Tuyển chọn chủng vi khuẩn có đặc tính probiotics từ ruột gà nuôi tự nhiên ứng dụng tạo chế phẩm bổ sung thức ăn nuôi gà công nghiệp

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGƠ CHÍ CƠNG

TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CĨ ĐẶC
TÍNH PROBIOTICS TỪ RUỘT GÀ NUÔI TỰ
NHIÊN ỨNG DỤNG TẠO CHẾ PHẨM BỔ SUNG
THỨC ĂN GÀ NUÔI CÔNG NGHIỆP
Chuyên Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Mã Chuyên Ngành: 60540101

LUẬN VĂN THẠC SĨ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019

1-i


Cơng trình được hồn thành tại Trường Đại học Cơng nghiệp TP. Hồ Chí Minh.
Người hướng dẫn khoa học: TS. Trịnh Ngọc Nam

Người phản biện 1: ...................................................................................................

Người phản biện 2: ...................................................................................................

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại
học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày . . . . . tháng . . . . năm . . . . .
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. ...................................................................... - Chủ tịch Hội đồng
2. ...................................................................... - Phản biện 1

3. ...................................................................... - Phản biện 2
4. ...................................................................... - Ủy viên
5. ...................................................................... - Thư ký

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA…………

1-ii


BỘ CƠNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: NGƠ CHÍ CƠNG………………… MSHV: 16002161
Ngày, tháng, năm sinh: 20/08/1992..............................Nơisinh: Bình Định ................
Chun ngành: Cơng Nghệ Thực Phẩm.......................Mã chuyên ngành: 60540101 .
I. TÊN ĐỀ TÀI:
Tuyển chọn chủng vi khuẩn có đặc tính probiotics từ ṛt gà ni tự nhiên ứng dụng
tạo chế phẩm bổ sung thức ăn gà nuôi công nghiệp
NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có đặc tính probiotics từ ṛt gà nuôi tự
nhiên và ứng dụng tạo chế phẩm bổ sung thức ăn chăn nuôi gà công nghiệp.
II. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Theo quyết định số 592/QĐ-ĐHCN về việc giao đề

tài và cử người hướng dẫn luận văn thạc sĩ của Hiệu trưởng trường Đại học Công
Nghiệp TP. HCM ngày 01 tháng 02 năm 2018
III. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 01/08/2018
IV. NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Trịnh Ngọc Nam

Tp. Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2019
NGƯỜI HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

VIỆN TRƯỞNG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

1-iii


LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian học tập và nghiên cứu, với sự giúp đỡ tận tình của Thầy Cơ, gia đình
và bằng sự nỗ lực của bản thân, tơi đã hoàn thành luận văn nghiên cứu. Để đạt được
kết quả này, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến:
Thầy Trịnh Ngọc Nam đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm
vô cùng quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành luận văn tốt
nghiệp. Mặc dù, Thầy rất bận rộn với công việc giảng dạy nhưng vẫn luôn theo dõi,
hướng dẫn và chỉ bảo giúp tơi hồn thành tốt các thí nghiệm trong luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy Cô của Viện công nghệ sinh học và thực phẩm,
Trường Đại Học Cơng Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh đã cho tôi những kiến thức
quý báu trong thời gian học tập tại trường. Những kiến thức được tích lũy từ sự giảng
dạy tận tình của q Thầy Cơ đã giúp tơi rất nhiều trong q trình thực hiện đề tài
này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Công ty Cổ phần Kỹ Thuật Sao Mai đã tạo
mọi điều kiện tốt nhất để tơi được hồn thành tốt các thí nghiệm tại Phịng nghiên

cứu và phát triển sản phẩm của cơng ty.
Cuối lời tơi xin kính chúc q Thầy Cô và Ban lãnh đạo công ty dồi dào sức khỏe và
thành công trong cuộc sống!

i


TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ
Probiotic được ứng dụng ngày càng rộng rãi trong ngành thực phẩm, dược phẩm,
chăn nuôi. Sử dụng probiotic một cách hợp lý giúp vật nuôi khỏe mạnh, tăng sức đề
kháng, cạnh tranh với các vi sinh vật gây bệnh, giúp chuyển đổi hệ số tiêu hóa thức
ăn tốt hơn và giảm dần lượng thuốc, kháng sinh sử dụng, đặc biệt đối với ngành chăn
nuôi công nghiệp. Nguồn vi sinh vật có đặc tính probiotic từ trong tự nhiên rất đa
dạng và phong phú đặc biệt là trong đường ruột của vật nuôi. Mục tiêu nghiên cứu
của đề tài là phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có đặc tính probiotic từ ṛt gà
ni tự nhiên để ứng dụng tạo chế phẩm probiotic bổ sung thức ăn chăn nuôi gà công
nghiệp. Từ 50 chủng vi khuẩn phân lập được từ ruột gà, tiến hành khảo sát khả năng
chịu pH acid, khả năng chịu muối mật, khả năng kháng lại các vi sinh vật kiểm
nghiệm, khả năng thích nghi với mợt số loại kháng sinh thơng dụng trong chăn ni,
khảo sát khả năng hình thành bào tử ở 60oC, và khả năng bám dính vào niêm mạc
đường ruột. Kết quả đã tuyển chọn được 3 chủng vi khuẩn C19, C31 và C43 có đặc
tính probiotic tốt: khả năng chịu pH 1.5 trong 3 giờ, chịu được nồng độ muối mật
1.5% trong 10 giờ, khả năng kháng lại các vi sinh vật kiểm nghiệm như Escherichia
coli, Salmonella sp., Staphylococcus aureus với đường kính vơ khuẩn từ 9 – 14 mm,
khả năng hình thành bào tử ở 60oC là ≥ 80% hay khả năng chịu được với enzyme
pepsin, pancreatin trong 180 phút. Tiến hành định danh các chủng vi khuẩn đã tuyển
chọn dựa vào vùng gen 16S rRNA đã xác định là các chủng Bacillus cereus, Bacillus
megaterium, Bacillus sp.. Chế phẩm probiotic trên của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
trên nền chất mang mantose dextrin và bột whey protein có mật đợ 108 CFU/g cho
thấy hiệu quả trong sự sinh trưởng của gà nuôi công nghiệp. Những kết quả của

