoài tại
Nigeria là một nguồn giàu các chất flavonoid và axit phenolic, quan trọng về
mặt dƣợc lý. Các chất chiết xuất methanolic của nó ức chế một số enzyme
chủ chốt liên quan đến bệnh lý học và biến chứng của bệnh đái tháo đƣờng
týp 2 in vitro. [Error! Reference source not found.].
Theo Jang Sun-Hee và cộng sự nghiên cứu cho thấy nhân sâm có tác
dụng chống bệnh đái tháo đƣờng trong mơ hình bệnh tiểu đƣờng chuột gây
ra bởi streptozotocin, thông qua việc chuyển saponin thành các chất chuyển
hóa của vi khuẩn đƣờng ruột làm giảm 62,5% mức đƣờng huyết. Ngoài ra,
các chỉ số khác nhau glycosylated máu, nồng độ insulin trong huyết thanh

cũng đƣợc cải thiện đáng kể [Error! Reference source not found.].
Quế (Cinnamomum zeylanicum) Chiết xuất quế có thể là một loại
thuốc thay thế hữu ích trong chế độ hàng ngày của bệnh nhân đái tháo
đƣờng, cải thiện hiệu suất của bộ nhớ và giảm rối loạn chuyển hóa lipid
[Error! Reference source not found.].
Cây hồ lơ bá (Trigonella foenum graecum) có tác dụng hạ đƣờng
huyết tốt. Sử dụng 10 % bột hạt hồ lô bá và 3% hành tây hàng ngày có sự

8


giảm đáng kể mức glucose trong máu lúc đói. Củ cải đƣờng, hành tây, bột
hạt hồ lô bá tỷ lệ 43%, 35% và 54% có tác dụng giảm cholesterol máu, đặc
biệt là từ các triglyceride LDLc giảm một cách đáng kể [Error! Reference
source not found.].
Các thành phần đƣợc xác định là biểu hiện tác dụng chống bệnh tiểu
đƣờng của cây chóc máu S.reticulata Wight bao gồm salacinol, kotalanol,
ponocinol, salaprinol… Mangiferin, 16-acetate kotalagenin và oligomers
proanthocyanidin khác nhau cũng đã đƣợc phân lập [Error! Reference
source not found.].
Dịch chiết của cây chóc máu (S.reticulata Wight) đã làm tăng sự biểu
hiện hoạt hóa AMPKα (Activated protein kinase α) và AMPKα phosphoryl
hóa trong các tế bào mỡ. Những phát hiện này chứng minh rằng chiết xuất
của S.reticulata Wight có tác dụng trị liệu về béo phì và rối loạn chuyển hố
lipid [Error! Reference source not found.].
Dịch chiết từ lá dây thìa canh (Gymnema sylvestre) với liều 100, 250
và 500 mg / kg thể trọng đƣợc thử nghiệm trên mơ hình chuột ni chế độ ăn
nhiều chất béo đƣợc chứng minh hiệu quả hạ đƣờng huyết do hoạt tính ức
chế amylase và giảm đáng kể sự gia tăng trọng lƣợng cơ thể, nồng độ lipid
huyết thanh, insulin và leptin huyết thanh, mô mỡ, viêm gan [Error!

Reference source not found.].
Selenium (Se) và Polysaccharide đƣợc phân lập từ lá sen, có tác dụng
chống oxy hố và đề kháng insulin. Chuột cống mang thai trƣớc khi sinh
uống liều 50 và 100 mg / kg có tác dụng giảm cân, giảm mức glucose, lƣợng
insulin, giảm cholesterol trong máu [Error! Reference source not found.].
Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết của một số cây thuốc tại Việt
Nam đang đƣợc rất nhiều các nhà khoa học trong nƣớc quan tâm.
Sử dụng hỗn hợp lá vối, lá ổi, lá sen (VOS) với liều lƣợng là 200 mg
VOS/kg thể trọng và 400 mg VOS/kg thể trọng trên chuột ĐTĐ trong 8 tuần
liên tục [Error! Reference source not found.].
Tác giả Phùng Thanh Hƣơng đã chứng minh cây bằng lăng nƣớc có
hoạt chất chính là polyphenol và acid corosolic có tác dụng ức chế men
anpha-glucosidase kiểm sốt glucose máu sau ăn vì vậy dịch chiết lá bằng
lăng nƣớc có tác dụng hạ glucose máu trên chuột chuột ĐTĐ [Error!
Reference source not found.].

9


Ngồi ra cịn có: nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của rễ cây
chóc máu Nam Bộ Salacia cochinchinensis L Celastraceae [Error!
Reference source not found.], dây thìa canh (Gymnema sylvestre (ReTz.)
R.Br.ex Schult )[Error! Reference source not found.], dịch ép thân cây
chuối tiêu Musa balbisiana Colla [Error! Reference source not found.],
dịch chiết vỏ quả hồng bì Clausena lansium (Lour.)
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu
-Thân cây xƣơng rồng Nopal trƣởng thành, nhánh 20-25cm (03 giống:
Jalpa, TV, PTV-01) đƣợc thu hái tại Ninh Thuận ( Vƣờn giống gốc của Viện

