Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trang 1

MỞ ĐẦU
Là nước xuất khẩu gạo lớn thứ 2 thế giới, Việt Nam không chỉ quan tâm đến việc
tăng năng suất cây lúa, mà còn phải nghiên cứu phát triển những giống lúa có phẩm chất
tốt để cạnh tranh giữ vững vị thế của mình và tăng giá trị hạt gạo Việt Nam, đưa hạt gạo
Việt Nam xâm nhập sâu vào các thị trường khó tính, mang lại lợi ích kinh tế cho người
nơng dân.
Thị yếu người tiêu dùng luôn luôn quan tâm đến phẩm chất của cơm, đây là một
chỉ tiêu quan trọng nó khơng chỉ phụ thuộc vào hàm lượng amylose, độ bền gel mà còn
phụ thuộc rất nhiều vào độ trở hồ của hạt gạo.
Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, sinh học phân tử đã đóng góp
rất lớn vào việc tạo và chọn những giống lúa mới có năng suất cao, phẩm chất tốt, phù
hợp với điều kiện tự nhiên của từng địa phương. Ứng dụng marker phân tử trong chọn
giống giúp chúng ta lựa chọn một cách nhanh chóng, chính xác đặt tính của giống mà
khơng bị chi phối bởi ảnh hưởng của môi trường. Với những ưu điểm vượt trội so với
marker hình thái và isozyme markers về số lượng, thời gian thí nghiêm, độ tin cậy, đơn
giản… marker phân tử đã và đang được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong việc chọn
giống tốt phục vụ cho ngành nông nghiệp.
Đề tài: “Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa.” để phục
vụ cho việc nghiên cứu chọn giống lúa có phẩm chất tốt.
MỤC TIÊU VÀ GIỚI HẠN ĐỀ TÀI
Mục tiêu đề tài
- Phân tích độ trở hồ trên các nhóm lúa khác nhau bằng kiểu hình thơng qua phân
tích sinh hóa.
- Phân tích độ trở hồ trên các nhóm lúa khác nhau bằng kiểu gen thông qua marker
phân tử SSR.
- Kết hợp kiểu gen và kiểu hình trong chọn giống.

Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trang 2

Giới hạn của đề tài
Đề tài này được tiến hành chỉ tập trung phân tích đối tượng là những giống lúa mới
của Viện lúa Đông Bằng Sông Cửu Long

Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trang 3
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về cây lúa
Lúa (Oryza spp.) là một trong năm loại cây lương thực chính của thế giới, cùng với
ngơ (Zea Mays L.), lúa mì (Triticum sp. tên khác: tiểu mạch), sắn (Manihot esculenta
Crantz, tên khác khoai mì) và khoai tây (Solanum tuberosum L.).
Người ta cho rằng tổ tiên của chi lúa
Oryza là một loài cây hoang dại trên siêu lục
địa Gondwana cách đây ít nhất 130 triệu năm
và phát tán rộng khắp các châu lục trong q
trình trơi dạt lục địa. Hiện nay có khoảng 21
lồi cây hoang dại thuộc chi này và 2 loài lúa
được đã thuần hoá là lúa châu Á (Oryza sativa)

và lúa châu Phi (Oryza glaberrima). Lúa có
nguồn gốc ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới
khu vực đông nam châu Á và châu Phi. Hai loài
này cung cấp hơn 1/5 toàn bộ lượng kalo tiêu
thụ bởi con người. Lúa là các loài thực vật sống
một năm, có thể cao tới 1-1,8 m, đơi khi cao
hơn, với các lá mỏng, hẹp bản (2-2,5 cm) và dài
50-100 cm. Các hoa nhỏ thụ phấn nhờ gió mọc
thành các cụm hoa phân nhánh cong hay rủ
xuống, dài 30-50 cm. Hạt là loại quả thóc (hạt
nhỏ, cứng của các loại cây ngũ cốc) dài 5-12
mm và dày 2-3 mm. Cây lúa non được gọi là

Hình 1.1 Cây lúa

mạ. Sau khi ngâm ủ, người ta có thể gieo thẳng các hạt thóc đã nảy mầm vào ruộng lúa đã
được cày, bừa kỹ hoặc qua giai đoạn gieo mạ trên ruộng riêng để cây lúa non có sức phát
triển tốt, sau một khoảng thời gian thì nhổ mạ để cấy trong ruộng lúa chính. Sản phẩm thu
được từ cây lúa là thóc. Sau khi xát bỏ lớp vỏ ngồi thu được sản phẩm chính là gạo và
các phụ phẩm là cám và trấu. Gạo là nguồn lương thực chủ yếu của hơn một nửa dân số
Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trang 4

thế giới, điều này làm cho nó trở thành loại lương thực được con người tiêu thụ nhiều
nhất. Trong tiếng Anh, từ rice (lúa, gạo) có nguồn
gốc từ arisi trong tiếng Tamil. [11]

Theo Vũ văn Hiển và Nguyễn Văn Hoan (1999)
thì dựa theo hệ thống phân loại học thực vật: cây
lúa được xem như tất cả các loại cây cỏ khác
trong tự nhiên. Nó được sắp xếp theo hệ thống
chung của phân loại học thực vật là nghành
(divisio), lớp (class), bộ (ordines), họ (familia),

Hình 1.2 Ruộng lúa

chi (genus), loài (species) và biến chủng
(varietas).
Nghành (Divisio):

Angiospermae – Thực vật có hoa.

Lớp ( Class):

Monocotylledones – Lớp một lá mầm.

Bộ (Ordine):

Poales (Graminales) – Hịa thảo có hoa.

Họ (Familia):

Poacae (Graminae) – Hòa thảo.

Họ phụ (Subfamilia): Poidae – Hòa thảo ưa nước.
Chi (Genus):

Oryza

Loài (Species):

Oryza sativa – Lúa trồng.