nghiên cứu cho thấy khả năng ứng dụng của vi khuẩn probiotic phân lập từ đường
ruột vật nuôi trong chăn ni.
Từ khóa: probiotic, chế phẩm sinh học, Bacillus, gà nuôi công nghiệp, bào tử
probiotic

ii


ABSTRACT
Nowadays, probiotics are widely used in food products, pharmaceutical and
considered as one of the main components of livestock industry. These
microorganisms have strong influence on animal health by improving food digestion,
increasing immune system and acting against many pathogentic microorganisms.
Microbial sources with probiotic properties are abundant in nature, especially in
livests gastrointestinal tract. The aims of this study are evaluating the probiotic
potential of 50 bacterium strains isolated from chichken intestine to produce probiotic
preparation for use in the poultry industry. Parameters consisted of the ability to
acidic, heat and bile salt tolerance, produce spores, pathogen antagonistic activity,
and ability to adhere to intestine. Three strains, C19, C31 and C43, were selected with
good probiotic characteristics such as tolerance to low pH 1.5 after 3 hrs culture,
tolerance to 1.5% bile salt after 10 hrs, resistance to gastrointestinal pathogens
Salmonella sp., Escherichia coli, and Staphylococcus aureus with zone of inhibition
diameter 9-14mm, resistance to gentamicin, amoxicillin, ampicillin, vancomicin,
doxycicline antibiotics, and good adhesion ability on chicken intestinal epithelium.
Moreover, heat tolerance at 60oC for these strains were identified. Using gene
sequencing of 16S rRNA, C19, C31 and C43 were identified as strains Bacillus
cereus, Bacillus megaterium, and Bacillus sp. The probiotic products of the selected
strains contain 108 CFU/g showed effective in the growth of industrial chicken. Taken
together, the results of this study showed the applicability of probiotic bacteria
isolated from chicken gastrointestine for the poultry industry.

Keywords: probiotic, probiotics, Bacillus, the poultry industry, probiotic spores

iii


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của bản thân tôi. Các kết quả nghiên
cứu và các kết luận trong luận văn là trung thực, không sao chép từ bất kỳ một nguồn
nào và dưới bất kỳ hình thức nào. Việc tham khảo các nguồn tài liệu (nếu có) đã được
thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định.
Học viên

Ngô Chí Cơng

iv


MỤC LỤC
MỤC LỤC………………………………………………...…………………………v
DANH MỤC HÌNH ẢNH .................................................................................... viii
DANH MỤC BẢNG BIỂU .................................................................................... ix
MỞ ĐẦU

………………………………………………………………………....1

1.

Đặt vấn đề .................................................................................................. 1

2.

Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................... 2

3.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................... 3

4.

Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu .................................................. 3

5.

Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 4
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 5
Probiotic ..................................................................................................... 5
Định nghĩa ‘’Probiotic’’ .......................................................................... 5
Đặc điểm chung của các chủng vi sinh vật probiotic ............................... 5

chủ

Vai trò và cơ chế tác dụng của các chủng vi sinh vật probiotic đối với vật
……………………………………………………………………………8
Vai trò của các chủng probiotic đối với vật chủ ................................ 8
Cơ chế tác dụng của các vi sinh vật probiotic đối với vật chủ ........... 9

Nam

Tình hình nguyên cứu và ứng dụng của probiotic trên thế giới và Việt
…………………………………………………………………………..11

Thế giới .......................................................................................... 11
Việt Nam ........................................................................................ 12
Một số chủng vi sinh vật probiotic phổ biến .......................................... 13
Lactobacillus sp.............................................................................. 13
Bifidobacterium sp.......................................................................... 15
Bacillus sp. ..................................................................................... 16
Đặc điểm của gà .................................................................................... 19
Đặc điểm sinh trưởng của gà .......................................................... 19
Đặc điểm hệ tiêu hóa của gà ........................................................... 20
Đặc điểm hệ vi sinh vật đường ruột ở gà ......................................... 22
Tổng quan về chế phẩm probiotic.......................................................... 23
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................. 25
Vật liệu..................................................................................................... 25

v


Đối tượng .............................................................................................. 25
Thiết bị, dụng cụ............................................................................. 25
Hóa chất, mơi trường ...................................................................... 26
Phương pháp nguyên cứu ......................................................................... 27
Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu .......................................... 28
Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật Probiotic.................... 28
Quan sát hình thái khuẩn lạc đặc trưng và hình thái hiển vi của các
chủng vi sinh vật………………….........………………………………………….28
Nḥm Gram các chủng vi khuẩn có đặc tính probiotic .................. 29
Bảo quản và lưu trữ các chủng vi sinh vật probiotic ........................ 29
Khảo sát khả năng chịu được pH của dạ dày ................................... 30
Khảo sát khả năng dung nạp muối mật ........................................... 30
Phương pháp xác định khả năng kháng khuẩn và sinh bacteriocin .. 31