Nghiên cứu và Phát triển Vùng).
-Chuột nhắt trắng đực dòng Swiss, trọng lƣợng từ 18-22 g đƣợc cung
cấp bởi Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ƣơng.
-Tế bào 3T3-L1 (tế bào mô mỡ chuột) đƣợc cung cấp bởi ATCC
(Rockwill, MD, Mỹ).
2.1.3.Hóa chất và thiết bị thí nghiệm
2.1.3.1. Hóa chất
Streptozocin (STZ) bột pha tiêm của hãng Sigma, Glyclazid (Standa)
(Pháp), Acarbose (Glucobay) (Đức), Metformin hydroclorid (Glucophage),
(Đức).
Các dung môi dùng trong chiết xuất, phân lập nhƣ: ethanol (EtOH),
methanol (MeOH), n-hexan (Hx), ethyl acetat (EtOAc), dicloromethan
(DCM). Silica gel pha thƣờng (0,040 - 0,063 mm, Merck). Bản mỏng tráng
sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha
đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm). Đèn tử ngoại ở hai bƣớc sóng 254 nm và
365 nm hoặc dùng thuốc thử để phát hiện vết chất.
Dung mơi, hóa chất dùng để định tính (EtOH 80%, nƣớc cất,
Pb(CH3COO)2 30%, Pb(CH3COO)2 10%, thuốc thử ninhydrin 3%, thuốc
thử Fehling A và Fehling B, thuốc thử Lugol….
Các dung môi dùng trong định lƣợng polyphenol tồn phần: (EtOH).
Thuốc thử: Folin-Ciocalteau (Merck). Hóa chất Na2CO3 (Trung Quốc).
Các dung môi dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao MeOH, Acetonitril
(ACN) của hãng Merck. Acid phosphoric đặc d=1,685g/cm3 của hãng
Merck.

10


Môi trƣờng DMEM và trypsin đƣợc cung cấp bởi Gibco, FBS,
penicillin/streptomycin. Kháng thể p-AMPK, p-ACC, FAS, kháng thể thứ

cấp chuột, kháng thể thứ cấp thỏ và β-actin (Cell signaling); D-14C(U)glucose; MTT [3- (4,5- dimethylthiazol-2-YL) 2,5- diphenyl-tetrazolium
bromid] (Sigma); dexamethasone (Sigma), 3-isobutyl-1-methylxanthin,
insulin (Sigma); Các nguyên vật liệu và hoá chất khác đƣợc cung cấp bởi
cơng ty Sigma.
2.1.3.2. Thiết bị thí nghiệm
Thiết bị phục vụ chiết xuất và nghiên cứu các thành phần hóa học:
Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C;Tủ sấy Memmert IN260 (MEMMERT Đức); Máy cất quay Rotavapor R-200 (Buchi), BUCHI(Thuỵ Sỹ), Máy siêu
âm Power sonic 405 (POWERSONIC - Hàn Quốc), Máy UV-vis 1800 dải đo
190nm-800nm (SHIMADZU -Nhật Bản); Máy đo độ nóng chảy Kofler
micro-hotstage (Đức); Máy đo phổ khối lƣợng phun mù điện tử (ESI-MS)
AGILENT 1200 series LC-MSD Ion Trap (AGILENT -Anh); Máy đo phổ
cộng hƣởng từ hạt nhân Bruker AM 500 FT-NMR spectrometer với chất
chuẩn nội là TMS (BRUKER(Đức), Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích
Shimadzu LC10tvp, detector diod array SPD-M10Avp (SHIMADZU Nhật
Bản);
Thiết bị nghiên cứu hoạt tính sinh học
Máy li tâm để bàn SIGMA 3K 30 (SIGMA-Đức); Máy đo pH
(HORIBA F-51BW HORIBA -Nhật); Máy đo quang TriStar LB 941
Multimode Microplate Reader TRISTA (Đức); Hệ thống phát hiện và phân
tích hình ảnh LICOR Odyssey® CLx LICOR (Mỹ), Máy đếm Tri-Carb 2000
(TRI- CARB -Mỹ)…
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Các nghiên cứu thực nghiệm đƣợc nghiên cứu tại khoa sinh-ĐHKHTN,
khoa hóa thực vật, dƣợc lý – Viện Dƣợc liệu
2.2.1. Nghiên cứu về thực vật học:
2.2.1.1. Xác định tên khoa học
Theo phƣơng pháp mơ tả, so sánh hình thái, đƣợc đối chiếu bởi các
khóa phân loại đến lồi và thứ của chi Opuntia Mill.,thuộc họ xƣơng rồng
Cactaceae trong các bộ Thực vật chí của Trung Quốc[Error! Reference
source not found.].

11


Việc thẩm định lại kết quả, xác định lại tên khoa học mẫu thu thập
đƣợc tại phòng thực vật-Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật.
2.2.1.2. Nghiên cứu giải phẫu
Theo phƣơng pháp nghiên cứu giải phẫu thực vật, bao gồm các bộ phận
thân, rễ. Các tiêu bản giải phẫu đƣợc làm theo phƣơng pháp nhuộm kép (đỏ
carmin xanh methylen)[Error! Reference source not found.,Error!
Reference source not found.]. Quan sát dƣới kính hiểm vi soi nổi và chụp
ảnh bằng máy kỹ thuật số
2.2.2. Nghiên cứu về hóa học
2.2.2.1. Đánh giá sơ bộ thành phần dinh dưỡng của cây XR Nopal trồng tại
Việt Nam
Vật chất khô (Phƣơng pháp trọng lƣợng), Lipid (Phƣơng pháp Soxlect),
Protein (Sử dụng máy Gerhard theo phƣơng pháp Kjeldahl); Xác định
vitamin A, vitamin C bằng phƣơng pháp HPLC; Xác định vitamin B1, B2,
B6 bằng phƣơng pháp cực phổ xung vi phân. Phân tích K, Na dựa trên tiêu
chuẩn Việt Nam TCVN 6196-3:2000; Xác định Zn, Fe, dựa trên tiêu chuẩn
Việt Nam TCVN 8126:2009; Xác định P theo phƣơng pháp TCVN
1525:2000
2.2.2.2. Phương pháp chiết phân đoạn
Mẫu thu về đƣợc loại bỏ phần hƣ hỏng, rửa sạch, phơi trong bóng râm
cho khơ, sấy ở 60oC cho đến khi mẫu có khối lƣợng không đổi, nghiền mẫu
thành bột và đƣợc chiết xuất bằng ethanol (EtOH) với phƣơng pháp ngấm
kiệt. Sau đó dịch chiết tồn phần EtOH đƣợc phân đoạn bằng các dung mơi
có độ phân cực tăng dần n-hexan, ethyl acetat [Error! Reference source not
found.].
2.2.2.3. Phương pháp định tính