Loài phụ (Subspecies): Japonica – Loài phụ Nhật Bản.
India – Loài phụ Ấn Độ.
Javanica – Loài phụ Java.
Biến chủng (Varietas): Var. Mutica – Biến chủng hạt mỏ cong.
* Đặc điểm thực vật của cây lúa [10]
Các giống lúa khác nhau có những đặc điểm như chiều cao, thời gian sinh trưởng,
tính chịu mặn, chống chịu sâu bênh, hạn hán…là khác nhau. Song các giống lúa đều có

Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trang 5

đặc tính chung về hình thái, giải phẫu và đều có chung các bộ phận rễ, thân, lá, bông và
hạt
- Bộ rễ: là rễ chùm, những rễ non có màu trắng sữa, rễ trưởng thành có màu vàng
nâu và nâu đậm, những rễ già có màu đen. Thời kì mạ rễ thưa và có chièu dài khoảng 5-6
cm, sau đó bộ rễ tăng dần và đến thời kì trỗ bơng bộ rễ đạt tối đa có thể tới 500-800 cái.
- Thân lúa: thân gồm nhiều mắt và lóng, thời kì lúa trổ thân được bao bọc bởi bẹ lá.
Tổng số mắt trên thân bằng tổng số lá trên thân cơng thêm 2, chỉ vài lóng ở ngọn là dài ra
còn số còn lại là ngắn và đặc, lóng trên cùng dài nhất.
- Lá lúa: lá lúa điển hình gồm bẹ lá, phiến lá, lá thìa và tai lá. Lá được hình thành

từ các mầm lá ở thân. Tốc độ ra lá phụ thuộc vào thời gian sinh trưởng và điều kiện ngoại
cảnh. Số lá trên cây phụ thuộc chủ yếu vào giống, vụ, biện pháp bón phân, q trình chăm
sóc.
- Bơng: bao gồm bầu nhị, vỏ trầu và bao phấn. Lúa là cây tự thụ phấn, sau khi trỗ
một ngày thì quá trình tự thụ bắt đầu. Vỏ trấu vừa hé mở 0-4 phút thì bao phân vở ra, hạt
phấn rơi vào đầu nhụy và hợp nhất với nõn ở bên trong bầu nhụy để bầu nhụy phát triển
thành hạt. Thời gian thụ phấn từ lúc vỏ trấu mở ra đến lúc khép lại kéo dài 50-60 phút,
thời gian thụ tinh kéo dài 8 giờ sau khi thụ phấn. Sau khi thụ tinh phôi nhũ phát triển
nhanh thành hạt, khối lượng hạt tăng dần trong vòng 15-20 ngày sau khi trỗ, đồng thời
quá trình vận chuyễn và tích lũy vật chất, hạt lúa vào chắc và chín dần.
* Thời gian sinh trưởng, người ta chia cây lúa ra ba thời kỳ sinh trưởng (Hình 2.4). Trong
mỗi thời kỳ, nhu cầu thức ăn của cây luôn khác nhau. Dinh dưỡng thích hợp cho cây sẽ
giúp gia tăng năng suất của nó. Ba thời kỳ đó là:[4]
- Thời kỳ sinh trưởng sinh dưỡng: từ lúc nảy mầm đến khi cây lúa bắt đầu phân
hóa địng. Các giống lúa có thời gian sinh trưởng khác nhau là do sự dài ngắn khác nhau
của thời kỳ này quyết định. Trong thời kỳ này, cây lúa phát triển về thân lá, chiều cao và
nở bụi.
- Thời kỳ sinh trưởng sinh dục: từ lúc phân hóa địng đến khi lúa trổ bơng. Thời
gian này kéo dài khoảng 35 ngày, các giống khác nhau có thời gian này khơng khác nhau
Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trang 6

nhiều lắm. Trong thời gian này, chiều cao cây tăng lên rõ rệt do sự vươn dài của các lóng,
giảm số chồi vơ hiệu, xuất hiện lá địng (lá cuối cùng), địng lúa hình thành và phát triển
qua nhiều giai đoạn, cuối cùng thoát khỏi bẹ của lá cờ. Giai đoạn này quyết định trọng
lượng hạt rất lớn.

Hình1.3: Ba thời kỳ sinh trưởng của cây lúa

- Thời kỳ chín: từ lúc trổ hoa đến khi thu hoạch. Thời gian kéo dài khoảng 30 ngày
đối với hầu hết các giống. Giai đoạn này theo sau sự thụ tinh và trải qua các giai đoạn:
chín sữa, chín sáp và chín hồn tồn. Trong ba giai đoạn này, giai đoạn chín sữa rất quan
trọng, quyết định lớn đến trọng lượng hạt. Tinh bột được tích lũy vào hạt trong giai đoạn
này từ sự vận chuyển các chất dự trữ trong thân lá và sản phẩm quang hợp.
1.2. Tình hình sản xuất Lúa
1.2.1 Trên thế giới
Trên thế giới, cây lúa được 250 triệu nơng dân trồng, là lương thực chính của 1,3 tỉ
người nghèo nhất trên thế giới, là sinh kế chủ yếu của nông dân. Là nguồn cung cấp năng
lượng lớn nhất cho con người, bình quân 180 - 200 kg gạo/ người/ năm tại các nước Châu

Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trang 7

Á , khoảng 10 kg/người/năm tại các nước châu Mỹ. Châu Á là nơi sản xuất và cũng là nơi
tiêu thụ khoảng 90% lượng gạo toàn thế giới.
Ở Châu Phi, gần như toàn bộ 38 nước đều trồng lúa, song diện tích lúa ở
Madagascar và Nigeria chiếm 60 %, tổng diện tích lúa là 8,5 triệu hecta của châu lục này.
Năng suất lúa của Châu Phi thấp, khoảng 1,5 tấn/ha, hay bằng 40 % năng suất của Châu
Á.
Sản xuất gạo toàn cầu đã tăng lên đều đặn từ khoảng 200 triệu tấn vào năm 1960
tới 600 triệu tấn vào năm 2004. Gạo đã xay xát chiếm khoảng 68% trọng lượng thóc ban
đầu.