Khảo sát khả năng chịu được một số loại kháng sinh thông dụng
trong chăn nuôi ...................................................................................................... 32
Khả năng chịu được enzyme trong dạ dày và đường ruột ................ 33
probiotic

Khảo sát khả năng hình thành bào tử của các chủng vi khuẩn
……………………………………………………………………...33
Xác định khả năng bám dính vào niêm mạc đường ṛt .................. 34

Định danh các chủng vi khuẩn probiotic bằng phương pháp giải trình
tự vùng gen 16S rRNA ... ………………………………………………………….35
Phương pháp phối trộn tạo chế phẩm probiotic ..................................... 36
gà

Phương pháp kiểm nghiệm và đánh giá hiệu quả chế phẩm probiotic trên
…………………………………………………………………………..36
Khả năng tăng trọng ....................................................................... 38
Ngoại hình ...................................................................................... 38
Đánh giá mức đợ nhiễm các loại bệnh thông thường ở gà ............... 38
Tỉ lệ các chủng vi sinh vật gây hại trong phân gà ............................ 38
Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................... 38
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 39
Phân lập các chủng vi sinh vật .................................................................. 39
Kết quả khảo sát khả năng chịu được acid của dạ dày ............................... 47
Kết quả khảo sát khả năng chịu được muối mật ........................................ 55

Kết quả khảo sát khả năng đối kháng với vi sinh vật kiểm nghiệm và khả
năng sinh bacteriocin ............................................................................................. 60

vi

Kết quả khảo sát khả năng chịu được một số loại kháng sinh thông dụng
trong chăn nuôi ...................................................................................................... 63
Kết quả khảo sát khả năng hình thành bào tử của các chủng probiotic ...... 67
Kết quả định danh các chủng vi khuẩn probiotic....................................... 69
Kết quả khảo sát khả bám dính vào niêm mạc ruột của các chủng vi khuẩn
probiotic ................................................................................................................ 77
Kết quả khảo sát khả năng chịu được enzyme của dạ dày và ruột ............. 78
Kết quả phối trộn tạo chế phẩm probiotic từ các chủng vi khuẩn probiotic
phân lập được ........................................................................................................ 81
Kết quả kiểm nghiệm và đánh giá hiệu quả chế phẩm probiotic trên gà .... 82
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 88
1.

Kết luận .................................................................................................... 88

2.

Kiến nghị.................................................................................................. 89

TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………….90
PHỤ LỤC ……………………………………………………………………......95
LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN ..................................................... 107

vii


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Cấu tạo của mợt dạng bào tử vi khuẩn Bacillus ....................................... 17

Hình 1.2 Các giai đoạn nảy mầm của mợt bào tử Bacillus ..................................... 19
Hình 1.3 Sơ đồ hệ tiêu hố của gà.......................................................................... 20
Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thực hiện

……………………………...………27

Hình 3.1 Biểu đồ ảnh hưởng của pH đối với sự phát triển các chủng vi khuẩn trong
thời gian 3 giờ
………………………...……………55
Hình 3.2 Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ muối mật đối với sự phát triển các chủng
vi khuẩn trong thời gian 10 giờ
60
Hình 3.3 Kết quả khảo sát khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh

63

Hình 3.4 Kết quả khảo sát khả năng chịu được kháng sinh

66

Hình 3.5 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ phần trăm hình thành bào tử của các giống vi khuẩn
ở các mức nhiệt đợ khác nhau
69
Hình 3.6 Kết quả điện di các chủng vi khuẩn

69

Hình 3.7 Cây phát sinh lồi chủng C19

73

Hình 3.8 Cây phát sinh lồi của chủng C31

74

Hình 3.9 Cây phát sinh lồi chủng C43

75

Hình 3.10 Cây phát sinh lồi của chủng C47

76

Hình 3.11 Chế phẩm probiotic từ chủng vi khuẩn C43

82

Hình 3.12 Gà ni thí nghiệm với chế phẩm probiotic C43 ở giai đoạn 40 ngày tuổi
83
Hình 3. 13 Biểu đồ thể hiện tốc đợ tăng trọng trung bình của gà qua các lơ thí
nghiệm

viii

85


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1 Đặc điểm mợt số nhóm thuộc Lactobacillus .......................................... 15
Bảng 2.1 Thiết bị, máy được sử dụng trong nghiên cứu …………………………..25

Bảng 2.2 Thí nghiệm đánh giá mức độ hiệu quả các loại chế phẩm probiotic trên gà
nuôi công nghiệp .................................................................................. 37
Bảng 3.1 Tổng hợp các đặc điểm hình thái khuẩn lạc và đặc điểm tế bào của các
chủng vi khuẩn phân lập được