Định tính bằng các phản ứng hóa học sử dụng thuốc thử đặc trƣng của
mỗi nhóm chất [Error! Reference source not found.],[Error! Reference
source not found.].
2.2.2.4. Phương pháp định lượng polyphenol toàn phần
Phƣơng pháp định lƣợng polyphenol toàn phần [Error! Reference
source not found.]: sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteau, đo quang ở bƣớc
sóng 760nm, so sánh với acid gallic, sử dụng kỹ thuật đƣờng chuẩn.
2.2.2.5. Phương pháp phân lập các hợp chất:

12


a. Sắc ký lớp mỏng : Dùng để kiểm tra độ tinh khiết của chất phân lập
đƣợc.
Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính
phân cực của các thành phần trong dung dịch. Pha tĩnh là một lớp mỏng các
chất đƣợc hấp thụ trên silicagel.[Error! Reference source not found.]
Sau khi chạy sắc ký xong để phát hiện chất trên bản mỏng có thể dùng
thuốc thử H2SO4 10% đƣợc phun đều trên bản mỏng, sấy khô rồi hơ trên
bếp điện đến khi hiện màu hoặc bằng đèn tử ngoại bƣớc song 365nm và
254nm
b. Sắc ký dựa trên sự phân bố các chất giữa 2 pha: pha cố định và pha di
động. Pha di động hay pha lỏng là dung môi dùng để chiết cho chảy qua cột,
pha cố định hay pha tĩnh đƣợc nhồi vào một cột thủy tinh. Mẫu đƣợc đƣa vào
cột, các mẫu sẽ đi qua cột với các tốc độ khác nhau, các phân tử có kích
thƣớc nhỏ sẽ ngấm sâu vào mạng lƣới của chất nhồi, cịn các phân tử có kích
thƣớc lớn hơn sẽ chỉ thâm nhập ở mức độ nhất định, các phân tử có khối
lƣợng rất lớn sẽ khơng đi đƣợc vào các mao quản. Kết quả là thứ tự các chất
ra khỏi cột theo khối lƣợng thứ tự giảm dần [Error! Reference source not
found.].

2.2.2.6. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học
a. Điểm nóng chảy (Mp)
Điểm nóng chảy đƣợc đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện
Dƣợc Liệu.
b. Phƣơng pháp phổ khối lƣợng:
Cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ thƣờng đƣợc xác định bằng
kỹ thuật phổ khối lƣợng. Nguyên tắc chủ yếu của kỹ thuật này là dựa vào sự
phân mảnh ion của phân tử chất dƣới dạng bắn phá của chùm ion bên ngoài.
Ngoài ra để xác định đƣợc cấu trúc hóa học của các hợp chất còn dựa vào cơ
chế phân mảnh của các ion bằng phổ MS
c. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR- Nuclear Magnetic
Resonance):Phổ 1H-NMR; Phổ 13C-NMR; Phổ DEPT. Ngồi ra, ngƣời ta
cịn sử dụng nhiều kỹ thuật phổ 2 chiều rất hiện đại khác nhƣ: HMQC,
HOMOCOSY, HMBC[Error! Reference source not found., Error!
Reference source not found.].
2.2.3. Nghiên cứu tác dụng sinh học
2.2.3.1. Xác định độc tính cấp

13


Tiến hành đánh giá độc tính cấp tính của DCTP của 03 giống XR
Nopal thử nghiệm (Jalpa, Tai voi, PTV-01) trên chuột nhắt trắng theo đƣờng
uống, liều dùng là 3g, 6g, 9g, 12g,15g,18g,21g/ kg/ ngày cho mỗi giống XR
Nopal [Error! Reference source not found.], mỗi lô 10 con.
Các chỉ tiêu theo dõi : Hoạt động tự nhiên, tƣ thế, màu sắc (mũi, tai,
đuôi), lông, phân, nƣớc tiểu.Theo dõi số lƣợng chuột chết ở mỗi lơ trong
vịng 72 giờ, xác định đƣợc LD50.
2.2.3.2. Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết
a) Phương pháp gây tăng glucose huyết bằng STZ

Chuột nhắt trắng sau khi mua về đƣợc để ổn định 3, tiêm màng bụng
STZ (pha citrate pH=4,5) với liều 150 mg/kg. [Error! Reference source not
found.].
b) Phương pháp gây chuột ĐTĐ type 2
Nhóm 1: nhóm ăn thƣờng (ND-normal diet) Chuột đƣợc ni bằng chế
độ ăn bình thƣờng (thức ăn chuẩn do viện vệ sinh Dịch tễ cung cấp). Nhóm
2: nhóm ni béo (HFD-high fat diet) ăn thức ăn giàu chất béo trong vòng 8
tuần.
Gây chuột nhắt ĐTĐ type 2 bằng cách tiêm màng bụng STZ 120
mg/kg (pha trong đệm citrate 0,01M, pH 4,3)
Sau khi tiến hành tiêm STZ với liều 120 mg/kg, các con chuột tiếp tục
đƣợc nuôi bằng chế độ dinh dƣỡng nhƣ ban đầu. Đo nồng độ đƣờng huyết lúc
đói tại 0 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 5 ngày, 7 ngày, 10 ngày. Sau 14 ngày lấy máu
định lƣợng đƣờng huyết.
c) Phương pháp định lượng glucose huyết
Định lƣợng đƣờng huyết bằng kỹ thuật enzyme, glucose bị oxi hóa nhờ
xúc tác của các enzyme trên bề mặt của vùng phản ứng giấy thử và đọc kết
quả trên máy One Touch Profile Meter của hãng Johnson&Johnson.
d) Phương pháp định lượng cholesterol toàn phần, triglyceride HDLc, LDLc
Định lƣợng cholesterol toàn phần theo phƣơng pháp của Deeg và
Zlegenhorn và định lƣợng triglycerid huyết thanh theo phƣơng pháp của
McGowan, định lƣợng HDL, LDL trên máy xét nghiệm sinh hóa máu bán tự
động TC plus 80.
e) Phương pháp thử tác dụng hạ glucose huyết
 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của 03 giống Nopal trên
chuột gây tăng glucose huyết bằng STZ:

14

Chia chuột thí nghiệm thành 8 lơ và cho uống các mẫu thử: 6 lô Cho
chuột uống cao dịch chiết toàn phần của 03 giống XR Nopal (Jalpa, TV,
PTV-01) với liều 500mg/kg/ ngày và 1000mg/kg/ ngày [Error! Reference
source not found.]. Lô chứng bệnh lý : Chuột đã gây tăng glucose huyết,
uống nƣớc. Lô uống mẫu đối chứng dƣơng: Chuột đã gây tăng glucose huyết,
uống Glyclazid với liều 100 mg/kg cân nặng. Chỉ tiêu theo dõi: glucose
huyết của các lơ thí nghiệm. Cho chuột tất cả các lô uống mẫu thử 7 ngày liên
tục. Sau ngày uống thứ 7, lấy máu đuôi chuột định lƣợng lƣợng glucose huyết
thanh (G7).
 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết, cholesterol trên chuột gây
ĐTĐ type 2 của các cao phân đoạn dịch chiết của giống XR Jalpa
Lơ thí nghiệm: Chuột đƣợc bố trí theo 6 lơ thí nghiệm: Lơ 1: Lơ đối
chứng - Chuột đã gây tăng đƣờng huyết, uống nƣớc muối sinh lý với liều
10ml/kg. Lô 2,3,4,5 Chuột đã gây ĐTĐ type 2, uống cao chiết phân đoạn
OFT, OFH, OFE, OFN mức liều khi qui đổi ra dƣợc liệu là tƣơng đƣơng liều
DCTP 1000mg/ kg. Lô 6: Chuột đã gây ĐTĐ type 2, uống thuốc hạ đƣờng
huyết Metfomin
Thí nghiệm đƣợc kéo dài 20 ngày. Đƣờng huyết chuột lúc đói đƣợc đo
tại các thời điểm 0 giờ, 7 ngày, 10 ngày, 20 ngày bằng máy glucose huyết tự
động. Định lƣợng cholesterol toàn phần trên máy xét nghiệm sinh hóa máu
bán tự động TC plus 80.
Dựa trên kết quả thí nghiệm, chọn cao chiết phân đoạn có tác dụng
chiếm ƣu thế nhất để tiếp tục nghiên cứu.
2.2.3.3. Phương pháp đánh giá tác dụng kích hoạt p-AMPK, p-ACC,
ức chế FAS kích thích sự hấp thu glucose.
a) Ni cấy và biệt hóa tế bào:
Tế bào 3T3-L1 đƣợc cung cấp bởi ATCC (Rockwill, MD, Mỹ) nuôi
cấy ở 37°C, 5% CO2 trong môi trƣờng DMEM. Sau khi tế bào hợp lƣu với
hỗn hợp các chất gây biệt hóa (1 μM dexamethasone, 500 μM 3-isobutyl-1methylxanthin, và 1 μg ml−1 insulin, MDI) đƣợc hịa tan vào mơi trƣờng
ni cấy tế bào DMEM ở trên trong 2 ngày (Day 2). Các tế bào từ sau 8 ngày

đƣợc biệt hóa và sử dụng cho các thí nghiệm.
b) Xác định độ độc tế bào
Tế bào nuôi cấy trong đĩa ổn định, các mẫu thuốc thử sẽ đƣợc đƣa vào
ủ trong 24 h. Tế bào sống sẽ đƣợc ủ và nhuộm màu với môi trƣờng nuôi cấy

15


tế bào có chứa MTT [3- (4,5- dimethylthiazol-2-YL) 2,5- diphenyltetrazolium bromid] (2 mg/ml, trong 2h). Loại bỏ môi trƣờng. Xác định tỷ lệ
tế bào còn sống giữa mẫu chuẩn và mẫu thử bằng máy đo quang ở bƣớc sóng
570 nm (Máy LB941, Berthold Technologies).[Error! Reference source not
found.]. Tính kết quả: Tỷ lệ % tế bào sống sót đƣợc tính theo cơng thức: I
(%) = (ODthử/ODchứng)x100% (Trong đó: I (%) là Tỷ lệ % tế bào sống sót;
OD là mật độ quang ở bƣớc sóng λ= 570 nm (ODthử: mật độ quang mẫu thử;
ODchứng: mật độ quang của mẫu chứng).
c) Phương pháp điện di protein
Các tế bào 3T3-L1 đƣợc xử lý với dịch chiết trong 2 h, sau đó thu lại
rồi rửa sạch. Các tế bào đƣợc ly giải trên băng. Dịch chiết tế bào sau đó đƣợc
đun sơi và ly tâm. Nồng độ dịch chiết tế bào đƣợc xác định bằng phƣơng
pháp BCA và điện di trên gel SDS – polyacrylamide 10%. Sau khi điện di,
protein trong gel đƣợc chuyển sang màng nitrocellulose, sau đó đƣợc ủ với
kháng thể nguyên cấp (p-AMPK, p-ACC, FAS và β-actin). Màng sau đó
đƣợc ủ thêm với kháng thể thứ cấp peroxidase liên hợp (chuột hoặc thỏ). Mật
độ các vết đƣợc phát hiện bằng dung dịch west femto (Thermo Scientific) và
hình ảnh đƣợc phát hiện và phân tích bằng máy LICOR Odyssey® CLx
(Lycor Biotechnology, Mỹ).[Error! Reference source not found.]
d) Đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK, ACC của các phân đoạn:
Tế bào sau khi ủ với từng phân đoạn OFT, OFH, OFE, OFN với nồng
độ 30μg/ml, Lô chứng: là mẫu trắng dimethylsulfoxid (DMSO), thời gian ủ là
2h, đƣợc thu protein, chạy điện di và phân tích Western blot. So sánh mức độ

biểu hiện của p-AMPK, p-ACC để tìm ra cao phân đoạn dịch chiết có tác
dụng hoạt hóa AMPK rõ nhất.
e) Nghiên cứu đánh giá tác dụng của các chất tinh khiết trên p-AMPK, pACC
Bƣớc 1: Xác định mức độ độc tính trên tế bào mô mỡ 3T3-L1 của 04 hợp
chất tinh khiết astragalin (OF2), rutin (OF4), narciscin (OF5) và typhaneosid
(OF6) đƣợc phân lập từ phân đoạn ethyl acetat. Lơ thí nghiệm: Các giếng có
chứa tế bào 3T3-L1 đã biệt hóa, bổ sung các chất ở nồng độ 3 μM, 10μM,
30μM, 100μM đƣợc ủ trong 24 h. Đánh giá mức độ độc tính trên tế bào mơ
mỡ 3T3-L1 bằng phƣơng pháp MTT tìm ra dải nồng độ an tồn để thí nghiệm
tiếp.