Các số liệu về xuất nhập khẩu gạo lại khác hẳn, do chỉ khoảng 5-6% gạo được
buôn bán ở quy mô quốc tế. Ba nhà xuất khẩu gạo hàng đầu thế giới là Thái Lan (26% sản
lượng gạo xuất khẩu), Việt Nam (15%) và Hoa Kỳ (11%), trong khi ba nhà nhập khẩu gạo
lớn nhất là Indonesia (14%), Bangladesh (4%) và Brasil (3%). Ngành sản xuất lúa gạo
nước ta trong những năm vừa qua đã có những bước chuyển tích cực. Nó đã thực sự giữ
vai trò quan trọng trong nền kinh tế đất nước. Hàng năm, ngành lúa gạo đã đóng góp từ
12 – 13% trong tổng GDP.
1.2.2. Tình hình sản xuất gạo ở Việt Nam
Ở Việt Nam, dân số trên 85 triệu và 100% người Việt Nam sử dụng lúa gạo làm
lương thực chính. Việt Nam có hai vùng trồng lúa chính là đồng bằng sơng Hồng ở phía
bắc và đồng bằng sơng Cửu Long ở miền Nam. Hàng năm sản lượng của cả nước đạt 3334 triệu tấn thóc, trong đó chỉ sử dụng khoảng 8 triệu tấn (tương đương 4 triệu tấn gạo sau
khi xay xát) cho xuất khẩu, còn lại là tiêu thụ trong nước và bổ sung dự trữ quốc gia.[15]
Việt Nam là nước xuất khẩu gạo lớn thứ 2 thế giới chỉ sau Thái Lan, diện tích
trồng lúa nước ta xếp vào hàng thứ 7 song xếp thứ 4 về năng suất. Năng suất lúa của nước
ta ở năm 2004 đứng đầu trong các nước Đông Nam Á và đã đạt bình quân là 48,2 tạ/ha.
Theo số liệu của Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông Thôn, thành tựu sản xuất lúa
gạo của nước ta là rất to lớn và vững chắc. Nếu giai đoạn 1975-1980 sản lượng thóc nước
ta mới chỉ xung quanh 10-11 triệu tấn thì đến năm 1990 đã có dư 0,8 triệu tấn gạo với sản
Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trang 8

lượng thóc là 19,2 triệu tấn, năm 2000 sản lượng lúa đã tăng lên 32,5 triệu tấn, đưa nước
ta vào một trong năm nước có sản lượng thóc lớn nhất thế giới. Năm 2009 nước ta xuất
khẩu 6 triệu tấn gạo, dự kiến năm 2010 sẽ xuất khẩu trên 6 triệu tấn.
Giá xuất khẩu gạo của chúng ta đã không thua kém nhiều so với Thái Lan. Là mặt
hàng có giá trị xuất khẩu đứng thứ 5, lúa gạo đã đem về cho đất nước mỗi năm từ 600 –

800 triệu USD. Khơng những thế nó cịn có vai trị quan trọng trong việc đảm bảo an ninh
lương thực trên toàn thế giới. Đứng thứ 2 về xuất khẩu gạo, nước ta mỗi năm góp từ 13 –
17% lượng gạo xuất khẩu trên toàn thế giới.[10]
Theo báo cáo ban đầu của Bộ kế hoạch đầu tư mà Reuters có được về vụ mùa ở
nam Việt Nam cho biết sản lượng sẽ tăng do năng xuất tăng nhẹ, đạt 6,38 tấn/ha vào năm
2010, cao hơn năm 2009 0,02 tấn/ha. Đồng bằng sông Cửu Long sẽ sản xuất 54% sản
lượng lúa Việt Nam, nhưng sẽ cung cấp 90% lượng gạo xuất khẩu của Việt Nam [14]
1.3. Giá trị dinh dưỡng của hạt gạo
- Protein: Các giống lúa Việt Nam có hàm lượng Protein chủ yếu trong khoảng 78%. Các giống lúa Nếp có hàm lượng protein cao hơn lúa tẻ. Gạo giã càng trắng thì lượng
protein càng giảm
- Lipit: Chủ yếu ở lớp vỏ gạo. Nếu ở gạo xay là 2,02% thì ở gạo đã xát chỉ cịn
0,52%
- Vitamin: Trong lúa gạo cịn có một số vitamin nhất là vitamin nhóm B như B1,
B2, B6, PP... lượng vitamin B1 là 0,45 mg/100 hạt ( trong đó ở phơi 47%, vỏ cám 34,5%,
hạt gạo 3,8%). Chất béo trong gạo thấp, từ 1-1,5%. Gạo có ít Canxi, nhiều Phospho nên
gạo là thức ăn có tính acit. So với protein của trứng thì protein của gạo thiếu Lysin, vì vậy
khi dùng nên phối hợp gạo với thức ăn động vật và đậu đỗ.
Có khoảng 2 tỉ người ở Châu Á dùng gạo và các chế phẩm từ gạo để bổ sung 60 %
tới 70 % nguồn năng lượng hàng ngày cho cơ thể. Gạo là nguồn cung cấp năng lượng
chính trong bữa ăn hàng ngày của chúng ta, gạo là một nguồn cung cấp năng lượng cho
cơ thể. Trong gạo hàm lượng tinh bột 62,4%. Là nguồn chủ yếu cung cấp kalo. Giá trị
nhiệt lượng của lúa là 3594 kalo. Tinh bột được cấu tạo bởi amylose và amylopectin.
Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trang 9

Amylose có cấu tạo mạch thẳng và có nhiều ở gạo tẻ. Amylopectin có cấu tạo mạch

ngang và có nhiều ở gạo nếp.
Bảng 1.1. Giá trị dinh dưỡng của lúa tính theo % chất khơ so với một số cây lấy hạt khác
[4]

Tinh bột

Protein

Lipit

Cellulose

Tro

Nước

Lúa

62,4

7,9

2,2

9,9

5,7

11,9

Lúa mì

63,8

16,8

2,0

2,0

1,8

13,6

Ngơ

69,2

10,6

4,3

2,0

1,4

12,5

Cao lương

71,7

12,7

3,2

1,5

1,6

9,9

1.4. Phẩm chất hạt gạo
Chất lượng hạt gạo bao gồm: chất lượng xay chà, phẩm chất cơm và phẩm chất
dinh dưỡng. Quan tâm của người tiêu dùng chủ yếu là phẩm chất cơm sau khi nấu. Tức là,
sau khi nấu chín người ta chú trọng xem cơm có ngon khơng, mềm khơng, ăn có vừa khẩu
vị khơng…. Chất lượng hạt cơm bao gồm có: hàm lượng amylose, độ trở hồ, độ bền gel;
hàm lượng dinh dưỡng bao gồm: protein, vitamin, khoáng vi lượng….