……………………………………...39

Bảng 3.2 Hình thái khuẩn lạc và đặc điểm nhuộm Gram của một số chủng vi khuẩn
phân lập từ ruột gà ................................................................................ 44
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát khả năng chịu được các nồng độ pH khác nhau của các
chủng vi khuẩn phân lập được ................................................................ 51
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khả năng chịu được các nồng độ muối mật khác nhau của
các chủng vi khuẩn phân lập được .......................................................... 56
Bảng 3.5 Kết quả kiểm nghiệm hoạt tính khảng khuẩn của của các chủng giống vi
khuẩn phân lập........................................................................................ 61
Bảng 3.6 Kết quả khảo sát khả năng chịu được kháng sinh của các chủng vi khuẩn
............................................................................................................... 64
Bảng 3.7 Kết quả khảo sát khả năng hình thành bào tử của các chủng vi khuẩn ở các
mức nhiệt khác nhau trong 12 giờ. .......................................................... 67
Bảng 3.8 Kết quả khảo sát khả năng bám dính của các chủng vi khuẩn trong mẫu
ruột gà tươi trong thời gian 2 giờ. ........................................................... 77
Bảng 3.9 Kết quả khảo sát khả năng chịu được enzyme tiêu hóa cảu các giống vi
khuẩn qua các mức thời gian khảo sát ..................................................... 79

ix


Bảng 3.10 Tăng tỉ trọng trung bình (gam) và hệ số chuyển đổi thức ăn của gà qua
các lơ thí nghiệm .................................................................................. 84
Bảng 3.11 Bảng số liệu kiểm nghiệm vi sinh vật gây bệnh trong phân gà qua các lơ

thí nghiệm ............................................................................................ 86

x


MỞ ĐẦU
1.

Đặt vấn đề

Dân số thế giới ngày một tăng cao, nhu cầu về nguồn thức ăn cũng sẽ tăng theo để
đáp ứng sự tồn tại và phát triển của con người. Cùng với sự bùng nổ dân số là sự bùng
phát dịch bệnh và sự lạm dụng chất hóa học, thuốc, kháng sinh, chất kích thích tăng
trưởng. Đó là những vấn gây áp lực lớn lên nền nông nghiệp nói chung và ngành chăn
ni nói riêng. Trong ngành chăn nuôi, việc phối trộn không đúng quy cách, không
đúng liều lượng thuốc, kháng sinh ngày càng nhiều sẽ dẫn đến mợt hậu quả vơ cùng
nghiêm trọng hơn là vơ tình làm tăng thêm hiện tượng kháng kháng sinh của các lồi
vi khuẩn gây bệnh đối với người và vật ni. Dẫn đến chất lượng sản phẩm không
tốt, gây ra nhiều hệ quả xấu đối với sức khỏe con người, vật nuôi và môi trường, làm
cho nền nông nghiệp phát triển không bền vững. Nhiều giải pháp đặt ra cho các nhà
khoa học, nhà quản lý và người chăn nuôi làm sao để vừa tạo ra sản lượng sản phẩm
chăn nuôi đủ lớn để đáp ứng nhu cầu xã hội vừa có có được chất lượng sản phẩm tốt,
an tồn và bền vững. Trong đó có việc áp dụng cơng nghệ sinh học để sản xuất các
loại chế phẩm sinh học như probiotic để bổ sung vào nguồn thức ăn vật nuôi giúp vật
nuôi khỏe mạnh, lớn nhanh, kháng được các loại bệnh và an tồn.
Trong chăn ni gà cơng nghiệp lấy thịt và lấy trứng, do điều kiện nuôi giới hạn, mất
tự do và ăn nguồn thức ăn tổng hợp sẵn chứa nhiều kháng sinh, chất tăng trưởng,
lượng đạm cao nhưng thời gian tiêu hóa lại ngắn dẫn đến hệ số tiêu hóa thức ăn thấp.
Gây lãng phí nguồn thức ăn, chất lượng sản phẩm khơng cao, mất an tồn và nguồn
chất thải lớn gây lên gánh nặng cho xã hợi và mơi trường.

Probiotic mang rất nhiều lợi ích khác nhau như hỗ trợ việc tiêu hóa thức ăn được tốt
hơn và giảm sự rối loạn trong hệ đường ruột, đẩy mạnh sự tổng hợp vitamin B, cải
thiện sự dung nạp lactose, cải thiện chức năng miễn dịch, ngăn chặn các chức viêm
nhiễm, ức chế các loại vi khuẩn gây hại trong ruột.

1


Hiện nay, trên thế giới và tại Việt Nam có rất nhiều công ty sản xuất các dạng chế
phẩm sinh học như probiotic để ứng dụng vào nhiều sản phẩm khác nhau từ các dạng
thực phẩm cho con người cho đến sản phẩm thức ăn chăn nuôi. Các chủng vi sinh vật
được sử dụng làm probiotic chủ yếu tḥc nhóm Bacillus sp., Lactobacillus sp.,
Bifidobacterium sp., Nitrosomonas sp., Nitrobacter sp.,…
Với điều kiện khí hậu nhiệt đới, nguồn đợng vật, thực vật và vi sinh vật vô cùng đa
dạng và phong phú như Việt Nam nên hệ vi sinh vật có đặc tính probiotic tốt cũng sẽ
rất đa dạng. Đặc biệt hệ vi sinh vật từ đường ruột của gà thả vườn tự nhiên tại các
vùng nông thôn rất đa dạng nhưng chưa được nghiên cứu ứng dụng nhiều trong
probiotic.
Vì vậy, để góp phần vào việc đánh giá, ứng dụng probiotic trong chăn nuôi gà công
nghiệp được hiệu quả, mang lại sự đa dạng trong hệ probiotic đặc trưng của Việt
Nam, chúng tôi chọn nghiên cứu đề tài: ”Tuyển chọn chủng vi khuẩn có đặc tính
probiotics từ ruột gà ni tự nhiên nhằm ứng dụng tạo chế phẩm bổ sung thức
ăn gà nuôi công nghiệp.”
2.

Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Mục tiêu chung
Tuyển chọn những chủng vi khuẩn probiotic có đặc tính từ hệ vi sinh vật đường ruột
của gà nuôi thả tự nhiên tại vùng nông thôn Việt Nam để hướng đến việc ứng dụng

tạo ra chế phẩm probiotic bổ sung trong thức ăn chăn nuôi gà công nghiệp.
2.2 Mục tiêu cụ thể
-

Phân lập và định danh được các chủng vi khuẩn có đặc tính probiotic trong

đường ṛt gà ni thả tự nhiên.
-

Tuyển chọn những chủng vi khuẩn có đặc tính probiotic vừa phân lập, định

danh được để có thể đáp ứng được với các yêu cầu về sản xuất chế phẩm và là một
hệ probiotic hiệu quả trong đường ruột của gà.

2


Ứng dụng các chủng vi sinh vật probiotic vừa tuyển chọn được để hướng đến sản
xuất chế phẩm probiotic nhằm bổ sung vào thức ăn chăn nuôi gà công nghiệp.
3

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1 Đối tượng nghiên cứu
Các chủng vi khuẩn có đặc tính probiotic trong hệ sinh vi vật đường ruột của gà nuôi
thả vườn tự nhiên tại vùng nơng thơn huyện Tây Sơn, tỉnh Bình Định.
3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: từ 11/2017 đến 6/2018
Địa điểm nghiên cứu: phịng thí nghiệm vi sinh, phịng thí nghiệm hóa sinh, phịng
thí nghiệm sinh học phân tử của Viện Sinh Học và Thực Phẩm, Trường Đại học Công

Nghiệp TP. HCM. Nhà F, số 12 Nguyễn Văn Bảo, Phường 4, Quận Gị Vấp, Tp. Hồ
Chí Minh.
Địa điểm thực nghiệm: xưởng sản xuất của Công ty Cổ Phần Kỹ Thuật Sao Mai. F6,
KP 4, Phường Tân Hiệp, Tp Biên Hoà, Đồng Nai.
4

Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu

Phân lập các chủng vi sinh vật có đặc tính probiotic từ ruột gà nuôi tự nhiên bằng
phương pháp cấy trải và cấy ria trên đĩa pertri.
Tuyển chọn, sàng lọc những chuẩn vi khuẩn có đặc tính probiotic mong muốn từ các
vi khuẩn đã phân lập, định danh được thông qua các đánh giá:
 Khả năng chịu pH acid dạ dày
 Khả năng chịu được muối mật
 Khả năng kháng các vi khuẩn có hại
 Khả năng thích nghi với kháng sinh, enzyme dạ dày và ruột
 Khả năng tạo bào tử

3


 Khả năng phát triển từ bào tử thành tế bào sinh dưỡng và bám dính trong đường
ṛt
-

Định danh các chủng vi khuẩn có đặc tính probiotic vừa tuyển chọn được bằng
phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA.

-

Tạo chế phẩm probiotic.

-

Kiểm nghiệm tính hiệu quả của chế phẩm probiotic trên đối tượng gà công
nghiệp.

5

Ý nghĩa của đề tài

5.1 Ý nghĩa khoa học
Góp phần định danh và tạo thêm nguồn vi khuẩn có đặc tính probiotic trong hệ vi
sinh vật của vật ni tại Việt Nam, từ đó đóng góp thêm vào ngân hàng giống vi sinh
vật đã và đang được nghiên cứu.
5.2 Ý nghĩa thực tiễn
Góp phần làm phong phú thêm nhiều chủng vi sinh vật có đặc tính probiotic có lợi
trong hệ vi sinh vật của vật ni. Từ đó có thêm nhiều sự lựa chọn chủng giống vi
khuẩn thích hợp cho sản xuất chế phẩm bổ sung vào thức ăn chăn ni, giúp góp phần
cải thiện chất lượng chăn nuôi hiện nay.

4


TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Probiotic
Định nghĩa ‘’Probiotic’’
Các chủng vi khuẩn probiotic đã đươc con người sử dụng từ hàng ngàn năm trước từ
các sản phẩm muối chua, lên men tuy nhiên mãi cho đến đầu thế kỷ 20 con người
mới bắt đầu nghiên cứu về chúng. Năm 1907 Metchnikoff là người đầu tiên đề nghị

sử dụng chủng vi khuẩn Lactobacillus để bổ sung vào hệ vi sinh vật đường ruột nhằm
hạn chế đợc tố do những vi khuẩn có hại gây ra và kéo dài tuổi thọ của người sử dụng
[1].
Năm 1965 Lilly và Stiwell đã mô tả thuật ngữ “probiotic” là những chất sản sinh bởi
vi sinh vật làm tăng trưởng một vi sinh vật hoặc sinh vật khác[1]. Năm 1989, Fuller
đã khái niệm lại probiotic như sau: “Probiotic là mợt loại thức ăn bổ sung vi sinh vật
sống, có tác đợng có lợi đến vật chủ nhờ khả năng duy trì sự cân bằng hệ vi sinh vật
đường ṛt” [2].
Năm 2001, Schrezenmeir và De Vrese định nghĩa: “Probiotic là lượng vi sinh vật
sống xác định với số lượng thích hợp được chuẩn bị trong các sản phẩm, có tác
dụng biến đổi tích cực hệ vi sinh vật đường ṛt và ảnh hưởng tốt đến sức khỏe vật
chủ” [3].
Năm 2002 FAO và WHO đã định nghĩa lại: “Probiotic, đó là những vi sinh vật sống
được kiểm soát chặt chẽ, với lượng thích hợp mang lại lợi ích cho vật chủ” [4]. Đây
là định nghĩa được chấp nhận nhiều hơn cả.
Đặc điểm chung của các chủng vi sinh vật probiotic
Vi sinh vật probiotic là những chủng vi khuẩn, nấm mốc, nấm men đơn bào không
sinh độc tố với vật chủ, mang lại những tác dụng lợi ích cho vật chủ và đáp ứng các
điều kiền sau:

5




Khả năng chịu được muối mật

Muối mật gồm natri glycocholate và natri taurocholate tiết ra từ túi mật. Trong ruột
non, muối mật ngồi chức năng hỗ trợ tiêu hóa cịn có chức năng kháng khuẩn, bảo
vệ ṛt non khỏi sự xâm nhiễm của các vi khuẩn có hại. Vì vậy các chủng vi sinh vật

probiotic khi vào ruột non sẽ chịu ảnh hưởng trực tiếp từ muối mật, khả năng sống
sót và phát triển tốt trong điều kiện có muối mật là điều kiện để lựa chọn các chủng
vi sinh vật probiotic [5].


Khả năng chịu pH acid dạ dày

Trong dạ dày khoảng hoạt động của pH rất thấp (từ 1.5 – 3), q trình tiêu hóa trong
dạ dày và ṛt non kéo dài từ 90 phút đến 180 phút. Do đó, khả năng thích ứng với
pH dạ dày và phát triển bám dính vào thành ṛt tốt trong khoảng thời gian thức ăn
được tiêu hóa là mợt yếu đó quang trọng để chọn lọc các chủng probiotic [6].


Khả năng kháng các loại vi sinh vật gây bệnh

Việc lựa chọn các chủng probiotic có khả năng ức chế, kháng lại các vi sinh vật gây
bệnh trong đường ruột cũng là một tiêu chí quan trọng để ứng dụng bổ sung probiotic
vào đường ruột vật chủ nhằm giúp vật chủ khỏe mạnh và ứng dụng sản xuất các loại
bacteriocin khác. Các loại vi khuẩn kiểm nghiệm thường được sử dụng như: E.coli,
Salmonella, Staphylococcus, Campylobacteria…
Cơ chế kháng khuẩn của các loại probiotic theo nhiều kiểu khác nhau như:
-

Sản sinh chất ức chế bacteriocin

-

Làm giảm pH

-

Cạnh tranh chất dinh dưỡng

-

Tạo ra H2O2

-

Làm giảm độc tố của các loại vi khuẩn gây bệnh

-

Làm giảm khả năng bám dinh của vi khuân gây bệnh

6




Khả năng bám dính vào tế bào biểu mơ ṛt [7]

Các chủng vi sinh vật chỉ phát triển tốt và có hiệu quả trong đường ṛt khi khả năng
bám dính của chúng trên thành ṛt tốt. Thời gian tiêu hóa thức ăn từ dạ dày cho đến
khi bài tiết ra ngồi theo phân là rất nhanh [5], do đó các chủng vi sinh vật probiotic
phải có khả năng sinh trưởng và phát triển nhanh trong khoảng thời gian tiêu hóa thức
ăn để có thể bám dính lại thành ṛt mà khơng bị trơi ra ngồi [6, 7].
Khi các vi sinh vật probiotic cư trú và bám dính tốt trên các vị trí niêm mạc ṛt sẽ
cạnh tranh vị trí các vi sinh vật khác, lúc này các vi sinh vật khác có thể dễ dàng bị
đào thải ra ngồi. Chủng Carnobacterium K1 đã được nghiên cứu khả năng bám dính

trên bề mặt ruột làm cho chủng này cạnh tranh vượt trội và ngăn cản được sự lan rộng
của các vi khuẩn gây bệnh ở cá như Vibrio anguillarum và Aeromonas hydrophila
[8].


Khả năng thích nghi với mợt số loại kháng sinh thông dụng

Trong phần lớn các loại thức ăn công nghiệp hiện nay đều có bổ sung mợt lượng
kháng sinh nhất định nhằm nâng cao hiệu quả sức khỏe vật nuôi, giúp vật nuôi chống
chịu lại các điều kiện biến đổi môi trường và sự xâm nhiễm của vi sinh vật gây hại.
Tuy nhiên, kháng sinh thường khơng có tính chọn lọc cao, ngoài tác dụng ức chế các
loại vi sinh vật gây bệnh thì nó cịn ức chế ln các loại vi sinh vật có lợi trong đường
ṛt. Dẫn đến mất cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, gây rối loạn tiêu hóa, tiêu
chảy…
Cơ chế tác dụng của kháng sinh lên tế bào vi sinh vật: i) ức chế quá trình sinh tổng
hợp vách tế bào vi khuẩn, khi đó tế bào dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp
suất thẩm thấu. ii) ức chế chức năng của màng tế bào làm cho các phẩn tử có khối
lượng lớn như protein và các ion thốt ra ngồi. iii) ức chế q trình sinh tổng hợp
protein. vi) ức chế quá trình sinh tổng hợp acid nucleic [9].
Vì vậy, các chủng dùng làm probiotic cần phải có khả năng chịu được một số loại
kháng sinh phổ biến trong chăn nuôi ở những nồng độ nhất định và khơng có khả

7


năng chuyển gen đề kháng kháng sinh sang những vi khuẩn khác trong đường tiêu
hóa, đặc biệt là những vi khuẩn gây bệnh [10].
 Yêu cầu của một chủng vi khuẩn probiotic cần đạt được là [11, 12].
-

An toàn đối với người và vật nuôi, không gây bệnh và không tạo đợc tố.