16


Bƣớc 2: Sử dụng phƣơng pháp Western blot để đánh giá mức độ biểu
hiện của p-AMPK, p-ACC : Tế bào sau khi đƣợc biệt hóa đƣợc ủ với từng
hợp chất với nồng độ 10μM, thời gian ủ là 2h. So sánh mức độ biểu hiện của
p-AMPK, p-ACC để tìm ra chất có tác dụng hoạt hóa AMPK rõ nhất.
f) Đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK kích thích sự hấp thu glucose của hợp
chất typhaneosid theo nồng độ
Tế bào 3T3-L1 sau khi đƣợc ủ với typhanosid ở các nồng độ 3 μM, 10
μM, 30 μM đƣợc thu và trộn đều trong dung dịch Krebs-Ringer HEPES chứa
1% BSA trong 30 phút ở máy lắc trong bồn nƣớc 37 °C, sau đó thêm D14C(U)-glucose và ủ 30 phút.
Xác định khả năng hấp thu glucose đƣợc bằng cách: lấy 300 μl của
mỗi dung dịch ở trên rồi trộn với 65 μl dầu dinonylphtalate sau đó đem ly
tâm. Các phân đoạn tế bào có gắn 14C đƣợc thu và hòa tan trong dung dịch
chất lỏng phát quang và đƣợc đếm bằng máy đếm Tri-Carb 2000.[Error!
Reference source not found.]
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu thống kê
Số liệu đƣợc xử lý bằng phƣơng pháp thống kê với sự trợ giúp của

phần mềm Excel 2007. Biểu diễn số liệu dƣới dạng Xtb ± SD, so sánh bằng
T-test student. Để so sánh sự khác biệt giữa các thời điểm khác nhau trong
cùng 1 nhóm và giữa các nhóm tại cùng thời điểm, dùng thuật tốn ANOVA,
sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p 0,05, sự khác biệt khơng có ý nghĩa
thống kê khi p 0,05.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Nghiên cứu về thực vật học
3.1.1. Xác định tên khoa học của cây Nopal
Tên khoa học chính xác là Opuntia ficus-indica (L.) Mill.,thuộc họ
xƣơng rồng Cactaceae. Kết quả này đã đƣợc giám định lại bởi Ths. Bùi Hồng
Quang, TS. Vũ Tiến Chính Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật với tên
khoa học số hiệu mẫu T.T.H-28/1/2016, hiện đƣợc lƣu trữ tại phòng tiêu bản
(HN) Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật.
3.1.2.Đặc điểm hình thái thực vật
Nopal là cây bụi, mọc thẳng, một số lồi có thể dạng leo. Thân cây
hình trụ, nhánh nopal có các lớp biểu bì dày thích nghi với việc lƣu trữ nƣớc,
có màu xanh lá cây.

17


+ Thân cây và nhánh (cành) đƣợc cấu tạo bởi các đoạn thân
+ Rễ cây Nopal có dạng rễ cọc, các rễ phụ phát triển mạnh với số lƣợng rễ
nhiều.
+ Lá là các gai non của Nopal, mọc trên bề mặt nhánh cây, trong hầu hết các
loại xƣơng rồng rau các lá chỉ xuất hiện lúc non (0,5-3mm) sau rồi biến mất.
+ Hoa có nhiều dạng 5-8 cm, hoa xuất hiện giống nhƣ một cái vƣơng miện,
màu sắc đa dạng. Quả Nopal có hình trụ
3.1.3.Đặc điểm giải phẫu
3.1.3.1. Cấu tạo giải phẫu thân

+ Vi phẫu thân: Bần gồm nhiều lớp tế bào hình chữ nhật xếp thẳng hàng
nhau. Mơ dày gồm 3-4 lớp tế bào thành dày lên ở tất cả các góc, mơ mềm cấu
tạo bởi những tế bào thành mỏng hình đa giác, có các tinh thể calci oxalat
hình cầu gai. Libe gỗ tạo thành các bó riêng biệt gồm libe, gỗ cấu tạo bởi các
mạch gỗ nhỏ xen kẽ với các tế bào mô mềm gỗ.
3.1.3.2. Cấu tạo giải phẫu thân rễ
+ Vi phẫu thân rễ: Lớp bần, sát lớp bần có các tế bào hình chữ nhật thành
mỏng là tầng phát sinh bần lục bì. Mơ mềm vỏ mỏng, phía trong mơ mềm vỏ
là libe cấp 2, có các tinh thể calci oxalat hình cầu gai. Gỗ gồm các mạch gỗ
xếp thành bó, trong gỗ có là mô mềm gỗ.
+ Bột thân: Bột màu xanh lục, khơng vị. Mảnh biểu bì có lỗ khí. Tinh thể
calci oxalat hình cầu gai rải rác trong mơ mềm. Mảnh mô mềm. Mạch xoắn
và mạch mạng.
+ Bột rễ: Bột màu trắng ngà, không vị, mùi thơm nhẹ. Mảnh bần gồm các tế
bào hình chữ nhật xếp thẳng hàng nhau. Mảnh mô mềm gồm các tế bào thành
mỏng xép lộn xộn. Hạt tinh bột hình chng, đơn lẻ. Mảnh mạch điểm và
mạch xoắn rõ. Rải rác trong mô mềm là các tinh thể calci oxalat hình cầu gai.
3.2. Nghiên cứu về hóa học:
3.2.1. Đánh giá sơ bộ thành phần dinh dưỡng của 03 giống cây xương
rồng Nopal nghiên cứu trồng tại Việt Nam.
Bảng 3.2. Hàm lượng một số chất dinh dưỡng trong 100 gram mẫu tươi
của 03 giống Nopal 1 năm tuổi trồng tại Ninh Thuận
Hàm lượng các