Hình 1.4 Hạt gạo

Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trang 10

Các đặc tính phẩm chất hạt do yếu tố di truyền và môi trường quyết định, tùy theo
tính trạng, sự thể hiện có thể do yếu tố di truyền, yếu tố kỹ thuật trước và sau khi thu

hoạch hay do tương tác kiểu gen và môi trường quyết định. Điều khó khăn cho phân tích
là phần lớn những tính trạng phẩm chất hạt có tương tác kiểu gen và mơi trường khơng
tuyến tính, khó giải thích trong những phân tích đơn giản (Bùi Chí Bửu, 1996). Chiều dài
hạt gạo là tính trạng ổn định nhất, ít bị ảnh hưởng bởi môi trường, được điều khiển bởi đa
gen (Somrith, 1974). Thứ tự tính trội được ghi nhận như sau: hạt dài > hạt trung bình >
hạt ngắn > hạt rất ngắn. Thị hiếu người tiêu dùng về dạng hạt rất thay đổi, có nơi thích
dạng hạt trịn, có nơi thích dạng hạt gạo dài trung bình, nhưng dạng hạt gạo thon dài là
được tiêu thụ nhiều nhất trên thị trường quốc tế (Khush và ctv, 1979).
1.5. Độ trở hồ
Độ trở hồ (GT) là tính chất vật lý thể hiện sự biến đổi của tinh bột từ trạng thái này
sang trạng thái khác và khơng hồn ngun khi nhiệt độ tăng ở ngưỡng xác định. Mức độ
của độ trở hồ từ 55 – 790C lúc ấy gạo biến thành cơm và khơng hồn ngun. Theo T.S.
Ngũn Cơng Thành, Trung tâm CG TBKT, Viê ̣n Lúa ĐBSCL thì GT trung bình là điều
kiện tối hảo cho chất lượng gạo tốt [14]. GT thường liên quan tới tỉ lệ gạo lứt nhiều hơn.
GT được kiểm soát bởi đơn gen, nhưng một vài tác giả đã cơng bố nó được kiểm soát bởi
đa gen.
Cấu trúc hạt tinh bột là do sự sắp xếp khơng gian của sợi amylose và amylopectin
hình thành. Khi có tác động của nhiệt độ hoạt hóa chất thì cấu trúc này bị phá vỡ và làm
biến dạng hạt tinh bột, quá trình này được gọi là sự hồ hóa (gelatinization), nhiệt cần thiết
cho q trình này gọi là nhiệt độ trở hồ (genlatinization temperature_GT). Nhiệt trở hồ là
nhiệt độ nấu mà khi lên đến đó nước được hấp thụ và hạt tinh bột phồng lên khơng hồn
ngun, đồng thời dạng tinh thể biến mất. Nhiệt trở hồ thường từ 55-790C được chia
thành 3 nhóm chính sau:
Thấp

dưới 700C

Trung bình

70-740C

Cao

trên 740C

Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trang 11

Đặc tính vật lý của cơm liên quan nhiều đến nhiệt độ trở hồ hơn là hàm lượng
amylose của tinh bột. Gạo có nhiệt độ trở hồ càng cao càng ít nở, cần nhiều nước và thời
gian nấu chín hơn do vậy nó làm cho hạt cơm đổ lơng khi nấu, đồng thời nó cịn phản ảnh
độ cứng của tinh bột và phơi, vì thế ảnh hưởng đến sự tấn công của côn trùng, nấm và vi
khuẩn trên lúa ở ngoài đồng cũng như khi tồn trữ trong điều kiện ẩm ướt. Có một số bằng
chứng cho thấy GT cao ít bị thiệt hại hơn so với gạo có GT thấp. Nhiệt độ khơng khí cao
sau khi trổ làm tăng GT (làm giảm phẩm chất hạt) và ngược lại.
Nhiệt độ trở hồ liên quan một phần đến hàm lượng amylose của tinh bột, là yếu tố
quyết định phẩm chất gạo khi nấu. Trong một số trường hợp, các nhà chọn tạo giống có
thể dựa vào cách thử nhiệt độ trở hồ đơn giản để ước lượng hàm lượng amylose. Việc
chọn giống căn cứ trên tiêu chuẩn hàm lượng amylose là chính, thị hiếu của người tiêu
dùng có thể quyết định tiêu chuẩn chọn giống có hàm lượng amylose cao hay thấp, hàm
lượng amylose ảnh hưởng đến độ mềm, độ bóng và màu sắc của hạt cơm. Theo tiêu chuẩn
của hệ thống đánh giá của viện lúa quốc tế - IRRI (1996) thì hàm lượng amylose trong
gạo được xếp thành 4 nhóm sau:
0-2%

rất thấp (nếp)

2-20%

thấp (gạo dẻo)

20-25%

trung bình (mềm cơm)

Trên 25%

cao (cứng cơm)

Gạo có hàm lượng amylose thấp thường ít hút nước, ít trương nở trong lúc nấu và
cơm có độ bóng cao.
Việc xác định hàm lượng amylose địi hỏi thiết bị phức tạp và khó thực hiện. Trong
khi xác đinh nhiệt độ trở hồ thì đơn giản và nhanh chóng nên ta có thể áp dụng tính chất
này để ước lượng nhanh về hàm lượng amylose của giống lúa. Tuy nhiên sự ước lượng
này chỉ có thể sử dụng cho giống lúa có hàm lượng amylose thấp vì nó liên hệ rõ rệt đến
nhiệt độ trở hồ cao, cịn việc chọn giống có hàm lượng amylose trung bình và cao địi hỏi
nhà chọn giống phải phân tích chỉ tiêu hàm lượng amylose.

Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trang 12

Dưới đây là kết quả đã ghi nhận được mối liên hiện giữa độ trở hồ và hàm lương

amylose
Bảng 1.2 Nhiệt độ trở hồ và hàm lượng amylose của một số giống lúa

Nhiệt độ trở hồ

Lượng amylose

Ví dụ

Cao

Thấp

Century Patna 231

Trung bình

Trung bình

CICA 4

Trung bình

Cao

Peta, IR5

Thấp

Thấp

Japonica

Thấp

Trung bình

nhiều dòng lai

Thấp

Cao

IR8

Và vẫn chưa ghi nhận được hoặc rất hiếm xuất hiện tổ hợp của hàm lượng amylose
với các phẩm chất khác của gạo (hàm lượng amylose và độ bền gel) sau khi điều tra 245
giống lúa của 27 quốc gia:
- Độ trở hồ cao (hoặc trung bình) và amylose cao.
- Độ trở hồ cao (trung bình) và gel trung bình (cứng).
- Độ trở hồ trung bình và amylose rất thấp (nếp): rất hiếm xuất hiện
Độ trở hồ được đánh giá qua độ lan rộng và trong suốt của hạt gạo khi xử lý bằng
KOH 1,7% ở 300C trong 23 giờ. Gạo có nhiệt độ trở hồ thấp sẽ hịa tan hồn tồn và trong
suốt, loại có nhiệt độ trở hồ trung bình sẽ rã một phần, cịn loại có nhiệt độ trở hồ cao hầu
như không phản ứng với kiềm.
Theo tiêu chuẩn đánh giá của Viện Lúa Đồng Bằng Sơng Cửu Long thì độ trở hồ
biến thiên từ cấp 1 đến cấp 9 như sau:
- Cấp 1 hạt gạo còn nguyên
- Cấp 2 hạt gạo phồng lên
- Cấp 3 hạt gạo phồng lên, viền cịn ngun, ít nở