-

Có khả năng sống sót trong đường ṛt của vật chủ ở những điều kiện pH thấp
và nồng đợ muối mật.

-

Có khả năng bám dính vào tế bào biểu mô ruột cạnh tranh về nơi trú ngụ với vi
sinh vật gây bệnh.

-

Có khả năng ức chế các vi sinh vật gây bệnh giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường
ṛt.

-

Nhờ có khả năng sinh enzyme ngoại bào nên giúp cho q trình tiêu hóa diễn ra
tốt hơn.

-

Có khả năng tăng cường đáp ứng miễn dịch và tăng sức đề kháng của vật chủ.

-

Có khả năng giữ được đặc tính ổn định trong thời gian dài ở điều kiện thường.

-

Đảm bảo đủ số lượng để giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột và cạnh tranh
lại các vi sinh vật gậy bệnh khác trong đường ruột.

-

Phù hợp với nhiều u cầu sản x́t khác nhau, quy trình ni cấy và sản xuất
đơn giản, chi phí thấp, dễ sử dụng.
Vai trò và cơ chế tác dụng của các chủng vi sinh vật probiotic đối với vật

chủ
Vai trò của các chủng probiotic đối với vật chủ
Trong hệ vi sinh vật đường ruột của người, gia súc, gia cầm các chủng vi sinh vật
probiotic có những tác dụng tích cực như:

8


-

Giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, tăng cường khả năng tiêu hóa các loại

thức ăn, đặc biệt là các loại thức ăn khó tiêu hóa. Tăng cường sinh tổng hợp các nhóm
vitamin đặc biệt là vitamin B, tăng khả năng hấp thu khoáng, giảm lượng cholesterol
trong huyết thanh [13].
-

Ức chế và tiêu diệt các chủng vi khuẩn gây bệnh nhờ các cơ chế kháng khuẩn của

mình, từ đó giúp tăng sức đề kháng và chống chịu lại các điều kiện biến đổi của môi
trường.
-

Tăng năng suất và chất lượng thịt cũng như các sản phẩm khác như trứng, sữa,

lông… Do không cần sử dụng nhiều các loại kháng sinh, chất kích thích tăng trưởng
nên sản phẩm từ vật ni sẽ an tồn và thân thiện hơn.
-

Góp phần cải thiện chất lượng nước, chống ô nhiễm môi trường nước, tăng

cường khả năng phân hủy các chất hữu cơ, giảm nồng đợ N và P, kích thích sinh
trưởng của tảo, giảm nguy cơ mắc bệnh và tăng năng suất tơm, cá và các lồi thủy
sản khác. Đối với chuồng trại chăn nuôi sẽ giảm được mùi thôi thúi do chất thải vật
nuôi sinh ra.
-

Giảm các triệu chứng viêm nhiễm do vi sinh vật hay do vết thương cơ học gây ra

đối với vật nuôi [13].
Cơ chế tác dụng của các vi sinh vật probiotic đối với vật chủ
Cơ chế tác dụng của hệ vi sinh vật probiotic đối với vật chủ vẫn đang là chủ đề được
rất nhiều nhà khoa học quan tâm tìm lời giải. có rất nhiều giải thích liên quan đến cơ
chế tác dụng tuy nhiên vẫn còn nhiều ý kiến khác nhau, nhưng phần lớn điều tập trung
giải thích cho 3 khía cạnh sau: (i) cạnh tranh loại trừ, (ii) đối kháng vi khuẩn, (iii)
điều chỉnh miễn dịch [14].
Cạnh tranh loại trừ là đặc điểm sinh tồn của vi sinh vật. chúng cạnh tranh qua nhiều
hình thức khác nhau như cạnh tranh vị trí bám dịnh, cạnh tranh nguồn dinh dưỡng
thiết yếu… Các chủng vi sinh vật probiotic bám dính trên thành ṛt và phát triển liên

tục khóa chặt các vị trí thụ cảm và ngăn chặn sự bám dính của vi sinh vật có hại như

9


E. coli, Salmonella… Khơng chỉ cạnh tranh bám dính, chúng cịn có khả năng gắn
kết các vi khuẩn có roi (đa số tḥc nhóm vi khuẩn gây bệnh) thơng qua cơ quan thụ
cảm mannose và đẩy các vi sinh vật gây hại này ra khỏi thành ruột [15].
Cạnh tranh loại trừ và đối kháng vi khuẩn của các chủng probiotic cịn được thể hiện
thơng qua cơ chế sản sinh chất ức chế bacteriocin như lactoferrin, lysozyme,
hydrogen peroxide và các acid hữu cơ khác để làm giảm pH môi trường gây ức chế
hoặc tiêu diệt vi sinh vật có hại [1].
Các vi khuẩn probiotic như Lactobacilli và Bifidobacteria có tác đợng đến cơ chế
miễn dịch từng phần và miễn dịch toàn thân. Điều hòa hệ thống miễn dịch bằng cách
tăng cường tiết ra các IgA, IgM và các immunoglobulin khác [16-18]. sIgA,
immunoglobulin đóng vai trị quan trọng ở bề mặt niêm mạc, cung cấp bảo vệ chống
lại các kháng nguyên, các mầm bệnh tiềm ẩn, độc tố và yếu tố độc lực [19], kích hoạt
sản xuất các đại thực bào và tăng cường sự hình thành phagocytosis [20].
Mợt số vi khuẩn probiotic có vai trị trong sự bài tiết cytokine pro và kháng viêm [18].
Làm giảm lượng antitrypsin, protein tiết niệu eosinophil X, yếu tố hoại tử khối u
(TNF) –α, các phản ứng viêm [21].
Một số vi khuẩn Bifidobacteria và Lactobacilli có thể tăng cường sản xuất tế bào Thelper cân bằng đáp ứng và kích thích sản xuất interleukin (IL) -10, và TGF-β [22,
23] cả hai trong đó có vai trò trong việc phát triển khả năng miễn nhiễm với kháng
nguyên và có thể giảm dị ứng miễn dịch.
Ảnh hưởng đối với miễn dịch bẩm sinh [24]