Đơn vị

Jalpa (JP)

chất dinh dưỡng

Tai voi

PTV

(TV)

Protein

gram

0,67

0,63

1,16

Lipid

gram

0,17

0,17

0,21

18


Xellulose

gram

1,77

1,77

1,99

Bảng 3.3. Hàm lượng một số chất khoáng chất và vitamin trong 100
gram mẫu tươi của 03 giống Nopal 1 năm tuổi trồng tại Ninh Thuận
Đơn vị: mg/100g
P

K

Ca

Na

Fe

Zn

Mg Mn

Tên

VitA

VitC

(Mcg)

Vt

Vt

B1

B2

VtB6

giống
JP

3,0

197

71

6,14

0,53

0,003

82

11

0,62

6,23

0,19 0,60 0,027

TV

10,0 224 155 6,24

0,28

0,003

76

21

1,01

8,84

0,15 0,70 0,027

PTV

9,0

220 204 4,47 0,003 0,001

83

3,0

0,36

8,61

0,20 0,65 0,021

Kết quả nghiên cứu bƣớc đầu cho thấy cây xƣơng rồng Nopal thích
nghi với điều kiện khí hậu khơ và nóng tại Ninh Thuận của Việt Nam
3.2.2. Kết quả chiết các cao phân đoạn
3.3.2.1. Dịch chiết toàn phần (DCTP) từ 03 giống XR Nopal nghiên cứu
03 Mẫu XR Jalpa, Tai voi, PTV-01, với khối lƣợng 2400g bột khô/
giống, ngâm từng giống với cồn và cất loại cồn nƣớc dƣới áp suất giảm thu
đƣợc cao chiết tổng với phần trăm tách chiết DCTP của các giống XR Jalpa,
TV, PTV tƣơng ứng nhƣ sau: 12,44%; 12,18%; 12,08%
3.2.2.2. Cao chiết phân đoạn từ giống XR Jalpa
Cao chiết tổng (DCTP) của giống XR Jalpa đƣợc thêm hỗn hợp cồnnƣớc (1:1) chiết lần lƣợt trong các dung mơi có độ phân cực tăng dần: nhexan, ethyl acetat. Phần trăm tách chiết: cao PĐ Hexan-OFH, cao PĐ ehthyl
acetat- OFE, Cao phân đoạn (PĐ) nƣớc-OFN: 0,81%; 3,78%; 9,8%;
3.2.3 Xác định các nhóm chất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất
trong cây XR Jalpa.
3.2.3.1. Định tính các nhóm chất trong các cao phân đoạn cây XR Jalpa
Nhóm hoạt chất có trong cây XR Jalpa là rất phong phú: polysaccharid,
đƣờng khử, alcaloid, acid amin, flavonoid, phytosetrol, carotenoid, chất béo.
3.2.3.2.Định lượng polyphenol toàn phần trong các cao phân đoạn

Hàm lƣợng polyphenol toàn phần trong các cao chiết OFT, OFE, OFN
lần lƣợt là 5,617 ± 0,046, 8,726± 0,103 và 4,585±0,049% tính theo acid
gallic. Cao chiết ethyl acetat (OFE) có hàm lƣợng polyphenol tồn phần cao
nhất đạt 8,726± 0,103%.

19


3.2.3.3. Kết quả phân lập các hợp chất, trong phân đoạn có hoạt tính hạ
đường huyết tốt nhất- Ethyl acetat (OFE)
Phân lập đƣợc 08 hợp chất OF1, OF2, OF3, OF3.1, OF4, OF5, OF6,
OF7, trong đó các hợp chất OF1, OF4, OF3, OF6 có hàm lƣợng tƣơng đối
cao so với các hợp chất còn lại, tƣơng ứng đạt là 55mg, 52mg, 25mg, 22mg.
3.2.3.4. Kết quả xác định cấu trúc các hợp chất trong phân đoạn có hoạt
tính hạ đường huyết tốt nhất- Ethyl acetat (OFE)
Bằng các phƣơng pháp sắc kí kết hợp với các phƣơng pháp phổ hiện
đại đã phân lập và nhận dạng đƣợc 8 hợp chất
Bảng 3.9. Bảng tên các hợp chất phân lập từ phân đoạn Ethyl
acetat
STT
Hợp
Tên hợp chất
Cấu trúc các hợp chất
chất
phân
lập
1
OF1
β-sitosterol 3-O-β-Dglucopyranosid
2

OF2

Kaempferol 3-O-β-Dglucopyranosid hay
astragalin

3

OF3

Acid ferulic

4

Acid gallic
OF3.1

5

OF4

Quercetin 3-O--rutinosid
hay rutin

OH
OH

2'
8

O 2

HO

6'
6

O
OH

OH

O

OO

CH2
O
1'''
OH
1''
OH
OH OH
OH

6

OF5

Isorhametin 3-O-rutinosid

hay Narcissosid

2'
8

HO

O

6'
6

OH

O
OH

O

1'''

CH2
O

OO

OH OH

OH
OH

1''
OH

20

OCH3
OH

2


7

OF6

Isorhamnetin-3-Orhamnosyl-rutinosid hay
Typhaneosid

OCH3
OH

2'
8

HO

O

2

6'

6

O
OH

OH

OO
1'''

OH OH

O
CH2
O

OH
OH

OH

1''
O

O
1''''

OH OH

8

OF7

Oligosaccharid

3.3. Nghiên cứu về tác dụng sinh học:
3.3.1. Nghiên cứu độc tính cấp của 03 giống XR Nopal trồng tại Việt Nam
Sau khi cho chuột uống cao chiết DCTP từ 03 giống XR Nopal với liều
tăng dần từ 3g- 21g mẫu/kg thể trọng, sau 72h không quan sát thấy biểu hiện
ngộ độc cấp tính.Vì khơng có chuột chết ở các lô thử nghiệm nên chƣa xác
định LD50 của dịch chiết tổng (DCTP) của 03 giống XR Nopal thử nghiệm.
Điều đó chứng tỏ dịch chiết từ 03 giống cây XR nopal dƣới dạng cao đƣợc sử
dụng bằng đƣờng uống không gây độc cho chuột.
3.3.2. Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của 03 giống cây xương rồng
Nopal trồng tại Việt nam.
Cho chuột gây tăng glucose huyết bằng STZ uống cao DCTP với liều:
+ Liều uống 500mg/kg/ ngày/ giống: % giảm glucose huyết so với chứng của
03 giống Jalpa, Tai voi, PTV nhƣ sau: 22,4% ; 6,8%; 0,56%.
+ Liều uống 1000mg/kg/ ngày/ giống: % giảm glucose huyết so với chứng
của 03 giống Jalpa, Tai voi, PTV nhƣ sau: 29%; 7,73%; 2,34%
Kết quả cho thấy trong 3 giống cây nopal thử nghiệm, giống Jalpa ở
liều 1000mg /kg thử nghiệm trên chuột có tác dụng hạ đƣờng huyết tốt nhất
3.3.3. Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết, hạ cholesterol của giống Jalpa
trên chuột ĐTĐ typy 2
3.3.3.1. Gây chuột nhắt ĐTĐ type 2
 Kết quả gây chuột nhắt béo:
Lô ăn béo (HFD) có trọng lƣợng trung bình là 62,550,66 đã tăng
260% (gấp gần 4 lần) sau 8 tuần so với thời điểm trƣớc khi cho chuột ăn thức

ăn giàu chất béo (17,310,98). Kết quả trên cho thấy chuột thí nghiệm đã
đƣợc gây béo phì.

Gây tăng glucose huyết cho chuột nhắt béo bằng STZ
Nồng độ đƣờng huyết của nhóm chuột béo phì nhóm HFD khi bị tiêm
STZ tăng là 21,64±1,75; 22,32±1,82; 22,81±2,12; 23,17±2,12 tƣơng ứng tại
các thời điểm 72h, 7 ngày, 10 ngày, 14 ngày. Nhƣ vậy, bằng chế độ ăn giàu

21


chất béo cho chuột ăn liên tục trong vòng 8 tuần kết hợp với STZ đã gây
đƣợc chuột bị tăng glucose huyết, bị ĐTĐ typy 2.
3.3.3.2. Tác dụng hạ đường huyết của các cao chiết phân đoạn trên chuột
ĐTĐ type2 bằng chế độ ăn giàu chất béo và STZ.
Chuột ĐTĐ type 2 đƣợc điều trị bằng các cao chiết phân đoạn OFT,
OFH, OFE, OFN sau 3,7,10,15, 20 ngày đo nồng độ glucose huyết thì nồng
độ glucose huyết giảm rõ nhất sau 20 ngày tƣơng ứng ở các phân đoạn OFT,
OFH, OFE, OFN là: 37,02% ; 32,50%; 59,04%; 49,62% so với đối chứng.
Uống Metfocmin (thuốc điều trị ĐTĐ) nồng độ glucose huyết giảm 77,3%.
Từ kết quả trên có thể khẳng định cao OFE có tác dụng hạ glucose
huyết tốt nhất.
3.3.3.3. Tác dụng hạ mỡ máu của các cao chiết phân đoạn trên chuột ĐTĐ
type2 bằng chế độ ăn giàu chất béo và STZ:
 Đánh giá các chỉ số mỡ máu chuột ở nhóm ND và HFD
Cho chuột ăn chế độ ăn giàu chất béo (nhóm HFD) và chế độ ăn
thƣờng (ND) liên tục trong vòng 8 tuần đánh giá chỉ số mỡ máu: cholesterol
tổng số, Tryglycerid, HDLc, LDLc. Nhóm chuột ND khơng bị rối loạn mỡ
máu. Nhóm HFD bị rối loạn mỡ máu, các chỉ số Cholesterol, Tryglycerid,
HDLc ; LDLc tăng so với nhóm ND tƣơng ứng là : 34,35%; 104,3%; giảm

20,53%; 26,73% .
 Tác dụng hạ mỡ máu của các cao phân đoạn dịch chiết
Chuột ĐTĐ type 2 đƣợc điều trị bằng các cao chiết phân đoạn OFT,
OFH, OFE, OFN sau 20 ngày đo chỉ số mỡ máu. Phân đoạn ethylacetat
(OFE) của giống XR Jalpa thể hiện tác dụng hạ mỡ máu tốt nhất: cholesterol
toàn phần giảm 31,05%, triglycerid giảm 15,7%, HDLc tăng 31,03%, LDLc
giảm 15,86% so với phân đoạn OFT, OFH, OFN, thử nghiệm trên chuột béo
phì, ĐTĐ type 2.
3.3.4. Kết quả đánh giá cơ chế tác dụng hạ glucose huyết sơ bộ của các
dịch chiết từ các cao chiết phân đoạn thơng qua hoạt hóa enzym AMPK.
Sau khi ủ các dịch chiết OFH, OFN,OFT,OFE với nồng độ 30 μg/ml
với tế bào 3T3-L1 trong 2 h, thu đƣợc protein, chạy điện di và đánh giá mức
độ biểu hiện của protein thông qua p- AMPK và p-ACC hoặc β- actin
(protein đối chứng) phƣơng pháp điện di protein (Western blot).

22


Hình 3.19, 3.20, 3.21. Tác dụng của cao chiết cồn 70% và các phân đoạn
của cao chiết cồn 70% của OFI trên protein phospho-AMPK và ACC.
Hình ảnh phân tích Western blot cho thấy: mức độ biểu hiện β- actin
không thay đổi. Cao phân đoạn ethyl acetat (OFE) và cao phân đoạn nƣớc
(OFN) với nồng độ 30 μg/ml đều làm tăng biểu hiện của p-AMPK và p-ACC
rõ nhất so với đối chứng. Tác dụng của phân đoạn OFE rõ hơn phân đoạn
OFN.
3.3.5. Đánh giá tác dụng của các hợp chất tinh khiết Flavonoid từ phân
đoạn dịch chiết ethyl acetat (OFE) trên AMPK và ACC.
3.3.5.1. Xác định độ độc tế bào
% Te bao song sot

150

100

**

**
50

30
10
0

3

10

30
10
0

10

3

30

3

10

30

3

10

D

M

S
O

0

Rutin ( M)

Astragalin ( M)

Narciscin ( M)

Typhane osid ( M)

Hình 3.22 . Mức độ độc tế bào 3T3-L1 của 4 hợp chất flavonoid phân lập
từ phân đoạn OFE
(Chú thích: **:P<0,01 so sánh với mẫu trắng DMSO)

Kết quả hình 3.22 cho thấy ở nồng độ 3 µM đến 30 µM, cả 4 hợp chất
thử nghiệm đều có tỉ lệ tế bào sống sót đạt > 90%. Do vậy dải nồng độ 3-30

μM là an tồn để thực hiện thí nghiệm tiếp theo trên tế bào 3T3-L1.
3.3.5.2. Đánh giá tác dụng kích hoạt p-AMPK, p-ACC trên tế bào 3T3-L1
của 4 hợp chất flavonoid

Hình 3.23; 3.24; 3.25.:Tác dụng của 4 hợp chất flavonoid phân lập từ

23


phân đoạn OFE của OFI trên protein phospho-AMPK và ACC
Ghi chú: 1: Rutin; 2: Astragalin; 3: Narciscin; 4: Typhaneosid
(so sánh với mẫu trắng DMSO *:P<0.05, **:P<0.01, ***:P<0.001)

Sử dụng phƣơng pháp Western blot để đánh giá mức độ biểu hiện của
p- AMPK, p-ACC, kết quả cho thấy Rutin với nồng độ mẫu 10 μM có tác
dụng kích hoạt p-AMPK mạnh nhất sau đó đến hợp chất astragalin trên pACC. Astragalin thể hiện tác dụng kích thích p-ACC cao hơn typhaneosid và
cả hai chất đều thể hiện tác dụng kích thích tăng p-AMPK tƣơng đƣơng nhau.
Aicar 2 mM là chất đối chứng chuẩn cho thí nghiệm
3.3.5.3. Tác dụng ức chế FAS theo nồng độ của typhaneosid và astragalin
trên tế bào 3T3-L1
Ti le FAS/-actin

1.5

Fas
β-actin

1.0

0.5

30

3

S
O

30

M

10

D

3

10

0.0

Typhaneosid (μM) DMSO

Typhaneosid (M)

Ti le FAS/-actin

1.5

Fas
β-actin

30

10

0.0

30

3

10

S
O

3

0.5

D

M

Astragalin (μM) DMSO

1.0

Astragalin (M)

Hình 3.27. Tác dụng ức chế FAS theo nồng độ của typhaneosid và
astragalin trên tế bào 3T3-L1
(so sánh với mẫu trắng DMSO *:P<0.05, **:P<0.01, ***:P<0.001)

Kết quả thể hiện ở hình 3.27 cho thấy hợp chất typhaneosid thể hiện tác
dụng ức chế FAS rõ rệt theo nồng độ tăng dần ở 3, 10, và 30 µM.
3.3.6. Đánh giá tác dụng kích hoạt p-AMPK, p-ACC trên tế bào 3T3-L1
theo nồng độ của typhaneosid

24


Hình 3.28; 3.29. Tác dụng kích hoạt p-AMPK và p-ACC của typhaneosid
ở tế bào 3T3-L1 theo nồng độ
(so sánh với mẫu trắng DMSO *:P<0.05, **:P<0.01, ***:P<0.001)

Kết quả cho thấy, ở dải nồng độ 10-30 μM, typhaneosid hoạt hóa pAMPK và p-ACC từ 2-3 lần so với mẫu trắng dimethylsulfoxid (DMSO).
Tác dụng hoạt hóa p-AMPK và p-ACC đều phụ thuộc nồng độ.
3.3.7. Đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK kích thích sự hấp thu glucose
của hợp chất typhaneosid theo nồng độ

Hình 3.30. Tác dụng hoạt hóa AMPK kích thích sự hấp thu glucose của
hợp chất typhaneosid phụ thuộc nồng độ
(so sánh với mẫu trắng DMSO *:P<0.05, **:P<0.01, ***:P<0.001)

Kết quả nghiên cứu cho thấy typhaneosid nồng độ 10-30 μM kích thích sự
hấp thu glucose so với mẫu trắng DMSO. Insulin 100 nM là chất đối chứng
chuẩn cho thí nghiệm

KẾT LUẬN
Cây Nopal mới đƣợc di thực vào Việt Nam nên tất cả các nghiên cứu
này đều là những nghiên cứu đầu tiên.
1.Về thực vật:
- Đã xác định đƣợc đặc điểm hình thái, giải phẫu thân, thân rễ và xác
định đƣợc tên khoa học của cây xƣơng rồng Nopal trồng ở Ninh Thuận-Việt
Nam là Opuntia ficus-indica .
2. Về hóa học:
- Xác định đƣợc thành phần dinh dƣỡng của 03 giống xƣơng rồng
Nopal giống: Jalpa, Tai voi, PTV-01 trồng tại Việt Nam với hàm lƣợng đạt
đƣợc tƣơng ứng nhƣ sau: + Protein (g/100g tƣơi) : 0,67; 0,63; 1,16

25