- Cấp 4 hạt gạo phồng lên, viền còn nguyên, nở rộng
- Cấp 5 hạt gạo nứt hoặc rã, viền hoàn toàn nở rộng
Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trang 13

- Cấp 6 hạt gạo rã hịa với viền, tâm đục
-Cấp 7 hạt gạo rã hồn tồn và hịa lẫn với viền trong suốt, tâm đục và mờ
- Cấp 8 hạt gạo tan hoàn toàn, tâm mờ, viền trong suốt, nở rộng
- Cấp 9 hạt gạo tan hồn tồn, trong suốt, khơng phân biệt được viền
Bảng 1.2: Bảng phân cấp đánh giá nhiệt độ trở hồ

Cấp

Phản ứng vơi alkali

Nhiệt độ trở hồ

1

GT cao

lớn hơn 790C

2-3

GT cao

75-790C

4-5

GT trung bình

70-740C

6-7

GT thấp

55-690C

8-9

GT rất thấp

Nhỏ hơn 550C

Theo IRRI (1996) thì độ trở hồ của gạo biến thiên từ cấp 1 đến cấp 7.
Bảng 1.3: Bảng biến thiên độ trở hồ của gạo theo tiêu chuẩn đánh giá của IRRI

Cấp

Mức độ

Phản ứng của gạo

1

Cao

hạt gạo còn nguyên

2

Cao

hạt gạo phồng lên

3

Cao

hạt gạo phồng lên, viền cịn ngun, nở ít

4

trung bình

hạt gạo phồng lên, viền cịn ngun, nở rộng

5

trung bình

hạt gạo rã ra, viền hòa tan, nở rộng

6

thấp

hạt gạo rã ra hòa chung với viền

7

thấp

hạt gạo tan hoàn toàn và quyện vào nhau

Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trang 14

Hình 1.5 Độ trở hồ cấp 2

Hình 1.6 Độ trở hồ cấp 3

Hình 1.7 Độ trở hồ cấp 4

Hình 1.8 Độ trở hồ cấp 5

Hình 1.9 Độ trở hồ cấp 6

Hình 1.10 Độ trở hồ cấp 7

* Một số nghiên cứu về di truyền của GT:
Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trang 15

Các kết quả nghiên cứu về di truyền của GT cho thấy rằng GT được điều khiển bởi
một gen (IRRI, 1976; Choi và ctv, 1980; Mckenjie và Rutger, 1983). GT do một gen
chính và vài gen sửa đổi (modifiers) điều khiển (Kahlon, 1964; Heu và Choe, 1973; Hue
và Park, 1979; Mckenjie và Rutger, 1983). Stansel (1965), Choi và ctv (1980), Chen và
ctv (1992) đã kết luận có hai gen điều khiển tính trạng này. Tuy nhiên, vai trò đa gen cũng
được đề cặp đến (Heda và Reddy, 1986). GT cao trội khơng hồn tồn so với GT thấp
(Ghosh và Govindaswamy, 1972; IRRI, 1976). GT cao trội hoàn toàn so với GT thấp
(Heu và Choe, 1973; Heu và Park, 1979; Choi và ctv, 1980; Chen và ctv, 1992). GT cao
lặn so vời GT thấp (Choi và ctv, 1980). GT do một dãy alen cùng một locus, cộng với vài
gen sửa đổi, alen trội Alk quyết định tạo thành GT cao, alen alka lặn so với Alk quyết
định hình thành kiểu GT trung bình, alen alkb lặn so với Alk và alkb tạo kiểu GT thấp (Lê
Cẩm Loan và Gurdev S. Khush, 1993). Sự khác biệt giữa hai giống có GT trung bình và
cao do sự điều khiển của một gen chủ lực, cộng với một vài gen phụ có tính chất biến đổi
(modifiers) (Kahlon, 1965). Khi lai giữa hai giống GT cao x GT trung bình, con lai chỉ có
hai dạng hình giống như bố mẹ, nhưng khi lai GT cao x GT thấp, con lai phân ly cả 3
dạng hình, nhưng dạng GT trung bình rất ít, thậm chí khơng có trong các dịng lai đã ổn
định (Stansel, 1966). Tính trội của GT cao rất phổ biến ở quần thể F2 (Somrith, 1974).
Người ta cũng tìm thấy ảnh hưởng gen cộng tính trong hai cặp lai với mức độ tương tác
gây phức tạp thêm trong phân tích (Somrith, 1974). Tính trạng GT cao, trung bình, thấp
được điều khiển bởi đa alen tại một locus, với các gen phụ (modifiers). GT cịn là tính
trạng rất dễ thay đổi bởi môi trường, đặc biệt là sự thay đổi nhiệt độ khi lúa trổ đến vào

chắc hạt (Heu và ctv, 1976). Gen trội alk điều khiển tính trạng GT cao, thể hiện tính trội
hơn alka (điều khiển GT trung bình), cũng như gen alkb (điều khiển GT thấp), alka có
tính trội hơn alkb (Lê Cẩm Loan và ctv, 1993). Khơng có ảnh hưởng tích lũy về lượng
như amylose, do đó việc chọn lọc GT thấp hoặc trung bình nên tiến hành ở các thế hệ
phân ly đầu tiên, trong cặp lai giữa bố mẹ có GT thấp (hoặc trung bình). Chọn lọc con lai
có GT trung bình, từ cặp lai giữa GT cao x GT thấp sẽ rất khó đạt kết quả tốt (Lê Cẩm
Loan, 1994).
Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (2000) cho rằng hệ số di truyền của GT được
kiểm soát bởi hai gen qASS-6 và gen alk, cả hai đều nằm trên NST số 6, và GT bị ảnh
Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trang 16