Cạnh tranh và ức chế sự phát triển của các mầm bệnh tiềm ẩn



Tăng cường sản xuất muxin



Giảm thấm thấu



Tăng cường hoạt động của các tế bào giết người tự nhiên, kích thích đại thực bào,

và bệnh thực bào

10


Ảnh hưởng đối với miễn dịch thích ứng [24]


Tăng IgA tồn bợ và đặc hiệu trong huyết thanh và đường ruột



Tăng các tế bào tiết IgA, IgG, và IgM



Điều chế phản ứng miễn dịch ṛt viêm
Tình hình ngun cứu và ứng dụng của probiotic trên thế giới và Việt

Nam
Thế giới
Từ lâu, con người đã biết sử dụng các chủng vi khuẩn probiotic trong các loại thực
phẩm như lên men, muối chua, rượu bia.. nhưng mãi đến đầu những năm 80 của thế
kỷ 20 chúng ta mới biết đến công dụng thực sự của chúng trong đường ruột và ứng
dụng bổ sung vào các loại thực phẩm khác nhau. Các nguyên cứu phân lập những
chủng vi sinh vật đường ruột của người và động vật bắt đầu được chú trọng.
Năm 1940, Yokohamo đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Kumura từ B. subtilis để
ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm mốc Asp. flavus, Asp.
paraciticus. Nghiên cứu này được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ sản xuất thức
ăn chăn nuôi [25]. Tại Nhật Bản, với chế phẩm probiotic có tên gọi là EM. (Effective
Microorganisms) trong đó có Bacillus, do TeRuo Higa (Trường Đại học Ryukyus,
Okinawa, Nhật Bản) nghiên cứu năm 1980 [25].
Savage, 1987; Vahjen và cộng sự, 1998; Wielen và cộng sự, 2000 đã nghiên cứu cho
thấy trong ruột non của người quần thể vi khuẩn Bacteroides và Bifidobacterium
chiếm ưu thế thì trong ṛt non của gà nhóm vi khuẩn Ruminocoscus và Steptococcus
chiếm phần lớn. Bằng kỹ thuật phân tử người ta đã xác định được có từ 20 đến 50%
số lồi vi khuẩn đường ṛt là probiotic [13]. Các nghiên cứu khác về vai trò của
probiotic đối với vật chủ, tác động đến hệ thống miễn dịch, tác dụng đến thành niêm
mạc ruột, thay đổi niêm mạc ở cả người và vật nuôi.

11


Trong những năm gần đây, nhờ tiến bộ của công nghệ sinh học, đặc biệt trong lĩnh
vực sinh học phân tử và giải trình tự gen chúng ta đã phân loại và định danh được rất
nhiều chủng vi khuẩn có đặc tính probiotic khác nhau. Ứng dụng để sản xuất các sản
phẩm probiotic phục vụ cho con người và chăn ni. Tuy nhiên cũng có các nghiên
cứu giải thích rằng trong một số trường hợp việc ứng dụng bổ sung probiotic trên vật
nuôi không mang lại hiệu quả. Breton và cợng sự, 1998 đã giải thích về việc sử dụng

chủng vi khuẩn Lactobacillus bổ sung thức ăn của lợn cái và lợn đực thiến trong giai
đoạn vỗ béo khơng có biểu hiện tích cực [26]. Navas-Sanchez, 1995 cho rằng đối với
lợn con sau khi cai sữa không nên sử dụng chế phẩm có bổ sung probiotic [27],
Galassi và cợng sự, 2001chứng minh được rằng không thấy sự khác biệt về tỉ lệ hiệu
quả tiêu hóa và sử dụng năng lượng của các nhóm vật ni sử dụng probiotic và
khơng sử dụng probiotic [28].
Việt Nam
Tại Việt Nam, probiotic được nghiên cứu để ứng dụng trong sản xuất chỉ mới vài năm
trở lại đây.
Năm 1995, Đào Trọng Đạt và Vũ Đình Hưng sử dụng yaourt và canh trùng của
Bacillus subtillis dùng để phòng và trị bệnh phân trắng ở heo con [29].
Năm 2003, Phạm Ngọc Lân và các cộng sự đã phân lập được 2 chủng Lactobacillus
agillus và Lactobacillus salivarius từ ruột gà để ứng dụng sản xuất probiotic dùng
trong chăn nuôi. Cũng trong năm này, Nguyễn La Anh và các cộng sự đã phân lập
được chủng vi khuẩn lactic BC 5.1 từ bắp cải chua và ứng dụng trong chế biến thực
phẩm Biochie giúp của thiện môi trường nuôi tôm, cá.
Năm 2012, Trần Thị Bích Qun và cợng sự đã phân lập được chủng vi khuẩn B.
amyloliquefaciens Q22 từ phân heo để ứng dụng sản xuất chế phẩm probiotic bổ sung
thức ăn chăn nuôi heo.

12