hưởng rất lớn của tương tác kiểu gen và môi trường. Pooni và ctv (1992) đã đề nghị một
mơ hình phân tích trực tiếp hạt và tính chất của phơi nhũ. Mo (1995) đã thiết kế phân tích
thống kê nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu gen đối với phôi nhũ và độ trở hồ.
Hệ số di truyền thấp trên tính trạng độ bền gel, độ trở hồ, tỷ lệ xay chà biểu hiện sự
đóng góp quan trọng của tương tác kiểu gen x mùa vụ và kiểu gen x môi trường. Điều này
cho thấy môi trường rất quan trọng khi chọn giống (Nguyễn Thị Lang và ctv, 2003). He
và ctv (1999) thiết lập quần thể tế bào double haploid để nghiên cứu hệ di truyền của GT
và tìm thấy ở GT cả gen chính và gen phụ đều nằm trên NST số 6, chỉ thị (marker)
CT201-RZ450 trên gen qASS-6 và gen alk marker CT506-C235.
Các kết quả trên cho thấy khơng có sự ổn định về số gen điều khiển tính trạng GT
này cũng như mối quan hệ giữa tính trội và tính lặn.[4]
1.5. Chỉ thị phân tử
DNA marker là những chỉ thị phân tử được tạo ra nhờ kỹ thuật phân cắt DNA bằng
những “restriction endonuclease” (enzyme phân cắt hạn chế). Khi sáng tạo ra những đoạn

DNA mới, người ta đã cố gắng tìm kiếm một sự liên kết giữa chỉ thị và gen định vị trên
nhiễm sắc thể nào đó. Bản đồ di truyền đơn giản của ruồi giấm đã được phát hiện rất sớm
vào năm 1925. Những tính trạng có biểu hiện giống nhau về di truyền được xếp vào cùng
một nhóm liên kết gen, trên cùng một nhiễm sắc thể. Những tính trạng này được xác định
trên nhiễm sắc thể tuỳ thuộc vào mức độ liên kết của nó. Sự sắp xếp một cách độc lập các
nhiễm sắc thể giúp cho việc định vị của loci trong các nhóm liên kết gen. Sự xuất hiện của
hiện tượng quấn chéo (crossing cover) trong gián phân giảm nhiễm giúp cho việc xác
định thứ tự của các loci trong nhiễm sắc thể. Khoảng cách di truyền trên bản đồ được đo
bằng tần số tái tổ hợp gen (recombinations). Gen thể hiện bản chất di truyền sẽ được kiên
kết với một tính trạng hình thái nào đó mà người ta có thể đo đếm được – gen đó có thể
xem như là marker gen.
Việc lập bản đồ gen và chọn lọc nhờ marker hình thái sẽ rất chậm, số lượng q ít
và chỉ ở qui mơ hình thái. Cịn việc áp dụng isozyme marker có chiều hướng tốt hơn
nhưng số marker cũng q ít, khơng thỏa mãn nhu cầu nghiên cứu. DNA marker đã được
chứng minh có tầm quan trọng hơn về lâu dài, do số lượng của nó lớn hơn rất nhiều lần
Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trang 17

“isozyme marker” (Tanksley và ctv, 1990). Việc áp dụng DNA marker dễ dàng hơn và
tương lai sẽ rẽ tiền hơn nhờ sự cải tiến không ngừng của các nhà khoa học.
Về căn bản, bất cứ chuỗi mã DNA nào được dùng để phân biệt giữa hai cá thể, hai
dịng hoặc giống khác nhau, đều có thể được xem như là một DNA marker.
Các loại DNA markers thông thường
- RFLP :

Restriction fragment length polymorphism

- ALP :

Amplicon length polymorphism

- AFLP :

Amplified fragment length polymorphism

- RAPD:

Random amplified polymorphic DNA

- DAF:

DNA amplification fingerprinting

- SSR:

Simple sequence repeat (microsatellite)

- AP-PCR :

Arbitrary primer – PCR

- SSCP :

Single strand conformation polymorpnism

- MRDHV- DNA : Moderately repeated, dispersed, and highly variable DNA

( minisatellite)
- SNP :

Single nucleotide polymorphism

Các DNA markers có thể được chia thành hai nhóm như sau:
- PCR – based: ALP, AFLP, SSR, SSCP.
- DNA/ DNA hybridization – based: RFLP, minisatellite.
Những lợi ích của DNA marker so với marker hình thái và isozyme marker là:
- Đo trực tiếp các vật liệu di truyền
- Có nhiều marker trong quần thể
- Đo lường không chi phối ảnh hưởng mơi trường và ảnh hưởng có tính chất phát
triển.[6]

Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trang 18

1.6. SSR marker (Simple sequence repeat (microsatellite))
SSR marker là một PCR-based marker khám phá sự khác biệt, các "vi vệ tinh"
(microsatellite) bằng cách nhân bản các chuỗi mã đơn giản lặp lại (simple sequence
repeat) phân tán trong bộ gen sinh vật nhờ phản ứng PCR. Các đoạn này sau đó được tách
ra trên gel polyacryramide hoặc agarose và hiển thị nhờ phản ứng nhuộm Bạc (Ag) hoặc
Ethidium Bromide rồi chụp hình bằng tia UV. Chiều dài các đoạn DNA trên điện di
thường khoảng 100 – 200 bp. Các đoạn mồi (primer) được thiết kế cho phản ứng PCR
dựa trên chuỗi mã ở 2 đầu của các “vệ tinh”. Thể đa hình chiều dài các chuỗi mã đơn giản
lặp lại (SSLPs) được xác định dựa trên sự khác biệt về số lượng các đơn vị lặp tại locus

mà marker đó định vị và nó cung cấp một nguồn đánh đấu sự khác biệt ngay trên vật chất
di truyền.[6]
Người ta thấy cần phải cải tiến để có những đánh dấu phân tử cung cấp ở mức độ
cao hơn về tính đa dạng alen và đánh dấu vi vệ tinh đáp ứng được phần nào yêu cầu này
bởi vì nó cho kết quả nhanh, tin cậy hơn RAPD, thể hiện tính chất “đồng trội”
(codominant), khơng dùng chất đồng vị phóng xạ.
Ứng dụng kỹ thuật SSR có nhiều thuận lợi hơn RFLP, do đó hiện nay các nhà
nghiên cứu thường dùng SSR để thiết kế bản đồ gen trong di truyền, chọn giống, đa dạng
hoá các vật liệu di truyền. Các bản đồ di truyền thế hệ thứ hai được xây dựng dựa vào loại
marker rất phong phú và có tính đa hình cao này đã được phát triển trên rất nhiều loài. Ở
động vật, vi vệ tinh với các base CA /GT là những đơn vị lặp lại rất phổ biến, nhưng ở
thực vật thì AT/TA phổ biến hơn sau đó là GA/CT. Loại đa hình này có tính chất tái bản
rất cao. Những primer như vậy thực sự rất cần cho yêu cầu phát hiện nhanh và chính xác
các locus đa hình.
Quy trình thực hiện như sau:
- Tách chiết và tinh sạch DNA của mẫu nghiên cứu.
- Thực hiện phản ứng nhân gen qua PCR với các mồi đặc trưng cho các đoạn lặp
đơn giản.

Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trang 19

- Điện di trên gel agarose tính tốn số liệu, xác định mức độ giống và khác nhau
giữa các đoạn lặp DNA
- Xử lý số liệu bằng các phần mềm Map Marker Program, SYTSTAT,
NTSYSpc… lập bản đồ di truyền và dựng cây phát sinh chủng loài.

Sử dụng SSR marker có thể phát hiện nhanh sự khác biệt DNA giữa các cá thể, dễ
thực hiện và ít tốn kém. [7]
Phản ứng PCR cho SSR bao gồm các thành phần sau:
- Một dung dịch gọi PCR buffer chứa Tris-HCl, KCl và MgCl2
- Bốn deoxynucleotide (dNTPs)
- Hai oligonucleotide primers
- DNA
- Một DNA polymerase
Thể tích cần cho một PCR của SSR có thể là 15 – 50 µl là đủ. DNA có thể trích ly
bằng nhiều phương pháp khác nhau. Tuy nhiên trước khi dùng DNA, điều quan trọng là
nồng độ DNA về số lượng cũng như chất lượng phải được kiểm tra. Nồng độ dùng cho
SSR từ 30 – 25 ng/l. Nếu nồng độ quá cao chúng ta phải pha loảng trước khi sử dụng.[8]
SSR rất phong phú và phân bố rộng trong genome cây lúa vì thế chúng được sử
dụng để phân tích đa dạng di truyền giữa các giống lúa. Bản đồ di truyền SSR trên
genome cây lúa được thiết kế với các SSR marker được viết tắt là RM (Rice
Microsatellite) ở Mỹ và OSR ở Nhật. Sự phong phú về số lượng các marker SSR với các
motif lặp đi lặp lại phát triễn trên các phần mã hóa và khơng mã hóa của bộ gen cây lúa
(Wu và Tanksley, 1993; Panaud và ctv, 1995, 1996; Akagi và ctv, 1996; Chen và ctv,
1997; Temnykh và ctv,200) giúp cho việc khảo sát sự hiện diện và khác biệt các chuỗi mã
đơn giản lặp đi lặp lại trên toàn bộ genome ngày nay càng hoàn hảo. So sánh 323 SSR
marker ( 194 marker từ kho lưu trữ genomic của cây lúa và 129 marker từ kho lưu trũ
thiết lập từ protein ( isozyme marker) thể hiện tính trạng rice-expressed sequence tags –
ESTs ), Cho và ctv (2000) xác định tỷ lệ đa hình tìm thấy nhờ marker từ genome cao hơn

Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trang 20

rất nhiều các marker từ ESTs ( 83,8% so với 54,0%). Về các motif lặp lại, mức độ đa
dạng di truyền cao nhất tìm thấy ở marker khuếch đại chuỗi mã GA trong khi hầu hết các
marker khuếch đại chuỗi mã CCG hoặc CAG khơng tìm thấy sự khác biệt
SSR là marker có giá trị cao bởi vì chúng thường là di truyền codominant và dễ
dàng phân tích bằng PCR. Trên lúa có khoảng 5700 – 10000 SSR có trình tự nhau 2, 3
hoặc 4 đơn vị lặp lại. Với số lượng lớn SSR sẽ thuận lợi cho việc ứng dụng lập bnar đồ
gen. Một bản đồ gen của cây lúa được Chen và ctv (1997) thiết lập trên 121 SSR marker.
Một bản đồ có mật độ phân tử cao cũng được công bố năm 1998 được thiết lập với 2275
marker. Một bản đồ khác đã được thực hiện bằng 312 SSR marker vào năm 2000. Ngoài
ra McCouch và ctv năm 2002 cũng đã phát triển và thiết lập bản đồ trên cây lúa với 2240
SSR marker mới.
Nguyễn Thị Lang (2001) đã thiết lập bản đồ di truyền cho gen kháng mặn trên cây
lúa bằng SSR marker trên các quần thể con lai BC2F2 của nhiều tổ hợp lại khác nhau.
Các tổ hợp lai giữa cây lúa trồng và cây lúa hoang đã được phần nhóm di truyền
thông qua STS marker trên gen kháng rầu nâu Bph – 10 và SSR marker để phát hiện gen
mục tiêu du nhập từ lúa hoang vào lúa thường các tính trạng chống chịu độ độc nhơm,
chống chịu sâu bệnh, năng suất cao…(Lang và Bửu, 2002). [6]
1.7 Phản ứng chuỗi polymerase (PCR)
1.7.1 Giới thiệu về PCR. [3]
Phản ứng chuỗi của polymerase thường được viết tắc là PCR (polymerase chain
reaction). Đây là một kỹ thuật tạo dòng DNA rất đơn giản và hiệu quả. Thông qua PCR,
hàng triệu đoạn DNA đồng nhất có thể được thu thập một cách dễ dàng từ một hỗn hợp
các phân tủ bao gồm RNA, protein, plysaccharride, ADN khơng có chức năng di truyền.
Người ta gọi đó là kỹ thuật tạo dịng ADN invitro. Ngày nay, PCR được dùng phổ biến
trong nhiều lĩnh vực thuộc sinh học.
PCR là kỹ thuật xử lý invitro các chuỗi mã hoá di truyền DNA bằng cách phát triển
primer một cách đồng loạt trên các dây đơn DNA. Toàn bộ tiến trình được hồn thiện do

Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trang 21

sự biến chất của DNA cần thiết, sự tác động của primer tại đầu của các dây đơn DNA
này, kế đến là sự phát triển của các primer do phản ứng DNA polymerase.

Hình 1.11: Phản ứng PCR

Sự khuếch đại này được tính như sau:
Tổng số DNA được khuếch đại = m x 2n
Trong đó n là số chu kỳ và m là số bản sao của chuỗi trình tự DNA cần nhân ra.
Giả sử chúng ta được hiệu quả khuếch đại là 100 %, chúng ta sẽ có:
Số chu kỳ

Tổng số khuếch đại

1

2

5

32

10

1024

20

1048576

30

1,07 x 109

1.7.2 Nguyên tắc chung
PCR được thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA theo 3 trình tự:
Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trang 22

- Biến thành dây đơn (denature).
- Phản ứng của primer gắn vào đầu dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi mã trên dây
nền (template), được gọi là tiến trình “annealing” để có phân tử DNA mới.
- Kéo dài dây mới nhờ Taq polymerase (extension).
- Lặp lại qui trình

Hình 1.12 Quá trình phản ứng PCR

Ba giai đoạn này lập lại nhiều lần, để tạo mức độ cao trong sự khuếch đại. Ba giai
đoạn xảy ra trong điều kiện nhiệt độ khác nhau (thí dụ 940C, 550C, 720C), nên máy nhân
gen (thermalcycler) phải có tính chất tự động hố một cách chính xác, với sự trợ giúp của
Taq. Enzyme này được chiết xuất từ vi khuẩn chịu nhiệt độ cao sống ở suối nước nóng

Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trang 23

(750C) là Thermophilus aquaticus, có hoạt tính tối ưu ở 720C, song nó có thể bền vững tới
940C [2].
Một polymerase của DNA và bốn deoxy (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) được dùng
để khuếch đại (amplified) một đoạn chun tính nào đó của DNA. Thể tăng hoạt có tính
“chọn lọc” này được hồn thiện thơng qua sự hợp lại của hai oligonucleotide (F và R)
trong phản ứng. Nhiệm vụ của những oligonucleotide này là tác động làm cho DNA bị
biến chất (mở dây đôi thành dây đơn) và những phần cuối của đoạn nhằm tăng hoạt lên và
cho nó hoạt động như những primer trong sinh tổng hợp DNA. Để có tác động một cách
đặc biệt tại vị trí mình mong muốn, những primer này phải được tổng hợp để cung cấp
khoảng 20-24 bp chuỗi xoắn (duplex) tại mỗi đoạn cuối của segment.
Primer ở bên trái tác động trên dây DNA 3’-5’ còn được gọi là forward primer, ký
hiệu là F. Primer bên phải tác động dây 5’-3’ còn được gọi là reverse primer, ký hiệu là R.
Sự sắp xếp như vậy đảm bảo vùng bị can thiệp được tăng cường hoạt động, theo 3 trình tự
đã nói trên. Có thể tóm tắt các bước của chu kì phản ứng chuỗi PCR theo sơ đồ sau:
Tóm lại, khi các primer kết hợp với sợi DNA đối lập của nó trong điều kiện một
khoảng cách đã được kích hoạt, các đoạn DNA này có thể sẽ được khuếch đại lên theo
phản ứng dây chuyền với polymerase. Độ dài của DNA được tăng hoạt tuỳ thuộc vào số
đoạn và chiều dài của primer trong phản ứng, điều kiện chất đệm, nhiệt độ annealing...
1.7.4 Các yếu tố của phản ứng PCR:
- DNA mục tiêu: là những đoạn ADN mang mật mã đã được biết trước. Trong kỹ
thuật PCR, người ta sẽ nhận được kết quả tốt, nếu ADN thật sự tinh khiết.
- Primer và dNTP: chiều dài của primer và thành phần của dNTP ảnh hưởng quan
trọng đối với nhiệt độ trong quá trình tác động dây đơn.

- Chất đệm: thành phần chất đệm gồm có Tris, KCl, MgCl2 . Nồng độ Mg

2+

tối

hảo là 1,5 – 2,5 mM. Vì dNTP có thể gắn với Mg 2+ , cho nên nồng độ chính xác của Mg2+
phụ thuộc và nồng độ dNTP.
- DNA polymerase được dùng phổ biến là Taq polymerase trích ly từ Thermus
aquaticus, có tính ổn định nhiệt rất cao.
Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trang 24

- Các thành phần khác như chất tẩy khơng có tính ion, gelatin, NP40 và Tween 20
được thêm và với số lượng nhỏ nhằm thúc đẩy hoạt động của Taq polymerase.[8]
1.7.4 Quy trình khuếch đại
Chu kỳ 25-35 trong điều kiện:
+ Denature 94-960C

15 giây (hoặc lâu hơn tùy theo vật liệu)

+ Annealing 550C

1 phút

+ Extension 720C

2 phút

Hình 1.13 Qui trình khuyếch đại trong phản ứng PCR
Bảng 2.4. Thiết lập chương trình chạy PCR trực tiếp trên máy cho SSR

Giai đoạn

Tên giai đoạn

1

Làm nóng

2

Làm nóng

Chu kỳ

34

Nhiệt độ (0C)

Thời gian
(phút)

94

5

94

1

Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trang 25

3

Lai

34

55

1

4

Chuyển

34

72

2

5

Chuyển

72

7

6

Lưu trữ

4

Vô định

1.8. Điện di
Phương pháp điện di trong gel (keo) thường được sử dụng để phân li (phân đoạn)
DNA, RNA, oligonucleotide, protein... sau đó có thể dùng để giám biệt (đồng định) và
tinh chế các chất đó. Việc phân li các chất dựa trên độ lớn cũng như hình thái của các
chất. Thơng thường sử dụng gel agarose và gel polyacrylamide nhưng gel agarose cho
phép phân li nucleic acid lớn hơn 1 kb, còn gel polyacrylamide thường dùng để phân li
các đoạn nucleic acid nhỏ hơn 1 kb. Nguyên lý của việc điện di DNA là khi ở trong điện
trường, do tích điện âm nên các phân tử DNA dịch chuyển về phía anode và với tốc độ
dịch chuyển của chúng khác nhau phụ thuộc vào khối lượng phân tử. Các đoạn DNA càng
lớn thì dịch chuyển càng chậm. Kết quả là từ một điểm chung (lỗ hay "giếng" tải mẫu)
các đoạn DNA khác nhau dịch chuyển về một hướng tạo thành một làn (lane), và trên làn
đó có các đoạn DNA khác nhau phân bố ở các vị trí (các băng - band) khác nhau tương

ứng với độ lớn của chúng. Trong khi đó, các phân tử protein do tích điện bề mặt khác
nhau nếu điện di trong gel khơng gây biến tính thì dịch chuyển theo các hướng khác nhau
với tốc độ khác nhau phụ thuộc cả khối lượng phân tử lẫn điện tích bề mặt, nhưng nếu
điện di trong gel sau khi xửlý bằng SDS thì do bề mặt protein trở nên tích điện âm đồng
nhất nên chúng dịch chuyển về anode với tốc độ khác nhau hầu như chỉ phụ thuộc khối
lượng phân tử. [9]

Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa